JPH09510105A - 液体サンプルのコンディショニングのための新しい方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 バクテリア数を測定するための蛍光測定にさらす前に脂肪小球体及び体細胞及び／又は蛋白質粒子を含む（例えばミルク又は食肉の）サンプルをコンディショニングするための方法、並びにこのようなサンプル中のバクテリア含量の測定を行う方法が開示される。前記コンディショニング方法は、イオンキレート化剤、蛋白質分解酵素、界面活性剤、及びエチジウムブロミドのような生物学的に特異的な蛍光色素でサンプルを処理することに関連する。界面活性剤は、脂肪小球体の溶解が実質的におこらず、これにより前記コンディショニングされたサンプルが重要な量の脂肪小球体を失わないような濃度において用いられる。蛍光の測定は、慣用のフローサイトメーターにおいて好ましくは行われる。脂肪小球体の分離を必要としないので、本方法は簡単で迅速である。前記バクテリアの測定は標準的な方法と比べて信頼できることが判明している。

Description

【発明の詳細な説明】 液体サンプルのコンディショニングのための新しい方法 本発明は、蛍光測定により、特にフローサイトメトリーにより、液体サンプル 内のバクテリアの量を測定するための、ミルクのような前記液体サンプルをコン ディショニングするための新しい方法及び前記測定を行うための方法に関する。 フルオロクロムで染色して、該フルオロクロムが吸収する波長域において光を 照射し、そしてその蛍光を評価することによりミルク中のバクテリアの数を測定 することが周知である。 このように、1980年３月19日に発行されたEP−Ａ8826は、ミルクのようなバク テリア含有液体サンプル中のバクテリアを計数するための方法を開示する。計数 手順の前にミルクにおいてEDTAの手段により体細胞を溶解し、遠心してこのサン プルの他の構成物（即ち、脂肪小球体及び体細胞壁）からバクテリアを単離し、 このように単離されたバクテリアの懸濁液をズブチリシンのような蛋白質分解酵 素で処理して、フルオロクロムの組合せ、特にアクリジンオレンジ、EDTA及び界 面活性剤で染める。この単離されたバクテリアの染色の後、このバクテリア懸濁 液を回転する円板の外側端上の薄いフィルムとして適用し、このフィルムを照射 にさらし、染められたバクテリアから発せられた光のシグナルをサンプル中のバ クテリアの数を測定するための基礎として用いる。 近年において、より簡単でより速い技術、特にフローサイトメトリーを用いて ミルク中のバクテリアの測定を行う試みがなされている。 このように1984年７月９日に発行されたFIで発行された特許明細 書番号 68654号は、44〜55℃でホモジナイズし、ml緩衝液当り20〜100 μｇの臭 化エチジウムを含むリン酸緩衝液 pH7.4を添加し、この懸濁液をフローサイトメ ーターで蛍光測定することにより、ミルクのような天然の懸濁液中の体細胞及び バクテリアの量を測定する方法を開示する。 1988年３月９日に発行されたEP−Ａ342501号において示唆される更に近年のス トラテジーは、非イオン性界面活性剤Ｃ_1-8アルコール及び10超のpHの緩衝液、 並びに臭化エチジウムのような呈色試薬から本質的になる清澄化試薬でミルクを 処理し、フローサイトメトリーにおける励起及び蛍光測定を含む。この清澄は、 存在し得るいずれの微生物又は体細胞にも影響を与えずに、ミルク中に含まれる 非細胞粒子を選択的に分解する。 このように、当該技術において示唆されるストラテジーは体細胞及びバクテリ アの両方の測定を含み、最も新しいストラテジーは、このような測定の前に細胞 小球体の除去を含む。 本発明に導く包括的な調査と関連して、許容される標準的な技術（Standard P late Count）と一致した信頼できる結果を確実にするであろうフローサイトメト リー蛍光測定において、ノイズ比に対するシグナルを得るために、ミルク中に固 有に存在するカゼインミセル／粒子をデグラデーション及び可溶化することが必 要である。というのは、カゼインの存在は、蛋白質の沈殿及び用いられる装置に おける蛋白質被膜の形成に導く傾向を有するからである。カゼインのデグラデー ションに利用できる手段、即ち蛋白質分解酵素、及びバクテリアを染めるのに利 用できる手段、即ち細菌学的特異的フルオロクロムは、体細胞の特定のデグラデ ーションを引きおこし、これにより、フローサイトメトリーに関係する２つの上 述の特許出願の教授に反して、体細胞が溶解され、デグラデーションし、可溶化 されなければならないことを意味するノイズ比に対するシグナルを害するであろ う細胞らを生じるであろうことも見い出されている。他方、上述の特許出願の最 新のものに反して、及びEP−Ａ8826の教授に反して、脂肪小球体を除去しないで 蛍光測定においてノイズ比に対して満足のいくシグナルを得ることが可能であり 、これによりサンプルコンディショニング及び用いられる計測器が相当に簡略化 されることも見い出されている。 本発明は、これらの認識を基礎として、 １）脂肪小球体及び ２）体細胞及び／又は蛋白質粒子 を含む初期液体サンプルからコンディショニングされたサンプルを調製するため の方法であって、該方法が、前記体細胞を溶解し、前記蛋白質粒子及び前記体細 胞由来の細胞片をデグラデーション及び可溶化し、その後前記初期サンプル中の 全てのバクテリアを染めるように、 イオンキレート化剤、 蛋白質分解酵素、 界面活性剤、及び 細菌学的に特異的な蛍光色素 で前記初期サンプルを処理することを含み、前記界面活性剤が、前記脂肪及び球 体の溶解が実質的におこらないであろう最大濃度以下の濃度で用いられ、それに より前記初期サンプルと実質的に同量の完全な脂肪小球体を含むが前記初期サン プルより少量の完全な体細胞及び完全な蛋白質粒子しか含まない前記コンディシ ョニングされたサンプルを得ることを特徴とする方法に関する。 本文脈において“コンディショニング”という言葉は、蛍光技術によるサンプ ル中のバクテリアの濃度又は数の測定のために調製さ れたサンプルを作ることを意味する。“蛍光技術”という言葉は、蛍光色素が吸 収する波長域における光をサンプルに照射して、その結果発せられた蛍光を、視 覚的、コンピューター像分析の手段、又は光電子増倍管もしくはホトダイオード のような適した変換機の手段のいずれかにより測定するいずれの技術をも意味す る。体細胞に関連して用いられる“溶解”という言葉は、体細胞の細胞壁を破壊 して細胞片を残すことを示す。蛋白質粒子及び細胞片に関連して用いられる“デ グラデーション及び可溶化する”という言葉は、例えば蛋白質の加水分解による 、蛋白質粒子及び細胞片の分解により、結果として、前記粒子又は分子に結合し た蛍光色素により発せられた蛍光が、蛍光色素で染められたバクテリアにより発 せられた蛍光ピークから区別できない蛍光ピークを、いずれの実質的な範囲まで は発生しないように小さい粒子又は分子を引きおこし、これにより上述の蛍光技 術において評価することを妨げないことを示す。粒子又は分子から発せられた蛍 光は、問題の粒子又は分子の大きさによるよりそれに結合した発蛍光団の量に通 常よる。これは、好ましく用いられるフルオロクロムが、デグラデーション及び 可溶化の後のサンプル内に存在する粒子は分子中に種々の量で存在する DNA又は RNAを染めるという事実に関係する。 本発明の重要な実施形態に従うと、初期サンプルが界面活性剤の存在中に蛍光 色素で処理される時、染色の効果性及び選択性がかなり増強される一方、界面活 性剤が特定の重大な限界未満の量において用いられる時のみ、界面活性剤の利益 的な効果が得られる：この重大な限界を超える時、バクテリアの染色の効果性が 劇的削減され、これにより後の蛍光測定におけるシグナル／ノイズ比をひどく減 少させる。この重大な量は、もちろん界面活性剤のタイプ及び個性によりある程 度までは種々であるが、界面活性剤のタイプ及び個と 実質的に独立した実際の上限は、脂肪小球体の溶解が実質的におこらないであろ う界面活性剤の最大濃度であることが見い出されている。 本明細書及び請求の範囲において、“脂肪小球体の溶解が実質的にない”とは 、（例えばミルクの）初期サンプルの些細な清澄しか行われないことを示す。脂 肪小球体の溶解についての定量アッセイは次の通りである：初期サンプルを第１ は本発明に従ってコンディショニングされ；第２（対照）は不活性溶媒、例えば 蒸留水中に当量に希釈された２つのアリコートに分割する。両サンプルを脂肪小 球体により散乱される光（例えば 488nmの波長の光）を照射し、照射する光に対 して90°の角度で散乱した光の強度を評価する。脂肪小球体の溶解が実質的にお こらないコンディショニングされたサンプルは、対照から測定された強度の少く とも50％である散乱された光の強度を生じる。コンディショニングされたサンプ ルから光の強度は、上述で定番される対照サンプルの好ましくは少くとも60％、 更に好ましくは70％、最も好ましくは少くとも80％である。 初期サンプルは、後に界面活性剤、キレート化剤、酵素、蛍光色素で、いずれ かの順序においても処理され得る。しかしながら以下のストラテジーが特に関心 のものである： １）初期サンプルを最初にキレート化剤、次に酵素、次に界面活性剤、そして 次に蛍光色素で処理する。 この態様において、体細胞を触媒させ、蛋白質粒子／ミセルをキレート化剤で の処理により部分的に分解し、これにより蛋白質粒子／ミセルの消化における蛋 白質分解酵素の効果性を改良し、その後界面活性剤が細胞片を更に可溶化し、及 び／又はバクテリアの染色を増強する。 ２）初期サンプルを最初にキレート化剤及び酵素の組合せで、次 に界面活性剤、そして次に蛍光色素で処理する。 この態様において、蛋白質粒子の消化と同時に分解が行われ、これにより有益 な順序の利点を犠牲にすることなく作業ステップを節約する。 ３）初期サンプルを最初にキレート化剤、酵素、及び界面活性剤の組合せで処 理し、その後蛍光色素で処理する。 この態様において、染色についてサンプルの全ての調製は１つの有効なステッ プにおいて行われる。その後蛍光色素はこのように調製されたサンプルに添加さ れる。この場合染色ステップは極めて短いインキュベーション、即ち下は２秒ま での間、しかし通常は５秒又は10もしくは20秒間の間行われ得、それにより蛍光 色素は、他の成分と組み合わせて用いられる通常のアルカリ性緩衝液から異なる リン酸緩衝液又は精製水中の溶液のような緩衝液中の溶液として添加される。こ れにより、アルカリ感受性蛍光色素の安定性は、蛍光色素がアルカリ性緩衝液中 に溶解される状況と比べて改良される。 ４）初期サンプルをキレート化剤、酵素、界面活性剤、及び蛍光色素の組合せ で処理する。 その安定性が特にアルカリ性感受性でないエチジウムブロミドのような蛍光色 素を好ましくは用いるこの実施形態は、もちろん作業ステップの点から最も簡単 かつ迅速なアプローチを構成する。 少くとも酵素での処理に関連する処理ステップが関連する限り、少くとも 0.5 分間のインキュベーション時間のような所定の最小のインキュベーション時間が 好ましい。好ましくは、インキュベーション時間は、0.5〜20分間の範囲内であ る。酵素での処理におけるインキュベーション時間の選択は全酵素活性を基礎と してなされるであろう；通常、必要なインキュベーション時間は、酵素濃度に反 比例する。最大の能力を得るために、インキュベーション時間は、 標準的な方法と同様の結果を確実にすることが見いだされることが可能な最も短 いインキュベーションとして選択される。同様の考慮を蛍光色素でのインキュベ ーション（染色）に適用する。 酵素又は細菌学的に特異的な蛍光色素で処理されるべきサンプルの温度は、好 ましくは15〜80℃の範囲内であり、この範囲内において、用いられる酵素もしく は細菌学的に特異的なフルオロクロムの温度最適条件に、並びにサンプルの実際 の液体／機械的取扱いに適するように適合される。 処理されるべきサンプルのpHは、その目的（更に後述を参照）に最適条件で適 合された酵素がこの範囲におけるそれらのpH最適条件を用するように、及びアル カリ性pHがカゼインを可溶化する傾向があるであろうように６〜11の範囲内に好 ましくは維持される。このpHは、緩衝液の手段により問題の範囲適切に維持され 、これは特に以下のものからなる群から選択される緩衝液である： リン酸（pH5.0 〜8.0）（Sorensen，S．P．L.，Biochem．Z.，21，131(1909)，a nd 22，352(1909); Ergebn．Physiol.，12，393(1912); Walbum，L．E.，Bioche m．Z.，107，219(1920)を参照のこと）、 ホウ酸ナトリウム／HCl(pH7.8〜9.2)(Sorensen，S．P．L.，Biochem．Z.，21，1 31(1909)，and 22，352(1909); Ergebn．Physiol.，12，393(1912); Walbum，L ．E.，Biochem．Z.，107，219（1920）を参照のこと)、 グリシン／NaOH（pH8.6 〜12.8）（Sorensen，S．P．L.，Biochem．Z.，21，131 (1909)，and 22，352(1909); Ergebn．Physiol.，12，393(1912); Walbum，L．E .，Biochem．Z.，107，219（1920）を参照のこと）、 ホウ酸ナトリウム／NaOH（pH9.4 〜10.6）（Sorensen，S．P．L.，B iochem．Z.，21，131(1909)，and 22，352(1909); Ergebn．Physiol.，12，393( 1912); Walbum，L．E.，Biochem．Z.，107，219（1920）を参照のこと）、 バルビタール−Na／HCl（pH7.0〜9.0）（Michaelis，L.，J．biol．Chem.，87， 33(1930)を参照のこと）、 ピペラジン／HCl（pH8.8〜10.6）（Smith and Smith，Biol．Bull.，96，233(19 49); Semenza et al.，Helv．chim．Acta，45，2306(1962)を参照のこと）、 テトラエチルエチレンジアミン（pH8.2 〜10.0）（Semenza et al.，Helv．chim ．Acta，45，2306(1962)を参照のこと）、 トリスマレイン酸(pH5.2 〜8.6)(Gomori，G.，in Colowick and Kaplan(Eds.)， Methods in Enzymology，vol.1，Academic Press，New York，1955，page 138; Gomori，G.，Proc Soc．exp．Biol．(N.Y.)，68，354，(1948)を参照のこと)、 ジメチルアミノエチルアミン（pH5.6 〜7.4 and 8.6 〜10.4）（Semenza et al. ，Helv．chim．Acta，45，2306(1962)を参照のこと）、 トリエタノールアミン／HCl(pH7.0〜8.8)(Beisenherz et al.，Z．Naturforsch. ，8b，555（1953）を参照のこと)、 Ｎ−ジメチルアミノロイシルグリシン／NaOH（pH7.0 〜8.8）（Leonis，J.，C． R．Lab．Carlsberg，Ser．Chim.，26，357(1948)を参照のこと）、 トリス／HCl（pH7.2〜9.0）（Gomori，G.，in Colowick and Kaplan(Eds.)，Met hods in Enzymology，vol.1，Academic Press，New York，1955，page 138)を参 照のこと）、 ２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール／HCl（pH7.8〜10.0）（Se e Gomori，G.，in Colowick and Kaplan(Eds.)，Meth ods in Enzymology，vol.1，Academic Press，New York，1955，page 138; Gomo ri，G.，Proc．Soc．exp．Biol．(N.Y.)，68，354，（1948）を参照のこと）、 及び 炭酸（pH9.2 〜10.8）（Gomori，G.，in Colowick and Kaplan(Eds.)，Methods in Enzymology，vol.1，Academic Press，New York，1955，page 138; Delory a nd King，Biochem．J.，39，245（1945）を参照のこと）、 好ましいキレート化剤は、以下のキレート化剤からなる群から選択されるキレ ート化剤のようなカルシウムーキレート化剤である。 全てのBAPTA(１，２−ビス（２−アミノフェニル）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ ′−四酢酸）−様キレーター（“New Calcium Indicators...”R．Y．Tsein，Bi ochemistry 19，2396(1980);“On the Dissociation Constants of...”R.，Pet hing，et al．Cell Calcium 10，491(1989);“Synthesis and Characterization ...”L．A．Levy，E．Murphy，R．E．London．Am．J．Physiol．252，C441（198 7）を参照のこと）、 EDTA（〔エチレンジニトリロ〕四酢酸）、 EGTA（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ′， Ｎ′，−四酢酸）、 APTRA(２−アミノフェノール−Ｎ，Ｎ，Ｏ−三酢酸、三カリウム塩)及び関連す る誘導体（Biochemistry 27，4041(1988); T.Meyer and L．Stryer in Annual R eview of Biophysics and Biophysical Chemistry，Vol 20; D．M．Englemann， Ed.，Annual Reviews（1991）pp．153-174 を参照のこと）、及び DTPA（Ｎ，Ｎ−ビス〔２−（ビス〔カルボキシメチル〕アミノ）エチル〕グリシ ン；ペンテン酸）（“kinetics of Calcium...”T．Meyer，T．Wensel，L．Stry er．Biochemistry 29，32(1990);“Highl y cooperative...”T．Meyer，D．Holowka，L．Stryer．Science 240，653(1988 )を参照のこと）。 本発明の１つの重要な特徴に従うと、一方で、イオンキレート化剤がバクテリ アの染色能を改良し、しかし他方で、この染色能に反対に作用し始めるであろう イオンキレート化剤の最大濃度が存在することが見い出されている。これにより 、イオンキレート化剤の最大の好ましい濃度を測定するのに用いられ得る容易で 再生可能なテストについて参照することで、イオンキレート化剤は、その濃度の 増加が、フローサイトメトリー蛍光測定により測定された、0.05vol ／vol ％ B rig 96の存在中のml当り２μｇの濃度におけるエチジウムブロミドでのリン酸緩 衝液 pH7.4において 620nmにおいて最適強度 0.5に調節されたシュードモナス・ フルオレセンス(Pseudomonas fluorescens) の一晩の培養の染色能の減少を引き おこすであろう濃度周り、又はそれ未満の濃度においても好ましくは用いられる 。 上述のことを考慮に入れると、イオンキレート化剤は、リッター当り約１〜10 ｇ、好ましくはリッター当り約２〜５ｇの濃度で通常用いられるであろう。 適した蛋白質分解酵素の例としては、1972の国際酵素命名システムにおけるク ラス３．４（ペプチド加水分解酵素）、特にサブクラス３．４．22（チオールプ ロティナーゼ）、３．４．24（金属プロティナーゼ）、及び３．４．99（未知の 触媒メカニズムのプロティナーゼ）並びにズブチリシンが適合するサブクラス、 即ちサブクラス３．４．21（セリンプロティナーゼ）におけるクラス３．４に分 類される酵素で言及され得、このクラスにおける関心の酵素は、広範囲の特異性 を有するものである。 蛋白質分解酵素は、６〜11のpH範囲においてその最大活性を有す ることが好ましい。実験において特に適していることが見い出されている酵素は スブチリシンである。 蛋白質分解酵素は、少くとも 0.02Anson単位の濃度、特に、約0.05〜0.5Anson 単位の濃度のような少くとも 0.05Anson単位の濃度、更に好ましくは約0.08〜0. 15Anson 単位の濃度において通常、用いられる。 界面活性剤は、適切にはいわゆる生物学的界面活性剤、即ち蛋白質及び膜構成 物の可溶化に効果的であることが知られているタイプの界面活性剤である。例え ば、研究及び診断試薬のための生化学品及び有機化合物のシグマ製品カタログ(S igma Chemical Company，St．Louis，MO，U.S.A.，1992)を参照のこと。適切な 界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレンエーテルのような非イオン性生物 学的界面活性剤（例えばラウリル、オレイル、ステアリル又はトリデシルエーテ ル）、例えば Brij96，Triton X100、もしくはTriton X165 ;モルラウレート（T ween 20）、モノオレート（Tween 80）、モノパルミテート、モノステアレート 、もしくはトリオレート、好ましくはTween 80もしくはTween 20のようなポリオ キシエチレンソルビタンエステル；又はジギトニンが言及され得る。これらの中 で、Brij−96及びTween 80が好ましい。 界面活性剤は、上述のものに従って用いられるその濃度が、当然脂肪小球体の 溶解が実質的におこらないであろう最大濃度において、又はこの濃度未満である であろう条件で、0.01〜２容量パーセントの量で通常用いられる。界面活性剤は 、上述の条件で、好ましくは0.03〜0.1 容量％の量で用いられる。 ほとんどの目的のために、キレート化剤及び界面活性剤の濃度及び組合せを選 択するめの実際のガイドラインは、特定の程度までミルク内の体細胞を可溶化す るのに効果的で、これによりFoss Elect ric A/S からのAOAC-approved Fossomatic 360による細胞計数において少くとも 95％の削減がおこるような濃度におけるこのようなキレート化剤及びこのような 界面活性剤を用いることである。 蛍光色素は、DNA／RNA −結合蛍光色素、バクテリア細胞壁もしくはバクテリ ア鞭毛に特異的に結合する蛍光色素、並びにバクテリア生存力染料から選択され る。十分な細菌学的特異性の指示として、蛍光色素は、3.5重量％の脂肪含量を 有する不均一な全体のミルクに室温でml当り10μｇの濃度で添加した時、５分間 静かに撹拌されたその結果の混合物が、照射ソースとして50ワット水銀ランプを 用いてガラススライド上で蛍光顕微鏡により検出され得る脂肪小球体のいずれの 染色もおこらないものであることが好ましい。上述のテストは、アクリジンオレ ンジの使用をとりけ排除し、本発明を研究する道程において得られた結果とよく 一致する事実である。特に好ましい蛍光色素は、プロピジウムイオジド又はエチ ジウムブロミドのようなフェナントリジウム誘導インターカレーターの群に属す るものである。これら両方は、脂肪小球体で染色しない測定された特性に加えて 、バクテリアの満足な染色をおこす。 特に好ましい蛍光色素はエチジウムブロミドであり、これは、液体サンプルの ml当り少くとも 0.1μｇの濃度、特に液体サンプルのml当り約1.5 〜10μｇの濃 度のように液体サンプルのml当り少くとも 0.5μｇの濃度において用いることが 好ましい。 本発明の方法が行われるべきサンプルの最も重要な種類は、植物又は飼料製品 のサンプル又はこれらから誘導されるサンプル、特に、脂肪小球体がミルク脂肪 小球体であるサンプルであり、サンプルの特に最も重要な種類はミルクサンプル である。しかしながら、他のタイプのサンプル、即ちホモジェナイズされた食肉 並びにチーズ及びヨーグルトのような日常製品、新鮮もしくは処理された食肉、 鳥肉、海産食物、パン類、発酵食物、並びにサラダ等においてバクテリア数を測 定するのに本発明の方法を用いることも可能である。 上述で議論されるような本発明に従うコンディショニングを行った後、コンデ ィショニングされたサンプル又はその一部は、蛍光色素を励起させる波長域にお ける光に当てられ得、この発された蛍光が測定され、そしてサンプル中のバクテ リアの数が蛍光を基礎として決定され得る。初期サンプルにおけるこのようなバ クテリアの測定は本発明のもう１つの重要な部分を構成する。 バクテリアの数の測定はいくつかの方法において行われ得る。本明細書内に記 載されるように（本明細書内に開示される方法、例えばフローサイトメトリーを 用いることによって）コンディショニングされたサンプル中の各々のバクテリア からの蛍光の発光を別々に測定することが可能である。その後、標準サンプル中 の周知のバクテリアの数とコンディショニングされたサンプルからの別々に発さ せられた蛍光インパルスとの間の関係により、標準曲線において補間することが 可能である。同様の方法において、未知のバクテリア含量のサンプルから、標準 プロトコルを用いることから測定されたバクテリア数に蛍光測定を相互に関係さ せることも可能である。本明細書内に記載される実施例のように、サンプル中の バクテリアの数を測定するための本発明の１つの方法は、２つの広く許容される 標準プロトコルと優れた相関関係を示し、これにより、蛍光測定からバクテリア 数へ補間することが可能となり、信頼できる結果が得られる。 蛍光色素を励起させる光は、キセノン又は水銀ランプのような広バンドの光ソ ースからの適した光であるが、レーザー光を用いることも本発明の範囲内である 。 サンプル中のバクテリア数を測定するための本発明の方法の好ま しい実施形態は、フローサイトメトリーにおいてサンプル又はサンプルの一部が 液体ストリングとして流れる時蛍光を測定する場合である。 フローサイトメトリーの中心はサンプルを受容するフローチャンバーであり、 薄い直線状の流れとして励起光のビームを通してそれを高速度に強いる。サンプ ルが粒子を含んでいると、これらは流れの中に入り、各々の粒子は極めて短い時 間、照射されるであろう。照射された時、粒子は励起光に対して特定の角度での 励起光の散乱、励起光の吸収、又は蛍光の発光のような光学的な出来事をひきお こすであろう。 フローチャンバーの周りに適した光学フィルター、光電子増倍管 もしくはオートダイオード並びに変換器も配置することにより、光学的出来事 が検出され、処理され、そして記録され得る。この出来事は、粒子を特徴づけ、 従って、粒子の複合混合物中の粒子の特定の群が、前記光学的出来事を基礎とし て同定され得る。スプレーにおいて励起光を通過するサンプルの量は周知である か、又は計算され得るのであれば、その後複合混合物中の粒子の特定の群が同定 され、定量され得る。 粒子により引きおこされる光学的出来事の選択性は、化学組成又は粒子の特性 を操作することにより改良され得る。これは、例えば分析に関連する粒子に対す る特定のアフィニティーを有するように蛍光染色を導入することによりなされ、 これにより、フローチャンバーにおいて励起光のビームを通過する時、粒子が蛍 光放射を発する。 いくつかの選択性が、分析に関連する粒子に対して特異的な染色剤の選択によ り達成されるが、染色剤は分析に関連しない粒子においても存在する（DNA成分 のような）粒子の特性に対してしばしば特 異的である。 フローチャンバーにおける光学的出来事の選択性は、分析に関連しない粒子の 特性と類似した特性を有する粒子を除去、デグラデーション又は消化することに より更に改良され得る。これは、慣用の分離技術の手段（遠心分離）により、又 は酵素消化により達成され得る。本明細書及び請求の範囲から明らかになるであ ろうように、上述の測定により（ノイズに対するシグナル比を改良する）光学的 出来事の選択性を改良することは本発明の範囲内である。 例えば、上述のEP−Ａ8826に開示されるように、フィルムが光で照射される場 合並びに発した蛍光が顕微鏡の対物レンズにより収集され、変換機に伝達される 場合、サンプルが回転するディスクの外縁部分上にフィルムとして適用される時 、蛍光が測定される上述の方法を用いることも本発明の範囲内である。EP−Ａ88 26において開示される回転ディスク系の適用は、分析に関連する粒子を特徴づけ る光散乱の使用を排除する。というのは、励起光路に対して 180°の光学的出来 事のみが収集されるからである。分析に関連する粒子を特徴づけすることができ るであろう光学的出来事のこのような排除は、蛍光測定において妨害する可能性 のある他の粒子と除去、デグラデーション又は消化する選択的染色剤及び選択的 方法を用いる本発明の方法の重要性を強調する。 最後に、本発明に従って、サンプル中のバクテリアの量は（エピフルオレセン ス顕微鏡による）顕微鏡の使用により測定され得る。顕微鏡は、サンプル中の粒 子の像を拡大し、適した倍率を用いることにより観察者はサンプル中の粒子を視 覚的に見ることができる。検査される量が知られているなら、分析に関連する粒 子の濃度が、計算され得る。視覚的な検査は方向及び形の両方を基礎とする粒子 においての選択を許容するが、複合混合物において分析に関連する 粒子の選択は、しばしば達成するのが極めて難しいか又は達成できない。いくつ かの選択性は、例えば慣用的な組織化学において適用されるように、分析に関連 する粒子に対するアフィニティーを有する吸収染色剤を用いることにより達成さ れ得る。例えば、蛋白質粒子は染色剤アミドブラック(Amido Black)で黒色に染 められ得る。しかしながら、分析に関連する粒子は、観察者に見えたままである 。 観察者により観察される粒子の選択性は、上述されるフローサイトメトリー及 び回転ディスクにおいて用いられるものと同様の励起光ソース及び光学フィルタ ーを顕微鏡に備えることにより、及び分析に関連する粒子に特異的な蛍光染色剤 を選択することにより更に改良され得る。蛍光を発する粒子のみが観察者に見え たままであり、上述の光学的出来事の選択性が適用されるであろう。 顕微鏡による観察の分析的な適用は、大きな倍率において観察される極めて小 さな量によりしばしば限定される。これを補うために、いくつかの観察が、サン プルのいくつかのランダムに選択された量においてなされ、これは分析のケイデ ンス(cadence)を乱す。更に、大きさ及び形を基礎とした分析に関連する粒子を 同定する選択性は、観察者によりしばしば偏る。それゆえ、コンピューター制御 のデジタル像アナライザーを顕微鏡に備えることにより観察者による偏りを最小 化することが好ましい。この方法において、コンピューターは、この目的に設計 されたソフトウェアーを用いることにより予めセットされた大きさ及び形の判定 基準を基礎として粒子を計数することを命令され得るか、又はコンピューターは 、分析に関連する粒子の認識において教育されている神経的ネットワークを用い ることができる。それゆえ光学的出来事の先に記載された選択性は、コンピュー ター制御デジタルアナライザを備えた顕微鏡で用いて も分析に適用されるであろう。 本発明の上述の記載は、脂肪小球体が初期サンプルからもコンディショニング されたサンプルからも実質的に除去されないか又は溶解されず、これにより蛍光 測定の間存在する場合中心にあることを意図するが、それらは、コンディショニ ングされたサンプルの脂肪小球体又は溶媒の除去、置換又は溶解が実際に行われ る場合にも少くともある程度までは適用されることが、本発明の利点の上述の説 明から理解されるであろう。 遠心による脂肪小球体の除去の前に行われる時、言及された順序及び組合せ、 特にキレート化剤及び酵素での最初の処理を用いて得られる改良されたサンプル コンディショニングにおいて存する本発明のこの態様の特定の利点は、更に改良 されたノイズに対するシグナル比を生じる。というのは、小さい粒子はより高い 拡散係数を有するので、より小さな粒子（デグラデーションした体細胞）より大 きい粒子（バクテリア）を収集することにおいて遠心がより効果的だからである 。もう１つの利点は、バクテリアに結合せずむしろ溶媒中又は脂肪小球体中（よ り小さな範囲まで）に溶解され、又は懸濁される過剰の蛍光色素が蛍光色素測定 の前に除去され得ることである。 図１は、蛍光測定によりサンプル中のバクテリアの量を測定するために有用な 装置を概略的に示す。この装置はそれ自身周知の種類のフローサイトメーターで ある。 ルス高の図である。 ｇ当りのパルス）対log10(コロニー形成バクテリア)を示すグラフである。 g10(ml当りパルス)対log10(個々のバクテリア数)を示すグラフである。 図１を参照すると、分析されるべき試料及び本明細書内に記載されるようなコ ンディショニングされている試料、例えば後述の実施例におけるものはノズル22 から放出される。シース流体は、シースフローを形成するように試料の周囲の層 状フローにおいて流れる。サンプルフローラインにおいて含まれるバクテリア21 はフローセル20の中心において流れる。 キセノンランプのような広バンドソース10からの光線12は、Infra Red(IR)光 及び発色団が発する波長域における光のような発蛍光団が吸収する波長域でない 光を除去するフィルター14を通してフローセル20に向けられ、集光レンズ18の手 段によりバクテリア21に焦点を合わせられる。光線12は、バクテリアに付着した 蛍光色素が吸収する波長域における光を含む。 光を発光するバクテリアからの発光は、バクテリアからの蛍光を透過するが発 蛍光団が吸収する波長域におけるいずれの残った光も除去するフィルター25を通 して、及びバクテリアからの蛍光を透過するが光ソース10により発せられるいず れのIR光をも除去するフィルター26を通して通過されて、レンズ24により集光さ れ、蛍光を測定する光電子増倍管27に焦点を合わせられる。 光電子増倍管27は、励起ソースからの直接光として、図１において描かれるよ り、光線12に関してもう一方の位置に好ましくは位置するであろうことに注意す べきである。好ましい実施形態において、光電子増倍管27は、光線12に対して90 °又は光線12に対して 180°に位置するであろう。 バクテリアは、特定のしきい値より低い高さを有する検出された パルスを除去するパルス高アナライザ（示さない）によりバックグラウンドノイ ズから分離され得る蛍光のピークとして検出されるであろう。これにより、検出 されたバクテリアの数はしきい値を超えるパルスの全体数であろう。フローセル 20中のサンプルの流れの比（時間の単位当りの容量）が知られている場合、サン プル中のバクテリアの温度は、測定された蛍光ピークの数及びこれらのピークが 検出されている時間を基礎として決定され得る。 実施例 本実施例において、キレート化剤、酵素、界面活性剤及び蛍光色素の組合せで ミルクサンプルを処理する。生のミルク 43の生のミルクサンプルを農業タンクから収集した。バクテリアの均一な分布 を得るために、ミルクをホモジェナイズすることが好ましい。これはコロニー形 成単位の数に対してサンプル中のコロニー形成バクテリアの数を評価することに 従う対照標準方法を改良する。本実施例において、KinematicaからのPolytronに おいて、ステップ６で10秒間、ミルクをホモジェナイズした。試薬 試薬は以下のもの： １）Na₂CO₃ 7.60ｇ／ｌ ２）NaHCO₃ 8.84ｇ／ｌ ３）Na₂H₂EDTA・H₂O 2.43ｇ／ｌ ４）Na₄EDTA・4H₂O 2.71ｇ／ｌ ５）ズブチリシンＡ（Novo） 91.2mUnit ／ｌ ６）エチジウムブロミド 5.0mg／ｌ を含む。 成分１）〜６）を精製水に添加して0.22μｍフィルターを通してろ過する。こ のpHを 9.3〜9.5 の範囲に調節する。実際の取り扱いの目的のために、成分１〜 ４を上述の濃度の２倍で保存緩衝液として精製水中に調製することができる。試 薬６は１ｇ／ｌを含む蛍光色素保存溶液中に調製することができる。 試薬５は 2.4Unit／ｌを含む酵素保存溶液として供給される。 試薬は、 500ml 緩衝保存溶液、 5ml 蛍光色素保存溶液、 38ml 酵素保存溶液、及び、 水を添加して1000mlとしたものを混合することによって保存溶液から調製するこ とができる。対照標準法 International Dairy Federation Standard 100bに従ってミルクサンプルにお いて対照標準法を行う。BactoScan 8000法 製造手順（Foss Electric，Denmark）に従ってミルクサンプルにおいてBactoS can 8000法を行う。この方法は、例えばミルク中のバクテリアの濃度の測定のた めのルーチン即ち方法としてドイツにおいて認可されている。サンプルのコンディショニング 上述の試薬４mlを１mlのミルクに添加し、その後このミルクを撹拌して50℃で ５分間、インキュベーションした。コンディショニングされたサンプルの分析 ーター内に供給する。蛍光を検出してパルス高分析図を作成する（図２）。染色 されたバクテリアがバックグラウンドノイズから容易 に圧別できるピークを形成しているこのパルス高の図から、個々のバクテリアを 検出して計数することができる。フローサイトメーターを通して流れているサン プルの流量を検出されたバクテリアの総数（ノイズシグナルを超えるシグナル） に関連させることにより、サンプル中のバクテリアの濃度を決定することができ る。結果 て、この装置のための推奨されるシース流体を用いて良好なシグナルに対するノ イズ比が確認された。 更に、上述のようにコンディショニングされ、図１に示される原理を用いる実 験的機構において決定された蛍光インパルスの数は、対照標準法（図３の中、Ｒ² ＝0.9506）及びBactoScan 8000法(図４の中、Ｒ²＝0.969)の両方で優れた相関 関係を示した。これは、本発明の方法の信頼性の証拠であり、例えばミルクサン プル中の、バクテリアの測定のための現在の標準的なプロトコルに代わる迅速、 容易、かつ信頼できるこれらの新しい方法の将来の使用可能性を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ， ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脂肪小球体並びに 体細胞及び／又は蛋白質粒子 を含む初期液体サンプルからコンディショニングされたサンプルを調製するため の方法であって、該方法が、体細胞を溶解して、該体細胞由来の蛋白質粒子及び 体細胞片をデグラデーション及び可溶化し、次に前記初期サンプル中の全てのバ クテリアを染めるように、 イオンキレート化剤、 蛋白質分解酵素、 界面活性剤、及び 細菌学的に特異的な蛍光色素 で前記初期サンプルを処理することを含み、前記界面活性剤が、前記脂肪小球体 の溶解が実質的におこらないであろう最大濃度以下の濃度において用いられ、そ れにより前記初期サンプルと実質的に同量の完全な脂肪小球体を含むが前記初期 サンプルより少い量の完全な体細胞及び完全な蛋白質粒子しか含まない前記コン ディショニングされたサンプルを得ることを特徴とする方法。 ２．前記初期サンプルが、前記界面活性剤、前記キレート化剤、前記酵素、及 び前記蛍光色素で、いずれかの順序で連続的に処理されることを特徴とする請求 項１に記載の方法。 ３．前記初期サンプルが最初に前記キレート化剤で、次に前記酵素で、次に前 記界面活性剤で、そして次に前記蛍光色素で処理されることを特徴とする請求項 １に記載の方法。 ４．前記初期サンプルが、最初に前記キレート化剤及び前記酵素の組合せで、 次に前記界面活性剤で、そして次に前記蛍光色素で処理されることを特徴とする 請求項１に記載の方法。 ５．前記初期サンプルが、最初に前記キレート化剤、前記酵素及び前記界面活 性剤の組合せで、そして次に前記蛍光色素で処理されることを特徴とする請求項 １に記載の方法。 ６．前記初期サンプルが、前記キレート化剤、前記酵素、前記界面活性剤、及 び前記蛍光色素の組合せで処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ７．前記初期サンプルが、少くとも前記酵素での処理において、少くとも 0.5 分間インキュベーションされることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の 方法。 ８．前記インキュベーションの時間が、0.5〜20分間の範囲であることを特徴 とする請求項７に記載の方法。 ９．処理されるべき前記サンプルの温度が、少くとも前記酵素での処理の間、 15〜80℃の範囲であることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 10．処理されるべき前記サンプルのpHが、緩衝液の手段により６〜11の範囲に 維持されることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 11．前記緩衝液が、 リン酸、 ホウ酸ナトリウム／HCl、 グリシン／NaOH、 ホウ酸ナトリウム／NaOH、 バルビタール−Na／HCl、 ピペラジン／HCl、 テトラエチルエチレンジアミン、 トリスマレイン酸、 ジメチルアミノエチルアミン、 トリエタノールアミン／HCl、 Ｎ−ジメチルアミノロイシルグリシン／NaOH、 トリス／HCl、 ２−アミノ−２−メチルプロパン−１，３−ジオール／HCl、及び 炭酸 からなる群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。 12．前記キレート化剤がカルシウムキレート化剤であることを特徴とする先の 請求項のいずれかに記載の方法。 13．前記カルシウムキレート化剤が、EDTA，BAPTA，EGTA，APTRA、及びDTPAか らなる群から選択されることを特徴とする請求項12に記載の方法。 14．イオンキレート化剤の濃度の増加がフローサイトメトリー蛍光測定により 測定された 0.05vol／vol ％のBrij96の存在中ml当り２μｇの濃度におけるエチ ジウムブロミドでのリン酸緩衝液 pH7.4中のシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens ）の染色能の削減を引きおこすであろう前記濃度以下 の濃度において、前記イオンキレート化剤が用いられることを特徴とする先の請 求項のいずれかに記載の方法。 15．前記イオンキレート化剤がリッター当り約２〜５ｇの濃度において用いら れることを特徴とする請求項14に記載の方法。 16．前記蛋白質分解酵素が、1972の国際酵素命名システム（international en zyme nomenclature system）におけるクラス３．４，特にサブクラス３．４．22 ，３．４．24及び３．４．99、並びにサブクラス３．４．21に分類される広い特 異性の酵素から選択されることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法 。 17．前記蛋白質分解酵素が、６〜11のpH範囲において最大活性を有することを 特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 18．前記蛋白質分解酵素がズブチリシンであることを特徴とする請求項15に記 載の方法。 19．前記酵素が少くとも 0.02Anson単位の濃度において用いられることを特徴 とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 20．前記酵素が少くとも 0.05Anson単位の濃度において用いられることを特徴 とする請求項19に記載の方法。 21．前記酵素が約0.05〜0.5Anson単位の濃度において用いられることを特徴と する請求項20に記載の方法。 22．前記酵素が約0.08〜0.15Anson 単位の濃度において用いられることを特徴 とする請求項21に記載の方法。 23．前記界面活性剤が生物学的界面活性剤であることを特徴とする先の請求項 のいずれかに記載の方法。 24．前記界面活性剤が、（ラウリル、オレイル、ステアリル又はトリデシルエ ーテルのような）ポリオキシエチレンエーテルのような非イオン性界面活性剤、 例えばBrij−96，Triton Ｘ100、もしくは Triton Ｘ165；モノラウレート、モ ノオレート（Tween 80）、モノパルミテート、モノステアレート、もしくはトリ オレートのようなポリオキシエチレンソルビタンエステル、好ましくはTween 80 ；又はジギトニンであることを特徴とする請求項23に記載の方法。 25．前記界面活性剤が、0.01〜２容量％の量において用いられることを特徴と する先の請求項のいずれかに記載の方法。 26．前記界面活性剤が、0.03〜0.1 容量％の量において用いられることを特徴 とする請求項25に記載の方法。 27．前記蛍光色素が、DNA／RNA 結合蛍光色素、バクテリア細胞 壁もしくはバクテリア鞭毛に特異的に結合する蛍光色素、並びにバクテリア生存 能染色剤から選択されることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 28．前記蛍光色素が、3.5重量％の脂肪含量を有する均一化されていない完全 なミルクにml当り10μｇの濃度において添加される時、その結果としての５分間 静かに撹拌された混合物が照射ソースとして50ワット水銀ランプを用いるガラス スライド上の蛍光顕微鏡により検出され得る脂肪小球体のいずれの染色も引きお こさない蛍光色素であることを特徴とする請求項27に記載の方法。 29．前記蛍光色素が、エチジウムブロミド又はプロピジウムイオジドのような フェラントリジウム誘導インターカレーターの群に構造的に属することを特徴と する請求項28に記載の方法。 30．前記蛍光色素がエチジウムブロミドであることを特徴とする請求項29に記 載の方法。 31．前記エチジウムブロミドが前記液体サンプルのml当り少くとも 0.1μｇの 濃度において用いられることを特徴とする請求項30に記載の方法。 32．前記エチジウムブロミドが前記液体サンプルのml当り少くとも 0.5μｇの 濃度において用いられることを特徴とする請求項31に記載の方法。 33．前記エチジウムブロミドが、前記サンプルのml当り約1.5 〜10μｇの濃度 において用いられることを特徴とする請求項32に記載の方法。 34．前記初期サンプルが、食物又は飼料製品のサンプル又はこれら由来のサン プルであることを特徴とする先の請求項のいずれかに記載の方法。 35．前記脂肪小球体がミルク脂肪小球体であることを特徴とする 先の請求項のいずれかに記載の方法。 36．前記初期サンプルがミルクサンプルであることを特徴とする請求項35に記 載の方法。 37．請求項１に記載の初期サンプルにおいてバクテリアの数を測定するための 方法であって、該方法が、前記初期サンプルに先の請求項のいずれかに記載の方 法を行い、次にこの得られたコンディショニングされたサンプル又はその一部に 前記蛍光色素を励起させる波長域における光を照射し、発せられた蛍光を測定し 、そして該蛍光を基礎として前記サンプル中のバクテリアの数を測定することを 含むことを特徴とする方法。 38．前記発せられた蛍光を測定する前に前記コンディショニングされたサンプ ル中の脂肪小球体の除去、溶解又は置換が実質的に行われないことを特徴とする 請求項37に記載の方法。 39．前記発せられた蛍光を測定する前に、脂肪小球体及び溶媒が少くとも部分 的に除去及び／又は置換又及び／又は溶解されることを特徴とする請求項37に記 載の方法。 40．前記蛍光色素を励起させる光が、キセノン又は水銀ランプのような広バン ドの光ソースからの光であることを特徴とする請求項37〜39のいずれかに記載の 方法。 41．前記蛍光色素を励起させる光がレーザー光であることを特徴とする請求項 37〜39のいずれかに記載の方法。 42．前記コンディショニングされたサンプル又はその一部がフローサイトメト リーにおいて液体ストリングとして流れている時に、前記蛍光が測定されること を特徴とする請求項37〜41のいずれかに記載の方法。 43．前記サンプルが回転ディスクの外縁部分上のフィルムとして適用される時 に前記蛍光が測定されることを特徴とする請求項37〜 41のいずれかに記載の方法。 44．前記蛍光がエピフルオレセンス顕微鏡により測定されることを特徴とする 請求項37〜41のいずれかに記載の方法。