WO2018097374A1 - 처리수 내 생존생물 분석 방법 - Google Patents

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WO2018097374A1
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treated water
phytoplankton
concentration
protein
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PCT/KR2016/013808
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박규원
김성태
이해돈
이광호
이지현
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(주) 테크로스
재단법인 한국화학융합시험연구원
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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing the survival of a living organism present in the treated water. Specifically, the present invention relates to a method for analyzing the survival of living organisms in treated water such as ballast water.
  • Ballast water is seawater that fills a tank installed in a vessel in order to maintain the center of gravity of the vessel during operation. When the cargo is loaded, the seawater is discarded. When the cargo is unloaded, the seawater is put back in to take the center of gravity of the ship. As the number of international trade increases, the number of ships increases and the size of the ships increases, and the amount of ballast water used for ships also increases. Ships operate in several countries, where ballast water from one country is discharged when entering ports of another country. At this time, the ballast water discharged contains harmful plankton or bacteria, and the ballast water discharge causes the migration and inflow of foreign marine species, resulting in marine pollution such as disturbing indigenous marine ecosystems. It is becoming.
  • Vessel ballast water killing criteria measure biological populations using a variety of standard measurement methods.
  • APHA Standard method 9215 dependent nutritional plate coefficient
  • APHA Standard method 9222 B measured total coliforms in water by membrane filtration
  • APHA Standard method 10200 C concentration method
  • EPA 445.0 1997
  • UNESCO 4 2003 (cell counting) and the like are known.
  • the methods have a problem in that a large amount of time and manpower are required for analysis because the number of cells must be counted directly.
  • ballast water As a method of analyzing organisms present in ballast water, a precision analysis method has been used in which a predetermined amount of ballast water is collected from a pipe from which ballast water is discharged, concentrated through a net, and inspected using a microscope. This precise analysis method requires a considerable time and a lot of manpower for inspection, and there is a problem in that inspection results for ballast water discharged in real time cannot be obtained.
  • Korean Patent No. 10-1551816 discloses a method for analyzing the presence and amount of living organisms in the ballast water by analyzing the ballast water collected by the collecting device using a fluorescence analysis method.
  • ballast water removes living organisms through sterilization before loading on a ship.
  • a sterilization method a method of decomposing organic matter through chemical treatment such as electrolysis, ozone treatment or chemical treatment, and photodegradation of organic matter through physical treatment such as UV irradiation or UV / TiO 2 treatment are known.
  • Sterilized ballast water is stored in ballast tanks in ships for long-term navigation, and organisms that have not been removed during sterilization continue to proliferate while continuing to synthesize proteins inside the tank.
  • an object of the present invention to provide a method for analyzing the survival of organisms in ballast water in a discharge step.
  • an object of the present invention is to provide a method for determining the presence or absence of living organisms in not only ballast water, but also water purification plants, tap water, sterile water used in the laboratory.
  • the above object is to set the killing criteria of zooplankton, phytoplankton and bacteria from the sterilized water, respectively; Irradiating a single wavelength selected in the range of 250 nm to 700 nm to the treated water to be measured and measuring the intensity of emitted light using a fluorescence analyzer; Calculating concentrations of protein, fulvic acid and humic acid, respectively, from the measured light intensities; And determining the presence of at least one of zooplankton, phytoplankton and bacteria by comparing the concentrations of the protein, fulvic acid and humic acid with the killing criteria. Is achieved.
  • the killing criterion of the zooplankton is 10 animal plankton in 1 m 3 of sterilized water, maintained for 24 hours and irradiated with a single wavelength selected from 250 nm to 450 nm and measured by a fluorescence spectrometer.
  • the concentration of protein, fulvic acid and humic acid may be divided by 24, respectively.
  • the phytoplankton killing standard is 100 phytoplankton in 10 ml of sterilized water, and maintained for 24 hours and irradiated with a single wavelength selected from 250 nm to 450 nm and measured by a fluorescence spectrometer.
  • concentration of protein, fulvic acid and humic acid may be divided by 24, respectively.
  • the bacterium killing standard is 100 phytoplankton in 10 ml of sterilized water, maintained for 24 hours, and irradiated with a single wavelength selected from 250 nm to 450 nm and measured by fluorescence spectrometer.
  • the concentration of fulvic acid and humic acid may be divided by 240, respectively.
  • the concentration of the protein of the treated water is higher than the concentration of the fulvic acid or humic acid of the treated water, it is characterized in that it is determined whether the zooplankton is killed compared to the killing criteria of the zooplankton.
  • the concentration of the protein of the treated water is lower than the concentration of fulvic acid or humic acid of the treated water, it is characterized in that the phytoplankton is determined whether or not compared to the phytoplankton killing criteria.
  • the killing of the bacteria may be determined by comparing with the killing standard of the bacteria.
  • the fluorescence spectrometer may include a chamber for holding a sample, a light source for irradiating light to the chamber, a filter for changing the light emitted from the light source to a single wavelength, and a sensor for measuring the intensity of light emitted from the sample.
  • a chamber for holding a sample
  • a light source for irradiating light to the chamber
  • a filter for changing the light emitted from the light source to a single wavelength
  • a sensor for measuring the intensity of light emitted from the sample. have.
  • the method may further include calculating the concentration of chlorophyll-a by measuring absorbance intensity after irradiating light of 620 to 700 nm to the treated water.
  • the treated water is ballast water.
  • FIG. 1 is a flowchart illustrating a method for analyzing organisms present in treated water such as ballast water according to the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of the 3D fluorescence spectrum analysis for ballast water in accordance with an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 schematically shows the configuration of the analysis process and the fluorescence analysis device according to the present invention.
  • the term "about” means 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, by reference quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight, or length. By amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length, varying by 4, 3, 2 or 1%.
  • the treated water may be one selected from the group consisting of ballast water, purified water treatment water, tap water, and sterile water in a laboratory, and more preferably, ballast water.
  • the analysis method comprises the steps of setting the killing criteria of zooplankton and phytoplankton, respectively (S11); Collecting the treated water to be measured, irradiating a single wavelength selected in the range of 250 nm to 700 nm, and measuring the intensity of emitted light using a fluorescence analyzer (S12); Calculating concentrations of protein, fulvic acid and humic acid from the measured light intensity (S13); And comparing the concentrations of the protein, fulvic acid and humic acid with the killing criteria to determine the presence of zooplankton, phytoplankton and bacteria (S14).
  • the concentration of chlorophyll-a (S15) after irradiating light of 620-700 nm to the ballast water to be measured after step S14, measuring the absorbance using a fluorescence analyzer to calculate the concentration of chlorophyll-a (S15). It may further include. This allows a more accurate determination of phytoplankton death.
  • the step of setting the killing criteria of the zooplankton and phytoplankton, respectively (S11).
  • the IMO D-2 standard set by the IMO is less than 10 cells / ml. Table 1 below is based on IMO D-2.
  • Target creature standard Plankton > 50 ⁇ m ⁇ 10 viable cells / m 3 Plankton, 10 ⁇ 50 ⁇ m ⁇ 10 viable cells / ml Toxicogenic Vibrio Cholerae (01 and 0139) ⁇ 1 cfu / 100ml Escherichira coli ⁇ 250 cfu / 100ml intestinal Enterococci ⁇ 100 cfu / 100ml
  • the killing criteria set forth in the present invention start from the IMO D-2 criteria but are set in different ways. Zooplankton, phytoplankton and bacteria are different, respectively, and because of the relatively large zooplankton, the amount emitted is high, the killing criteria may be high.
  • the criteria for killing zooplankton are determined by the following method.
  • the sterilization method may be one method selected from the group consisting of electrolysis treatment, ozone treatment, chemical treatment, UV irradiation, and UV / TiO 2 treatment.
  • the sterilization process kills all plankton and bacteria in the treated water and sterilizes all proteins, fulvic acid and humic acid. 10 animal plaquetones were added to the sterilized water and maintained for 24 hours, followed by stirring and collecting 5 ml.
  • the collected sterilized water is filtered with a filter of 10 ⁇ m or less, and then irradiated with a single wavelength of 275 nm, 330 nm, and 370 nm, respectively, using a fluorescence spectrometer to measure the intensity of the emitted wavelength.
  • concentrations of protein (275 nm), fulvic acid (330 nm), and humic acid (370 nm) are calculated, respectively, and divided by 24 to set the criteria for killing zooplankton.
  • the killing criteria may be determined by measuring this step several times and calculating the average.
  • the criteria for killing phytoplankton are determined by the following method.
  • 10 ml of sterilized treated water is prepared by sterilizing the treated water to be treated, and 10 x 10 phytoplankton are added (based on IMO D-2: 10 / ml).
  • the sterilization treatment is the same as that described above.
  • the mixture was kept for 24 hours, stirred, and 5 ml were collected.
  • the collected treated water is irradiated with a single wavelength of 275 nm, 330 nm, and 370 nm, respectively, using a fluorescence analyzer to measure the intensity of the emitted wavelength. This calculates the concentrations of protein, fulvic acid and humic acid, respectively. Dividing this by 24 sets the phytoplankton killing standard.
  • the killing criteria may be determined by measuring this step several times and calculating the average.
  • plankton Maintaining for 24 hours after the addition of plankton is to give the biosynthesis progress time of plankton.
  • concentration value of protein, fulvic acid, humic acid measured after fluorescence is divided by 24 to determine the death criteria. This is to consider that it takes about 1 hour to measure by using a fluorescence analyzer after sampling the treated water, and is set as a standard assuming the average concentration discharged for 1 hour.
  • Planckton can be biosynthetic more or less in one hour, so it is maintained for 24 hours and divided by 24 to give an average value.
  • the criteria for killing bacteria are as follows.
  • 10 ml of sterilized treated water is prepared by sterilizing the treated water to be treated, and 10 x 10 phytoplankton are added (based on IMO D-2: 10 / ml).
  • the sterilization treatment is the same as that described above.
  • the mixture was kept for 24 hours, stirred, and 5 ml were collected.
  • the collected treated water is irradiated with a single wavelength of 275 nm, 330 nm, and 370 nm, respectively, using a fluorescence analyzer to measure the intensity of the emitted wavelength. This calculates the concentrations of protein, fulvic acid and humic acid, respectively. Divide this by 240 to establish the criteria for killing bacteria.
  • the killing criteria may be determined by measuring this step several times and calculating the average.
  • the fluorescence analyzer used in the present invention comprises a chamber for storing a sample, a light source for irradiating light to the chamber, a filter for converting light emitted from the light source into a single wavelength, and a sensor for measuring the intensity of light emitted from the sample. .
  • the sample is placed in a chamber and the excitation and emission wavelengths are fixed at 250-600 nm and scanning is performed for about 40 minutes.
  • the treated water to be measured is collected, irradiated with a single wavelength selected in the range of 250 nm to 700 nm, and measuring the intensity emitted for each wavelength using the fluorescence analyzer (S12).
  • a single wavelength selected in the range of 250 to 450 nm more preferably 275nm, 330nm, 370nm wavelength can be irradiated in turn.
  • Treated water such as ballast water
  • BWTS ballast water treatment unit
  • the organic matter is decomposed through the sterilization treatment. It is then stored in ballast tanks, where biodegradable organisms, such as zooplankton or phytoplankton, continue to biosynthesize, resulting in the dissolution of many metabolites such as proteins, fulvic acids, and humic acids within the ballast tanks.
  • this step is to store the sterilized ballast water in the ballast tank and to collect before releasing to the sea and to measure the intensity of light emitted for each wavelength using a fluorescence analyzer .
  • the sample collected using the fluorescence analyzer may be irradiated with a wavelength of 250 to 425 nm at 5 nm intervals, and the intensity of the light emitted from the sample may be measured for each wavelength.
  • wavelengths corresponding to proteins, fulvic acids, and humic acids are emitted. Irradiate one wavelength at a time and measure the wavelength emitted.
  • the intensity of the emitted 250 ⁇ 600 nm wavelength by the sensor of the fluorescence spectrometer (about 5 nm step) between 300 ⁇ 400 nm
  • the amount of protein can be measured in intensity.
  • the amount of humic acid may be measured by irradiating 330 nm of light on the sample and the amount of fulvic acid by irradiating 370 nm of light.
  • the intensity of the emitted wavelength is proportional to the amount of living organisms in the sample taken.
  • the amount of metabolites such as proteins, fulvic acid, humic acid present in the treated water (S13).
  • the amount of metabolite is measured by distilled water as a sample, and the amount of protein, fulvic acid, and humic acid can be calculated by converting the difference from the measured light intensity with respect to the treated water. Can be.
  • the treated water collected in this step can be measured after filtering with a filter of about 10 ⁇ m or less, and when measuring phytoplankton can be measured after filtering with a filter of about 50 ⁇ m or less.
  • Filters can be applied selectively.
  • the chlorophyll-a may be measured by applying a 50 ⁇ m filter, and then treated water may be discarded, and the concentration of protein, fulvic acid, and humic acid may be measured by applying a 10 ⁇ m filter.
  • the step of determining the presence of zooplankton, phytoplankton and bacteria by comparing the concentration of the protein, fulvic acid and humic acid with the killing criteria of the zooplankton, phytoplankton and bacteria (S14).
  • the criteria for killing zooplankton, phytoplankton and bacteria may be fluid depending on the sterilization state of the treated water to be measured.
  • the concentration of protein calculated in the sample is higher than the concentration of fulvic acid and humic acid, respectively, it is determined that the amount of zooplankton is superior.
  • the concentration measured in the fluorescence spectrometer is compared with the killing standard of the zooplankton, and if it is low, it is determined that the zooplankton is killed. If the measured concentration is higher than the killing standard, the zooplankton is considered to have survived. In this case, a specialized inspection should be requested to determine the discharge of treated water.
  • the concentration of the protein calculated in the sample is low compared to the concentration of fulvic acid and humic acid, respectively, it is determined that the amount of phytoplankton is superior.
  • the concentration measured in the fluorescence spectrometer is compared with the phytoplankton death criterion, and when it is lower than the phytoplankton determination, it is determined that the phytoplankton is killed. If the measured concentration is higher than the killing standard, the phytoplankton is considered to have survived. In this case, the expert agency should be carefully examined to determine whether the treated water should be discharged again.
  • Figure 2 shows the results of the 3D fluorescence spectrum analysis of the protein, fulvic acid, and humic acid measured by the above method. Referring to FIG. 2, it is shown that the fluorescence spectrum of the treated water is measured based on the predetermined killing criterion, and the biological killing is determined based on the killing criterion.
  • the protein concentration is higher than the concentration of fulvic acid or humic acid, it is determined whether to die according to the killing criteria of zooplankton. If the concentration of the protein, fulvic acid, and humic acid in the ballast water is lower than the killing standard of zooplankton, it is determined as biokilling.
  • the protein concentration is lower than the concentration of fulvic acid or humic acid, it is determined based on the phytoplankton killing standard, and the measured protein, fulvic acid, When the concentration of humic acid is lower than the phytoplankton killing standard, it is determined as biokilling.
  • the phytoplankton individual may be determined to be absent.
  • the absorbance intensity may be measured to calculate the amount of chlorophyll-a (S15).
  • the absorbance intensity measurement may use the above-described fluorescence analyzer.
  • the treated water can be measured after filtration with a 50 ⁇ m filter. This can be used as an aid to increase the accuracy of phytoplankton survival.

Abstract

본 발명은 선박 평형수와 같은 처리수 내에 존재하는 생물의 생존 여부를 분석하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는,살균 처리수로부터 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 사멸 기준을 각각 설정하는 단계; 측정하고자 하는 처리수에 250 nm ~ 700 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치를 이용하여 방출되는 빛의 세기를 측정하는 단계; 상기 측정된 빛의 세기로부터 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 각각 산출하는 단계; 및 상기 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 상기 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아 중 적어도 하나의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 처리수에 존재하는 생물의 생존 여부 분석방법을 제공한다.

Description

처리수 내 생존생물 분석 방법
본 발명은 처리수 내에 존재하는 생물의 생존 여부를 분석하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 선박 평형수와 같은 처리수 내에 존재하는 생물의 생존 여부를 분석하는 방법에 관한 것이다.
선박 평형수(ballast water)는 선박 운항시 선박의 무게중심을 유지하기 위해 선박 내에 설치된 탱크에 채우는 바닷물이다. 화물을 선적하면 싣고 있는 바닷물을 버리고, 화물을 내리면 다시 바닷물을 집어넣어 선박의 무게중심을 잡는다. 국제 교역량이 증가하면서 선박수가 증가하고 대형화가 이루어지고 있어, 선박에 이용하는 선박 평형수의 양도 크게 증가하고 있다. 선박은 여러 국가를 운항하게 되는데, 한 국가에서 채운 선박 평형수를 다른 국가의 항만에 입항 시 배출하게 된다. 이때 배출되는 선박 평형수에는 유해성 플랑크톤이나 박테리아 등이 포함되어 있어, 선박 평형수의 배출로 인해 외래 해양 생물종들의 이동과 유입이 발생하고, 그 결과 토착 해양 생태계를 교란시키는 등 해양 오염을 일으키는 원인이 되고 있다. 이를 막기 위해 유엔 산하 국제해사기구(IMO)는 해양오염을 막기 위해 2004년 ‘국제 선박평형수 관리협약’을 채택하였다. 이에 따르면, 새로 제조되는 선박과 기존 선박은 2014년부터 2020년까지 IMO의 승인을 받은 선박평형수 처리 시설을 의무적으로 설치하도록 했다. 현재 30여 개국이 협약 비준을 마쳤으나, 선주 협회 등에서는 평형수 내 생물체의 분석방법 표준화가 완성되지 않은 상태에서 협약을 비준할 수 없다고 주장하고 있다.
선박 평형수의 생물 사멸 판정 기준(IMO D-2)은 다양한 표준 측정방법으로 생물 개체수를 측정하고 있다. 예를 들면, APHA Standard method 9215(종속영양 평판계수), APHA Standard method 9222 B(막 여과에 의한 수중 총대장균군 측정), APHA Standard method 10200 C(농축기법), EPA 445.0:1997(식물플랑크톤의 생사판별 시 형광을 이용한 해양 식물플랑크톤의 엽록소-a의 결정), UNESCO 4 : 2003(세포 계수) 등의 방법이 알려져 있다. 상기 방법들은 직접 세포 수를 계수해야 하여 분석에 많은 시간과 인력이 소요되는 문제점이 있다.
선박 평형수 내에 존재하는 생물을 분석하는 방법으로는 선박 평형수가 배출되는 배관에서 일정량의 평형수 시료를 채취하고 이를 네트에 걸러 농축한 후 현미경을 이용하여 검사하는 정밀분석방법이 사용되어 오고 있다. 이러한 정밀분석방법은 검사에 상당한 시간 및 많은 인력이 필요하고 실시간으로 배출되는 평형수에 대한 검사결과를 얻을 수 없다는 문제점이 있다.
또 다른 방법으로서, 한국등록특허 제10-1551816호에서는 포집장치에서 채취된 선박평형수를 형광분석법을 이용하여 분석하여 평형수 내의 생존생물의 존부 및 양을 분석하는 방법을 개시하고 있다.
또한, 지표 분석을 위한 다수의 장치가 이미 공지되어 있으나, 측정 방식별로 단일 생물군만 측정하므로 전체적인 미생물의 생존 유무에 대해서는 판별이 되지 않고 정확도가 떨어진다.
일반적으로 선박평형수는 배에 싣기 전에 살균처리를 통해 생존생물을 제거하고 있다. 살균처리 방법으로는 전기분해처리, 오존처리 또는 약품처리와 같은 화학적 처리를 통해 유기물을 분해하는 방법과, UV 조사나, UV/TiO2 처리와 같은 물리적 처리를 통해 유기물을 광분해하는 방법이 알려져 있다. 살균처리된 선박평형수는 선박에 밸러스트 탱크에 보관되어 장기간 항해를 하게 되는데, 살균처리시에 제거되지 않은 생물들이 탱크 내부에서 단백질 합성을 계속하면서 번식하게 된다. 그러나 배출 단계에서 평형수 내에 존재하는 생물의 존부에 대해 실시간으로 정확하게 측정하는 방법에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명은 배출 단계에서 선박 평형수 내에 생물의 생존 여부를 분석하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 선박 평형수뿐만 아니라 정수장, 수돗물, 실험실에서 사용되는 멸균수 등에서 생존 생물의 유무를 판별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 과제는, 살균 처리수로부터 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 사멸 기준을 각각 설정하는 단계; 측정하고자 하는 처리수에 250 nm ~ 700 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치를 이용하여 방출되는 빛의 세기를 측정하는 단계; 상기 측정된 빛의 세기로부터 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 각각 산출하는 단계; 및 상기 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 상기 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아 중 적어도 하나의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 처리수에 존재하는 생물의 생존 여부 분석방법으로 달성된다.
바람직하게는, 상기 동물성 플랑크톤의 사멸 기준은 살균 처리수 1 m3에 동물성 플랑크톤을 10 마리 투입하고, 24시간 유지한 후 250 nm 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치로 측정된 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 각각을 24로 나눈 값일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준은 살균 처리수 10 ml에 식물성 플랑크톤을 100 마리 투입하고, 24시간 유지한 후 250 nm 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치로 측정된 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 각각을 24로 나눈 값일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 박테리아의 사멸 기준은 살균 처리수 10 ml에 식물성 플랑크톤을 100 마리 투입하고, 24시간 유지한 후 250 nm 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치로 측정된 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 각각을 240으로 나눈 값일 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 처리수의 단백질의 농도가 처리수의 풀빅산 또는 휴믹산의 농도보다 높은 경우 상기 동물성 플랑크톤의 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤의 사멸 여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 처리수의 단백질의 농도가 처리수의 풀빅산 또는 휴믹산의 농도보다 낮은 경우 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준과 비교하여 식물성 플랑크톤이 사멸 여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
또한 바람직하게는, 상기 처리수의 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 모두가 식물성 플랑크톤의 사멸 기준보다 낮은 경우 상기 박테리아의 사멸 기준과 비교하여 박테리아의 사멸 여부를 판단하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 형광분석장치는 시료를 담는 챔버, 챔버에 빛을 조사하는 광원, 광원에서 방출되는 빛을 단일 파장으로 변화시키는 필터, 시료에서 방출되는 빛의 세기를 측정하는 센서를 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 처리수에 620~700 nm의 빛을 조사한 후 흡광 강도를 측정하여 클로로필-a의 농도를 산출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는, 상기 처리수는 선박 평형수이다.
본 발명의 방법에 따르면, 선박 평형수와 같은 처리수 내에서 식물성 플랑크톤, 동물성 플랑크톤 및 박테리아의 생존 여부를 동시에 그리고 정확하게 분석할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 선박 평형수와 같은 처리수 내에 존재하는 생물의 분석 방법을 도시한 플로우차트이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 선박 평형수에 대한 3D 형광 스펙트럼 분석 결과를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 분석 공정 및 형광분석장치의 구성을 개략적으로 도시한 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 처리수에 존재하는 생존생물의 분석 방법을 도시한 플로우차트이다. 상기 처리수는 선박 평형수, 정수장 처리수, 수돗물, 실험실의 멸균수로 이루어진 군에서 선택된 1종일 수 있고, 보다 바람직하게는 선박 평형수이다.
상기 분석 방법은 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤의 사멸 기준을 각각 설정하는 단계(S11); 측정하고자 하는 처리수를 채취하고, 250 nm 내지 700 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치를 이용하여 방출되는 빛의 세기를 측정하는 단계(S12); 상기 측정된 빛의 세기로부터 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 각각 산출하는 단계(S13); 및 상기 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 상기 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 존재 여부를 결정하는 단계(S14)를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, S14 단계 이후에 측정 대상 선박 평형수에 620~700 nm의 빛을 조사한 후 형광분석장치를 이용하여 흡광도를 측정하여 클로로필-a의 농도를 산출하는 단계(S15)를 추가로 포함할 수 있다. 이를 통해 식물성 플랑크톤의 사멸 여부를 보다 정확하게 판단할 수 있다.
이하에서는 각 단계를 상세하게 설명한다.
먼저, 동물성 플랑크톤과 식물성 플랑크톤의 사멸 기준을 각각 설정하는 단계(S11)이다. 동물성 및 식물성 플랑크톤에 대하여 IMO에서 정한 IMO D-2 기준은 10 cells/ml 이하이다. 아래 표 1은 IMO D-2 기준이다.
목표 생물 기준
플랑크톤, >50㎛ <10 viable cells/m3
플랑크톤, 10~50㎛ <10 viable cells/ml
Toxicogenic Vibrio Cholerae(01 및 0139) <1 cfu/100ml
Escherichira coli <250 cfu/100ml
intestinal Enterococci <100 cfu/100ml
본 발명에서 정한 사멸 기준은 상기 IMO D-2 기준에서 출발하지만, 상이한 방법으로 설정된다. 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아가 각각 상이하며, 동물성 플랑크톤이 상대적으로 크기 때문에 배출되는 양이 많아 사멸 기준이 높을 수 있다.
동물성 플랑크톤의 사멸 기준은 아래의 방법으로 정한다.
먼저, 처리하고자 하는 처리수를 살균하여 살균 처리수 1 m3를 준비한다. 이때 살균 방법은 전기분해처리, 오존처리, 약품처리, UV 조사나, UV/TiO2 처리로 이루어진 군에서 선택된 1종의 방법일 수 있다. 살균 처리를 통해 처리 수 내의 플랑크톤이나 세균은 모두 사멸되며, 단백질, 풀빅산, 휴믹산이 모두 살균된다. 상기 살균 처리수에 동물성 플라크톤 10마리를 투입하고 24시간 유지한 후, 교반하고 5ml를 채취한다. 채취된 살균 처리수를 10 ㎛ 이하의 필터로 여과한 후, 형광분석장치를 이용하여 각각 275nm, 330nm, 370nm의 단일 파장을 차례로 조사하여 방출되는 파장의 강도를 측정한다. 이를 통해 단백질(275nm), 풀빅산(330nm), 휴믹산(370nm)의 농도를 각각 산출하고, 이를 24로 나누어 동물성 플랑크톤의 사멸 기준으로 설정한다. 바람직하게는 상기 사멸 기준은 본 단계를 수회 반복하여 측정한 후 평균을 산출하여 정할 수 있다.
식물성 플랑크톤의 사멸 기준은 아래의 방법으로 정한다.
처리하고자 하는 처리수를 살균하여 살균 처리수 10ml를 준비하고, 식물성 플랑크톤 10 x 10 마리를 투입한다(IMO D-2 기준: 10 마리/ml). 상기 살균 처리는 상기한 방법과 동일하다. 투입 후 24시간 유지한 후, 교반하고 5ml를 채취한다. 이후 채취된 처리수를 형광분석장치를 이용하여 각각 275nm, 330nm, 370nm의 단일 파장을 각각 조사하여 방출되는 파장의 강도를 측정한다. 이를 통해 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도를 각각 산출하고 이를 24로 나누어 식물성 플랑크톤의 사멸 기준으로 설정한다. 바람직하게는 상기 사멸 기준은 본 단계를 수회 반복하여 측정한 후 평균을 산출하여 정할 수 있다.
상기에서 플랑크톤 투입 후 24시간 동안 유지하는 것은 플랑크톤의 생합성 진행 시간을 부여하는 것이다. 또한, 형광분석 후 측정된 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도값을 24로 나누어 사멸 기준으로 정한다. 이는 처리수를 샘플링한 후, 형광분석기를 이용한 측정까지 약 1시간 정도 소요되는 것을 고려한 것이고, 1시간 동안 배출된 평균 농도를 가정하여 기준으로 설정한 것이다. 플랑크톤은 1시간 동안 생합성을 많이 할 수도 있고 적게 할 수도 있기 때문에 24시간 동안 유지하고 24로 나누어 평균값은 산출한 것이다.
박테리아의 사멸 기준은 다음과 같다.
처리하고자 하는 처리수를 살균하여 살균 처리수 10ml를 준비하고, 식물성 플랑크톤 10 x 10 마리를 투입한다(IMO D-2 기준: 10 마리/ml). 상기 살균 처리는 상기한 방법과 동일하다. 투입 후 24시간 유지한 후, 교반하고 5ml를 채취한다. 이후 채취된 처리수를 형광분석장치를 이용하여 각각 275nm, 330nm, 370nm의 단일 파장을 각각 조사하여 방출되는 파장의 강도를 측정한다. 이를 통해 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도를 각각 산출하고 이를 240로 나누어 박테리아의 사멸 기준으로 설정한다. 바람직하게는 상기 사멸 기준은 본 단계를 수회 반복하여 측정한 후 평균을 산출하여 정할 수 있다.
본 발명에서 사용된 형광분석장치는 시료를 저장하는 챔버, 챔버에 빛을 조사하는 광원, 광원에서 방출되는 빛을 단일 파장으로 변환시키는 필터, 시료에서 방출되는 빛의 세기를 측정하는 센서로 구성된다. 시료를 챔버에 넣고 여기 및 방출 파장을 250~600 nm로 고정하고 약 40분간 스캐닝을 실시한다.
다음으로, 측정하고자 하는 처리수를 채취하고, 250 nm 내지 700 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 상기 형광분석장치를 이용하여 파장별로 방출되는 강도를 측정하는 단계(S12)이다. 바람직하게는 250 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장일 수 있으며, 보다 바람직하게는 275nm, 330nm, 370nm 파장을 차례로 조사할 수 있다.
선박 평형수와 같은 처리수는 선박 평형수 처리 장치(BWTS)에서 전기분해, 오존처리 또는 약품처리와 같은 화학적 처리를 통해 유기물을 분해하거나, UV 조사나, UV/TiO2 처리와 같은 물리적 처리를 통해 유기물을 광분해하여 살균처리를 실시한다. 이후 밸러스트 탱크에 보관되는데, 이때 분해되지 않은 생물, 즉 동물성 플랑크톤이나 식물성 플랑크톤은 계속 생합성을 하기 때문에 밸러스트 탱크 내에서는 단백질, 풀빅산, 휴믹산과 같은 다수의 대사물질이 용존하게 된다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 본 단계는 살균처리된 선박 평형수를 밸러스트 탱크에서 보관한 후 해상으로 방출하기 전에 채취하여 형광분석장치를 이용하여 파장별로 방출되는 빛의 세기를 측정하는 단계이다. 형광분석장치를 이용하여 채취된 시료에 250 내지 425 nm의 파장을 5 nm 간격으로 조사할 수 있고, 시료에서 방출된 빛을 파장별로 강도(intensity)를 측정할 수 있다.
바람직하게는, 275 nm, 330 nm, 및 370 nm 파장의 빛을 시료에 조사하면(excitation) 각각 단백질, 풀빅산, 휴믹산에 해당하는 파장이 방출된다(emission). 한 번에 하나의 파장을 조사하고 방출되는 파장을 측정한다. 본 발명의 일 실시형태에 따르면, 시료에 275 nm의 빛을 조사하고, 방출되는 250 ~ 600 nm 파장의 강도를 형광분석장치의 센서로 각각 분석하면(약 5 nm 단계) 300~400 nm 사이의 강도에서 단백질의 양을 측정할 수 있다. 같은 방법으로 시료에 330 nm의 빛을 조사하여 풀빅산의 양을, 370 nm의 빛을 조사하여 휴믹산의 양을 측정할 수 있다. 방출되는 파장의 강도는 채취된 시료 내에 살아있는 생물의 양과 비례한다.
이 단계에서 측정된 빛의 세기를 이용하여, 처리수 내에 존재하는 단백질, 풀빅산, 휴믹산과 같은 대사 물질의 양을 산출할 수 있다(S13). 대사물질의 양의 산출은 증류수를 시료로 측정하여 방출된 빛의 세기를 기준점으로 하고, 처리수에 대해 측정된 빛의 세기와의 차이를 환산하여 각각 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 양을 산출할 수 있다.
본 단계에서 채취된 처리수, 바람직하게는 선박 평형수는 약 10 ㎛ 이하의 필터로 거른 후 측정할 수 있고, 식물성 플랑크톤을 측정하는 경우에는 약 50 ㎛ 이하의 필터로 거른 후 측정할 수 있다. 필터는 선택적으로 적용할 수 있다. 예를 들면, 50 ㎛ 필터를 적용하여 클로로필-a를 측정한 후 처리수를 버리고 10 ㎛ 필터를 적용하여 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도를 측정할 수 있다.
다음으로, 상기 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 상기 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 존재 여부를 결정하는 단계(S14)이다. 상기한 바와 같이 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 사멸 기준은 측정하고자 하는 처리수의 살균 상태에 따라서 유동적일 수 있다.
상기에서 시료에서 산출된 단백질의 농도가 풀빅산 및 휴믹산의 농도와 각각 대비하여 높은 경우 동물성 플랑크톤의 양이 우세한 것으로 판단한다. 이 경우 형광분석장치에서 측정된 농도를 상기 동물성 플랑크톤의 사멸 기준과 비교하고 낮은 경우 동물성 플랑크톤이 사멸된 것으로 판단한다. 만일 측정된 농도가 사멸기준보다 높은 경우에는 동물성 플랑크톤이 생존한 것으로 판단되며, 이 경우 전문기관에 정밀한 검사를 의뢰하여 처리수의 배출 여부를 다시 결정해야 한다.
또한, 상기에서 시료에서 산출된 단백질의 농도가 풀빅산 및 휴믹산의 농도와 각각 대비하여 낮은 경우 식물성 플랑크톤의 양이 우세한 것으로 판단한다. 이 경우 형광분석장치에서 측정된 농도를 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준과 비교하고, 사멸 기준보다 낮은 경우 식물성 플랑크톤이 사멸된 것으로 판단한다. 만일 측정된 농도가 사멸기준보다 높은 경우에는 식물성 플랑크톤이 생존한 것으로 판단되며, 이 경우 전문기관에게 정밀한 검사를 의뢰하여 처리수의 배출 여부를 다시 결정해야 한다.
도 2는 상기한 방법으로 측정된 단백질, 풀빅산, 및 휴믹산의 3D 형광 스펙트럼 분석 결과를 도시한 것이다. 도 2를 보면, 상기 미리 설정한 사멸 기준을 중심으로 처리수의 형광 스펙트럼을 측정하고 사멸 기준을 중심으로 생물 사멸 여부를 판단하는 것을 보여준다.
측정하고자 하는 처리수에 대해 250 nm ~ 700 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석을 실시한 후, 단백질 농도가 풀빅산이나 휴믹산의 농도보다 높으면 상기한 동물성 플랑크톤의 사멸 기준에 따라 사멸 여부를 판별하고, 측정된 선박평형수의 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도가 동물성 플랑크톤의 사멸 기준보다 낮으면 생물사멸로 판단한다.
또한, 측정하고자 하는 선박평형수에 대해 형광분석을 실시한 후, 단백질 농도가 풀빅산이나 휴믹산의 농도보다 낮으면 상기한 식물성 플랑크톤의 사멸 기준으로 판별하고, 측정된 선박평형수의 단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도가 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준보다 낮으면 생물사멸로 판단하다.
단백질, 풀빅산, 휴믹산의 농도 각각이 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준과 대비하여 1/10 이상 낮으면 식물성 플랑크톤 개체가 존재하지 않는 것으로 판단할 수 있기 때문에, 박테리아 기준으로 분석한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, S14 단계 이후에 추가로 620 nm 내지 700 nm의 빛을 조사한 후 흡광 강도를 측정하여 클로로필-a의 양을 산출할 수도 있다(S15). 상기 흡광 강도 측정은 상기한 형광분석장치를 이용할 수 있다. 클로로필-a의 양을 산출하는 경우 처리수를 50 ㎛ 필터로 여과한 후, 측정할 수 있다. 이를 통해 식물성 플랑크톤의 생존 여부에 대한 정확성을 높이는 보조자료로 사용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 살균 처리수로부터 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아의 사멸 기준을 각각 설정하는 단계;
    측정하고자 하는 처리수에 250 nm ~ 700 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치를 이용하여 방출되는 빛의 세기를 측정하는 단계;
    상기 측정된 빛의 세기로부터 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 각각 산출하는 단계; 및
    상기 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도를 상기 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤, 식물성 플랑크톤 및 박테리아 중 적어도 하나의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 처리수에 존재하는 생물의 생존 여부 분석방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 동물성 플랑크톤의 사멸 기준은 살균 처리수 1 m3에 동물성 플랑크톤을 10 마리 투입하고, 24시간 유지한 후 250 nm 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치로 측정된 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 각각을 24로 나눈 값인 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준은 살균 처리수 10 ml에 식물성 플랑크톤을 100 마리 투입하고, 24시간 유지한 후 250 nm 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치로 측정된 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 각각을 24로 나눈 값인 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 박테리아의 사멸 기준은 살균 처리수 10 ml에 식물성 플랑크톤을 100 마리 투입하고, 24시간 유지한 후 250 nm 내지 450 nm 범위에서 선택된 단일 파장을 조사하고 형광분석장치로 측정된 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 각각을 240으로 나눈 값인 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 처리수의 단백질의 농도가 처리수의 풀빅산 또는 휴믹산의 농도보다 높은 경우 상기 동물성 플랑크톤의 사멸 기준과 비교하여 동물성 플랑크톤의 사멸 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 처리수의 단백질의 농도가 처리수의 풀빅산 또는 휴믹산의 농도보다 낮은 경우 상기 식물성 플랑크톤의 사멸 기준과 비교하여 식물성 플랑크톤이 사멸 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 처리수의 단백질, 풀빅산 및 휴믹산의 농도 모두가 식물성 플랑크톤의 사멸 기준보다 낮은 경우 상기 박테리아의 사멸 기준과 비교하여 박테리아의 사멸 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 형광분석장치는 시료를 담는 챔버, 챔버에 빛을 조사하는 광원, 광원에서 방출되는 빛을 단일 파장으로 변화시키는 필터, 시료에서 방출되는 빛의 세기를 측정하는 센서를 포함하는 것을 특징으로 하는, 분석방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 처리수에 620~700 nm의 빛을 조사한 후 흡광 강도를 측정하여 클로로필-a의 농도를 산출하는 단계를 추가로 포함하는, 분석방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리수는 선박 평형수인, 분석방법.
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