CN100585394C - 食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 - Google Patents

食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明的优点在于：可同时检测食品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。

Description

食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法
技术领域
本发明涉及一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法。
背景技术
目前，国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法，尚不够完善，每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌，而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此，几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂，耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面，FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序，检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列，而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌，PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例，拟态弧菌、至今仍未见到过。
除了常见的霍乱弧菌和副溶血弧菌外，许多国家已开始关注其它致病性弧菌在食物中的存在。目前，由于在水产品检测中经常是一份样品同时检测几种致病性弧菌，因此，有必要研究一种方法，可同时检测多个致病性弧菌。这样，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本，以适应加入WTO后的新的形势需求，与国际方法接轨。
发明内容
本发明提供了一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其优点在于：可同时检测以上三种致病性弧菌，在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，最后用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，采用霍乱弧菌的胶原酶基因(vcc，AE004243)、拟态弧菌的溶血素基因(vmh，VMU68271)和副溶血弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh)为一组检测霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌(三重PCR)，检测出霍乱弧菌后再以vcc、霍乱肠毒素基因(ctx，AF516349)为一组确定霍乱弧菌是否具有霍乱肠毒素基因(V.c二重PCR)。其优点在于：可同时检测以上三种致病性弧菌，可以在不影响检出率的条件下加快检测速度，减少工作量和检测成本。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的引物序列表图。
图3为本发明的V.c、V.m和V.p三重PCR检测结果示意图。
图4为本发明的V.c.的二重PCR检测结果示意图。
图5为本发明两份实施例的PCR检测结果图。
其中，图3中，1：从上到下三个条带依次为：副溶血弧菌产生的450bp的条带、拟态弧菌产生的243bp的条带和霍乱弧菌产生的155bp的条带；2：霍乱弧菌产生的155bp的条带；3：拟态弧菌产生的243bp的条带；4：副溶血弧菌产生的450bp的条带；5：阴性对照；6：Marker(100bp-1000bp)。
图4中，1：非O1/非O139群霍乱弧菌产生的155bp的条带；2：从上到下依次为O1/O139群霍乱弧菌产生的708bp的条带和155bp的条带；3：溶藻弧菌没有产生条带；4：阴性对照；5：Marker(100bp-1000bp)。
图5中，1：第一份甲鱼蛋，2：第二份甲鱼蛋，3：第三份甲鱼蛋，4：第四份甲鱼蛋，5：第一份墨鱼，6：第二份墨鱼，7：第三份墨鱼，8：霍乱弧菌、拟态弧菌和副溶血弧菌，9：阴性对照，10：100bp Marker。
具体实施方式
本发明所提供的食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：待检测的样品经二次增菌后，采用水煮法提取弧菌基因组DNA，然后经PCR反应后，再经电泳、染色、漂洗，接着用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果。
所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为：在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有9倍量的3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，在37℃±3℃条件下培养4h～15h。
所述的水煮法提取弧菌基因组DNA，其操作步骤为：取培养的菌液加入离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用。
所述的PCR反应为先做三重PCR反应，检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应。其中，三重PCR反应反应体系为：H2O：12.3μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，引物Pn：(0.4*6)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl，所述的V.c二重PCR反应，其反应体系为：H2O：12.5μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，Pvcc：(0.4*2)μl，Pctx：(0.7*2)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl。PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min。
所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为：PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min。
所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的存在。
以下结合具体实施例子说明：
实施例一：墨鱼的检测
1.无菌操作，取25g面包虾样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。
6.加样，做PCR
7.取10μlPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析谱图：
实施例二：甲鱼蛋的检测
1.无菌操作，取25g文蛤样品，充分剪碎，加入盛有225ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，37℃±1℃条件下培养4h～15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min，弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀，100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min，取上清作为DNA模板，-20℃备用。
6.加样，做PCR
7.取10μlPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析谱图：
针对上述两个实施例的谱图分析：根据图5可见，在四份甲鱼蛋中，只有第三份产生了155bp的特征条带，说明第三份含霍乱弧菌，三份墨鱼全部产生了450bp的特征条带，说明三份墨鱼中全部含有副溶血弧菌。

Claims (1)

1.一种食品中霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的PCR检测方法，其特征在于：其检测步骤为：
(1)检测的样品经二次增菌：所述的二次增菌，包括第一次增菌和第二次增菌，所述的第一次增菌，其操作步骤为：在无菌条件下，取充分剪碎的样品，加入盛有3％的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内，所述样品与碱性蛋白胨水的用量为：每25克样品加入225ml的碱性蛋白胨水，在37℃±3℃条件下培养4h～15h，所述的第二次增菌，其操作步骤为：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3％NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内，所述增菌液与碱性蛋白胨水的用量为：每1ml增菌液加入9ml的碱性蛋白胨水，在37℃±3℃条件下培养4h～15h；
(2)水煮法提取弧菌基因组DNA：吸取1.5ml培养的菌液，加入1.5ml离心管中，以13000rpm离心1min，弃上清液，然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀，振荡混匀后，96-100℃水浴10min，12000rpm离心5min，取上清液作为DNA模板，-20℃环境下储存备用；
(3)PCR反应：所述的PCR反应为先做三重PCR反应，检出霍乱弧菌后再做V.c二重PCR反应：所述的三重PCR反应，其反应体系为：H2O：12.3μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，引物Pn：(0.4*6)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl，所述的V.c二重PCR反应，其反应体系为：H2O：12.5μl，Buffer：2.6μl，dNTP：0.5μl，Pvcc：(0.4*2)μl，Pctx：(0.7*2)μl，Taq酶：0.2μl，模板DNA：2.0μl，总体积为20μl；所述的PCR反应循环参数为：94℃预变性3min；然后94℃变性1min，60℃退火1min，72℃复性1min循环35次，最后72℃延伸7min；
(4)电泳：所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳，其操作步骤为：PCR反应结束后以98V电压2.5％凝胶电泳90min；
(5)染色：所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min；
(6)漂洗；
(7)用凝胶成像仪观察结果并拍照，最后经过谱图分析即可得出检测结果，所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照，对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现，即可判别被检测对象中是否有霍乱弧菌、副溶血弧菌和拟态弧菌的存在。
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