CN1967236A - 食品中河弧菌的pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,接着用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。本发明所提供的食品中河弧菌的PCR检测方法,采用河弧菌的溶血素基因(AF348455)为目的基因检测河弧菌,其优点在于:在不影响检出率的条件下,较以往传统检测方法的检测速度更快,而且减少了工作量和检测成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种食品中河弧菌的PCR检测方法。
背景技术
目前,国内关于致病性弧菌的检测方法还是传统的微生物学检测方法,尚不够完善,每种检测方法仅能检测一种致病性弧菌,而国外的传统微生物学检测方法(如FDA、AOAO、ISO等)也是以单一或少数目标菌为目的设计的程序。因此,几乎每检测一种致病性弧菌都需配制不同的培养基和试剂,耗时又耗力。在分子生物学检测方法方面,FDA2004标准仍是以检测一种致病性弧菌为目的设计PCR程序,检测不同的弧菌需要不同的反应条件。国内的检测人员设计PCR检测方法时也是以毒力基因为待扩增序列,而且关注的大都是O1型和O139型霍乱弧菌与副溶血弧菌,PCR方法检测创伤弧菌的报道只有2000年有过1例,拟态弧菌、溶藻弧菌和河弧菌至今仍未见到过。
发明内容
本发明提供了一种食品中河弧菌的PCR检测方法,在不影响检出率的条件下,较以往传统检测方法的检测速度更快,而且减少了工作量和检测成本。
本发明所提供的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,最后用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。
本发明所提供的食品中河弧菌的PCR检测方法,采用河弧菌的溶血素基因(AF348455)为目的基因检测河弧菌,其优点在于:在不影响检出率的条件下,较以往传统检测方法的检测速度更快,而且减少了工作量和检测成本。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的引物序列表图。
图3为本发明的V.fl PCR检测结果示意图。
图4为本发明实施例的V.fl PCR检测结果图。
其中,图3中,1:Marker(100bp-1000bp);2-5:河弧菌产生的446bp的条带;6:少于10cfu/ml的河弧菌没有产生条带;7-8:无河弧菌;9:阴性对照。
图4中,1:100bp Marker,2:河弧菌,3、4:面包虾,5、6:文蛤,7:阴性对照。
具体实施方式
本发明所提供的一种食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,接着用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。
所述的二次增菌,包括第一次增菌和第二次增菌,所述的第一次增菌,其操作步骤为:在无菌条件下,取充分剪碎的样品,加入盛有9倍量的3%的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h,所述的第二次增菌,其操作步骤为:吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h。
所述的水煮法提取弧菌基因组DNA,其操作步骤为:取培养的菌液加入离心管中,以13000rpm离心1min,弃上清液,然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀后,96-100℃水浴10min,12000rpm离心5min,取上清液作为DNA模板,-20℃环境下储存备用。
所述的PCR反应,其反应体系为:H2O:14.6μl,Buffer:2.0μl,DNTP:0.4μl,P:(0.4*2)μl,Taq酶:0.2μl,模板DNA:2.0μl,总体积为20μl。其反应循环参数为:94℃预变性3min;然后94℃变性1min,60℃退火1min,72℃复性1min循环35次,最后72℃延伸7min。
所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳,其操作步骤为:PCR反应结束后以98V电压2.5%凝胶电泳90min。
所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照,对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现,即可判别被检测对象中是否有河弧菌的存在。
以下结合具体实施例子说明:
实施例一:面包虾的检测
1.无菌操作,取25g面包虾样品,充分剪碎,加入盛有225ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液,加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min,弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀,100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min,取上清作为DNA模板,-20℃备用。
6.加样,做PCR
7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min,漂洗,拍照。
9.分析谱图:
实施例二:文蛤的检测
1.无菌操作,取25g文蛤样品,充分剪碎,加入盛有225ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌容器内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
2.吸取1ml增菌液加入盛有9ml 3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,37℃±1℃条件下培养4h~15h。
3.移液枪吸取1.5ml培养的菌液,加入1.5ml离心管中13000rpm离心1min,弃上清。
4.加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀,100℃水浴10min。
5.12000rpm离心5min,取上清作为DNA模板,-20℃备用。
6.加样,做PCR
7.取10μl PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。
8.EB染色20min,漂洗,拍照。
9.分析谱图:
针对上述两个实施例的谱图分析:根据图4可见,四份样品均无河弧菌的特征条带出现,由此可见,四份样品全部不含河弧菌。
Claims (8)
1.一种食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:其检测步骤为:待检测的样品经二次增菌后,采用水煮法提取弧菌基因组DNA,然后经PCR反应后,再经电泳、染色、漂洗,接着用凝胶成像仪观察结果并拍照,最后经过谱图分析即可得出检测结果。
2.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的二次增菌,包括第一次增菌和第二次增菌,所述的第一次增菌,其操作步骤为:在无菌条件下,取充分剪碎的样品,加入盛有9倍量的3%的NaCl碱性蛋白胨水的灭菌容器内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h,所述的第二次增菌,其操作步骤为:吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3%NaCl碱性蛋白胨水(APW)的灭菌试管内,在37℃±3℃条件下培养4h~15h。
3.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的水煮法提取弧菌基因组DNA,其操作步骤为:取培养的菌液加入离心管中,以13000rpm离心1min,弃上清液,然后加入0.6ml无菌去离子水悬浮沉淀,振荡混匀后,96-100℃水浴10min,12000rpm离心5min,取上清液作为DNA模板,-20℃环境下储存备用。
4.根据权利要求4所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的PCR反应,其反应体系为:H2O:14.6μl,Buffer:2.0μl,DNTP:0.4μl,P:(0.4*2)μl,Taq酶:0.2μl,模板DNA:2.0μl,总体积为20μl。
5.根据权利要求4所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的PCR反应循环参数为:94℃预变性3min;然后94℃变性1min,60℃退火1min,72℃复性1min循环35次,最后72℃延伸7min。
6.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的电泳为琼脂糖凝胶电泳,其操作步骤为:PCR反应结束后以98V电压2.5%凝胶电泳90min。
7.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的染色为在溴化乙锭溶液中染色20min。
8.根据权利要求1所述的食品中河弧菌的PCR检测方法,其特征在于:所述的谱图分析包括阳性对照和阴性对照,对于谱图中是否有相应特征位置条带的出现,即可判别被检测对象中是否有河弧菌的存在。
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CN101824447A (zh) * | 2009-03-02 | 2010-09-08 | 中国水产科学研究院东海水产研究所 | 一种提取赤潮甲藻核酸的方法 |
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