CN101824447A - 一种提取赤潮甲藻核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提取赤潮甲藻核酸的方法，涉及赤潮生物核酸提取方法，需要建立一种提取赤潮甲藻核酸的方法，本发明采取藻液，并进行显微镜计数，其特征是取10mL藻液于50mL离心管中，置于100℃沸水浴中，然后分别在不同煮沸时间取样，然后进行显微镜细胞计数，计算破碎率，同时以灭过菌的去离子水做空白对照，检测核酸浓度；算出每毫升藻液中煮沸破碎前数目(N0)和破碎后的数目(N1)，计算破碎率；扩增塔玛亚历山大藻和环状异帽藻ITS序列，取5uL扩增混合物用琼脂糖电泳检验，得到扩增片段，回收该扩增片段并测序、比对后确认扩增序列为目的序列即获得的微藻核酸。本发明用于微藻核酸分子生物学实验。

Description

一种提取赤潮甲藻核酸的方法
技术领域
本发明涉及赤潮生物核酸提取方法。
背景技术
近年来，赤潮已成为沿海地区的重要环境问题，随着河口、内湾和沿岸水域污染不断加剧，水体富营养化程度日趋严重，赤潮发生的频率和危害程度明显上升。赤潮生物种类的识别与鉴定是赤潮预报预测及其防治的关键。传统鉴定方法主要以形态学特征为基础，即海水样品采集后利用光学或电子显微镜直接观察，毒性试验等。这些方法操作费时费力，非专业人员无法完成鉴定工作，而且有些微藻在不同的环境中形态变化很大，因而难以做出准确鉴定。因此如何利用先进的分子生物学技术找到种间界定的稳定指标，进而建立快速、准确的鉴定和定量检测方法，已成为浮游植物生态学研究的热点之一，也是海洋水质检测特别是实现赤潮监测和预警亟待解决的问题。
目前用于赤潮藻类鉴定的方法主要有荧光原位杂交技术(张宝玉，2005)、三明治杂交技术(Scholin etal，1999)、双特异探针技术(甄毓，2006)、实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)技术(张宝玉，2005)等。这些方法都需要进行微藻核酸的制备。CTAB法常用来提取微藻核酸，这种方法虽然能得到较高纯度的核酸，但是过程繁琐、时间长、成本高、得率低。陈颖等(2001)利用纤维素酶法、改进的CTAB法、超声波处理法三种方法对小球藻进行过核酸提取，纤维素酶和CTAB法步骤较复杂，而超声波穿透能力较大，能破坏细胞的完整性，使细胞内的活性组分渗透到胞外，以提高有效成分的提出率(王雪青等，2007)，但对于分子量较大的核酸可能损伤较大。陈伟平等(2008)利用溶胀法、反复冻融法、低浓度氯化钙法和玻璃珠处理法对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻进行细胞破碎，均获得较高纯度的藻红蛋白。目前还未见利用煮沸法提取赤潮微藻核酸的报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是利用煮沸法建立了一种简单稳定提取赤潮甲藻核酸的方法。
本发明的技术方案采取藻液，并进行显微镜计数，其特征是取10mL待处理藻液于50mL离心管中，置于100℃沸水浴中，然后分别在不同煮沸时间10min，30min，60min，90min取样，然后进行显微镜细胞计数，计算破碎率，同时以灭过菌的去离子水做空白对照，检测核酸浓度；显微镜下用血球计数板计数，算出每毫升藻液中煮沸破碎前数目(N0)和破碎后的数目(N1)，按下式计算破碎率：破碎率＝(N0-N1)/N0×100％；以不同时间煮沸获得的藻细胞液为模板，扩增塔玛亚历山大藻和环状异帽藻ITS序列，PCR引物的序列为：LH2：5’-AGGTGAACCTGCGGAAGGATC-3’和Diam：5’-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3’，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，塔玛亚历山大藻55℃退火45s，环状异帽藻58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min，取5uL扩增混合物用琼脂糖电泳检验，得到了预期的扩增片段，回收该扩增片段并测序，序列比对后确认扩增序列为目的序列即提取的核酸满足于分子生物学实验。
本发明利用简单设备水浴锅对赤潮有毒甲藻塔玛亚历山大藻和环状异帽藻进行不同时间煮沸，破碎其细胞，提取了核酸，以不同时间提取的核酸为模板进行PCR验证，结果都能够得到稳定的扩增条带，经序列测定，比对后所扩片段是目的基因片段，说明本发明方法提取的核酸模板适合于微藻分子生物学实验。
附图说明
图1表示不同煮沸时间处理下微藻核酸浓度变化。
具体实施方式
本发明实施方式依照下述具体步骤进行：
(1)取一定体积的生长到对数期的藻液，离心收集细胞，然后再用PBS(PH 7.0)缓冲液洗涤两次后重悬，制成一定密度的待处理藻液，并进行显微镜计数。
(2)取10mL待处理藻液于50mL离心管中，置于100℃沸水浴中，然后分别在不同煮沸时间(10min，30min，60min，90min)取样，然后进行显微镜细胞计数，计算破碎率。同时以灭过菌的去离子水做空白对照，检测核酸浓度。
(3)显微镜下用血球计数板计数，算出每毫升藻液中煮沸破碎前数目(N0)和破碎后的数目(N1)，然后按下式计算破碎率：
破碎率＝(N0-N1)/N0×100％。
随着煮沸时间的延长，塔玛亚历山大藻破碎率增加幅度较小，而环状异帽藻破碎率增加明显，至90min两种微藻破碎率均能达50％以上，见表1。
表1不同煮沸时间处理下微藻细胞破碎率(％)的比较
Figure B2009100468773D0000041
塔玛亚历山大藻和环状异帽藻随着煮沸时间的增加核酸浓度基本呈上升趋势，见附图1。
(4)核酸质量的PCR验证。以不同时间煮沸获得的藻细胞液为模板，扩增塔玛亚历山大藻和环状异帽藻ITS序列。
PCR引物采用的序列为：LH2：5’-AGGTGAACCTGCGGAAGGATC-3，和Diam：5’-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3’。
扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，塔玛亚历山大藻55℃退火45s，环状异帽藻58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min。取5uL扩增混合物用琼脂糖电泳检验，得到了预期的扩增片段，回收该扩增片段并测序，序列比对后确认扩增序列为目的序列，说明获得的微藻核酸满足于分子生物学实验。

Claims (1)

1.一种提取赤潮甲藻核酸的方法，采取藻液，并进行显微镜计数，其特征是取10mL藻液于50mL离心管中，置于100℃沸水浴中，然后分别在不同煮沸时间10min，30min，60min，90min取样，然后进行显微镜细胞计数，计算破碎率，同时以灭过菌的去离子水做空白对照，检测核酸浓度；显微镜下用血球计数板计数，算出每毫升藻液中煮沸破碎前数目(N0)和破碎后的数目(N1)，按下式计算破碎率：破碎率＝(N0-N1)/N0×100％；以不同时间煮沸获得的藻细胞液为模板，扩增塔玛亚历山大藻和环状异帽藻ITS序列，PCR引物序列为：LH2：5’-AGGTGAACCTGCGGAAGGATC-3’和Diam：5’-CCTGCAGTCGACAKATGCTTAARTTCAGCRGG-3’，扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，塔玛亚历山大藻55℃退火45s，环状异帽藻58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸7min，取5uL扩增混合物用琼脂糖电泳检验，得到了预期的扩增片段，回收该扩增片段并测序，序列比对后确认扩增序列为目的序列即提取的核酸适合于分子生物学实验。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1308130A (zh) * 2000-12-26 2001-08-15 李永武 从微生物细胞中制取核酸的方法
CN1562297A (zh) * 2004-03-31 2005-01-12 北京师范大学 一种治疗血管性痴呆的中药组合物及其制备方法
CN1967236A (zh) * 2006-08-26 2007-05-23 福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心 食品中河弧菌的pcr检测方法

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