CN102392077B - 一种检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的引物序列及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的引物序列及方法，属于分子生物学领域，包括：(1)提取待测水样中产毒铜绿微囊藻细胞的DNA，以提取的DNA为模板，用本发明公开的引物序列进行定量PCR扩增并记录下达到荧光阈值时的循环数；(2)将步骤(1)中得到的荧光强度参照定量PCR测定产毒铜绿微囊藻细胞浓度的标准曲线得到待测水样中产毒铜绿微囊藻细胞的浓度。本发明的引物特异性高，能够迅速，精确的检测处水体中产毒铜绿微囊藻细胞的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的引物序列及方法。
背景技术
虽然近些年来蓝藻问题一直存在，但并未引起公众的重视，2007年无锡太湖区域蓝藻大面积爆发给人们敲响了警钟，也使人们开始意识到蓝藻毒素问题的严重性。蓝藻包括一系列不同的光化学合成细菌，这些细菌具有合成叶绿素a，藻胆素蛋白，藻蓝蛋白和藻红蛋白的能力。在一些水体中的蓝藻细菌还能合成对多数真核生物体有很大毒性的成次生代谢产物。这些释放的毒素进入娱乐和生活饮用水中对公众健康和环境造成了很大的威胁。
蓝藻毒素根据其病理，可分为4种类型，包括肝毒素、神经毒素、皮疹毒素和细胞毒素等，按产毒蓝藻的种类可分为微囊藻毒素、鱼腥藻毒素、束丝藻毒素。在已发现的各种不同藻毒素中，微囊藻毒是目前已知的一在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素种类。目前，为了保障人民的身体健康，国家标准委和卫生部在新颁布的《生活饮用水标准》中，将微囊藻毒素的限值定为每升1微克，与世界卫生组织完全相同。但是，如何有效监测是目前执行这个标准所面临的最大问题。
传统的测定水中铜绿微囊藻浓度的方法如显微镜计数法，存在费时费力、样品保存时间短、很难对藻类进行分类以及无法区别产毒铜绿微囊藻和不产毒铜绿微囊藻等不足；近年来一些检测微囊藻毒素的方法比如高效液相色谱法、蛋白磷酸酶抑制实验和酶联免疫吸附法发展迅速，但是仍存在着或多或少的问题，特别是在样品的前处理时间和需要采集样品的量上，样品前处理时间比较长，需要采集的量较大。
定性PCR技术是1985年由美国的莫里森发明的，并获得了1993年的诺贝尔化学奖。PCR技术以其简便、快速、灵敏、特异的特点，受到了分子生物学家的普遍重视。基本的PCR技术原理是在高温DNA多聚酶、模板DNA、引物、Mg2+、dNTP存在及特定离子强度下，通过高温解链、低温模板引物复性、中温延伸反应，如此循环30-40次，从低拷贝模板获得高拷贝产物的过程。
实时荧光定量PCR技术(Real-Time Quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在实时荧光定量PCR反应中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。
CT值表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值。因此，只要获得未知样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
传统的定量PCR绝对定量方法要求先制作重组质粒标准品，将提取出来的含有目标片段基因的重组质粒DNA进行梯度稀释作为待测样品的参照，据此检测得到的数据受标准品的纯度和DNA提取效率影响较大。
发明内容
本发明提供了一种检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的引物序列及方法，避免了DNA提取效率的误差，实现了精确定量。
一种检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：
正向引物：TATCATCTAGCCATTCTCGCATCT；
反向引物：AAATTTACAGCCAAACATCGG。
一种用所述的引物序列检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的方法，包括：
(1)提取待测水样中产毒铜绿微囊藻细胞的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录下达到荧光阈值时的循环数；
(2)将步骤(1)中得到的荧光强度参照定量PCR测定产毒铜绿微囊藻细胞浓度的标准曲线得到待测水样中产毒铜绿微囊藻细胞的浓度。
步骤(2)中所述标准曲线的标准品为从已知浓度梯度的产毒铜绿微囊藻细胞重提取的DNA。
所述的定量PCR反应体系为：1.5ul DNA溶液，5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0.25ul的10mM浓度的正反引物对，2.8ul的DEPC水一般的定量PCR反应体系，小体积很容易造成PCR反应孔壁上残留与蒸发反应液，导致反应体系间试剂浓度变异，所以一般定量PCR推荐反应液体积为20-50ul。本发明中对于反应孔壁上残留液，通过离心以及添加ROX校准染料克服移液误差；通过将反应板架空在冰盒子中加样以及使用ABI公司原装96孔板热封膜封口来较少蒸发对反应结果的影响，将反应体系减少为10ul，定量PCR的反应液相对较贵，这就造成实验成本过高，影响检测方法投入实际应用，采用小体积的反应体系做定量PCR大大降低的实验体系能大大减小实验成本，使高通量检测成为可能。
所述的提取DNA的方法为：用DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取，采用该方法提取DNA具有以下优点：(1)、节约时间只需要2-3个小时即可提取到样品的DNA，与传统的有机溶剂抽提法所需要的一天甚至二天比起来大大减少了预处理的时间；(2)DNA提取过程中基本不发生降解；(3)DNA提取效率稳定，提取结果具有很好的重复性；(4)与反复的有机溶剂抽提相比避免了与有毒物质的直接接触，保障了实验操作人员的工作环境。
本发明的有益效果：
(1)已知浓度的藻细胞梯度稀释，然后分别提取各个梯度稀释藻细胞的DNA将其作为标准品，这就避免了DNA提取效率的误差，实现了精确定量；
(2)可以精确区分各类藻，并且样品可以保存半年甚至多年，有利于将各个季节的样品进行对比分析；
(3)优化了定量PCR实验的反应液体系，只需要10ul混合反应液，而一般实验需要20ul甚至更多的反应液才能得出准确的数据，大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能；
(4)采集低至0.1ml水样就可以进行实验检测，当需要采集很多不同样品时，采样量低更方便快捷，携带及后处理更方便。
具体实施方式
DNeasy Blood & Tissue Kit试剂盒提取DNA的步骤如下：
1)将100ul水样吸入1.5ml的离心管中，加入180ul ATL缓冲液和20ul蛋白酶K，震荡混匀，然后将离心管放入设置恒温56℃的摇床中震荡1个半小时；
2)在摇床中取出离心管，加入400μl缓冲液BL(200ul缓冲液与200ul无水乙醇的混合液)，震荡混匀后将混合液吸入DNA提取专用管中，在7000g的离心力下离心1分钟；
3)将上层离心管置于新的2ml离心管中，加入500μl的缓冲液AW1，在7000g的离心力下离心1分钟，去除下层离心管；
4)把上层液体放入新的2ml离心管，加入500μl的缓冲液AW2，在20000g的离心力下离心分离3分钟，更换下层离心管并重新离心一次以确保上层离心管中没有液体残留；
5)将上层离心管置于新的2ml离心管中，加入150ul的AE溶液，静置1分钟，然后于7000g的离心力下离心1分钟，收集下层离心管中的溶液即为提取并纯化完成的DNA。
实施例1引物的设计
(1)从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网点的genbank中下载产毒铜绿微囊藻mcyA基因序列(accession no.AF139330)；
(2)将序列输入到Primer Premier 5.0，设计出满足定量PCR要求的引物，由于定量PCR要求扩增产物片段长度为50-150bp，经过筛选，我们确定了一对扩增产物片段长度为112bp的引物，即：
正向引物mcya：5-TATCATCTAGCCATTCTCGCATCT-3(SEQ IDNO：1)；
反向引物mcyb：5-AAATTTACAGCCAAACATCGG-3(SEQ IDNO：2)；
(3)引物特异性的验证：
软件验证：采用NCBI的引物设计和特异性检验工具Primer-BLAST验证引物的特异性，显示引物特异性很好；
实验验证：验证结果见实施例3中的实例1、2和3。
实施例2标准品的准备
(1)采用显微镜计数的检测方法，配制好浓度为2.7*107个/L浓度的产毒铜绿微囊藻；
(2)将2.7*107个/L浓度的产毒铜绿微囊藻按照三分之一梯度稀释，分别稀释成浓度为9*106个/L、3*106个/L、1*106个/L、3.3*105个/L的标准品；
(3)用DNeasy Blood & Tissue Kit提取标准品中的DNA，保存在零下20摄氏度待用。
每一次定量PCR反应都需要加入标准品进行实验，配制好反应预混液(包含5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0.25ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，2.8ul的DEPC水)并用移液枪转移到96孔反应板的反应孔中，在对应的反应孔中加入1.5ul标准品及待测样品的DNA，通过StepOne Software v2.0点击开始实验，实验结束后系统即自动生成标准曲线和待测样品的浓度，标准曲线以产毒铜绿微囊藻细胞浓度为横坐标，CT值即达到荧光阈值时的循环数为纵坐标。
实施例3引物序列的实验验证
实例1
(1)取已知浓度(显微镜计数)为1*106个/L的实验室纯种培养的产毒铜绿微囊藻100ul，用DNeasy Blood & Tissue Kit提取DNA并保存待测；
(2)预先配制好定量PCR的反应预混液，包含5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0.25ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，2.8ul的DEPC水；
(3)将反应预混液转移至96孔反应板的反应孔中，将步骤(1)中提取的DNA取1.5ul及1.5ul实施例2中的标准品DNA加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2.0点击开始实验，反应条件为95℃下热变性10分钟，然后进入40个循环的扩增阶段，95℃变性10秒，62℃扩增10秒，扩增的同时扫描荧光信号，实验结束后系统即自动生成标准曲线及根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中产毒铜绿微囊藻的浓度，三个重复实验结果分别为9.96*105个/L、9.91*105个/L、1.02*106个/L。
实例2
1)取显微镜计数为1*106个/L的小球藻、纤细裸藻、不产毒的铜绿微囊藻，节球藻混成100ul溶液，用DNeasy Blood & Tissue Kit按照标准步骤提取DNA并保存待测；
2)预先配制好定量PCR的反应预混液，包含5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0.25ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，2.8ul的DEPC水；
3)将反应预混液转移至96孔反应板的反应孔中，将步骤(1)中提取的DNA取1.5ul及1.5ul实施例2中的标准品DNA加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2.0点击开始实验，反应条件为95℃下热变性10分钟，然后进入40个循环的扩增阶段，95℃变性10秒，62℃扩增10秒，扩增的同时扫描荧光信号，实验结束后系统自动生成标准曲线及根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中产毒铜绿微囊藻的浓度，本实例中三个重复实验结果分别都低于检测线，说明样品中没有产毒铜绿微囊藻的存在。
实例3
1)取已知浓度(显微镜计数)为1*106个/L的实验室纯种培养的产毒铜绿微囊藻50ul，并混入50ul的小球藻、纤细裸藻、不产毒的铜绿微囊藻，节球藻混合液，用DNeasy Blood & Tissue Kit按照标准步骤提取DNA并保存待测；
2)预先配制好定量PCR的反应预混液，包含5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0.25ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，2.8ul的DEPC水；
3)将反应预混液转移至96孔反应板的反应孔中，将步骤(1)中提取的DNA取1.5ul及1.5ul实施例2中的标准品加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2.0点击开始实验，反应条件为95℃下热变性10分钟，然后进入40个循环的扩增阶段，95℃变性10秒，62℃扩增10秒，扩增的同时扫描荧光信号，实验结束后系统即自动生成标准曲线及根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中产毒铜绿微囊藻的浓度，三个重复实验结果分别为4.87*105个/L、5.01*105个/L、4.93*105个/L，结果显示其他藻的存在对本检测方法无影响。
实例1、2、3的结果表明定量PCR检测方法得到的结果具有很好的重复性，并且跟显微镜计数的结果一致，说明设计的引物序列具有特异性，用该引物序列进行定量PCR检测水肿产毒铜绿微囊藻是一种有效的检测方法。
实施例4
用实施例1中设计的引物序列进行定量PCR检测待测水体中产毒铜绿微囊藻的浓度。
(1)采集湖泊或河流中的水样作为待测样品；
(2)取待测样品100ul，用DNeasy Blood & Tissue Kit按照标准步骤提取DNA并保存待测；
(3)配制定量PCR反应的反应液体系：1.5ul样品DNA溶液，5ul SYBRPremix Ex Taq溶液，0.2ul ROX Reference溶液，0.25ul的10mM浓度的正向引物和反向引物，2.8ul的DEPC水，每个样品做三次重复，使用10ul量程的排枪操作，降低移液枪枪头残留溶液的影响；
(4)将反应液体系转移至96孔反应板的反应孔中，将步骤(1)中提取的DNA取1.5ul及1.5ul实施例2中的标准品DNA加入对应的反应孔中通过StepOne Software v2.0点击开始实验，反应条件为95℃下热变性10分钟，然后进入40个循环的扩增阶段，95℃变性10秒，62℃扩增10秒，扩增的同时扫描荧光信号，实验结束后系统即自动生成标准曲线及根据每一轮扩增扫描到的信号强弱对比标准品的信号强弱得出样品中产毒铜绿微囊藻的浓度，三个重复实验结果分别为1.42*107个/L、1.3*107个/L、1.35*107个/L，说明待测水样中含有产毒铜绿微囊藻，此结果说明利用实施例1中设计的引物序列进行PCR能有效检测待测水体中的产毒铜绿微囊藻的浓度。
Claims (4)
1.一种检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：
正向引物：TATCATCTAGCCATTCTCGCATCT；
反向引物：AAATTTACAGCCAAACATCGG。
2.一种用权利要求1所述的引物序列检测水体中产毒铜绿微囊藻浓度的方法，其特征在于，包括：
(1)提取待测水样中产毒铜绿微囊藻细胞的DNA，以提取的DNA为模板，用权利要求1所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录下达到荧光阈值时的循环数；
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定产毒铜绿微囊藻细胞浓度的标准曲线得到待测水样中产毒铜绿微囊藻细胞的浓度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述标准曲线的标准品为从已知浓度梯度的产毒铜绿微囊藻细胞中提取的DNA。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的定量PCR的反应体系为：1.5ul DNA溶液，5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.2ul ROXReference溶液，0.25ul 10mM浓度的正向引物和反向引物，2.8ulDEPC水。
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