CN103149173B - 一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品安全领域，建立了一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法。本发明方法为：利用显微红外光谱仪采集细菌的红外谱图，进行数据预处理后提取特征中红外波段（3000-2800cm^-1、1800-1500cm^-1、1500-1200cm^-1、1200-800cm^-1）的信息，进行主成分分析（Principle Component Analysis,PCA）以建立鉴别模型，进行类模拟软独立建模分析（Soft Independent Modeling of Class Analogy,SIMCA）以验证模型可靠性。本发明的优点是：结果可靠，特异性强，检测快速，操作简便，灵敏度高，普及性强，应用范围广；可特异鉴定副溶血弧菌；可检测正常和不同程度损伤状态的副溶血弧菌。

Description

一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体地涉及一种检测副溶血弧菌的方法。

背景技术

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌，在海产品中的携带率高达45.7%，在我国部分沿海地区，由副溶血弧菌引起的食物中毒在细菌性食物中毒事件中居首位。经加热、冷冻、脱水等处理后，细菌或被杀死，或无损的存活下来，还有一些可能受到了亚致死性损伤。在适当条件下，受损细菌可以修复损伤并恢复包括毒力和繁殖能力在内的所有生理活性，仍具有致病性，严重威胁人类健康。因此，检测副溶血弧菌及其亚致死损伤对于食品安全监控和人类健康都具有重要意义。

对于细菌的鉴定，常规培养检测方法包括增菌培养、选择性培养、生化试验和血清学反应等过程，耗时长、操作繁琐、检出率低，不适应实际检验工作的需要。以免疫学为基础的检测方法利用抗原抗体反应的显著特异性，包括ELISA、免疫荧光法和放射免疫试验等。基于核酸的检测方法如PCR技术可以在很短时间内将几个甚至一个目标序列扩增到几百万个拷贝，为致病菌检测提供了一种快速、灵敏、特异的检测方法，但对于食品样品中的抑制物质非常敏感，有时会给出假阴性结果。目前已公开的副溶血弧菌检测相关的两个专利包括实用新型专利“用于检测肠道感染的集合胶体金试纸”（中国专利申请号:201120375786.7）和发明专利“PCR-焦磷酸法检测副溶血弧菌的检测引物、试剂盒和检测方法”（中国专利申请号:201210272737.X）。

对于亚致死损伤细菌的检测，现有技术的缺点是：常规培养法工作量大，检测周期长，且可能低估甚至给出假阴性结果；微生物表面形态观察法，则对实验者的操作技能要求较高，且仪器昂贵；基因芯片法价格昂贵，检测时间长，需要专业人员操作等。目前已公开的损伤细菌检测相关的专利仅有发明专利“荧光法快速测定活细菌总数”（中国专利申请号:200810140095.1）。

红外光谱技术具有操作简单、分析速度快、成本低、应用范围广、灵敏度高等优点，显微红外光谱技术将光学显微镜与红外光谱技术相结合，比普通红外光谱技术更快、更灵敏、更简便。但红外谱图提供的信息较复杂，样品之间差异细微，一般需要结合化学计量学深入分析。红外光谱技术在微生物检测中的应用兴起于上世纪九十年代，目前，国内外尚未见到利用红外光谱技术研究副溶血弧菌亚致死损伤的报道，且大多采用普通红外技术研究细菌。目前未见利用红外光谱技术对副溶血弧菌进行鉴定和不同状态检测的专利。

发明内容

鉴于上述现有技术发展情况，本发明的目的就是提供一种快速、简便的基于显微红外光谱技术检测副溶血弧菌的方法。

本发明的目的是这样实现的：

首先利用显微红外光谱仪，通过高级功能“Map view”自动采集不同类别细菌或不同状态副溶血弧菌的多张红外谱图，进行二阶导转换等数据预处理。继而对每个菌株的24个样本，分别提取四个特征中红外波段（3000-2800cm^-1、1800-1500cm^-1、1500-1200cm^-1、1200-800cm^-1）二阶导数谱的波数和峰值，进行主成分分析（PCA），建立每个波段的鉴别模型。最后同样提取四个特征波段二阶导数谱的信息，从每个菌株的24个样本中随机选取14个加入训练集，剩下10个加入预测集，进行类模拟软独立建模（SIMCA）分析，预测未知样本，验证每个波段模型的可靠性。通过以上步骤既可以特异鉴定副溶血弧菌，也可以检测正常和不同程度损伤状态的副溶血弧菌。

本发明所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，包括如下步骤：

（1）制备待检样品

培养待测菌株，收集菌体，将菌体悬浮于生理盐水中，取菌悬液滴在BaF₂盐片上，干燥；

（2）光谱采集

利用显微红外光谱仪采集细菌的微区域吸收信号，获得原始谱图（map）文件；

（3）数据预处理

将原始谱图（map）文件转换成红外谱图，并将红外谱图进行二阶导转换；

（4）主成分分析（Principle Component Analysis,PCA）

提取特征波段二阶导数谱的信息，进行主成分分析（Principle ComponentAnalysis,PCA）建立不同类别或不同状态细菌的鉴别模型；

（5）模型验证

利用类模拟软独立建模（Soft Independent Modeling of Class Analogy,SIMCA）预测不同类别或不同状态的细菌，验证模型可靠性。

优选地，所述利用类模拟软独立建模（Soft Independent Modeling of ClassAnalogy,SIMCA）预测，是指提取所述特征波段二阶导数谱的信息，将每个菌株的样本随机分为训练集和预测集，对训练集中每一类样本测量数据矩阵，建立主成分回归模型，计算未知样本到各类模型的SIMCA距离，以确定未知样本类别，根据SIMCA结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，验证模型可靠性

具体操作如下：

(1)制备待检样品

将5μL溶于生理盐水的菌悬液滴在BaF₂盐片（Φ10×2mm）上，均匀铺开，干燥器中放置30min，晾干后上机检测。每块盐片上同时滴5个样品，3孔透射支架同时放置3块盐片，一次可完成15个样品的测试。

(2)光谱采集

利用高级功能“Map view”一次自动采集8个微区域的吸收信号，光阑为100μm×100μm，步长为100μm×100μm，对每个类别或状态的菌株均准备3份平行样品，共获得3个map文件。采集参数为：扫描范围：4000-600cm^-1；采集时间：3s，即16张干涉图加和；分辨率：8cm^-1。

(3)数据预处理

将每个原始map文件转换成8张红外谱图，选取4000-800cm^-1波段进行大气背景抑制、自动基线校正、归一化（使酰胺谱带I1655cm^-1的吸收强度等于1），采用Savitzky-Golay模式，平滑点数为7，多项式次数为3，将谱图进行二阶导转换。

(4)PCA分析

提取以下四个中红外特征波段二阶导数谱的波数和峰值，分别进行后续的PCA分析和SIMCA分析：3000-2800cm^-1、1800-1500cm^-1、1500-1200cm^-1、1200-800cm^-1。对每个菌株的24个样本，分别提取上述四个特征波段二阶导数谱的信息，进行PCA分析。

PCA属于无监督的分类方法，可将多维的数据压缩成几个主要、独立的潜在变量（主成分，PC），这些主成分保存了最相关和最具代表性的信息。PC1表示能描述目标多维数据矩阵中最显著的特性，PC2表示除PC1之外的所能描述目标多维数据矩阵中最显著的特性。二维PCA示意图可直观区分不同类别或不同状态的细菌，从而建立每一个波段的鉴别模型。

（5）SIMCA分析验证

对每个菌株的24个样本，分别提取步骤（4）中四个特征波段二阶导数谱的信息，从每个菌株的24个样本中随机选取14个加入训练集，剩下10个加入预测集；对训练集中每一类样本测量数据矩阵，建立主成分回归模型；计算未知样本到各类模型的SIMCA距离，以确定未知样本类别；根据SIMCA结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，考察模型可靠性。

本发明利用显微红外光谱仪采集不同类别或状态的细菌谱图（均为纯培养物），对原始数据进行一系列预处理后，结合化学计量学中的PCA和SIMCA，可特异鉴定副溶血弧菌，也可以检测正常和不同程度损伤状态的副溶血弧菌。

本发明的优点是：

检测快速，操作简便，灵敏度高，特异性强，结果可靠；

1、结果可靠，对于亚致死损伤副溶血弧菌的检测，红外光谱的结果得到了传统经典的培养法的验证。

2、特异性强，可特异性鉴定副溶血弧菌。

3、快速，显微红外光谱仪1小时可采集大于120张谱图，从样品前处理到完成数据处理的整个检测过程不超过一天。

4、简单，前处理只需简单离心，仪器操作简单，“Map view”可自动采集多个微区域的红外谱图。

5、灵敏度高，只需5μL浓缩菌液就可获得很强的红外信号。

6、普及性强，操作者容易学习和掌握。

7、适用范围广，不仅可用于副溶血弧菌的检测，也可推广用于其他食源性致病菌和细菌的检测。

8、应用领域多，即可应用于副溶血弧菌的鉴定，也可应用于副溶血弧菌存活和亚致死等各种不同状态的检测。

附图说明

图1为不同菌株区分的PCA示意图，A：1200-800cm^-1；B：1500-1200cm^-1；C：1800-1500cm^-1；D：3000-2800cm^-1；I：Vibrio parahaemolyticus ATCC17802；II：Listeria monocytogenes EDGe。

图2为未受损与不同程度受损副溶血弧菌ATCC17802区分的PCA示意图，A：1200-800cm^-1；B：1500-1200cm^-1；C：1800-1500cm^-1；D：3000-2800cm^-1；I：未受损；II：加热2min；III：加热4min；IV：加热6min；V：加热8min。

本发明中，所用试剂、仪器以及菌株均可从市售获得。所用菌株副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus ATCC17802和单增李斯特菌Listeria monocytogenesEDGe购自中国微生物菌种网。不同菌株类型，并不影响本发明的鉴定效果。

具体实施方式

以下结合附图和附表通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：基于显微红外光谱技术快速鉴定副溶血弧菌

菌液制备：将供试菌株Vibrio parahaemolyticus ATCC17802从-80℃超低温冰箱中取出，在TCBS培养基上37℃划线培养16h，挑取典型单菌落，接种于200mL含3%NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃下175rpm过夜振荡培养至稳定期；将供试菌株Listeria monocytogenes EDGe从-80℃超低温冰箱中取出，在TSA-YE培养基上37℃划线培养18～24h，挑取典型单菌落，接种于200mL胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃下250rpm振荡培养24h至稳定期。取10mL菌液加入50mL离心管中，4000r/min离心4min收集细胞。为消除代谢产物和培养基对细菌红外谱图的影响，将细胞用10mL无菌生理盐水洗涤两次后，倒掉生理盐水收集菌体，重新悬浮于200μL生理盐水中，供光谱分析。每个菌株各做3次平行试验，获得3个平行样品。

光谱采集：取5μL菌液直接滴在BaF₂片上，干燥器中放置半小时，待水分蒸干后，上显微红外光谱仪进行测试。每块盐片上同时滴3个样品，3孔透射支架同时放置2块盐片，在短时间内完成了6个样品的测试。扫描范围：4000-600cm^-1；采集时间：3s；分辨率：8cm^-1；通过面扫描（Map View）模式，每个样品采集8张图谱，获得1个map文件，步长为100μm×100μm，光阑为100μm×100μm。每个菌株共有24张图谱。

数据预处理：将原始map文件转换成8张红外谱图，选取4000-800cm^-1波段进行大气背景抑制、自动基线校正、归一化（使酰胺谱带I1655cm^-1的吸收强度等于1），采用Savitzky-Golay模式（平滑点数为7，多项式次数为3）将谱图进行二阶导转换。提取以下四个特征波段二阶导数谱的波数和峰值，分别进行后续的PCA分析和SIMCA分析：3000-2800cm^-1、1800-1500cm^-1、1500-1200cm^-1、1200-800cm^-1。

PCA分析：对每个菌株的24个样本，分别提取四个特征波段二阶导数谱的信息，进行PCA分析。从二维PCA示意图（图1）可以看出，在四个光谱波段中，单核细胞增生李斯特菌与副溶血弧菌能够各自聚成一组，彼此区分开。PCA结果表明，红外光谱法能够特异地鉴定副溶血弧菌与单核细胞增生李斯特菌，从而建立了副溶血弧菌的特异鉴定模型。

SIMCA分析：首先对每个菌株的24个样本，分别提取四个特征波段二阶导数谱的信息，从每个菌株中随机抽取14个样本加入训练集（共28个样本），剩余的10个样本加入预测集（共20个样本）；然后分别计算各类的主成分回归模型；最后根据未知样本到各类模型的距离进行模式判别。根据SIMCA结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，验证模型可靠性。预测率考察某类样品有多少落在该类模型的区域内，而拒绝率是考察某类样品模型对于其它不属于该类的未知样品的拒绝程度，当两个值都为100%时，表明某类样品与其他类样品之间没有重叠，可以较好地将其聚类分开。从表1可见，两个菌株都在四个光谱区域都取得了100%的预测率和100%的拒绝率，即在每一个波段中，每一个菌株的10个未知样本都被正确归类，都能将非本组的10个细菌样本全部排斥在外。SIMCA结果表明，PCA模型可靠度高，能够有效地预测未知样本的归属。

实施例2：基于显微红外光谱技术快速检测热激亚致死损伤的副溶血弧菌

热激试验：供试菌株Vibrio parahaemolyticus ATCC17802从-80℃超低温冰箱中取出，在TCBS培养基上37℃划线培养16h，挑取典型单菌落，接种于200mL含3%NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃下175rpm过夜振荡培养至稳定期。取10mL菌液加入50mL离心管中，4000r/min离心4min收集细胞。为消除代谢产物和培养基对细菌红外谱图的影响，将细胞用10mL无菌生理盐水洗涤两次后，重新悬浮于5mL生理盐水中，制得热处理培养液。每个处理皆准备3个平行样品。将1个热处理培养液作为空白对照，另外4个装有5mL热处理培养液的离心管同时浸入55℃水浴，彼此保有一定空间以利于热传导，分别于2、4、6、8min后取出并立即置于冰浴上冷却至少5min。每热激试验重复3次。

光谱采集：将菌液离心，倒掉生理盐水收集菌体，重新悬浮于200μL生理盐水中。取5μL菌液直接滴在BaF₂片上，干燥器中放置半小时，待水分蒸干后，上显微红外光谱仪进行测试。每块盐片上同时滴5个样品，3孔透射支架同时放置3块盐片，在短时间内完成了15个样品的测试。扫描范围：4000-600cm^-1；采集时间：3s；分辨率：8cm^-1；通过面扫描（Map View）模式，每个样品采集8张图谱，步长为100μm×100μm，光阑为100μm×100μm。每个菌株共有24张图谱。

数据预处理：将原始map文件转换成8张红外谱图，选取4000-800cm^-1波段进行大气背景抑制、自动基线校正、归一化（使酰胺谱带I1655cm^-1的吸收强度等于1），采用Savitzky-Golay模式（7-point,polynomial degree3）将谱图进行二阶导转换。提取以下四个特征波段二阶导数谱的波数和峰值，分别进行后续的PCA分析和SIMCA分析：3000-2800cm^-1、1800-1500cm^-1、1500-1200cm^-1、1200-800cm^-1。

PCA分析：对每个菌株的24个样本，分别提取四个特征波段二阶导数谱的信息，进行PCA分析。从二维PCA示意图（图2）可以看出，在四个光谱波段中，正常细菌与受损伤细菌能够清楚、完全地区分开，而受损伤程度不同的细菌也能基本分离，从而建立了正常和不同程度亚致死损伤副溶血弧菌的鉴别模型。

SIMCA分析：首先对每个菌株的24个样本，分别提取四个特征波段二阶导数谱的信息，从每个菌株中随机抽取14个样本加入训练集（共70个样本），剩余的10个样本加入预测集（共50个样本）；然后分别计算各类的主成分回归模型；最后根据未知样本到各类模型的距离进行模式判别。根据SIMCA结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，验证模型可靠性。从表2可见，除3个例外，不同程度热损伤（包括未受损）的副溶血弧菌的预测准确程度均大于80%；拒绝率均大于90%。SIMCA结果表明，四个光谱区域模型的预测程度都较好。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

表1  不同菌株的SIMCA判别结果

表2  副溶血弧菌ATCC17802不同受损程度的SIMCA判别结果

Claims (5)

1.一种基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，包括以下步骤：

(1)制备待检样品

培养待测菌株，收集菌体，将菌体悬浮于生理盐水中，取菌悬液滴在BaF₂盐片上，干燥；

(2)光谱采集

利用显微红外光谱仪的“map view”自动、快速采集菌株的多个微区域吸收信号，获得原始图谱文件；

(3)数据预处理

将原始图谱文件转换成红外谱图，并将红外谱图进行二阶导转换；

(4)主成分分析

提取特征波段二阶导数谱的信息，进行主成分分析建立不同类别或不同状态细菌的鉴别模型；

(5)模型验证

利用类模拟软独立建模预测不同类别或不同状态的细菌，验证模型可靠性；

其中，所述步骤(3)中，所述将原始图谱文件转换成红外谱图，条件为选取4000-800cm^-1波段进行大气背景抑制、自动基线校正、归一化，使酰胺谱带I 1655cm^-1的吸收强度等于1；

所述步骤(4)中所述特征波段是指3000-2800cm^-1、1800-1500cm^-1、

1500-1200cm^-1和1200-800cm^-1波段；

所述的副溶血弧菌为纯培养物；

所述步骤(2)中，利用显微红外光谱仪采集菌株的红外谱图，是指利用显微红外光谱仪自动采集微区域的吸收信号，光阑为100μm×100μm，步长为100μm×100μm，采集参数为：扫描范围，4000-600cm^-1；采集时间，3s；分辨率，8cm^-1；所述步骤(2)中一次自动、快速采集8个微区域的吸收信号，对每个待测菌株均准备3份平行样品，进行检测；

上述方法用于不同程度亚致死损伤副溶血弧菌的鉴别。

2.根据权利要求1所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：所述步骤(4)中

所述二阶导数谱的信息是指二阶导数谱的波数和峰值；

所述主成分分析是指二维主成分分析。

3.根据权利要求1所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，

所述利用类模拟软独立建模预测，是指提取所述特征波段二阶导数谱的信息，将每个菌株的样本随机分为训练集和预测集，对训练集中每一类样本测量数据矩阵，建立主成分回归模型，计算未知样本到各类模型的类模拟软独立建模距离，以确定未知样本类别，根据类模拟软独立建模结果统计每类样本在每个波段的预测率和拒绝率，验证模型可靠性。

4.根据权利要求2所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，采用Savitzky-Golay模式，设置平滑点数为7，多项式次数为3。

5.根据上述任一项权利要求所述的基于显微红外光谱技术快速检测副溶血弧菌的方法，其特征在于：所述方法能够特异鉴定副溶血弧菌，也能够检测正常和不同程度损伤状态的副溶血弧菌。