PL219153B1 - Nowe szczepy bakteryjne, plazmid pSinA, sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów i szczepy wytworzone tym sposobem oraz ich zastosowania - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p i Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, plazmid pSinA, sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów oraz nowe szczepy bakteryjne wytworzone tym sposobem. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja obejmująca nowy szczep bakteryjny lub plazmid pSinA oraz zastosowania tych nowych szczepów jak i sposób bioaugumentacji środowiska skażonego arsenem, w szczególności sposób usuwania arsenu z wód.

Arsen należy do pierwiastków szeroko rozpowszechnionych w skorupie ziemskiej, gdzie występuje w ilościach śladowych głównie w glebie i w minerałach. Pod wpływem naturalnych procesów oraz działalności człowieka arsen jest także uwalniany do wód i powietrza. Obecność związków arsenu w źródłach wodny pitnej stanowi zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Najbardziej dramatyczne skutki wpływu arsenu są obserwowane w Bangladeszu oraz w Zachodnim Bengalu w Indiach, gdzie, jak obliczyła Światowa Organizacja Zdrowia (WHO), ponad 50 milionów mieszkańców jest narażonych na spożywanie wód pitnych skażonych tym toksycznym pierwiastkiem.

Biologiczne usuwanie arsenu z terenów skażonych wydaje się być niezbędnym uzupełnieniem dla wielu tradycyjnych, chemicznych metod remediacji. Stosowanie takich metod jak koagulacja czy filtracja wiąże się z usuwaniem nie tylko arsenu, ale i innych pierwiastków występujących w oczyszczanym środowisku. Aktualne prace nad systemami biologicznego usuwania arsenu skupiają się głównie na wykorzystaniu potencjału mikroorganizmów i roślin (Kostal i wsp., 2004, Tripathi i wsp., 2007).

Efektywne oczyszczanie wód skażonych arsenem wiąże się z usuwaniem obu nieorganicznych form arsenu (As III i As V). O ile arseniany mogą być wydajnie i wybiórczo wytrącane na silnych adsorbentach (Pattanayak i wsp., 2000), to w przypadku arseninów nie ma możliwości zastosowania selektywnych utleniaczy bez skutków ubocznych dla środowiska. Altematywą dla chemicznego utleniania staje się, więc mikrobiologiczne utlenianie As(III). Lievermont i wsp. (2003) zaproponowali wydajną, niskonakładową, dwu stopniową technologię usuwania arsenu z wód z wykorzystaniem bakterii Herminiimonas arsenicoxidans ULPAs1. Autorzy wykazali, że immobilizowany na złożu alginianowym szczep ULPAs1 może wydajnie utleniać nawet 100 mg/l As(III) i może być zastosowany w technologiach usuwania arsenu, tam gdzie jest wymagane wstępne utlenianie skażonych wód.

Znane zastosowania bakterii utleniających arseniny w procesach bioremediacji są jak na razie ograniczone do badań laboratoryjnych i metod ex situ. Znane sposoby bioremediacji terenów zanieczyszczonych arsenem metodami in situ nie spełniają swoich funkcji ponieważ, wprowadzane do „nowego” środowiska bakterie nie są zdolne do przetrwania w nowych warunkach. Jest to głównie związane z występowaniem innych, niż laboratoryjne, warunków fizycznochemicznych oraz z konkurencją międzygatunkową z florą autochtoniczną. Proponowanym rozwiązaniem tego problemu jest biostymulacja autochtonicznej mikroflory lub stosowanie organizmów genetycznie modyfikowanych.

W publikacji Yang i wsp. (2010) opisano skonstruowany w laboratorium wektor pochodną plazmidu pBBR1MCS-5 niosący geny dużej i małej podjednostki oksydazy arseninowej. Wektor ten zawiera gen oporności na gentamycynę i jego wykorzystanie wiąże się z koniecznością stosowania presji selekcyjnej z gentamycną w stężeniu 60 mg/L. W związku z czym wprowadzenie bakterii zawierających taki plazmid do środowiska niesie ryzyko rozpowszechniania genów oporności na gentamycynę, jak również wiąże się z ryzykiem niestabilności takich szczepów w środowisku. Opisany w Yang i wsp. (2010) wektor jest stosowany do konstrukcji szczepów przydatnych w bioremediacji arsenu, ale działa tylko po wprowadzeniu do szczepów pierwotnie zdolnych do utleniania arseninów i zwiększa tylko wydajność istniejącego już procesu. Wektor ten nie powoduje nabywania nowej zdolności jaką jest możliwość katalizowania reakcji utleniania As(III) do As(V).

Proponowane stosowanie organizmów genetycznie modyfikowanych wiąże się z wprowadzaniem do środowiska naturalnego organizmów obcych genów przez nie przenoszonych jak np. genów markerów typu oporności na antybiotyki czy kodujących Gfp (ang. green fluorescence protein), co jest nieakceptowane ze względów społecznych i niepożądane ze względów środowiskowych, jak również powoduje utratę plazmidów przy braku presji selekcji na stosowane markery w naturalnym środowisku.

PL 219 153 B1

Pożądane jest aby mikroorganizmy posiadające zdolność utleniania arseninów wykazywały również oporność na obecność w środowisku innych metali ciężkich.

Szczep Sinorhizobium sp. M14 został wyizolowany z mat mikrobiologicznych z kopalni złota w Złotym Stoku (Drewniak i wsp., 2008). Szczep ten jest zdolny do chemolitoautotroficznego wzrostu z wykorzystaniem arseninów jako źródłem energii oraz może mobilizować arsen z arsenopirytu (Drewniak i wsp. 2010). Szczep M14 niesie dwa megaplazmidy: 109 kpz plazmid nazwany pSinA oraz ok. 300 kpz plazmid nazywany pSinB (Drewniak, 2009). Częściowa sekwencja plazmidu pSinA została ujawniona w bazie GenBank NCBI pod nr dostępu GU990088.1 (ujawniona sekwencja odpowiadała jedynie nukleotydom 21498 do 48497 SEKW. ID. NR 1 według niniejszego wynalazku).

W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie nowych szczepów bakteryjnych, plazmidu oraz sposobów umożliwiających wprowadzenie do szczepu bakteryjnego, zwłaszcza szczepu autochtonicznego, plazmidu w celu wytworzenia stabilnych, ulepszonych szczepów zdolnych do utleniania arseninów, które ponadto charakteryzują się zwiększoną opornością na inne metale. Takie szczepy mogą być jednocześnie pozbawione niepożądanych genów markerowych takich jak geny oporności na antybiotyki. Celem wynalazku jest również dostarczenie nowych szczepów bakteryjnych zdolnych do utleniania arseninów, lecz nie akumulujących arsenu, kompozycji je obejmujących i ich zastosowań.

Istota niniejszego wynalazku opiera się, więc na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że możliwe jest wykorzystanie naturalnego plazmidu pSinA z Sinorhizobium sp. M14 do wytworzenia stabilnych szczepów bakteryjnych różnych gatunków bakterii zdolnych do utleniania arseninów, korzystnie nieposiadających niepożądanych genów markerowych jak i na opracowaniu metody wytwarzania nowych szczepów bakteryjnych z zastosowaniem szczepów obejmujących ten plazmid lub plazmidu pSinA. Nieoczekiwanie stwierdzono, że plazmid pSinA wprowadzony do innych szczepów i gatunków bakterii niż Sinorhizobium sp. jest w nich w pełni funkcjonalny oraz utrzymuje się w nich stabilnie oraz umożliwia takim bakteriom chemolitotroficzne utleniania arseninów. Ponadto nieoczekiwanie stwierdzono, że w odróżnieniu od szczepu Sinorhizobium sp. M14 nowe uzyskane szczepy obejmujące plazmid nie akumulują wewnątrz komórek arsenu, ale umożliwiają jego przetwarzanie prowadząc do uzyskania biomasy pozbawionej szkodliwego arsenu.

Niniejszy wynalazek dotyczy nowych szczepów Agrobacterium tumefaciens (D10) zdeponowanego pod nr KKP2039p i Paracoccus alcaliphilus (C10) zdeponowanego pod nr KKP2040p w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno Spożywczego w Warszawie.

Przez termin wariant nowego szczepu lub szczepu wytworzonego sposobem według wynalazku należy rozumieć szczep mutanta lub szczep otrzymany przez hodowlę zdeponowanego szczepu lub szczepu wytworzonego sposobem według wynalazku jako materiału wyjściowego, który obejmuje plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1 i jest zdolny do chemolitotroficznego utleniania arseninów.

Wynalazek ponadto dotyczy wyizolowanego plazmidu pSinA przedstawionego na SEKW. ID. NR 1.

Termin „pochodna plazmidu pSinA lub funkcjonalna pochodna plazmidu pSinA” obejmuje plazmidy o sekwencji nukleotydowej kodującej otwarte ramki odczytu, które kodują produkty zawierające identyczną lub wysoce homologiczną sekwencję aminokwasową lub nukloeotydową do sekwencji kodowanych przez plazmid psina, których sekwencje kodujące lub inne sekwencje plazmidu zostały zmienione np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów tych otwartych ramek odczytu i umożliwia zachowanie funkcjonalnych właściwości niesionych przez plazmid pSinA takich jak zdolność chemolitotroficznego utleniania arseninów oraz oporność na arseniany [As(V)] i arseniny [As(III)]. Sekwencja wysoce homologiczna oznacza, że sekwencja jest homologiczna, w co najmniej 70%, korzystniej 80%, bardziej korzystnie 90%, najkorzystniej, w co najmniej 95%.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nowych szczepów Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p i Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p zawierających naturalny plazmid pSinA z Sinorhizobium sp. M14 oraz wykorzystanie samego plazmidu pSinA z Sinorhizobium sp. M14 niosącego: (i) wszystkie geny niezbędne do chemolitoautotroficznego utleniania arseninów, (ii) geny oporności na metale ciężkie oraz (iii) geny kodujące system replikacyjno-stabilizujący (z syste4

PL 219 153 B1 mem partycji - aktywnego rozdziału), system rozdziału multimerów i system addykcyjnym toksynaantytoksyna zapewniające stabilne utrzymywanie palzmidu w komórkach bakterii, do konstrukcji szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów. Takie szczepy lub plazmid są przydatne w bioremediacji, w tym do bezpośredniego zastosowania w procesie bioaugmentacji mikroflory środowisk skażonych arsenem. Takie szczepy mogą również służyć do wytwarzania innych szczepów zdolnych do chemolitoautotroficznego utleniania arseninów lub do usprawniania szczepów już posiadających taką właściwość. Pełna sekwencja plazmidu pSinA z Sinorhizobium sp. M14 została przedstawiona na SEKW. ID. NR 1. Przedstawione rozwiązanie umożliwia konstrukcję szczepów przydatnych do usuwania arsenu ze środowisk skażonych, bez stosowania manipulacji genetycznych i wprowadzania genów powszechnego ryzyka (np. oporności na antybiotyki) do obiegu w środowisku. Dzięki wynalazkowi możliwe jest wprowadzanie plazmidu pSinA do komórek szczepów autochtonicznych wyizolowanych z danego środowiska i tworzenie stabilnych szczepów zdolnych do utleniania arseninów. Ponadto, wynalazek umożliwia prowadzenie metody selekcji i monitoringu szczepów niosących plazmid pSinA.

Wynalazek dotyczy więc sposobu wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów obejmującego etapy: a) uzyskania szczepu biorcy, oraz b) wprowadzenia plazmidu pSinA przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 do szczepu biorcy. W korzystnym sposobie etap b) przeprowadza się przez:

(i) koniugację trójrodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1 i szczepu pomocniczego niosącego plazmid pomocniczy, albo, (ii) koniugację dwurodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.

Korzystnym szczepem donorowym w tym sposobie jest Agrobacterium tumefaciens (D10) zdeponowany pod numerem KKP 2039p lub Paracoccus alcaliphilus (C10) zdeponowany pod numerem KKP 2040p.

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów w etapie a) uzyskiwania szczepu biorcy dodatkowo wprowadza się do szczepu biorcy gen kodujący dodatkowy marker selekcyjny, korzystnie kodujący oporność na antybiotyk. Korzystniej gen kodujący dodatkowy marker selekcyjny wprowadzany jest na plazmidzie, korzystnie za pomocą koniugacji trójrodzicielskiej z szczepem bakteryjnym zawierającym plazmid obejmujący gen kodujący dodatkowy marker selekcyjny oraz z szczepem pomocniczym zawierającym plazmid pomocniczy.

W korzystnym sposobie wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów szczepem biorcy jest szczep bakterii wyizolowany ze środowiska naturalnego, korzystnie ze środowiska skażonego arsenem, szczególnie korzystnym szczepem biorcy jest szczep bakterii należący do Alphaproteobacteria i Gammaproteobacteria.

Wynalazek dotyczy konstrukcji szczepów zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów na bazie szczepów autochtonicznych pierwotnie nie zdolnych do utleniania As(III). Dzięki zastosowaniu plazmidu pSinA jego pochodnych albo szczepów Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p można konstruować szczepy bakterii zdolne do prowadzenia takich reakcji, wychodząc od szczepów, które wyjściowo nie posiadały całego aparatu genów niezbędnych do utlenia arseninów.

Wynalazek umożliwia konstrukcję szczepów na bazie bakterii wyizolowanych z różnych środowisk skażonych arsenem bez ograniczeń szerokością geograficzną. Ze względu na fakt, że plazmid pSinA jest zdolny do replikacji w komórkach bakterii należących do Alphaproteobacteria i Gammaproteobacteria, może być stosowany praktycznie w każdym środowisku. Powszechnie wiadomo, że bakterie należące do Alphaproteobacteria i Gammaproteobacteria występują zasadniczo w każdym badanym środowisku.

Wynalazek w kolejnym aspekcie dotyczy nowego szczepu bakteryjnego zdolnego do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzonego sposobem według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również kompozycji do biologicznego usuwania arsenu obejmującej nowy szczep bakteryjny Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, nowy szczep bakteryjny zdolny do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzony sposobem według wynalazku lub plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.

PL 219 153 B1

W innym aspekcie wynalazek dotyczy zastosowania nowego szczepu bakteryjnego Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, nowego szczepu bakteryjnego zdolnego do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzonego sposobem według wynalazku, plazmidu pSinA przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 lub ich kombinacji do konstrukcji szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów.

Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania nowego szczepu bakteryjnego Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, nowego szczepu bakteryjnego zdolnego do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzonego sposobem według wynalazku, kompozycji według wynalazku lub ich kombinacji w procesach biologicznego usuwaniu arsenu.

W korzystnym zastosowaniu biologiczne usuwanie arsenu obejmuje bioremediację, korzystnie bioaugmentację lub biometalurgię arsenu.

Poprzez „bioremediację” należy rozumieć przekształcanie szkodliwych substancji obecnych w środowisku do mniej toksycznych lub całkowicie bezpiecznych metabolitów, za pomocą drobnoustrojów lub wyższych organizmów.

Zgodnie z wynalazkiem „bioaugumentacja” - oznacza wprowadzanie do środowiska naturalnego bądź zdegradowanego, wyselekcjonowanych szczepów/zestawu mikroorganizmów w celu zwiększenia wydajności i możliwości przebiegu danego procesu.

Przez „biometalurgię” należy rozumieć technologię odzyskiwania metali z rud metali i odpadów przemysłu metalurgicznego.

W innym aspekcie wynalazek dotyczy sposobu bioaugumentacji środowiska skażonego arsenem, który obejmuje etap wprowadzenia nowego szczepu Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, nowego szczepu bakteryjnego zdolnego do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzonego sposobem według wynalazku kompozycji według wynalazku lub ich kombinacji do środowiska skażonego arsenem.

Wynalazek dotyczy więc sposobu bezpośredniego wprowadzenia plazmidu pSinA do środowiska w ramach bioaugmentacji szczepem Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, Sinorhizobium sp. M14, szczepem bakteryjnym zdolnym do chemolitotroficznego utleniania arseninów otrzymanym w sposobie wytwarzania według wynalazku obejmującym plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, lub kompozycją według wynalazku.

W przypadku gdy nie ma możliwości bezpośredniego skonstruowania szczepów utleniających arseniny na bazie mikroflory autochtonicznej, można wprowadzić plazmid do środowiska za pomocą metod bioaugmentacji. Wprowadzany jest szczep zawierający plazmid pSinA lub kompozycja według wynalazku do gleby i/lub wody skażonej związkami arsenu i w wyniku naturalnej koniugacji plazmid jest przekazywany do komórek mikroorganizmów autochtonicznych.

Zaletą szczepów bakteryjnych obejmujących plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1 wytworzonych sposobem według wynalazku jest ich stabilne utrzymywanie wprowadzonego plazmidu. Takie szczepy nie są w stanie się go pozbyć nawet w warunkach braku presji selekcyjnej tj. przy braku arsenu w podłożu, co jest wynikiem posiadania na plazmidzie genów kodujących układ toksyny i antytoksyny, który zapewnia stabilne utrzymywanie plazmidu w bakteriach. Szczególnie korzystne jest stosowanie w bioaugumentacji szczepu Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, pochodnej A. tumefaciens bakterii uznawanej za środowiskowo bezpiecznej i dopuszczonej do stosowania w środowisku glebowym i wodnym. Ponadto, zaletą nowo wytworzonych szczepów bakteryjnych obejmujących płazmid pSinA jak Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p (D10), Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p (C10), w przeciwieństwie do szczepu macierzystego - Sinorhizobium sp. M14 jest zdolność do utleniania (do ~400 mg/L) arseninów do arsenianów z wydajnością 100% lub bliską 100% i brakiem akumulacji wewnątrz komórek arsenu.

Wynalazek dotyczy również sposobu usuwania albo odzyskiwania arsenu poprzez chemolitotroficzne utlenianie arseninów w którym etap chemolitotroficznego utłeniania arseninów prowadzony jest przez nowy szczep Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p, nowy szczep bakteryjny zdolny do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzony sposobem według wynalazku, kompozycję według wynalazku zawierająca szczepy zdolne do chemolitotroficznego utleniania arseninów lub ich kombinację.

W korzystnym sposobie usuwania albo odzyskiwania arsenu po etapie chemolitotroficzngo utleniania arseninów następuje etap usuwania arsenianów np. strącanie powstających arsenianów w formie nierozpuszczalnego, stabilnego osadu lub adsorpcja arseninów. Do strącania lub

PL 219 153 B1 adsorpcji i efektywnego usuwania arsenianów korzystnie można wykorzystać m.in. wapno palone (CaO) (Twidwell et al. 1999), wodorotlenek wapnia Ca(OH)2 (Bothe, Brown 1999) albo żelazowe rudy darniowe.

W opisie przedstawiono również metody selekcji i identyfikacji trasnkoniugantów uzyskanych w wyniku koniugacji dwu i trójrodzicielskiej opartej na cechach fenotypowych kodowanych na plazmidzie pSinA.

Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone jako referencje. Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:

Figura 1. Przedstawia organizację genetyczną plazmidu pSinA. Na schemacie opisano poszczególne moduły szkieletu plazmidu i regiony fenotypowe: REP/STA i REP/STA2 - moduły replikacyjno-stabilizujące, TRA/TRB - moduł koniugacyjny, ARS - moduł metabolizmu arsenu, HMR - moduł oporności na arsen oraz moduł TOKSYNA/ANTYTOKSYNA. W obrębie modułu REP/STA znajduje się system repABC (replikacja i system partycyjny - aktywnego rozdziału) system MRS (ang. multimer resolution system - system rozdziału multimerów) oraz system PHD-DOC (system addykcyjny - toksyna/antytokysna).

Figura 2. Przedstawia porównanie zdolności do utleniania arseninów przez dzikie szczepy (wt) Agrobacterium tumefaciens LBA288 i Paracoccus alcaliphilus JCM7364R oraz ich pochodne Agrobacterium tumefaciens zdeponowany jako KKP 2039p (D10) i Paracoccus alcaliphilus zdeponowany jako KKP 2040p (C10) niosące plazmid pSinA. W celu porównania zdolności badanych szczepów do utleniania arseninów do arsenianów prowadzono hodowle na podłożu minimalnym MSM zawierającym 5 mM (375 ppm) arseninu sodu. (A) i (B) przedstawia zawartość As(III) i As(V) w płynach hodowlanych pobieranych z hodowli co 24 godziny. (A) przedstawia porównanie kinetyki utleniania arseninów przez szczep A. tumefaciens LBA288 i jego pochodną, szczep A. tumefaciens (D10) z pSinA; (B) przedstawia porównanie kinetyki utleniania arseninów przez szczep P. alcaliphilus JCM7364R i jego pochodną P. alcaliphilus (C10) z pSinA; (C) przedstawia porównanie wartości MIC (ang. minimal inhibitory concentration) dla As(III) pomiędzy dzikimi szczepami A. tumefaciens LBA288 oraz P. alcaliphilus JCM7364R i ich odpowiednimi pochodnymi, niosącymi plazmid pSinA: A. tumefaciens KKP 2039p (D10) i P. alcaliphilus KKP 2040p (C10).

Figura 3. Przedstawia wykres obrazujący częstość transferu koniugacyjnego płazmidu pSinA z komórek szczepu Sinorhizobium sp. M14 do komórek bakterii autochtonicznych. W eksperymencie wykorzystano dwie próbki gleby: (I) pochodząca z okolicy Złotego Potoku i oznaczona jako ZP oraz (II) pochodząca z okolic Potoku Trująca i oznaczona jako PT. - zaznaczono szczep Sinorhizobium sp. M14 (donor plazmidu pSinA); - autochtoniczna mikroflora zdolna do utleniania arseninów, zawierająca bakterie z rodzajów: Brevundimonas sp., Stenotrophomonas sp., i Pseudomonas sp. dla gleby I (ZP) oraz (ii) Achromobacter sp., Acidovorax sp., Acinetobacter sp. Brevundjmonas sp., Microbacterium sp., Pseudomonas sp., i Stenotrophomonas sp. dla gleby II (PT); >-- transkoniuganty niosące plazmid pSinA - pochodne bakterii autochtonicznych, w tym bakterie z rodzaju Sinorhizobium sp. i Pseudomonas sp. dla gleby I (ZP) oraz Brevundimonas sp., Sinorhizobium sp. i Pseudomonas sp.dla gleby II (PT).

Figura 4. Przedstawia porównanie wydajności usuwania arsenianów poza komórkę przez dziki szczep Sinorhizobium sp. M14 oraz nowo utworzone szczepy niosące plazmid pSinA: Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p (D10) i Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p (C10) . W celu porównania wydajności badanych szczepów do utleniania As(III) do As(V) i usuwania powstających arsenianów, prowadzono hodowle na podłożu minimalnym MSM zawierającym 5 mM (375 ppm) arseninu sodu. Na wykresie przedstawiono zawartość As(V) w płynach hodowlanych pobieranych z hodowli co 24 godziny.

Figura 5. Zdjęcie z obserwacji i analiza ziarnistości o dużej gęstości elektronowej w komórkach Sinorhizobium sp. M14. A - Transmisyjna mikroskopia elektronowa. B - Analiza rentgenowska

Figura 6. Przedstawia wykres obrazujący częstość transferu koniugacyjnego plazmidu pSinA z wytworzonych szczepów niosących ten plazmid: Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p (D10) i Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p (C10) do komórek bakterii autochtonicznych. W eksperymencie wykorzystano próbkę gleby pochodzącą z okolic Złotego Potoku. Częstość transferu koniugacyjnego oszacowano po 15 dniach inkubacji w temperaturze pokojowej. - zaznaczono częstość transferu koniugacyjnego plazmidu pSinA gdy jako donor wykorzystano Agrobacterium

PL 219 153 B1 tumefaciens KKP 2039p (D10); Ό - zaznaczono częstość transferu koniugacyjnego plazmidu pSinA gdy jako donor wykorzystano Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p (C10);

Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.

W po niższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. i D.W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Charakterystyka plazmidu pSinA i określenie jego pełnej sekwencji

Plazmid pSinA o wielkości 109 kpz został wyizolowany z szczepu Sinorhizobium sp. M14 (Drewniak i wsp., 2008, Drewniak i wsp. 2010). W celu zsekwencjonowania plazmidu wyizolowano plazmid pSinA z 200 ml nocnej hodowli Sinorhizobium sp. M14 metodą lizy alkaliczn ej. Plazmid pSinA zsekwencjonowano metodą pirosekwencjonowania stosując strategię typu „shotgun” na sekwenatorze GS FLX Titanium (454) (w centrum Oligo P1.). Do konstrukcji biblioteki DNA wykorzystano ok. 5 μg DNA pSinA i zastsosowano dostarczone przez producenta zestawy odczynników (GS FLX Titanium Library Preparation Kit, Roche). Skonstruowana biblioteka została zsekwencjonowana i poskładana z wykorzystaniem programów z pakietu Newbler de novo assembler (Roche). Uzyskane sekwencje zostały następnie złożone w kontigii z wykorzystaniem programów Seqman z pakietu Lasergene package (DNAStar). Adnotację plazmidu (wyróżnienie otwartych ramek odczytu i określenie ich potencjalnych funkcji) wykonano z wykorzystaniem programu Artemis oraz programów BLAST (z bazy NCBI).

Sekwencjonowanie plazmidu pSinA wykazało, że jest to cząstka DNA o wielkości 108 938 pz i zawartości par GC 59.5%. W jej skład wchodzą 103 otwarte ramki odczytu (ORF), co stanowi 89% sekwencji plazmidu. Poniżej w Tabeli 1 przedstawiono szczegółowy opis wyróżnionych ORF w obrębie SEKW. ID. NR 1.

T a b e l a 1. Wyznaczenie potencjalnych sekwencji kodujących plazmidu pSinA w odniesieniu do SEKW. ID. Nr 1.

*Numery podane w sekwencji kodującej odpowiadają nr nukleotydów z SEKW. ID. NR1

Nr ORF	Sekwencja kodująca (start-stop kodon)*	Wielkość białka (aa)	Przewidywana funkcja białka	Największe podobieństwo (porgram BLASTP)
Ident. (%)	Organizm	Numer w GenBank
1	189-1463	424	Replication initiation protein (Rep A)	90 (380/424)	Agrobacterium rhizogenes (pRil724) '	NP_066713
2	1567-2571	334	Replication initiation protein (RepB)	71 (236/335)	Agrobacterium rhizogenes (pRiI724)	NP„OĆ6714
3	2740-3951	403	Replication initiation protein (RepC)	73 (288/399)	Rhizobium etli CFN 42 (p42a)	YP.471771
4	4297-5457c	386	Integrase family protein (Cre-like recombinases)	82 (305/372)	Rhizobium leguni nosa rum bv. trifolii WSM2304(pRL8)	YP 770909
5	5535-5813	92	Prcvent-host-dcath family protein	84 (77/92)	Rhizobium leguttinosarum bv. trifolii WSM2304(pRL8)	YP 002279 248
6	5800-6231	143	Hypothetical protein (PemK-Iike protein)	75 (107/143)	Brucella ovis ATCC 25840	YP.001257 527
7	6467-7597	376	Protein of unknown function (DUF1612)	67 (253/380)	Agrobacterium radiobacter K84	YP 002546 559
8	7688-8281	197	Hypothetical protein	97(179/185)	Agrobacterium tumefaciens (pTi)	NP,.O53264
9	8345-8731	128	Predicted nucleic acid-binding protein (PilT protein-like protein)	91 (100/111)	Agrobacterium tumefaciens (pTi)	NP.053265
10	8768-12582c	1271	Putative protein involved in celi division and chromosome partitioning	28 (326/1181)	Rhizobium etli CIAT 652	YP 001984 284
11	12767-13393	208	Hypothetical protein	85(177/209)	Rhodopscudomonas palustris BisBIS	YP.532912
12	13414-14253	279	Hypothetical protein	34 (87/256)	Bacillus thuringiensis	ZP.040871

serovar huazhongensis 11

BGSC 4BD1

PL 219 153 B1

13	14474-16219	581	Predicted ATPase (COG5293)	45 (258/585)	Nostoc sp. PCC 7120	NP 485895
14	16235-17032	265	Hypothetical protein (transposofl)	80(211/265)	Pseudomonas aeruginosa	ACD39332
15	17092-17913	273	Hypothetical protein	49 (97/202)	Agrobacterium tumefaciens (pTi)	NP_059784
16	18097-21072	991	Hypothetical protein (ATPase involved iti DNA repair)	86 (837/978)	Labrenria alexandrii DFL- 11	ZP 051144 52
17	21082-21768	228	Putative siderophore biosynthesis-associated protein	72(131/182)	Methylobacterium extorquens DM4	YP 003066 102
18	21761-22699	312	Hypothetical protein	84 (244/293)	Methyłobacterium extorquens DM4	YP 003066 101
19	22735-23241	168	Hypothetical protein	68 (108/161)	Xanthobacter autotrophicus Py2	YP_001415 141
20	23283-23777	164	Hypothetical protein	92(150/164)	Oceanicola granulosus HTCC2516	ZP_011575 50
21	23783-24139C	118	Hypothetical protein	96(113/118)	Rhizobium etli CIAT 894	ZP 035262 52 ABC18312
22	24660-25877C	405	Molybdcnum-biosynthesis protein (MoeA)	84 (338/404)	arsenite-oxidising bacterium NT-26
23	26035-26418c	127	c-type cytochrome c552	97(122/127)	Agrobacterium tumefaciens	ABB51926
24	26508-29045c	845	large subunit of Arsenite oxidase (AoxB)	99(831/845)	Agrobacterium tumefaciens	ABB51928
25	29O58-29585C	175	Stnall subunit of Arsenite osidase (AoxA)	98 (171/175)	Agrobacterium tumefaciens	ABB51929
26	29723-31051C	442	Putative transcriptional regulator (AoxR)	97 (428/442)	Agrobacterium tumefaciens	ABB51925
27	31041-32S07C	488	Putative sensor histidine kinase (AoxS)	97 (470/488)	Agrobacierium tumefaciens	ABB51924
28	32504-33424c	306	Phospbate/phosphonate ABC transporter (PhnD)	57 (167/295)	Xanthobacter autotrophicus Py2	YP_001418 827
29	33604-3429ÓC	230	Phosphate reguton transcriptional regulntory protein (PhoB)	83 (187/227)	Agrobacterium vitis S4	YP_002548 344
30	34661-35698	345	Phosphate-binding protein (PstS)	75 (229/306)	Alcaligenes faecalis	AAQ19844
31	35756-36679	307	Phosphate ABC transporter, tnner membranę subunit (PstC)	75 (227/305)	Alcaligenes faecalis	AAQ19845
32	36679-37626	315	Phosphate ABC transporter, inuer membranę subunit (PstA)	70 (212/303)	Aicaligenes faecalis	AAS45094
33	37644-38486	280	phosphate ABC transporter, ATPase subunit (PstB)	75 (195/262)	Alcaligenes faecalis	AAS45095
34	38502-39179	231	Phosphate transport system regulatory protein (PhoU)	49 (108/224)	Pseudovibrio sp. JE062	ZP 050852 95
35	39203-39865	220	Phosphate regulon transcriptional regulatory protein (PhoB)	40(88/225)	Pseudonibrio sp. JE062	ZP 050853 50
36	39872-40963c	273	Bifunctional protein: N-terminal transcriptional regulator (ArsR) and C-tenninal arsenate reductase (ArsC)	47 (130/280)	Nitrobacter hamburgensis X14(pPB12)	YP_571847
37	40850-41803	317	Phospbate/phosphonate ABC transporter (PhnD)	78 (232/300)	Xauth oba eter autotrophicus Py2	YP 001418 843
38	41877-42716	279	Phosphonaie ABC transporter, ATP-binding protein (PhnC)	76 (190/251)	Roseobacter sp. AzwK-3b	ZP 019049 69
39	42716-43531	271	Phosphonate uptake ABC type transporter (PhnE)	75 (197/266)	Fulvinarina pelagi HTCC2506	ZP 014384 81
40	43531-44349	272	Phosphonate uptake ABC type transporter (PhnE)	70 (187/268)	Vibrio metschnikorii CIP 69.14	ZP_058813 11
41	44496-44855	119	ArsR family transcriptional regulator	72(80/112)	Rhizabium etli CIAT 894	ZP 035303 66
42	45085-45612	175	Tyrosine arsenate reductase (ArsC)	89 (147/166)	Rhiaobium etli CIAT 894	ZP_035303 68
43	45717^46151	144	Arsenate reductase (ArsC)	80(114/143)	Sinorhizobium medicae WSM419	YP_001313 767
44	46237-47307	356	Arsenite efflux transporter (AsrB)	89(314/356)	Sinorhizobium medicae WSM419	YP 001313 766
45	47324-48367	347	FAD-dependent pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase (TrkA)	62 (206/336)	Burkholderia vietuamiensis G4	YP 001114 753
46	4831749537C	406	Major facilitator superfamily (MFS_1) protein	68 (272/404)	Rhizobium leguninosarum bv. trifolii WSM1325	YP 002976 231
47	49534-5024lc	235	NADPH-dependenl FMN reductase (ArsH)	84 (196/235)	Rhizobium leguminosaTum bv. viciae 3841	YP.768473
48	50290-50622C	110	ArsR family transcriptional regulator	65 (63/97)	Agrobacierium ritis S4	YP_002547 788
49	S0781-51596C	271	Putative universal stress response protein (UpsA)	34 (92/271)	Rhiznbium etli CFN 42	YP_472Ó5O
50	51610-52875C	421	Putative phosphopynivate hydratase (euolase)	70 (291/421)	Methylococcus capsulatus str. Bath	YP_114366
51	52931-531lćc	61	Hypothetical protein	51 (30/59)	Rhizobium leguttinosarutn bv. trifolii WSM2304	YP 002279 234

PL 219 153 B1

52	53176-53514c	112	Hypothetical protein	92 (94/103)	Rhizobium etli IE4771	ZP 035174 89 YP .002548 815
53	53752-55569c	605	C1C sycA-like chloride channel protein	80(343/433)	Agrobacterium vitis S4
54	55761-56153C	130	Hypothetical protein	48 (30/63)	Burkholderia phytofirmans PsJN	YP 001893 937
55	56215-56706	163	Putative Co/Zn/Cd efflux system component (CzcD)	71 (109/155)	Methylobacterium nodulans ORS 2060	YP 002497 120
56	56763-5755 lc	262	Predicted permease (DUF81)	76 (177/233)	Methylobacterium extorquens DM4	YP_003068 171
57	57710-58918c	402	pH-dependent sodium/proton antiporter	74 (287/392)	Rhizobium etli CFN 42	YP.468132
58	59238-59546	102	Hypothetical protein (probable helicase)	50 (38/77)	Agrobacterium vitis S4	YP 002542 648
59	59529-59969C	146	MerR family transcriptional regulator	100(146/146)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP_001371 693
60	60055-60480	141	Mercuric transporter (MerT)	100(141/141)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP 001371 694
61	60501-60794	97	Mercuric transport protein periplasmic component (MerP)	100 (97/97)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP 001371 695
62	61040-63277	745	Mercuric reductase (MerA)	100(745/745)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP.001371 697
63	63661-65805C	714	Hypothetical protein (putative phage integrase)	99 (713/714)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP 001371 699
64	65802-67610C	602	Hypothetical protein (putative phage integrase)	100 (602/602)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP 001371 700
65	67610-69049c	479	Putative XerD integrase	100 (479/479)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188	YP .001371 701
66	69480-70514	344	Putative RecA relaxase	62 (209/341)	Rhizobium etli CFN 42	YP 471728
67	70577-71182	201	Protein of unknown function (DUF1419)	73 (145/201)	Agrobacterium rhizogenes	NP_066672
68	71278-71571c	97	Hypothetical protein	37 (35/95)	Agrobacterium tumefaciens	NP_053284
69	71747-76921	1724	S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase	86 (1445/1687)	Rhizobium leguninosarurn bv. viciae3841	YP_770997
70	77344-79101	585	Partitioning protein ParBC	71 (408/578)	Agrobacterium rhizogenes	YP 001961 038 YP_001961 040 YP_001373 171
71	79098-79991	297	Hypothetical protein	61 (171/282)	Agrobacterium rhizogenes
72	79998-80299	103	Hypothetical protein	43 (38/89)	Ochrobactrum anthropi ATCC 49188
73	80356-80589	77	Hypothetical protein	68 (27/40)	Rhizobium etli IE4771	ZP_035141 74 YP 001961 043 YP_771003
74	80683-81270	195	Hypothetical protein	83(161/194)	Agrobacterium rhizogenes
75 76	81548-82471 82799-83125	307 108	Conjugal transfer aniirestriction protein (ArdC) Hypothetical proteiu	82 (244/300)	Rhizobium leguninosarurn bv. viciae 3841 No significant similarities found
77	83142-83450	102	Protein of unknown function (DUF736)	99 (100/102)	Sinorhizobium meliloti	YP 001965 632
78 79	83600-83938 84033-84302	112 89	Hypothetical protein Hypothetical protein	61 (69/114)	Agrobacterium vids S4 No significant similarities found	YP 002551 439
80	84441-84893c	150	Putative nuclease	64 (96/150)	Rhizobium leguninosarurn bv. viciae 3841	YP_771010
81	85731-87668C	645	Conjugal transfer coupling protein (TraG)	82 (508/627)	Rhizobium etli CFN 42	YP„471745
82	87655-87870c	71	Conjugal transfer protein (TraD)	80 (56/70)	Rhizobium ieguninosarum bv. viciae 3841	YP_771013
83	87875-88171C	98	Conjugal transfer protein (TraC)	69 (67/98)	Agrobacterium tumefaciens	BAB47248
84	88422-91745	1107	Dtr system oriT relaxase (TraA)	78 (855/1109)	Agrobacterium tumefaciens	BAB47249
85	91742-92308	188	Conjugal transfer pilin processing protease (TraF)	55 (102/188)	Rhizobium leguninosarurn bv. viciae 3841	YPJ771016
86	92298-93464	388	Conjugal transfer protein (TraB)	62 (239/388)	Rhizobium sp. NGR234	NP 443826
87	93482-94093	203	Conjugal transfer protein (TraH)	71 (144/205)	Rhizobium leguninosarurn bv. viciae 3841	YP_770822
88	94126-94746C	206	Hypothetical protein	71 (144/205)	Rhizobium leguninosarurn bv. viciae 3841	YP. 770822
89	94747 95502c	251	Hypothetical protein	65 (165/255)	Rhodopseudomonas palustris DX-1	ZP 063576 67
90	96193-96897	234	Putative LuxR-type trauscriptional regulator protein (TraR)	51 (119/234)	Sinorhizobium meliloti	YP_001965 652
91	96912-9721 lc	99	TraR antiactivator (TraM)	52 (51/99)	Agrobacterium tumefaciens	NP 053353
92	97764-98483	239	AHL-dependent transcriptional regulator similar to LuxR	59 (134/231)	Rhizobium leguninosarurn	AF210630_ 2
93	98601-99263	220	Conjugation factor synthetase (Trał)	62 (136/221)	Rhizobium etli Brasil 5	ZP_035047 72
94	99303-100598C	431	Conjugal transfer protein (TrbI)	76 (328/432)	Sinorhizobium meliloti	YP_001965

PL 219 153 B1

SM 11 654

95	100611- 101054c	147	Conjugal transfer protein (Tibll)	70(100/143)	Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841	YP_771025
96	101058- 101888e	276	Conjugal transfer protein (TrbG)	86 (237/276)	Sinorhizobium meliloti SM11	YP_001965 656
97	101904- 102566c	220	Conjugal transfer protein (TrbF)	92(201/220)	Rhizobium leguminosarum bv. viciae3841	YP_771027
98	102588- 103769c	393	Conjugal transfer protein (TAL)	87 (327/380)	Rhizobium etli IE4771	ZP 035195 61
99	103944- 104747c	267	Conjugal transfer/entry exclusion protein (TAJ)	87 (205/238)	Rhizobium leguiiinosarum bv. viciae	AAO21104
100	104740- 107175C	811	Conjugal transfer protein (TAE)	89(719/809)	Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841	YP 771030
101	107186- 1O7485C	99	Conjugal transfer protein (TAD)	78 (77/99)	Rhizobium etli CEN 42	YP_471765
102	107478- 107870C	130	conjugal transfer protein (TrbC)	74 (97/132)	Rhizobium leguminosarum bv. viciae 3841	YP_771032
103	107860- 108825c	321	conjugal transfer protein (TrbB)	90 (288/321)	Sinorhizobium meliloti SM11	YP 001965 665

P r z y k ł a d 2. Konstrukcja szczepów Agrobacterium tumefaciens i Paracoccus alcaliphilus zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów

Aby wykazać, że plazmid pSinA może być zastosowany do konstrukcji szczepów zdolnych do utleniania arseninów wprowadzono plazmid pSinA do dwóch szczepów należących do Alphaproteobacteria. Do konstrukcji wybrano dwa szczepy: Agrobacterium tumefaciens LBA288 i Paracoccus alcaliphilus JCM7364R, niezdolne do utleniania arseninów i wrażliwe na As (III) (1 mM arseninu sodu hamuje wzrost obu szczepów). Jako metodę wprowadzania plazmidowego DNA zastosowano koniugację dwu- i trójrodzicielską opisaną w Sambrook i Russel, 2001.

Aby można było wprowadzić plazmid pSinA do wybranych szczepów, należy znać ich cechy fenotypowe, które można wykorzystać jako markery do selekcji, umożliwiające eliminację komórek donora plazmidów. W przypadku gdy nie można zastosować żadnej z cech fenotypowych kodowanych przez szczep biorcy, należy go odpowiednio zmodyfikować (przykład 2A) lub zastosować odpowiednią metodę identyfikacji transkoniugantów (przykład 2B).

P r z y k ł a d 2A. Konstrukcja szczepów opornych na tetracyklinę

Szczep A. tumefaciens LBA288 nie niesie żadnych cech fenotypowych, które umożliwiają zastosowanie odpowiedniej presji selekcyjnej do eliminacji komórek dawcy plazmidu. W związku z powyższym w celu zastosowania odpowiedniej metody selekcji, wprowadzono do jego komórek plazmid pBBR1MCS3 (Kovach i wsp., 1995), niosący gen oporności na tetracyklinę. Szczep Sinorhizobium sp. M14 jest wrażliwy na tetracyklinę co umożliwia usunięcie komórek szczepu dawcy w koniugacji. Plazmid pBBR1MCS3 (uprzednio wprowadzony do komórek Escherichia coli TG1) został wprowadzony do komórek szczepu A. tumefaciens LBA288 z zastosowaniem koniugacji trójrodzicielskiej, w której wykorzystano plazmid pomocniczy pRK2013 (Ditta i wsp. 1980) (uprzednio wprowadzony do komórek Escherichia coli TG1). Plazmid pomocniczy ułatwia koniugację, w przypadku szczepów, które mają tylko geny odpowiedzialne za sam transfer, a nie mobilizację do transferu. Koniugację poprowadzono według Sambrook i Russel (2001), a do selekcji trasnkoniugantów zastosowano podłoże LB wzbogacone tetracykliną (20 μg/ml) (eliminuje komórki biorcy) oraz rifampicyną (50 μg/ml) (eliminuje komórki szczepu dawcy i szczepu niosącego plazmid pomocniczy - w obu przypadkach Escherichia coli TGl). Przygotowane hodowle dawcy (E. coli TG1 z plazmidem pBBR1MCS3), szczepu pomocniczego (E. coli TG1 z plazmidem pRK2013) i biorcy (A. tumefaciens LBA288) mieszano w stosunku 1:1:2, po czym 100 μl mieszaniny wysiewano na podłoże LB. Po 24 godzinnej inkubacji w 30°C kolonie bakterii

-3 zmywano z powierzchni szalki 2 ml roztworu fizjologicznego, a odpowiednie rozcieńczenia (10⁰ - 10^-3) wysiewano na podłoże selekcyjne LB uzupełnione tetracykliną i ryfampicyną, a następnie inkubowano przez 48 h w 30°C. W wyniku przeprowadzonej koniugacji uzyskano transkoniuganty, pochodne A. tumefaciens LBA288 niosące plazmid pBBR1MCS3. Do dalszej analizy wybrano jeden szczep, nazwany A. tumefaciens PBBR-Tc. Uzyskany szczep został następnie wykorzystany jako szczep biorcy w koniugacji ze szczepem Sinorhizobium sp. M14.

Wprowadzenie plazmidu pSinA do komórek szczepów opornych na tetracyklinę. Wytworzenie szczepu A. tumefaciens D10 (zdeponowanego jako KKP2039p)

W celu wprowadzenia plazmidu pSinA do komórek szczepu A. tumefaciens PBBR-Tc, ponownie zastosowano koniugację trójrodzicielską (z wykorzystaniem plazmidu pomocniczego pRK2013, wprowadzonego do komórek E. coli TG1) oraz dodatkowo koniugację dwurodzicielską. Jako dawca w obu typach koniugacji zastosowany był szczep Sinorhizobium sp. M14, który jest zdolny do utleniania

PL 219 153 B1 arseninów i jest oporny na As(III) (do 20 mM) oraz wrażliwy na tetracyklinę. Do selekcji transkoniugantów zastosowano podłoże LB (Sambrook i Russel, 2001) wzbogacone 2.5 mM As(III) oraz tetracyklinę (20 pg/ml). Przygotowane hodowle dawcy (Sinorhizobium sp. M14 z plazmidem pSinA4), szczepu pomocniczego (E. coli TG1 z plazmidem pRK2013) (w przypadku koniugacji trójrodzicielskiej) i biorcy (A. tumefaciens PBBR-Tc) mieszano w stosunku 1:1:2, po czym 100 pl mieszaniny wysiewano na podłoże LB (Sambrook i Russel, 2001). Po 24 godzinnej inkubacji w 30°C kolonie bakterii zmywano 0 -3 z powierzchni szalki 2 ml roztworu fizjologicznego i rozcieńczenia (10⁰ - 10^-3) wysiewano na podłoże selekcyjne LB uzupełnione tetracykliną i arseninem sodu, a następnie inkubowano przez 48 h w 30°C. Potencjalne transkoniuganty poddawano następującym analizom:

1. analiza fizjologiczna na określenie zdolności do utleniania As(III) na zmodyfikowanym podłożu MSM (Drewniak i wsp., 2008) - w celu oznaczenia zdolności do utleniania As(III) szczepy potencjalnych transkoniugantów hodowano w podłożu MSM wzbogaconym arseninami (jedyne źródło energii) w temperaturze 30°C. Po 5 dniach inkubacji w warunkach tlenowych, pobierano 500 pl hodowli i dodawano do 500 pl 0,1 M roztworu azotanu srebrowego. Wynikiem reakcji pomiędzy AgNO3 a As(III) lub As(V) jest wytworzenie się kolorowego osadu. Brązowy osad świadczy o obecności Ag3AsO4 (ortoarsenian srebrowy), podczas gdy żółty osad świadczy o obecności Ag3AsO3 (arsenin srebrowy). W przypadku testu na zdolność do utleniania arseninów obecność brązowego osadu świadczy, więc o utlenieniu As(III) do As(V).

2. hybrydyzacja DNA-DNA metoda Southerna - w celu identyfikacji genów plazmidu pSinA w genomach potencjalnych transkoniugantów. Jako sondy stosowano, zamplifikowane w reakcji PCR (przy użyciu starterów przedstawionych w tabeli 2) i wyznakowane digoksygeniną, fragmenty genów zlokalizowanych na plazmidzie pSinA. Hybrydyzację prowadzono wobec DNA plazmidów wyizolowanych z transkoniugantów, uzyskanych poprzez minilizę alkaliczną i uwidocznionych w trakcie elektroforezy DNA.

3. analizy PCR - w celu identyfikacji genów plazmidu pSinA w genomach potencjalnych transkoniugantów przeprowadzono reakcję PCR z zastosowaniem starterów opisanych w tabeli 2.

4. wizualizacja plazmidów potencjalnych transkoniugantów uzyskanych poprzez minilizę alkaliczną i uwidocznionych w trakcie elektroforezy DNA

Do analizy hybrydyzacyjnej i analizy PCR wykorzystano geny i startery przedstawione w Tabeli 2.

T a b e l a 2.

Sekwencje starterów użytych do amplifikacji PCR genów plazmidu pSinA oraz chromosomalnych genów 16S rRNA

Nazwa genu	Starter	Sekwencja	Pozycja w genomie plazmidu pSinA w odniesieniu do SEKW. ID. NR 1
aoxB	aoxBF	CCACTTCTGCATCGTCGGCT	26701-26721
aoxBR	GTCGGTGTCGGATAGGCCAT	28954-28974
repA	repAF	CGTGCGCTATCTTCAGACGG	188-208
repAR	GCTTGAGTTCTTCGTAGTCC	1709-1729
traI	tralF	GTGCTCATCGGAGTGAATGG	98200-98220
traIR	GACATCAAGGATCTCGGCTA	99912-99932
orfl2	12F	GCAATCGGTCTCACAAGAGG	12122-12142
12R	AAGGCGCACATCAGCTCGAA	14139-14159
16SrRNA	27F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	Uniwersalne startery do amplifikacji bakteryjnych genów 16S rRNA
1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT

W obu typach koniugacji (dwu i trójrodzicielskiej) uzyskano transkoniuganty niosące plazmid pSinA. Do dalszej analizy wybrano szczep z koniugacji dwurodzicielskiej A. tumefaciens D10 (zdeponowany jako KKP2039p). Szczep ten był zdolny do utleniania arseninów i wykorzystywania ich jako donor elektronów (źródło energii) (Fig. 2A). Dodatkowo szczep ten zwiększył swoją tolerancje na As(III) (Fig. 2C). Aby sprawdzić czy skonstruowany szczep stabilnie utrzymuje plazmid przeprowadzono serię pasaży (4-6 razy) na podłożach bez presji selekcyjnej. Uzyskane wyniki wykazały, że skonstruowany

PL 219 153 B1 szczep A. tumefaciens D10 stabilnie utrzymuje plazmid pSinA. Po ok. 60 generacjach wzrostu w warunkach bez presji selekcyjnej (braku arsenu) nie zaobserwowano komórek bezplazmidowych.

P r z y k ł a d 2B.

W przypadku gdy nie chcemy stosować presji selekcyjnej związanej ze stosowaniem anatybiotyków istnieje możliwość pośredniej selekcji transkoniugantów niosących plazmid pSinA lub jego pochodną. W tym celu przeprowadza się koniugację dwu lub trójrodzicielską stosując podłoże minimalne MSM jako podłoże selekcyjne oraz arsenin sodu jako jedyny związek do selekcji potancjalnych transkoniugantów. Następnie przeprowadza się identyfikację ok. 100 - 200 losowo wybranych kolonii potencjalnych transkoniugantów. Identyfikację właściwych szczepów przeprowadza się wykorzystując analizy opisane w przykładzie 2A.

P r z y k ł a d 3. Konstrukcja szczepu Paracoccus alcaliphilus, zdolnego do chemolitotroficznego utleniania arseninów

Szczepy do których wprowadzono plazmid pSinA (np. A. tumefaciens zdeponowany jako KKP2039p (D10)) mogą być także być wykorzystane do konstrukcji kolejnych szczepów zdolnych do utleniania arseninów. W celu potwierdzenia powyżeszgo założenia wykorzystano szczep A. tumefaciens D10 do transferu plazmidu pSinA do szczepu Paracoccus alcaliphilus JCM7364R (Bartosik i wsp., 2002). Szczep ten jest nie zdolny do utleniania arseninów i jest wrażliwy na As(III) (1 mM arseninu sodu hamuje wzrost). Jako metodę wprowadzania plazmidowego DNA zastosowano koniugację dwurodzicielską opisaną w Sambrook i Russel (2001).

Konstrukcja szczepu P. alcaliphilus opornego na kanamycnę

Ponieważ szczep P. alcaliphilus JCM7364R nie niesie żadnych cech fenotypowych, które umożliwiają zastosowanie odpowiedniej presji selekcyjnej do eliminacji komórek dawcy plazmidu, zostały przeprowadzone manipulacje genetyczne polegające na wprowadzeniu do komórek szczepu P. alcaliphilus JCM7364R plazmidu pBBR1MCS2 (Kovach i wsp., 1995), niosącego oporność na kanamycynę. Szczep A. tumefaciens KKP2039p (D10), który wykorzystano jako dawcę w koniugacji, jest wrażliwy na kanamycynę, co umożliwiło usunięcie komórek szczepu dawcy w koniugacji.

Plazmid pBBR1MCS2 uprzednio wprowadzony do komórek Escherichia coli TG1 został wprowadzony do komórek szczepu P. alcaliphilus JCM7364 z zastosowaniem koniugacji trórodzicielskiej, w której wykorzystano plazmid pomocniczy pRK2013 (Ditta i wsp. 1980) (uprzednio wprowadzony do komórek Escherichia coli TG1). Koniugację poprowadzono według opisu w Sambrook i Russel (2001), a do selekcji trasnkoniugantów zastosowano podłoże LB z kanamycyną (50 pg/ml), które eliminuje komórki biorcy oraz z rifampicyną (50 pg/ml), co pozwała na eliminację komórek szczepu dawcy i szczepu niosącego plazmid pomocniczy - w obu przypadkach Escherichia coli TG1. Przygotowane hodowle dawcy (E. coli TG1 z plazmidem pBBR1MCS2), szczepu pomocniczego (E. coli TG1 z plazmidem pRK2013) i biorcy (P. alcaliphilus JCM7364R) mieszano w stosunku 1:1:2, po czym 100 pl mieszaniny wysiewano na podłoże LB (Sambrook i Russel, 2001). Po 24 godzinnej inkubacji w 30°C kolonie bakterii zmywano z powierzchni szalki 2 ml roztworu fizjologicznego, a odpowiednie rozcień0 -3 czenia (10⁰ - 10^-3) wysiewano na podłoże selekcyjne LB uzupełnione kanamycyną i ryfampicyną, a następnie inkubowano przez 48 h w 30°C. W wyniku przeprowadzonej koniugacji uzyskano transkoniuganty, pochodne P. alcaliphilus JCM7364R niosące plazmid pBBR1MCS2. Do dalszej analizy wybrano jeden szczep, nazwany P. alcaliphilus PBBR-Km. Uzyskany szczep został następnie wykorzystany jako szczep biorcy w koniugacji ze szczepem A. tumefaciens D10 (zdeponowany jako KKP 2039p).

Wprowadzenie plazmidu pSinA z A. tumefaciens KKP 2039p (D10) do P. alcaliphilus PBBR-Km. Wytworzenie szczepu Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p (C10).

W celu wprowadzenia plazmidu pSinA do komórek skonstruowanego szczepu P. alcaliphilus PBBR-Km, zastosowano koniugację trójrodzicielską (z wykorzystaniem plazmidu pomocniczego pRK2013, wprowadzonego do komórek E. coli TG1). Jako dawcę zastosowano szczep A. tumefaciens D10, który jest zdolny do utleniania arseninów i jest oporny na As(III) (do 15 mM) oraz wrażłiwy na kanamycynę. Do selekcji transkoniugantów zastosowano podłoże LB wzbogacone 2.5 mM As(III) oraz kanamycyną (50 pg/ml). Przygotowane hodowle dawcy (A. tumefaciens D10 z plazmidem pSinA), szczepu pomocniczego (E. coli TG1 z plazmidem pRK2013) (w przypadku koniugacji trój rodzicielskiej) i biorcy (P. alcaliphilus PBBR-Km) mieszano w stosunku 1:1:2, po czym 100 pl mieszaniny wysiewano na podłoże LB. Po 24 godzinnej inkubacji w 30°C kolonie bakterii zmywano z powierzchni

-3 szalki 2 ml roztworu fizjologicznego, a odpowiednie rozcieńczenia (10⁰ - 10^-3) wysiewano na podłoże selekcyjne LB uzupełnione kanamycyną i arseninem sodu, a następnie inkubowano przez 48 h w 30°C. Potencjalne transkoniuganty poddawano analizom analogicznym jak w przykładzie 2A.

PL 219 153 B1

W wyniku koniugacji uzyskano transkoniuganty P. alcaliphilus niosące plazmid pSinA. Do dalszej analizy wybrano szczep P. alcaliphilus C10. Szczep ten nabył zdolność do utleniania arseninów i wykorzystywania ich jako donor elektronów (źródło energii) (Fig. 2B). Dodatkowo szczep ten zwiększył swoją tolerancje na As(III) (Fig. 2C). Aby sprawdzić czy skonstruowany szczep stabilnie utrzymuje plazmid przeprowadzono serię pasaży (4 - 6 razy) na podłożach bez presji selekcyjnej. Uzyskane wyniki wykazały, że skonstruowany szczep P. alcaliphilus C10 stabilnie utrzymuje plazmid pSinA. Po ok. 60 generacjach wzrostu w warunkach bez presji selekcyjnej czyli bez arsenu nie zaobserwowano komórek bezplazmidowych.

Przykład 4. Wprowadzanie plazmidu do komórek mikroflory autochtonicznej środowisk skażonych arsenem na drodze bioaugmentacji szczepem Sinorhizobium sp. M14

Aby wykazać, że plazmid pSinA może być wykorzystany w biouagmentacji mikroflory autochtonicznej środowisk skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment na dwóch różnych próbkach gleb pochodzących z okolic kopalni złota w Złotym Stoku. Gleba oznaczona jako ZP (I) pochodziła z okolic Złotego Potoku i zawierała od 1149,3 do 1241 mg As/kg gleby. Gleba oznaczona jako PT (II) pochodziła z okolic Potoku Trująca i zawierała od 528 do 532 mg As/kg gleby. Eksperyment prowadzono przez 60 dni w mikrokosmach z dodatkiem 100 g niesterylnej gleby, do której dodano szczep Sinorhizobium sp. M14. Jako kontrolę zastosowano gleby niewzbogacone szczepem M14. Na początku eksperymentu i co 15 dni pobierano próbki gleby i wysiewano bakterie na stałe podłoże MSM (Drewniak i wsp., 2008) z 5 mM arseninem sodu. Wyrosłe hodowle pasażowano na podłoże LB z 5 mM As(III) oraz na podłoże płynne MSM z 5 mM As(III). W celu sprawdzenia czy wyrosłe kolonie (potencjalne transkoniuganty) niosą plazmid pSinA przeprowadzano następujące analizy: (i) analiza fizjologiczna na określenie zdolności do utleniania As(III) na zmodyfikowanym podłożu MSM; (ii) hybrydyzacja DNA-DNA metodą Southema w celu identyfikacji genów plazmidu pSinA w genomach potencjalnych transkoniugantów; (iii) analizy PCR w celu identyfikacji genów plazmidu pSinA w genomach potencjalnych transkoniugantów; (iv) wizualizacja plazmidów i megaplazmidów potencjalnych transkoniugantów. Do analizy hybrydyzacyjnej i analizy PCR wykorzystano geny i startery przedstawione w Tabeli 2.

Po 60 dniach hodowli w obu próbkach gleb zidentyfikowano transkoniuganty niosące plazmid pSinA. W zależności od typu gleby transkoniuganty stanowiły od 25 - 40% wszystkich bakterii utleniających arseniny wyizolowanych z mikrokosmów (Fig. 3). W poniższej Tabeli 3 przedstawiono listę zidentyfikowanych szczepów, do których wprowadzono plazmid pSinA.

T a b e l a 3.

Klasyfikacja taksonomiczna uzyskanych transkoniugantów glebowych niosących plazmid pSinA

Nazwa szczepu	Grupa taksonomiczna	Podobieństwo do sekwencji zdeponowanych w bazie GenBank (podano nr GenBank) i identyczność [%]
	Transkoniuganty glebowe niosące plasmid pSinA wyizolowane z gleby ZP (I)
SZP1	Alphaproteobacteria	Ensifer adhaerens strain REG34 (EU647697.1) [100%]
SZP2	Alphaproteobacteria	Sinorhizobium sp. S1-2B (AY505137.1) [99%]
SZP3	Alphaproteobacteria	Sinorhizobium sp. TB8-2 (AY505141.1) [99%]
SZP4	Gammaproteobacteria	Pseudomonas marginalis strain LMG 2238

(HE586396.1) [97%]

Transkoniuganty glebowe niosące plasmid pSinA wyizolowane z gleby PT (II)

SPT1	Gammaproteobacteria	Pseudomonas sp. PSA A4(4) (DQ628969.1) [97%]
SPT2	Gammaproteobacteria	Pseudomonas jessenii strain Gd4F (GU391474.1) [99%]
SPT3	Gammaproteobacteria	Pseudomonas sp. BIHB 813 (EF437218.1) [99%]
SPT4	Alphaproteobacteria	Brevundimonas sp. sp. CCBAU (JF772569.1) [99%]
SPT5	Gammaproteobacteria	Pseudomonas sp. OS8

(EF491958.1) [99%]

PL 219 153 B1

Wśród transkoniugantów niosących plazmid pSinA, są szczepy zaklasyfikowane do typu Alphai Gammaproteobacteria. Wszystkie skonstruowane szczepy były zdolne do utleniania arseninów i wykorzystywania ich jako donor elektronów (źródło energii) i stabilnie utrzymywały plazmid pSinA (po ok. 60 generacjach wzrostu na podłożu bez presji selekcyjnej).

Uzyskane wyniki świadczą o możliwościach horyzonatylnego transferu genów metabolizmu arsenu z zastosowaniem plazmidu pSinA. Plazmid ten może być przenoszony międzygatunkowo pomiędzy reprezentantami klasy Alphaproteobacteria i Gammaproteobacteria dzięki obecności systemów replikacyjnych o szerokim zakresie gospodarza oraz systemowi transferu koniugacyjnego. Ze względu na obecność kompletu genów odpowiedzialnych za metabolizm arseninów, szczepy posiadające plazmid pSinA charakteryzują się wysoką tolerancją na związki arsenu oraz są zdolne do utleniania arseninów.

P r z y k ł a d 5. Analiza akumulacji arsenu przez szczepy niosące plazmid pSinA oraz wydajności utleniania

Analiza wydajności utleniania została przeprowadzona dla szczepów Sinorhizobium sp. M14,

A. tumefaciens KKP 2039p (D10) oraz P. alcaliphilus KKP 2040p (C10). Eksperyment wzrostowy i analizę wydajności prowadzono w podłożu MSM wzbogaconym arseninami jako jedynym źródłem energii, w temperaturze 22°C przez 120 godzin. Z płynów hodowlanych zawierających zawierających wyjściowo 5 mM (375 ppm) arseninu sodu pobierano próbki co 24 godziny i oznaczano zawartość As(III) i As(V) (Drewniak i wsp., 2008).

Analiza wydajności utleniania arseninów do arsenianów wykazała, że szczep wyjściowy Sinorhizobium sp. M14 całkowicie utlenia arseniny do arsenianów, które są częściowo usuwane poza komórkę a częściowo akumulowane w komórce. Z początkowego stężenia oznaczonego na 388 mg/L As(III) po 120 godzinach inkubacji pozostało 155 mg/l As(V) (Fig. 4), co przy zerowej zawartości As(III) wskazuje, że część arsenu jest akumulowana w/na komórkach Sinorhizobium sp. M14. W celu sprawdzania czy szczep Sinorhizobium sp. M14 akumuluje arsen, komórki hodowane na podłożu MSM z arseninami obserwowano w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) i poddano analizie rentgenowskiej. Zaobserwowano, że w komórkach M14 występują koliste ziarnistości o dużej gęstości elektronowej (Fig. 5). Wszystkie komórki hodowane na podłożu z dodatkiem arsenu zawierały, co najmniej po dwie „granule”, a ponad 90% zwierało od trzech do pięciu. Nie obserwowano występowania ziarnistości w komórkach hodowanych na podłożu bez dodatku arsenu. Przeprowadzona analiza wykazała, że ziarnistości występujące w komórkach Sinorhizobium sp. M14 zawierają głównie arsen, żelazo i molibden (Fig. 5).

Analiza wydajności utleniania dla szczepów A. tumefaciens KKP 2039p oraz P. alcaliphilus KKP 2040p wykazała, że oba szczepy po 120 godzinach hodowli całkowicie utleniają arseniny do arseninów, które w całości są usuwane poza komórkę (Fig. 4). Na podstawie uzyskanych danych stwierdzono, że szczepy Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p w odróżnieniu od szczepu Sinorhizobium sp. M14, z którego pochodzi plazmid pSinA nie gromadzą w wytwarzanej przez nie biomasie arsenu i wykazują zwiększoną wydajność procesu utleniania As(III) do As(V).

P r z y k ł a d 6. Wprowadzanie plazmidu do komórek mikroflory autochtonicznej środowisk skażonych arsenem na drodze bioaugmentacji szczepem A. tumefaciens KKP 2039p (D10)

Aby wykazać, że nowo skonsturowany szczep A. tumefaciens KKP 2039p oraz wprowadzony do jego komórek plazmid pSinA może być wykorzystany w biouagmentacji mikroflory autochtonicznej środowisk skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment na próbkach gleby pochodzącej z okolic kopalni złota w Złotym Stoku, oznaczonej jako ZP (I). Eksperyment prowadzono przez 15 dni w 100 ml płynnego podłoża MSM (Drewniak i wsp., 2008) z dodatkiem 10 g niesterylnej gleby, do której dodano szczep A. tumefaciens KKP 2039p. Po 15 dniach inkubacji w temperaturze pokojowej pobrano próbki gleby i wysiano bakterie na stałe podłoże MSM z 5 mM arseninem sodu. Wyrosłe hodowle pasażowano na podłoże LB z 5 mM As(III) oraz na podłoże płynne MSM z 5 mM As(III). W celu sprawdzenia czy wyrosłe kolonie (potencjalne transkoniuganty) niosą plazmid pSinA sprawdzano ich zdolności do utleniania As(III) na zmodyfikowanym podłożu MSM. Wszystkie szczepy [donor (A. tumefaciens KKP 2039p) oraz potencjalne transkoniuganty] zdolne do utleniania arseninów zostały następnie poddane szczegółowym analizom: (i) sprawdzenie obecności plazmidu pSinA poprzez identyfikację genów (aoxB, repA, tral, orfl2) plazmidu pSinA w genomach potencjalnych transkoniugantów za pomocą reakcji PCR; (ii) identyfikacja szczepu pełniącego funkcję donora (A. tumefaciens KKP 2039p) oraz transkoniugantów za pomocą analizy fragmentów restrykcyjnych genów 16S rRNA (iii) wizualizacja plazmidów i megaplazmidów potencjalnych transkoniugantów. Do analizy PCR wykorzystano geny

PL 219 153 B1 i startery przedstawione w Tabeli 2. Na Fig. 6 przedstawiono częstość transferu plazmidu pSinA z komórek A. tumefaciens KKP 2039p do komórek bakterii autochtonicznych.

P r z y k ł a d 7. Wprowadzanie plazmidu do komórek mikroflory autochtonicznej środowisk skażonych arsenem na drodze bioaugmentacji szczepem P. alcaliphilus KKP 2040p

Aby wykazać, że nowo skonstruowany szczep P. alcaliphilus KKP 2040p oraz wprowadzony do jego komórek plazmid pSinA może być wykorzystany w biouagmentacji mikroflory autochtonicznej środowisk skażonych arsenem przeprowadzono eksperyment na próbkach gleby pochodzącej z okolic kopalni złota w Złotym Stoku, oznaczonej jako ZP (I). Eksperyment prowadzono przez 15 dni w 100 ml płynnego podłoża MSM (Drewniak i wsp., 2008) z dodatkiem 10 g niesterylnej gleby, do której dodano szczep P. alcaliphilus KKP 2040p. Po 15 dniach inkubacji w temperaturze pokojowej pobrano próbki gleby i wysiano bakterie na stałe podłoże MSM z 5 mM arseninem sodu. Wyrosłe hodowle pasażowano na podłoże LB z 5 mM As(III) oraz na podłoże płynne MSM z 5 mM As(III). W celu sprawdzenia czy wyrosłe kolonie (potencjalne transkoniuganty) niosą plazmid pSinA przeprowadzano analizy jak w przykładzie 6. Na Fig. 6 przedstawiono częstość transferu plazmidu pSinA z komórek P. alcaliphilus KKP 2040p do komórek bakterii autochtonicznych.

W przedstawionych przykładach wykonania twórcy wykazali możliwość wykorzystania naturalnego, niemodyfikowanego genetycznie plazmidu pSinA do konstrukcji szczepów zdolnych do utleniania arseninów, szczególnie korzystnych szczepów nie akumulujących związków arsenu. Wytworzono nowe szczepy Agrobacterium tumefaciens (D10) zdeponowany pod numerem KKP 2039p oraz Paracoccus alcaliphilus (C10) zdeponowany pod numerem KKP 2040p, które nie akumulują arsenu i nie gromadzą go w wytwarzanej przez nie biomasie oraz charakteryzują się zwiększoną wydajnością procesu utleniania As(III) do As(V). Nieoczekiwanie okazało się, że wykorzystanie plazmidu pSinA nie jest ograniczone do szczepów pierwotnie zdolnych do utleniania arseninów. Szczepy całkowicie niezdolne do utleniania arseninów nabywają tą zdolność wraz z nabyciem plazmidu pSinA. Wprowadzenie plazmidu pSinA do komórek gospodarza gwarantuje im nabycie oporności na arseniny i arseniany, jak również na inne metale ciężkie.

Ponadto wykazano, że stosowanie szczepu Agrobacterium tumefaciens KKP 2039p, Paracoccus alcaliphilus KKP 2040p czy też Sinorhizobium sp. M14 oraz innych szczepów niosących plazmid pSinA w usuwaniu arsenu metodami in situ i opartych na utlenianiu As(III) do As(V) gwarantuje stabilność tego procesu. Jeżeli wprowadzone szczepy nie będą zdolne do przetrwania w nowych warunkach, to na drodze horyzontalnego transferu genów przekażą plazmid pSinA do komórek mikroflory autochtonicznej, a to z kolei zagwarantuje zdolność do utleniania arseninów w określonym środowisku.

Literatura powoływana w opisie, włączona niniejszym jako referencje:

- Bartosik, D., Baj, J., Piechucka, E., Waker, E., and Wlodarczyk, M. 2002. Comparative characterization of repABC-type replicons of Paracoccus pantotrophus composite plasmids. Plasmid 48: 130-141

- Chwirka J.D., B.M. Thomson i J.M. Stomp. 2000. Removing arsenic from groundwater. J. Am. Water Works Assoc. 92: 79-88.

- Ditta G., S. Stanfield, D. Corbin i D.R. Helinski. 1980. Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-51.

- Drewniak, L., 2009. Charakterystyka bakterii arsenowych wyizolowanych z kopalni złota w Złotym Stoku. Praca doktorska. Pracownia Analizy Skażeń Środowiska, Uniwersytet Warszawski. Warszawa

- Drewniak, L., Matlakowska, R., Skłodowska, A., 2008. Arsenite and arsenate metabolism of Sinorhizobium sp. M14 living in the extreme environment of the Złoty Stok gold mine. Geomicrobiology Journal 25 (7-8), 363-370.

- Drewniak, L., Matlakowska, R., Rewerski, B., Skłodowska, A., 2010. Arsenic release from gold mine rocks mediated by the activity of indigenous bacteria. Hydrometahurgy 104, 437-442.

- Driehaus W., R. Seith i M.R. Jekel. 1995. Oxidation of arsenic(III) with manganese oxides in water treatment. Water Res. 29: 297-305.

- Hooykaas, P.J.J., den Dulk-Ras, H., Schhperoort, R.A. 1980. Molecular mechanism of Ti plasmid mobilization by R plasmids: isolation of Ti plasmids with transposon-insertions in Agrobacterium tumefaciens. Plasmid 4: 64-75.

- Kostal J., R. Yang, C.H. Wu, A. Mulchandani i W. Chen. 2004. Enhanced arsenic accumulation in engineered bacterial cells expressing ArsR. Appl. Environ. Microbiol. 70: 4582-7.

PL 219 153 B1

- Kovach M.E., Elzer P.H., Hill D. S., Robertson G. T.,. Earris M. A., Roop R.M. i K.M. Peterson. 1995. Pour new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene 166: 175-176

- Lievremont D., A. N'Negue M, P. Behra i M.C. Lett. 2003. Biological oxidation of arsenite: batch reactor experiments in presence of kutnahorite and chabazite. Chemosphere 51: 419-28.

- Pattanayak J., K. Mondai, S. Mathew i S.B. Lalvani. 2000. A parametric evaluation of the removal of As(V) and As(III) by carbon-based adsorbents. Carbon 38: 589-596.

- Sambrook, J., Russell, D.W., 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

- Simeonova D.D., K. Micheva, D.A. Muller, F. Lagarde, M.C. Lett, V.I. Groudeva i D. Lievremont. 2005. Arsenite oxidation in batch reactors with alginate-immobilized ULPAsl strain. Biotechnol.

Bioeng. 91: 441-6.

- Tripathi R.D., S. Srivastava, S. Mishra, N. Singh, R. Tuli, D.K. Gupta i F.J. Maathuis. 2007. Arsenic hazards: strategies for tolerance and remediation by plants. Trends Biotechnol. 25: 158-65.

- Wilkie J.A. i J.G. Hering. 1998. Rapid oxidation of geothermal arsenic(III) in streamwaters of the eastern Sierra Nevada. Sci. Technol. 657-662.

- Yang C, Xu L, Yan L, Xu Y. (2010) Construction of a genetically engineered microorganism with high tolerance to arsenite and strong arsenite oxidative ability. J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng.;45 (6): 732-7.

PL 219 153 B1

Na poniższym wykazie sekwencji:

- SEKW. ID.NR. 1 odpowiada pełnej sekwencji nukleotydowej plazmidu pSinA

WYKAZ SEKWENCJI <110> Uniwersytet Warszawski <120> Nowe szczepy bakteryjne, plazmid. pSinA, sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów i szczepy wytworzone tym sposobem oraz ich zastosowania <130> PK/1609/AGR <160> 1 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 108938 <212> DNA <213> Sinorhizobiurn sp.

<400> 1 aagtcggaga gacggcctgt cggcgtcttg aatatttgcg aacagattgt aagggaagga 60 gattttggac gggaatttat accaggctaa atctctggaa acgttgaaaa aaaaggcggc 120 acagtttgtt gcatcaaaat gcgttaaggt tttgttaacc ctatttctct tgcggacaga 180 cgggaatcgt gcgctatctt cagacggtaa tagcgcgtct gacgctgata aaccgtcttg 240 aacctgaggc taaagtgaac gtgatcgaca ggcacatcag tagggcagca acgtccgcac 300 atattacgca gcgcgcggaa gctctatccg cgagactccg tgcggtcggt gaacgcgcct 360 ttcccccgac cgcgcagaag tcgcttcggt cgttcacctc tggggaggta gccgagatcg 420 ttggtgtttc ggatggctac ctgcgtcaac tctccctgga tggcctcggc ccggcacctg 480 atatcgggac cggtggccga cgctcctata cacttgaaca aatcaatggc ttgcggcagt 540 acctcgccga ggcacgcccc aaggaagcag tgcgtttctg gccccgtcgc cgggagggtg 600 aaaaacttca aatcatcact gtcgccaatt ttaagggtgg ctcggccaag accacgacat 660 ctctatatct cgcgcagggt ctggcgctcc agggttatcg agtccttgcc atagatcttg 720 atccccaggc ctcgctctcc gcgatgtttg gttatcagcc ggaattcgat gttgcggaga 780 ataccacgat atacggcgcc atcaggtatg atgaccagcg tgtggcgatg aaagatgtga 840 tccgcaagac ctacttcacg ggcattagca tcgttcccgg caatcttgag ctgatggagt 900 ttgagcatca gaccccgcga tttatgcttc agaaccgagg acggccagaa gatttgtttt 960 tcaggcgtgt cgcaagcgcc attgatcagg tcaaagacga gtacgacatt gtcgttgttg 1020 actgccctcc tcagcttggc ttcctcacca tgggtgctct gaatgcagcg acaggaatga 1080 ttgtcaccgt ccacccacaa atggtggacg tagcttccat gagccaattt ctcctaatga 1140 cgtccgatct tgtctccgta atcgaagagg cgggaggtaa gctcgactat gattttctga 1200 ggttccttgt gacccgccat gatccccgag atgtacctga acaggaaatc gtcggtttac 1260 ttcgggacgt attcggtacc gatgtgatgg ctgcggcagc atggaaatcg accgcgattg 1320 ctaatgccgg tttgaccaag caatctcttt acgagttgtc gcgtggcgcg gtcggtcgat 1380 cgacctatga tcgagcgatg gaatccatca gtgccgtgaa tcacgaagct gtcggcctaa 1440 tcaatgaagt gtggggtaga tgatggtgct ccactctcaa aagaatcaat cgcttaactt 1500 gttgtcagct gacgacgtga tgtcgtcggg gctagtagtt aaacgttctg attggggaaa 1560 tgatagatga gcaaacggac tcaatcagtt cgcaatctct ttgccgcagg gcctgatgag 1620 gcgccgaccg tggacacacg tcaaccaatg cagcgcgtag cttcaggagc ggttcggtcg 1680 ttgaaggaca ctttttcgga agttgagagg gactacgaag aactcaagca aaaagttgct 1740 gacggcgctc ttccgattga cctcgatccg tctcttatcg acccatcccc cttcgccgat 1800 cgttttgcgg atcaggatgc ttcggctgtc gaagctctca aagcctcttt ccttgagcac 1860 gggcaagaaa taccaattct agtacgggct catccgactg agattggccg ttatcagatt 1920 tcttatggcc atcgtcgcgt acgagctgcc actgagcttg gtcttaaggt caaggcttac 1980 gtgcgcgaac ttagtgacga tcgccttgct gtcgcccaag gcattgaaaa ttcagctcgt 2040 gaagatctta cttttataga gcgttcaatg ttcgcgctga aactcgagga aggcgggttt 2100 gagaggactc tcattcaaac cgcgttgtcg gttgatcggc aggaagcatc caagctcatc 2160 agcgtaggcc gcgcagttcc tggttggctg gccgaagcga taggccgggc tccgaagata 2220 ggtcgcccgc ggtggcagga gcttgctgac ggtctgaaaa atgcaggagc ggaaagcaaa 2280 gcgcgcaagg ctacaactga caagtctttt ggtcacaaga cttccgatga tcgctttatc 2340 gcggttcttc gcgcgataaa ggcgatagat agaccgagcg cggaaaagac gccggtactt 2400 tccgcaaagt ctgccgaggg tactaagatc gctaccctcg cggtctccgg cagggtttgt 2460 aaaattgaga ttgatagaga tcgggacgag gcgtttgcca agttcgtgat ggatcgaatt 2520

PL 219 153 B1 cctgatcttt aaaccgcaaa aagcagcctg tgagctgatt acgccattcg gacatccgta cgcgcgctac tatccagaga ctgagcgcac gtgggtgccg ggcaaggacg gcggaagaac gttaaggagc gaagatggtg aggcttcgga ttgcgcgaag aatgacaacg gaacctagct gagccgctaa tatgcgcctg cggtcgacct gagaatgcgg ggtggctatc atgataatgg taccaggagc gcagctaagg caactgaaat ggtagggtag gcatgacctt catgctgcca gctccgacgg ctgctccatc ccgcaacccg gacaatatcg aatcgcccga atcaaccggc gcggccgaga ctcagtcgtc cgcaaagcca agtggctagc ttggcgtggc agcgccgtcg ggtatcgggc aacctcagcc atgggcgaca cgcggcgtgc ctcacccata ttcggcaagc ggcgcggttt acctgtccaa aaaggagttc cctatcagga cggttctgat tcaccacggc gtctcgatca gtcggttggg gagggcgaca acgcccgcag atcgaaatcc atcctgacgg gaaaccggct gtcgaactgg tgtggtcgcg acgagaaatt agaaaaaggc agaatcgcat ccttttgccg ggcggcggcc agggaaaagt ttggcctgcg cggacctcag gagcgaacgg gactgataaa gcgaggtgga ttgctctcat ggacgactat cgcctggcga ccgccaagtc gtgtactcag aaatccgtca cagaaaaaga agagtttccc gaggccaggt tgggagtaag ccgtcgcgat tccgcgatct cgcttttgaa tttcggaagc tttcttaatc agacgaacgt atagaagctt cgtttatcag ttgccgtccg gtcgcgttgt gcctccggca tgcgcggaaa ttgatcgcct aacacactgc cggccggtca tggattgaca aactgttccc accatcagga atttttgcca acggcacgaa aaaccgcgcc gcgtgcggcc ggcatgccat aacttaagga gaccaggctt ccttcgttga ttgtcacgtc aaaacattct tgctaaatgt tgccatgacc tgccgcagtc cgcctatgag gatgagtgac tctcaacgcc tctttcgtta aggaccgccc tccgtgtcct cgccggcgac aaagcaaccg accttggccc cgcgcggcca gatcttggct ccggcagacc ccccaaacgt ttccatgaat atcgaaaggt gatgacgctt tgcggacaaa cgatagagcg cgaagatgcg catcgcgggc tcgtaacgac gacagcatat ggcgcagcgg tgcgcgcagg ctgggcgacg gattgaggcc cgtattggaa gcacatacag gcagggtggg tattggtttg ccagagttgg cgcttcagct ggcggcgata tacctccaga agtgaactct cgtcgattgt acctgcgacg atttcgaaag cagattgctt ctcgtttttc gaggacgacg tgtagtagct aaggaacgcc actcccccgc tcggatcgag cactttcaat gaaagacaac gcgagggcag tgcgcagccc tggcgcgatc tgatgtctcc cggcgagccg acttggtcag cggttgatct ggtccggatc gcagcgcctc cgagatagcc tcaggtgacg ggtcgatcgg gggtgacaga gcgtttgcaa tcgaccgtga cgcgagccgg gactatctgc gatgaacttg gaactgctga ttcctatctc ggcgctggtg gccgatcacg aaaacggcgt gtttgtctgg tttgccaccg gcgtcatcgc ggccgcgtct gagcccggat tgccgtcgtg cccagtcaat gaaagaaaaa gcgttggtca tggaaagtat cttgctgtgc aaccttgtgg acgactctga agtcccaatg gggttcagtc gtggccgagg gacgtgcgta atggagacaa cttgaatcga agcaacatct aattcaaata aaaccgatgt gtgatgcgag agggacttga tatcaggatg cttgagcgag acgcgccgcg ggcggggcta agtcagctga tccatattca tggtaccagc tgggaaacag ccaacgccac gttcccttat tgacgcctgc ccggtttgcg ctccagcccg cgcccgacgg cttggcggca ttcatcgctg gggagccccg ggcaatctcg gcggatgtca agtgaccgcc gattgcggac tgtcgaccag gagaaagccg ggtttcgcgc gggcgccggc gagatcggag cagggtctcg cagcaccgac cgataccgac aagttacgga cagcagcagc tgattatcac gtctggccag ccgccattga cgggcaaaca tggcactggc ttggcgattg cactcgccgc cttggactgg ccgggaccgg gcattgttca gccacgggcc ttgatctgca ccgaaggtta gaagcctctc agtctttggc tgcgaagtgg ggacccaatt accgcgatgc tcaacgctct tctttccgtc gagagaactt gtaaacgcta ttgccccatt aggcacgacg agcttatcac tctacatagg tcctggacga tttcacaaaa ccgaatctat tgaagtcaga catgccctga tgtccgcggc cttgcgaggc ctgggcacat gtgaattttc taagtgcgtg ctacaaacta ggagtcaaaa ggtccttttt agcggcgaaa ggaaatacgg aacaatcgcg tgcaccgatc gcttcggtca gccatcgtcg gaaacattcc acaagccagg tcgccgctgc ccctcaacgg ctgcgacggc cgaaggctct ttggcgctct ttaagggcag ttggccagac ccatctcgaa ctcgctgggt cagggaaggg gtcaacgccc acgtcctggt gcgatggtgt aaggtctttt aagcccgtat cgtttccaag caagaacggc acgcgaccgt agcgtctcag tgctgccgac agcatctcga ttgcgacctt cctctgatcc acgacgaacg atgtccggcc acgagatcaa gcagcgaata atatcgagca gagaaggaag tcattggtct accgatttgg aagtgtaacg ccaggcagcg ctgcgaagca cctgtcgttt taatgctcaa ggctgtattg cgtgagacgt gcttgcgagg cttcaaggta ggctgctgtt ggccgtagca actagaacta aaccgctacc aaatgaattt ccgactggcc aattgcggcc agtcgtggtt aatgggcgca caattccgct gctcggcccg atgttcccga accccctgtt cagacgtttg tccgccgcgc tgcgcgttga tttcagtgaa tagcccggcc ggtggcgcga aatagcccga cccgctgttt cccagcgatc cgctcagggc tggtctttgt cgatcggcgg gcccacccga cgctggcaca tgcggcggcg gggaggcaaa gccggcgcac gggcctggtc cccagaggtg cgccgccagt gcagcgtatt cggtcaggat cgagctgttc tcgtcatagg attccggaac aattttggcg cggccgcgca cgcgtagatc atggagtcgg tgaaccaaaa aggccgggag ggacgatggc gagtgacgcg atcctggatt cgttgacagc gcgccgcttt gcggcttagc aaatgggtcc

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4680

4740

4800

4860

4920

4980

5040

5100

5160

5220

5280

5340

5400

5460

5520

5580

5640

5700

5760

5820

5880

5940

6000

6060

6120

6180

6240

6300

PL 219 153 B1 tttgtgacca taagggttac aacaggtata cgcgaaattg tcgtcttgac tttcctcgag cgttctgcac cgacatcctg tcaaggcctc agagagtttg agatcctgat ctcggacgcc ggatccgttc cgtgctgacg ctggaatgaa gatcctgcgc caaggctatt ttcaagggcg ggcgcggcag gcttgtcgag tgaggtcaca cgggagaggg cgaacgacag cgttcggatg catcttcaag tcgaagcatt caaactggcg cctgaagcgc gcacctagtc cctatccggg tcttctcaac acaacaggtc cccgaagcaa agcttgaaat gagaatgtcg ctcggttcga gaacgcgatc cgtcgacgag cgacgatacc cgtcgcggat atctgtgccc attatctcag gcgtgcagga tattacctga cgacgaagcg acgcgtaagc gacaaacaaa tcgcaaattg gtgggcggct attgagggat cgtgccttct cggctgtgtg tcgccccgcg gtcggtgaca cgtgtaaaac ccactgtcgg ggccccattc gaaaccagct ggccgaaacc gagttcaatt ctttttgacc tagttctatg cgcacgggtc tcctagcgcc ttatcggggg tagatttccc cccctccaga gagcgcatcg gcccatgcct gacgcccttc aaaacccgcc gcctccctct ccggatggca gccgacggtc gcgattgaag gtctacgacc cggtcccagg atcgccgtgc gagagcggcg cccgtcgatc ttggtgattg atgatgatgc ctcgttatgg ccgcagggag aggtttcggg gccttgcgct gaacatctga aaggttgtcg cggcagttcg ctgacgccca agtctcgcga ttcgtcgagc aaggagccgg gccggcgcca gtggcggcgc acggcaaaag acctgctcga cggcttggct gagatttcga gccaaggctg cctgtcgcac ggcttggccg tttcagggcc tcccaagatg ccatccacaa tcatatcccg tctccagcat aggggccacg ccaattgtca accacgactc ccttcatcgg atcaccacaa atattgctcg tgattcagat cgggcgcttt aagtcgttgt aagacaacct aggttcgctg taatctgaca tccgcatcga cccgccgaat ggttcggatg gcgagtgcaa accggcacca cgctcgtgaa aactgttcga caattttacc tcagaagccg ttaacgaatc gcctgttgag cccgttctcc cgctctgggt gcgacatccg gtcgcatcgc gcgggcaggc atgttgtcag ttagtgatgc aagcgaagaa tcgactggga atctgccgcc tccagcatgc tcaccaccgg ggcgccggca ccgccgagac gcaaacttga cgcggccgct cgcgccggat cgtgggggat atctataatt caacggcaca agcgcgcgcc gtcaagctga agagccaatc aggaagtcgt gcaagctgaa tcatccgagg cggtcgaaga gcgtctatgc ccgccatgcg tacaaatgtc cgatactatc aaggcatcga ccgacgcaat gccgttgggg cgacagcgca ggggcgtcac tggcacgatg ttctgcggaa ttgcttttcc cccaacgttc gtgacgccac tgtttgccgc ctacattgcg aaacctggtg gctgcgagcc cctcgaaagt ccgcggaaat ccaaccaaga cgacccagag tgtccggcag ttttctcatc cggaaaacgt gccggatcaa gtctttccag tggcctgcca cgccgagact tcttgcccga ccgcaaaaat tcggaccctt gatttgcggt caggcccatt atttaccata gccggtctca cgttggcggg cgacggtgaa cgcacccacc cgcccatccc gtggcctgca cgacactcgg gtttgccgcg gccggggggc tgaggacgag ggtcctgcaa gccgtggctc tggccatctc tcgtgatcgc ggggctgaag gggacgccgg gatctcggcc cgttcaggag tgtctagaat cggtcctatc ggcggctttt gattaagccg gctggtgttt cgagttctat gttcggcaaa ggaactcgag cacgcacatc gattcttcgc ggaggcgcat cgcagccgat ctgaaagaga gatgattacc gaagaagcgt cttcgcggct tcagatgctc ggtgaatgat ggtccttgat agcttcgacc cggatcacca tacgtcctga caggaaggcc aaccgtggag agggtgcttg aagagcgtct aaaaaacggt ggcgaggtcc tggctgtaac ccatgccttt gagcgatggc caaattgaag cggtgtcgat gacgccgtat gtttgagggt ccggtctttc catcgaaagt gccaggtttg cgacgaagcg atcaaagccg ctggtcggcc aagccgctcg ctcaaatcaa tgtcagaagt atttcaatgg gaaacaggcg ggctttctcg cttgtccatt cacgaactca ccggcctggg gcatcgtcgg ggtggggtag atcgatgcgg gcgaaaaacg cggctggcgg tccatcgtgg ggtcggctgc gcagcgatca gagacgcggt gagcatgatc acgtcatcga ggcatggtgg cttggtttga gggtcagaac tttcggggtg gtggtgggcg caactcgtga ctccatgcct gaggcgttgc cagcgctacg aagctcaccg gaggcgcatc gactatccct ccgaaggcgg cttagcgcgc ttggtcgacc gatctcgcca acgaccgatg tatcaaggtc ggtcaatcag cttatcatgg ccgttcaaga ggatcggata aacacgtgca ttggctttga ggaaaccacc catcctcggt tcgctacggc gccaagtcag tctccatccg tccgggagcg caacgcccta ctggttccat gcggaagcga gccagctgct aggccaagcc cgatacggga tcgacacctg gcatcgatac ggttcctctg ggcaacgccc tcggcttcgt gaatcctccg gtcggtcttg acaagggtgt tcacttccga atagaactct tttacgatct tcgcacttgc agcgttccca tggaggacct ccatcgcccg cgctctctgc gtgtcgacgg gggaggccga ttcttgcccg cttcggacaa agtggcaggc cgctcgacgc tggctgcctc atgtcgggct tgctggcgat gcctggtgct ggctgccgga caaagacgct gggagatgac gagatgaaat aattaggagg cgccgctgga agcgaggtgg atgacgaact ggacgacatc acatcggtca atcaggtcga ggatcgctgc ccttgaagga gccggccgta tggatgactg cgaaccgcac tcagcgtgat acgtcgtggc gtattctccc ataagaatat tgtcacgcaa agcctgccag agatatctaa gggctaggaa agaccgcgtc tcggtgtaat ccaacaactg cgccgctgca acgcaagaat ctacgctgcc ccgcagcggt tgctgctcag tcgattgcag tggcacggct ggagcttgct tttccgtcga attctttgct gcgtggatgc cgatcatgac gccctttgag tgtcggaaag ggccaagaag aatgtcggga cggaggctgc caaagagcgc

6360

6420

6480

6540

6600

6660

6720

6780

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

B640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

9600

9660

9720

9780

9840

9900

9960

10020

10080

PL 219 153 B1 ctcgtcgtca tatcaatgtt ggcgtcctgc tttcagtttc gagttcatcg aacgtcccgg cggtccggcg gcgccgatag agagcagaga aagctggatg ggcgatgctg tgcgtcctcc gcacgggaga gagccacgcg tgcgtcgacg gctggcgatt taacaacctc tgcctccgtc tatttgttcc atgcgccgta caatgtctgc ggtcggatag ggtcagttcg cgccgatttg cctgagccgt aagagcggtc caccgcaaga aggattcgat gcctgcaaga gagcgtatcg ctgcaaagcc gtctacgtca gtgcccgaca agcgatttgc tgcaatcggt gtacggttgc gatgatctgg agccttgtcg gagaaatccg gtacagatat gctcgacgtc ctcgtttgta agcttccaag cgaatagggg cacatcaacc gtctgtcccg gccaagtgat ggtcaagatc tccacagctt gaccgggtcg gcaggtcccg caagcgggtg tgtcggcacc acaaatcgcg ccaggctccc gctcgatgga gtttggtggg gcggtcccta gtctgcgcct acctatgtcg gcctcgatga catcatacga aaggaaagtc ggatcgacgt acaggtgcat aggagggccg agctggagcg agaaccatgc aacgtcccgg agcttggccg acgtcaccga agagcgtgct gcgccgacac acaccgatgc gccagctgag tcttcgctcg aacgcggcgc tcgtcagcct agcgcaattc aatctgcctt aatcgttctg ataacgtcga acgaggtcga tcgatcgtct tcggggggag ggttctgcct tgttcggcga gcttcaatcg tggaggttct gcgcccgcgc ttctcatcaa tgtagcaact acttcctgca cgtacggaga tcgtggacat tcgatcaaaa ggtacccaga ctcacaagag cgtgctgaca ctctcagcgg agggtggcct gagaacgggt aagcgagacg cgactagcga ttttctgacg gttgggccaa cgtcaggagc ttgaacgtca gatcagatca tttctggacg gggaaactcc ggcccgctat cagctgcaga agcaaaagca gtcgatctgc gtcgtgcagg gcgcgccgtc gcttggatgc tgaggtcccc cgccgcgggt tgggcgctag ttccgaaatg gcgaggcggc ccgatgagga tcatcgacaa acgagaagca ctatcccggc ggtcgccggc gcaacctcgc caagcaaatc gggcatgttc caagaccgta cacacgcaaa atacccccca cggcataatc ccataagttc ttaaccaggc gtagcatggc gaaacctcgt ggtgaaacgc gctggaagtc cgctttgccc ccgcagggtg gctcgacgag cggtaagaaa acgcatggag ccgctcgttg ttggcgagct tacgcgatgc atgtgcgatc tttgttccaa ccatggttga cagcctcctc gaggcaggtt ggattctgag gcgcaacgcc gttcactctg cgtgcaacat aatagctgct agttctcctc gggagcggaa tgctctccac gatcgacgcg tcccgccagc gttcacgatc gaagatcgtc atatcggtcg acgctttgcc ccagattggt caattgcgcg gaaaaatgtg tgaagcgcgc tggccgggcg gtcgcctggc cgccggcccc ttgcgggcgc cctatctgac gtcatgcctc ctcttcgtca tgtcggccaa ggccgacgct ctccttccgg cagcaagcga ttacccgacc cgacaagcac ccacattcgc gcgcgacaac ggtcgaggcc ggttcgtcag ctcgcgcgcc gtacgatgcc acgaaattcg gagttgaatg ggccatgtgc catctcaatc cgcgactaaa tgcaatacgt tcgcgcctcc caggtcagct tttgaattcc cttgaacgta tttgccgagt ctcaaacgtc tatctcgccg agcgacttgc tgtcgcggcg cgctccgatg cgccttccaa gatcaatccc cggataggcg caattcgccg gaggatagcc ggcgaggact atccgccgca aaggcttggt ggcgatcttc ttccagttca atttggcttc cagacggcct gagatcgttt gtcttgaaga gagcctctcg cagagaggat aagagccgca gagggctagg tccgggatat ctgatcgcac ggacgtcagc gttgcccagg tagatcgtta attggcatcc tggacgaaaa attgtatttg tattattttc ccgcgcgcgc cgcggcagtc gcgaggcctt tgatgatgtc gcgggcggcg caacggtccc gccgaagcat tgtcggggcg tgacaagaaa cgtctcgatc cagatgacag ccctacggtc aggatcatcc ctcacctacg ggcgagaagg gtgcgaaacc gattggccga gcgatggagg caagccaaaa gcgcgtcttc ttcgcgtcgc tcgtttccgt tctgctgctt caaagctggt gcttcgatag tggcgtacgg tggactttgc ggacctagtg gccaaatcgt gccaccaatc gtaatgggcg ttgaactctt gcataagaag agatcgagaa tagcggaggg ttcccccgtg cgcggcggcg cgccggagtg agcgtcagat gcaaatgcat gacgcatcgg ggtgcatttg tctaaacggc gcgcaaaggc gccatcgcga tgcagagtct tcatcatcga tcccgtacta tcagctgttg gctgtttgca cgcaagcacg gcagagccta ttcagtatga gtatcgtggt ctcgctattg gacactgccg caagacaaaa cacattatat gagaccggtc atgtggtaac agtgacccag cttgaatagg tgacgcatga gggcgcggcg gaccaagccc tacgacttcc gcccacgcat aatgccctcg tcgcgccggg ctgattgctc gtgcgtgcgg aagcttgcct gccaatgcag ggcacccaat gcgcgggagt tcgctttccg acgcgaaggt cgaccgccgc tcatctatct ctccgacgct aagccttcgc tttgaccgag ctaggtctac gaaatccccc cagaaagccc tgatgagccc gcagcgaaac cattacccga ggtccaagcc cgcgccgcga attccgacat catcggtttc gatcgccact cttcccgttc cagggctgat acagaatgat tccgagctat gaatctcgac attgcagtag acggattttt cgtcttgcac gtcgcccaac catagagcgc caaacctccc ggtggtgctg ttgccgtgcg gcagcaaccg gtacgaccgg ggccggtgag agttggcggg agctgctcca ccaggtagac cgggagcgaa acgcgaggtg tttcatcggg tcatcgcgct tttcaagttc ctgctttcat gagccagcac ttccatcgat cgctaccggt gcggcgcggc tccggcgatc ttccaacgct taatgaaagt aaaccatcac tcgtcttcac tctcccgatt cgaaggttca tggcgcgcga gtctctccac tcgtgttggg caggcagtga ccgatgttgc caactgcagt catccggtga agcttgcgca atacaaactg gagcggtggc cggcgatgac acgctacgat ctgcacggat tctggctctg tgacgtcgcc

10140

10200

10260

10320

10380

10440

10500

10560

10620

10680

10740

10800

10860

10920

10980

11040

11100

11160

11220

11280

11340

11400

11460

11520

11580

11640

11700

11760

11820

11880

11940

12000

12060

12120

12180

12240

12300

12360

12420

12480

12540

12600

12660

12720

12780

12840

12900

12960

13020

13080

13140

13200

13260

13320

13380

13440

13500

13560

13620

13680

13740

13800

13860

PL 219 153 B1 tttccggaac tcgttcgacc cggcacatta gaagcacagc tatgcgcggc gcccagcgcg ttgttcgaaa aagaggcgct tctccggcct tcctagcctc tcaggaccgc gtttaaggct cacgacgaac caacccctcg ggagctgacc cttcgccgtc catgccaggg tagcgacctc cgcgcgaaac ctgggacatt ctggcagcag aggcgcggtc caccacgcag tcgcgagatc taatatcgtg accgacggcg cgttaggaaa cgagttcatt ggttgtcact cctggaggaa gctgaccaac tgaaaccgtt gtcccaggca actggtgatc cagcgagggt gcgccagcgt cgacccgcga cttccaatac cttcgatttc gcttgggttt ggaggccatc gcacctgatc ctacaacgcg cattcgtctg gcgcgcactg actcaaaaaa gcgggccgat acttctggca gatgcgcacg tggcgagcct gagcggcttt cgatgctcga ctcgctcatt caatgtgaac acctggcgct ctgatccaca gcgaagttca cataccgcaa ggttgcaccc aatcaaatcc cgccaccccc ttcgccctga cgccaggccg tgcaaaacgc tgatcgcgcc tcgccgccgg ttgattccga gaaaggaagg gtctgaaacg tctgcgatgt gatcggagtc gtgggagcgt caacctgctc atcatgatcc ggcatcaatc gcccttggga cccggaaagg atcggtggca gaaggatcga ctcgacacga gcatctgagt caggctgttg caggtccaca ctgaaggatc gatggtgagc cttgagcggg gaggcacagg gataagcgcc gatcgtctcg actctcgctg gccagcgaga ctgaccgatc ctcacccacc aggattaccc gcgctcaaac ctgagcctgt gatatcgacg atcagcaaga ggcctgggca cagcgcgccc atttgcacgc gcatccgtgg aggtactgat gctggcgcgc gcatcgacca tttgctgaaa gcgatgaagc cttaaccagg gccgagattg ctggaaggcc gacaactatt cgcaccgggc ccgctcctcg gcaaatctcg attcattggg catcgtcgcc acgacaattt acggttctcc cgatcgccgg gcggcggctc tgatgagggc aagtgcaggc tctacgaaca agacgccaat tccacgcctc ttcaggagat cgtgtcctgg ggacgagaag cctgaccgca tttcccagag ccataagggc tcaggcggac gttcgagaaa ggcgcaaccc ctccgctcag tatctcatcg gagccgtacg ttgttcttgc agtcgacgct gcctgcgcat atgacgtcgc ccgtggggtg aaaagtggcg ccggatacaa cctacaacac atgccttcct agaagaacgc ttgcttccct aacgcgaagc cgaacattct gacttgagcg aagctctgta atgctcgcgc ttaccgcgct gacgcgccgg tgcaggaact agctccgcca gggctgcaat tctcggaatt acaccggata tgaagatctt tcgacttcct acgcgctcga tgaacaccga tccgcatgcg cggaggcgga tcggcgatac aaatgtccga gtcagaatac cagcgcgcta cgctcgcatt cacaaaccct gcggcgtcca ttcacgccgt tttccgacga cgatcaatcc tgcgcgggac tgatgtcgaa tcgacagcgc ggcgaaggag gggagcgatg ccaatcggaa gtcttggagt cgctgacaac gtcccatccg cgaggtccct cgtcgtacaa gctggaccag tctgtggctg gtctccaagc atcaagaaga cgcgtgaccg cgactgaagg gacgaactat aagaccgcag tgatccttcc ttctggcgca agcctaacgt gcgccatcga cgccaaccag cgaccgctcc gatcgaaatc cgaagccttg cgtaacgcgg gcctgtgcag agcagtgctc gccgtctgcc cccgttcaaa gcttgggctc gcttgatgcg cggtgagctt cctgtccacc cacaagcgag ttatcgcgag taacgaagcc attcaacgag cgaagctgcg ttatctcggc ccacgctgcg gatgaccacc actggattat ctccgaggcc caaattcgac ctgctacgac tattcacgac actggcggcg catggttccg cctaaccgac gtggatggcg ggaggcgggt tccgggggca caaacgcaac cagccgctct cgccggcctg ccccgaagcc ccccgatgta ccaggaagca cggcgccggg gcgcagcacg attcgggatg agaggacgca gcatatgccc attgtaagat ccgcccttcg tcgtcatggt tcgagcgaaa gcccccgtat gaagtcggct tacgaggtta gcaccggaga gccgatcgtc ctcgaaaccg aggcgcccgc acgcgctctc tcggtgagta ccggcttcct tcgagctgat ggatcgcggt aaccaaacac cctaggcggg cggtacgttc catcaaagac aagggctttc tcggcagccg atcgacttct cagggctggg tctcccgacg ccggccccaa gcctgggcgt cggtcgttgc catttcgaca aactgggaga ctgaagcagg gaggccgaac tttcgcgttt atccacggct tcagtggtga ggaatcgcgt aagatcgtcg gtggtaaatc gccctggccg acgcgtctca aagtcggaca gaagaacggc ctgtacaatg gtcgagatag ctcatgctca agcaccatct gcaatgtctg atcaacgatt accgacccaa ctattctcgc ttgaccggcc atgacgaaga cgaaccaaca cccgagcgtt gttgtcgatc cagcgacggg ctcaggtttt gtgaagagcg ctggtcgatc gtaagcgaac ttccgcaatc gaagatctgc ccacgagttt tgggtctaac ctgcgaacgc cgatcttcga gctgggcgat tcatcagcgc tgccggatgc ggccgcccgc agtctcttgg tgttgctcga tttcgacggc catcaacggg gaacggggcg tatcgaggcc cgaagaatat gtgcgccttc gctggtctac atcccgcaga ccaatgacgg gagcgcttcg ggtctgatcg acgctgccgc gggacaagga gtctggcgag ccttcaccct cgcccgggtt acaaggacgg tgttcgggat tatcctattt atcagaagac aggcggccgc cgatcaagac gcctgcgtct tgccgcagta tggtaaacgc acgaggatgc taccgggcgc ccaaccgccg gcgatgctca gacaaggcgc aggtggatga cgatcaaggt gcgcggtgtg ctgccgggag ctggcagtcc tctcgttcgc tcgacggtgt ccaaatatgg tttcggcaga gcggtagtct aagaccaact ccgagatcca gggtccgaat ttttgcaatt atgagccgat agactgggga cgcgcgagct gccgagccga tcgccgacaa gcactcttgg ggagcgagca ctacagcgca tgacaatcgt aagtgagacc gatgccgacc ctttaactcg gctcttcaag cagcgatttg gttctgggac cgatgtcgtc actgctggcg tgagcgcgcc gcagcgtcct tttccagggc

13920

13980

14040

14100

14160

14220

14280

14340

14400

14460

14520

14580

14640

14700

14760

14820

14880

14940

15000

15060

15120

15180

15240

15300

15360

15420

15480

15540

15600

15660

15720

15780

15840

15900

15960

16020

16080

16140

16200

16260

16320

16380

16440

16500

16560

16620

16680

16740

16800

16860

16920

16980

17040

17100

17160

17220

17280

17340

17400

17460

17520

17580

17640

PL 219 153 B1 catgaaagcg gagctggcac gatcgaaggg aaatatttca atgagatcat tcgaaccatg 17700 cgcaataata atcgcggcag tgcccttgct gaagccctcg gatggatgac gaagatgcac 17760 ggatacctat cctccccagg gggcggcggc gttcgccacg gcacccagct tgcggccgat 17820 gtctccccta cgctcaggga ggcacacctc tactgcaacc tgacccggag ctatatcaac 17880 tacctcctgg ccgaactggc ggaacagaac taatcgcagg agtcagcgat tcgtgttgtt 17940 tttcgtacac aagagagtgg acggcgaacc acactatatt gcgccgcgct agtttccgga 18000 aatattccta agatggaatg caaggcgctg cgctatcgtg cggttgcatc gcgggcgaca 18060 gagcggacaa cagaaggaag tataccaggt gggcgtatga tcagtcgcgg ttcggaatgg 18120 catcgttggg agccccatat tcatgcgcct ggcaccgtcc tcaacaatca gttcggtgcg 18180 gccgatccct ggggtgcata tctcacatcg ctcgaagggc tgacgccgaa gatcgaagta 18240 atcgccgtca cggactatta cgtcaccgat acctacgaac agttccttac ccataaggcc 18300 gctggccggt tgccagacgt gaagctgctc tttccgaaca tcgaactgcg cctcgatgtg 18360 gcggcaaaga cggggttcgt gaacatccat ctgttggtga gccccgagga cccagatcat 18420 gttggcgagg tcaagcggat cctcaagcgc ctgcaattcg gcgcccataa cgatcgcttc 18480 gactgcacgc gcgaggagct gatcaagctc ggcaagcgct ccgacaccac gatcaccgaa 18540 gacggcgcgg cgctccgcca cggcgcgacc caggtgaagg taaacttcga ccaattgcgc 18600 aaagtcatcc atgagagcga atgggcgaaa aagaacgtcc tgatcgctgt cgcgggcggc 18660 gctggagacg gcacgtctgg gctgcggcag gctgccgacg cgacgatgcg tcaggaaatc 18720 gaaaagttcg ctcacatcat cttttcgagc agcccggcgc agcgcgagtt ctggctcggc 18780 cagcgcggtg tgccgatcga ggagctgcgt tcgcgctatg acggctgcaa gccttgcctc 18840 catggcagcg attcccacga ccagaaatcg gtgggccagc ctgtcgacag tcgcttttcg 18900 tggatcaagg gcgctttaga gttcgatgcc cttcggcagg cctgcatcga ccccgagggt 18960 cgtgcctatg tcggcgagca gccgccgcgc tcggcgatgc catcgcaagt gatctcgcat 19020 gtcaggatcg acgatgcgga ttgggcgtcc acaccggata tcccgctcaa ccctggcctc 19080 gtcgccatca ttggtgctcg ggggtccggc aagaccgcct tggcagacgt catcgcggcg 19140 gggtgcgatg caattccccc atccggatgg gacgcggacg agaacaacag tccgtccttc 19200 ctggcgcgtg cgcgcaggct tatcagcgat gcgacgacga cgctgacctg gggcggcggc 19260 gcaacggtca cccgcgcgct cgacgggagc gatgccaacg gccatatgtc ctttccacgg 19320 gcccgctacc tgtcgcagca gtttgtcgag gagctttgct ccgccaaagg cgtctccgac 19380 ggtctggtcg aggagatcga gcgcgtgata tacgaatcgc attcgcccga tgatcgcgaa 19440 tgggcgctcg acttcgccga gctgcgcgag cagcagacct cccgtttcca acaagcgcgc 19500 gagcgcgagg cccaggcgat cgccgacatc tccgaccgta ttgccaccga gttcgagaag 19560 gagagcctcg tcgcctcgct gaccaagcag gtcggggaga agaacaagct gatcgccgac 19620 tacgctgccg atcgcgcgag gctggtcgta agaggcaccg aagctcaggt cgcccggcat 19680 acgcaactca gcgaagccgc tcaaaagctc cgcagcagca tccagaattt tggcaaccaa 19740 cgccgcacct tcgtcgcact ccacgacgag gtccgctcca tgcgggcaac cggctcgccg 19800 gagatgctgc ggcaggcgca ggcccgtcac gccaatagcg ggctcaacgc cacgcaatgg 19860 gacgaattcc tgctgatcta caagggcgac gtcgacaaga gccttacagc ctatgtgaac 19920 tgggcggata ccgagatccg taagcttcag ggcgttcccc cgccgcccgg cgatcccaat 19980 gtcgcgctca tcgccgacac ggttgatatc tcaacactgc ccctggcgcc aatcatcgcc 20040 gaaatgacgc ggctagaagc actgttcagc gcagataagg tggtgcgaga tcaatatacg 20100 gcactcacca accgcatcgc gcaggaaaat tccgcgctcc aaacgctgca gacgcgcctt 20160 aaagatgcgg aaagggccgc ggcgcgccgc aaggacctgc agaacgaacg tgacgacacc 20220 tacggccgcg tattcgaagc tatcatcaac gagcagaata cgctggccgg gctttacgca 20280 cccctgatgg cgcgcctcgc ggccgcctcg ggcacgttga agaagctcag cttctcggtc 20340 cgccggatcg ccgacgtcca ggcctggggc acctttgccg aggaggagct tctcgaccga 20400 cgcaaaaccg gtcccttcta cgggcgcggt tcgctgatcg ctgcggccac ggacgcgctc 20460 aactcggcgt gggagacggg atccgcggct gaggtacagt ccgccatgac ggccttcatg 20520 gcgaaatatc tgcgagatct gctgacccat gcaccttatg cgccgaccca gcaggcggaa 20580 ttccgggctt ggtcgaagca gttcgcgcac tggcttttca gcaccgagca catcactgtc 20640 cggtatgaaa tctcctatga cggcgtcgac atccgcaagc tctcacccgg cacgcggggt 20700 atcgtgcttc tgttgctcta tctggcgctc gacgattccg acgatcggcc actgatcatt 20760 gaccagcctg aagagaatct cgatccgaag tccgtcttcg acgagcttgt cgcgctcttc 20820 atcgccgcga aagcaaagcg ccaggtgatc atggtcacgc acaacgccaa cctcgtcatc 20880 aacacggacg cggaccagat catcgtcgcc gaagcagggc cgcatcccgc aggcggcctg 20940 ccgccgatca gttatgtggc gggcgggctg gagaacgcgg caatccgcaa ggcggtctgc 21000 gacatcctcg aaggtggcga agccgctttc cgcgagcgcg cgcggcgcct tcgcgtccgc 21060 ctcgacagat aggatagcga gatggttaca cgcgatatcg ccgcctccga tcctcaacag 21120 atcttcggct tcctggcgga gcgcggctgg tctcgccaca gcagcgaaga cgcggaccca 21180 gacgccatcg tccgcgcgct gggccaactc ggtgatcggc tcgggacgcg cgttccgggt 21240 cgtgcgggct cgctcgagga agtcgtcgag ccgcgtgccg ccgatgatgc gcatcctcga 21300 tccttgagcg cgcgctacgg cctgggcgcc ctgccgcttc acacggaact cagccatcgc 21360 actagaccct gccgttacct ccttctcgga tgtatcgatc cgggatcgcc ggccgcttcg 21420

PL 219 153 B1 acgatgcttc tcgactggcg gacgctcggc ttttcgcagg aggagcttga ccttctcgaa 21480 gacgctccga tccttgttcg caccggtcgg cgctccttct actcgacgat cctgtcgccg 21540 ggccgagctt tcttgcggta cgatcccggc tgccttgaag ccttggacga gcgcggccgg 21600 acggccctgg cgcttatcga ggaccggatc gccggcgccc actcagaggc gcatcattgg 21660 cgccggggcg acatcctcat cattgacaac tggegcgtcc tgcacgggcg cagtccgtcg 21720 gaccgagggt ccggccgccg tctagcaagg attctcatcg atgcctgagg aagtcttcat 21780 cgcaatcaac ggcgacgctc tccatacaaa gtcgaaagtt tacatcggcc gagcccttgt 21840 tcggaagggc gccagcgatc tagacgaata tcagctctgg gcctcgctcg cgctcgagct 21900 gctcggcaaa gccgcgctcg cccggaaaca cccgagcctt gtggtcgatc cgacgcactg 21960 gcagtcgatg ttcgtcgccg ccggtatcaa tgtcacgacc gacgtcaaga cgatcaccgc 22020 caagaccctg ttcgagcgcc tcgcacacct cgtcccgcgc ttcgacaaga cggtgcagaa 22080 attctgccaa gacatcgccg agcgtcgaaa tgccgaactg cactcggccg accttccgtt 22140 ccgcaccatg cgtctcgacg cctgggaggc gcgctattgg catgcgtgcg atacgatcct 22200 gcaccagatg ggatcgtctc tggagcaatg gcttggggcg gccgatgcca aggcgccccg 22260 tcaattgctc gacgaagccg ccaaggccct cgaagcggcg gtcaaacttc gcgtcgaagc 22320 tgcaagggaa cagttcgagg cattgaggag ggccgagcgg gaacgtctgg ccgccgaagc 22380 cgaattgcgc gagccgcagc atcaggcggg aatcttcaag ggccgctacg acgagatctg 22440 gaccgagagc tgcccggcct gcaaatgcag agcgttcatg accggcgagc agaccggtga 22500 agatatcagc gaagagcgcg acgagtatgc gatctgggaa atcgtcgacc gcgagttcgt 22560 cggcgaagag tttcgctgcc cgacatgcga actcgcgctg atgggaagcg acgaaatcgg 22620 cgcgggcgga ctgaactaca tccacgagga ccaacaagag cgcgaaatgg aatacgaggc 22680 cgactacggc aacgactgac catcggcgga gaaatataca acggggcaac acacatgccg 22740 gtctacttca taggcgagga tgaaaacgga tgctcgccga tcaaggtcgg cgtagccaag 22800 gacatcggcc ggcggaagag cgacctgcag accggaaatc cgctcgaact caaactcctc 22860 ggttggatca cgtcgcccga cgatttcgag accgagcgcg atctgcaccg tcgcctcgca 22920 tcccggcgcg gccgcggcga gtggttctac atcgagccgg ccgacgtcct gcctttcctg 22980 atggaggtcg gacagcgtgg tttcgtcgcg aagaatgcgg atgccttcga aatcaccggc 23040 tacgatcgcg acgccatccc cgaatatctc ggtgtgtggg aatgggccga cctcgaaatc 23100 gacgaatgct gtcccttctg cggatgcctt tgcggcatgc attttcagga cgcctctcag 23160 atgtactact gcatccagtg cgacacgctc accgacttct cggaactgtc cccggatgac 23220 cgcgacgggc gagaggactg actggcctca agaccaacaa cgaatggggg cataacatga 23280 gcatgcaatg gctattggcg cgagcaccgg gattccacgc gctgcccgaa gaggaccgcg 23340 cagcgatctt caacttcact ttcctgtgga gcctgttcga ggcccaagtc atgggcaatt 23400 ttgcgcgcgc cgatctcatt tgcgcgaagg ccgacgagtg goaagacgcc ggcacgctcg 23460 acgccgacca gtatgatgga gagctggctt attttcgcca gcgctatttc gccaacgggc 23520 aattcacgca ccacttcgcc cacctgcatc ttcgccccgc cgatcagccc gacctcgtcc 23580 ggtcggtcct cgacgggagc aacaacgacc cgcgcgatcg gctgctgacc gtgctgataa 23640 tcgtctggcg ctttcgcaac aatctgttcc acggcgagaa gtggacctac cagctccagg 23700 gccagcacgc gaatttcacg cacgccaatg ccgtgttgat gcggctcctc gaacggcatg 23760 ggcagttggc agcctgacgg cgtcaggtgc tccccggctt ccgccagaat ggttcgtccg 23820 catagatgct gacgcccatc tgtccgcgcg gattttcggc cgcccaagcc agcacctctt 23880 cggtcgggac gaccagtctg gtctggccgg tcggctccca gcagttcttg ccggacttca 23940 tgtagaagtc tccgacacct tccacgttga tccggccggt gcgcatgcgc cgcaagccga 24000 aggccgtgat ctggtacgtc aggacgcctc cgtgggtccg gcgaacaacg gccgccgatc 24060 cctcgggttg attgcggtag tagtcttcga tctcggcctc ggtctgacgg gcgcatggcg 24120 aaagcttacg gtctggcacg gcaatcctct cgttcggggg ctgtcggccc tccgctgcac 24180 acaggcggtg actaatccct ggtggcgaac accttgcgcg ttccctgcat cagcagattt 24240 cgtcgatctc gaggcgacga tctagctttg atccagacca attggccctc gtggcaacgc 24300 cggcaccatc gttcgtgcag gtagagagcc acgctttggt tgcgctgaaa tcagttagta 24360 tctcagcaag ttaagcagcg gcttcacaca tagtccccag aaattccgca tgccccgaag 24420 gatctgcttc aaatatttgc cattcaagat gcgtactctg gtctgctttc cagttccgct 24480 ccccacagcc gcccgtccat tcacggcgcc atacagccgc tctccggaca caaaccgacc 24540 ttcaccgctg agcagtttga gcacgttagc ccctattcga ataacagggt cgaaggttct 24600 gatcctttca aggcggcgaa tctcacgctt cgagtggcgc gatgagattt tttaagagat 24660 tacccgatgg aaaatggctc gaaacgcaag ggcatgcccc gctctagggt tacgagctcc 24720 ggtggcagga ttgccagacc ggcggcttgg gccatgggcg acaggcttcc cgacgatccg 24780 cggcccagca ttgccagcac gggagtgcca gaagcgtcgc gactctgaag tcgaacgggg 24840 acgaattccg ttcggccctc cttcttgcgc aacccaaagt cggagatcgc cggcatccag 24900 acgggatcca aatgctcgat cccggccaca gccctgatcg ccggcagcgc aatcttgtcg 24960 agtgtcacgg cggaggccat gggattccca ggcaagccga taaagagcgc cgaccctagc 25020 gtgccgaagg aaaccggctt gcccggtcgc atggcgacat caagcacgcc gagcgacccg 25080 ccgcagcgtg tgagcgcgtc ccgcacatga tcctcgccac ccctggacat cccgcctgac 25140 gtcacgacga tatcgtgctc cgtagcagcg ctgtgaatga tattggtggt cgcctcaatc 25200

PL 219 153 B1 gtgtccggcg aaaaggtagc agttcagagc aagcctgcgg agcaaagagt cggtaggcgg tcgaaaccgg ctgctgctgc ccactgccgg cgcggcaagg agatcgaggt tcggcaaccg tcgaacaacg aagggacagg ggtgctgatt ggcgaaggcc gtgggcttcg gaagccctcg gttggccgca tttttccgcg cgaaaacagt ccgcccacgt tattctttcg atattgcccc acattgccct gtcggtgtcg tccccctcct gggaaccggt ttggcgcgcc gcctgcagtc acgccgtcgg ggctcctgga ccatgagcgt cccttgaact ttggctagcc cgctcggtca gtggccgcag ttgacggcga cggtcgccat acgcgcttga tgcacgcccc tgggcgtcgg ccaggacgac taattgtcgt ccgccttcct cccgttattt ttggacaaat gctacacctt gcgatgtatg tgcaggacgt ggatcgacaa ttctcgagac gtctccagcg cagttgttca gggcggttgt ccccaggtgt gcgtcctcac tcgtcccagc tgttgctggg gaaccgagac cggccatcct tgttgctgct ttgttgattg tcgccccgag gattggaatt ctgtcgtaat ccgcgagcag tttggtcgac tggtgaactg ccgggatcat tggcctgatc aaaaacccgc cacagggcga cttcggtagc acaacatggg cggcacggtc tgtggagatc gttttcaggt atcttggttc tcccaggtcc acgcctgcga ccctcgccga tcgccctcgg ttccgcattt ctggagggaa acttgaaggt aggtctgctt gcacgccagt gataggccat tgagccccgc ccatgacgaa cgttgttgat cgcgccacgg tatagagccg atccgttggt gtctgttgta tgccggcata gggcggcgat accgcatccg gcaggatgac acagaccacc agggagcgac actcgtgggc cttggccgcc acgggcgcac cgatattgcc tgccccagat tcggcatggc tcgcggcttc gtccaggctt cccgcaaggt taaacagcgc tgtccttgcc tgataatccg tttcgccgcg cattggtgcc actcgccgac ggatacggat tttcgtagcc ccttctcctt tcgtcggctg tgttgcgggc cggtgttcac gtttgacgac cggacagatc gccaggtgta atcgcggact atagatctgg gaacccgagt cgcaatccgg atcttcgccc gcgatcatgc cgcgccggtg tccggctgcc cgtgcgaacc gcggatgtcg ggtcacgggc gcgagcagct cgctggcatg gcgacctcct aagcgatgac ccttgatata agccctcttc ccttccggcc cggcatggca ccatggcggg gtattgtcca gagtggcagg cagatgagcc gtagtttggg cgggaaaccg ggcctgggtc ttccaccatg gtcgttttcc cagatatttg tgcgtccatg ctgggtgccg gcccatggcg accgtccatg ggcagcgtcg caggcagtcc gcgttcgcca gtgacaggcc ctggttgatc gctcatcgca gttgagggtg gatcagcaac ataaccttcc ggtggcgagg caggcccttc aatccattcg ctcgatggat gctgtccgat cgatttgtcg attgaatagc agccgtttcc gcccgcttca caggttcggg gaccgcgacg gcccatgteg gttcttgacc gcctccggcg gatgatcttc catctgtcca ttcggaaaag cacgcattcg attgtacatg gacgccgaac ggcgtgatag tcgagccagg ccagccgcca cggatctttc tgtgctgtca gccctgcgga cgcgaacatt aagatttcca actctgtctg gcaaacccgt gcggccacca cggcacaggc aaggctcgcc taattcatca ctgtgaggtc gtcggccaca ggccttggga ggcctttgcc gatgatggca ggcggtgcat ggatgttgca tatgtttgaa ggccactcgc acgtttttag atgatcaact aacaacatga gcgccggcat tcctccgggt tggtcaagat tggttgtcct aagcgcgcct gcgatcttgc ctcaggcgct aaggcgtctt cccatctcgg ggcatggatt ttcatcgaag tcgccgatct gcagcgacga tccttcacca gtcttgtagt tggtcgacat tggtgaccgc gccagattca tcgtagccga gcggctttga acgcggcacc ccgccacgcg atgaattcgc gctaggtcgc tcgctcgcat tgcggctcgt atccagtgat atcgtgtcgg cgggtaccgt ttcatggcct ccgccatggt gccgtcacgc tagcgccaga ctcgtttcgg tggtccggct gatggcgaat acgtttttct ccgcagccga gatgcgacag agtgctcacc gaacgatgga gaaccgtccc tgttctcgcc tttcacggat cggcctcagc cgaccagaaa ccatcgccga cgcggccgcc cgatggcgcg cgcagtcgag aggcctccca gcgacaccag tcctcgggct ttggcgagat ttgaaggcgg ttcagttcag ttcttgaaaa atcaggcaca ggagtgggcg tgtgtcctca gcgcatccga cgttcgtgcc aggtttcgcc cattgtaaat tcatttcgat aagcggattg tctgctgttg tgccatcgtc cgtcggcaaa cataggtgac cctcggtctg tcagcacccg ggccgggcgg tgaggttcat ttgtcgggat tggcgttcac tgtcggtgcg ggtcgcagcc aggccgccgg cgaggcgaac ccagcgcgcc acatgacgcg tgatctggga cttcgacggc cgggatagag ggtcaaccca tgccggaatt tgacggtcac ctggcatgat tgaggaaata ccagttcggc ggacttccga cgaaatagag cgaaggccga gggcgacaag cgaggggatc ccatcctggc tgatgacgac accaggcgtc gcgggtccgt cgatgcagaa catggaggcg cggctctttc aatccgagac ggccttgaac tgggcgggga gatcacggcg attttcgaaa ggtccaggga atgatcgaag tgcagaaaac ggccaccgca agcagcgcgg accacgatta cgcttcacgg tcttcaggcc actcggtcaa gcgagtagtt gaccgacctt cgaccgcgcc gtgagactat gcgctactgg agccgaccgg aatcttgcgg ggcgctggtc gcggcgtgcg ctcgacgagg gaacggatag ccagaccaca cttgcccggt ggtcgagaac acccgtcgcc gaattcaccg ccagtcgaag ttccatggta gtccatgtag ctcgcccgac gatgtctata catggcctcg cttcttgtag ccaaatgtgg ccggccgaca gacgccaccg gttggtgcgg tcgacgcttg ttggtctagc atcctcgaaa cggcggccgt gcccttatca gatcgcgaga cgtgcggcgc ctgctttttc gtttgtctgg atcctcatag attataggcc cttgcccgtg aacgatcaga atcaagcgca cgtcaggcgc tccgcgaact atgaacgtcg agtttccgcc gccgccctgt gtggcaggtg

25260

25320

25380

25440

25500

25560

25620

25680

25740

25800

25860

25920

25980

26040

26100

26160

26220

26280

26340

26400

26460

26520

26580

26640

26700

26760

26820

26880

26940

27000

27060

27120

27180

27240

27300

27360

27420

27480

27540

27600

27660

27720

27780

27840

27900

27960

28020

28080

28140

28200

28260

28320

28380

28440

28500

28560

23620

28680

28740

23800

28860

28920

28980

PL 219 153 B1 acgttgtgct gccatgatct ccttcggcga gtggactgtc ggacagttga atggtagaaa agtttgagaa agggtgagtt gtagcggctc gccaatgccc gacatgcgat tagagggctg aacggccagt gcgtcatttt tctgtccgcc catcggagag ccgccggcat gctcgcgggc tgccccgaac acaggatgtc gaaagaacaa agacaatgcg cctcgatgag gaaagagaat taaatgctcc cgcagtttac cgctgacttc cataacgccg tgagctcafcc tgtcgaacgg ctatatcggc ggaaaacctc gttctgatcc tgtggccctc gtatggcgat ggcaagtgca ccggcctcat gccggccatg gtatcggcaa atcgtgccgt cgcacagtag atcgtttgtc tgtaggacga acatcgcgaa tcgtttgccc ttgatctcgt gccaatcgac tgaaacagat ggctgtccgg cgtctggtca agaagcgtct tgtacggtcc gactgccatt tcggaaagta gtcacaaccg tcataggttt tcgaaatagg aatacgcgtt acccgaaccg cccgttccat caagctggag cgtttcttat ggaagccgtg tctttgcgtc tcttccctta agatgtcacc cccagacctg acgtcttgtt agccgacgat gaacgcccga ccgagatgtt ttgcctgtgg ctccgcgtag cctcctccat atttatcgcg aaccaccgtt ctcccaaagg ggttgcgctt tgttccgatc cacgagcaga attcccgggc gcgagtctcc ttcctgtcgt gtcctttcga tgccttgaac acgaagaagt accttcgccg tttctcgtgg ggcgatgaaa cttgccagtg caacatctgt ctgccgcttg tttggtgatg gtagccagac ttcaccattc gctggcgagc aagcgaaagt gcgccctgtt attcaatgac ccaccagctt gatctggcga ccgagaggat catcgcccgc agccgggcag tgcggcttat gaggctttcc taccgccgag catgtcgctt gggccatgct gcgtgagtgc cagcgagttc ccgcaccaga agacgtatcc ggagaacctg cgatcgactt cgatgcggat ccgggatagc tctcgatcgg cccatacatc ttcccacgac cggagatgat tcaagggaat gttgaccgcg gcgctcaagc tctggcaacc ccagtcagac cgcgggaatg tagaacgttg gttatctgcg ctggcctccc gtcggcggta gtcgccatcg ggcatcttca ggcgagacga cgcgccgacg gaactggcgt tgaatgtcga cctttttcgc gttcagttgg gtcgtacgag agcgcccgca cgcggcgtat ttttccgaca caacagtgtt ctgatctgca tcacgcagcg aaggaactgg gggatggatg ttcgcctgca gcacgttccg ccgaaaagct ggggcgagcg ccggtctctc tcggcgtcgc ctccttaagc aagtcgaccg atgaataaaa atgtctggaa tcgcgcatgg cgctggatga tcacgctgca ggtcaggccg ccggaccatc tgtaaggaca taacgtcgag agcggcgctt ggcagatatg aatgacgggg ggagcggtcc accacgttcc caacgtgtcg ggatgcgagc gctgcgctgc acccgcgcga gcgcatgtgt aactgcggca gcgcctttcc tccctgataa ttcatcgtct gtgcggatcg agacacggcc ctgccgcaaa gccgttcaga gaggctgacg gccgcgaacg atactttcgt accgttcggc ggctggcttt ttcaccagta atcggcagac gacaggcggc acgcggagca ttttcagcat tagctcagcg ggaccgacgc tcgggatagg ttggcgggat cccgtgacga cgaccgatat aggtcgaatt gaatcttccg ccgaacgttc aaatgccgag ggatctgtcg cagatacttt gagcagcggc caagcattgc tgatctcctc gtgcaagcat cgtcgctgcc tttcgctgcc gaacaggcgg cgtagccgcg cgctttccag cacgctttga cctgaatgag gcatggcgcg ttgatgagac caccactgcg agggtgttgc ggcggatatc cctgctctcc gcgactctcc tggctagttt gcttcggtcc cacaggccaa ttagttgcgg ccgtcttcct gcgtttagca gtgagattgg ccggccagta ggccggtatg agaagggaca atggagttga cgtcctaaac tgctcggctt tacggaaatt tgtgccaatg aacacgaatg gcgacaagat aggagctgcc ttgcctcggt ctggaagcca gcaaacatcg acagccggga tgctgttcct acgatcatca cgctcgatga agctttcggg ccagctcgtc cgcgctgtcg ccctcgtttt ggtcgatgtg cgtagatgag cgtattgagg cgaacaccga gaaaaccctt cgccttccac cgaogtcgag agtccacgcc cgacactagc cgaocatgtt gcaatagctg tgtgtgggtt actagcttct atgtcctgcg gcgctccgcg ggcgacgtcg gcgttccagc gtcctcggca gagaaagcgc gactggaagg aatctcctga gacccgatga catatcaccg atgaagttgg cagttcggct taactgatgc aacggggagg ggagatgccg gcgatcgagg catcagacgc ggtatcgcgg gcaaacgacg cttcgtccac catgatggga cctccccagg ttgacaaacg gccctccagc ccttcggcag cgaggcatgt cgaggttcaa atgggctgct ggcgcacatc ttgccagtgc cactggtgct acagtcctcc tggcaagctt gtaccaaagc cttcagcggg tcgccaccgg ccaagacagc gggtgatgtc tgatcccgaa cagcgaaggc gtaccatgcc tacgggtgcg taagagcggt gcatgtcatg gggatgccac ggctcacccc tggaacctga gctgtgcatt tgcggcggct cgagagcagt acgtttgaag ctcatcgacg caggttctgc gaagtggccg gtgggggcag gcgcgtcccg aggttcgttg ggccgcagcg gcccgcggcg tcgacagcgt tgccaacagg cggatttccg attccgaaac gcctgagaaa gcgtcccgcg gggaatagat cgattgcgga agcgtactga tgagcgagcc gcggaaagac tgggtggcac aaccaaccat atctcgtcga tgagcacccg ggaatggctg agaaacctgg ggatgagagg agggagctat aaagccgtca accgcctggt ctggcctggc aggtcgaacg catttcacct tcgtcctcga aatcaatatc gatatgtcca tgactgagcg gcccggcccc ctccacaaaa aagtgcttgc cacccagtgc ttccagatcc tgcctgtaca ccgtacgcct gagcggatta ctcttcctcg gttgaagcca aatggtgtag cctgaccata attcgtcgca gaaagaggcg cccggtgttc cgggggaagt atcccgtcca gtcgagcagg ggacaagcca aaggcgagcc cattaccggg agcctccgaa gtgaacccgt tgcaggagcg gcgatgggcg tccggttcgg

29040

29100

29160

29220

29280

29340

29400

29460

29520

29580

29640

29700

29760

29820

29880

29940

30000

30060

30120

30180

30240

30300

30360

30420

30480

30540

30600

30660

30720

30780

30840

30900

30960

31020

31080

31140

31200

31260

31320

31380

31440

31500

31560

31620

31680

31740

31800

31860

31920

31980

32040

32100

32160

32220

32280

32340

32400

32460

32520

32580

32640

32700

32760

PL 219 153 B1 tctgtttcat ccactgcccg cctcggagac cggggtcgga gttgaccgac ccagctccag gattccccga cttcttgacc tcgatagaaa gcaactcgct ccatccggcg acaccgacga agattgtcca ccgctaccac attttacttc tggcttgttg ttcgtctaca gcgccccggc ttcacggcgc caaaatggac aagttccgga cacacgctct tggtctggcg cagaattagc gattgtctcg ttcctcgtct ctgtcaggcg atctggaaat gtgggtgcat tcatgtatta actatacttg gatgtcgcgt ctttcgcccg cctcgttgcc cgtattcccc cctggtgacc aaccgacatc gaacggcgtt cccggcgaac tgaagcacag gctcggcctc taacggcaaa gatccagggc cgagaatgct gccgtccatc ttacgcttcc tttcgatgcc cgaagccgct aggcggttcc tcccaaccct aacaacgctc cctgtcgatg catcgtttac gttcctgacc acttcttaca aacaagcctc accggtgctc gtttatcact tcccggtatc gatgcgtgcc gcagacgtcg tctcggaatg ccctaatctc gacttcccag gatcacattg gccgcgttcg gaacgcatgg gatgaggtag ctcgtcccgg gaccaggagg aatagcgcgg gacgggtgtc tcccgcaggc cgatatacga cctccctcag accgctcctc ctttttgcaa aaacctgtat gcaaagttaa tagagatcgt gacgccatga tcgcgatgga gagatcaatg gtcgagaatg gtctcctccc cgtagacggc agatccggca acaaggtatc tcgacgatca atttattaca atgattgtca cgagagcgac agcaagtaaa gttgacataa tcagcttttc gcgcgcgccg ccttcttttg atttccgaag gtcggttctt accggcgctt gaattcatcg gactgggcga gggaaggtca tttggcgccg gagcatgcca gtcggcggcg ggcaaggtga gagacagcca aagaagtcag aagaaccagg ggccttgctc aaggtcggcg cccggcagtc gacgcctata cgcgtgttgc gtgcttgtaa gataccgagt gcaaccctct gccgtctacc gaattgctcg ccactgcttc gtgctcggca gtgccggcct ttcagggtca tcacgggccg accgcagatc acgtacccat cggtggccgt gccagatagg atatcccccc gattggtaaa aacttcatga gcagtgactt actaggtagg aacccaaacc gatccggcga cacttgtcgg ctctcctcca cgggattgag ctatccggga ccattgaata gggcttttct gaccccaaac gaaaatcgag cacgatggct ctggtttgga gcttcaccag cccgtgccgt ggcaaagttc cgctttcctg cttcggcctc tgacctttgg gtgacacttc tcgtgaggat gcatctctac aaacttccaa aactgtcatc tgaattcaca ccttcgcctc cgcagcaggc ccatggctga ctggcacggg cccgaccgat agctgcctgt cgtgcatgac cgaactggaa gcacggattc gccgcggcga acaagaatgc aggctgtcga ccgacggaac ccgaagaaaa aagaactcgt tgaagaagtt tgacggtcac gcgagtactc ttccaagcga ttttcttgtc gcgagtcgtg ggacgccggt gggccgccgg tcagtgagta gcggcgtgcc agacgttcat tcatgatcat cattgaggga tcattccggg taggcgagac ctcgcgaagg caacgctccc aggtaaaaaa ttttcgtgac gacagtcatc gcggcttatc acgggtagcc cctggtaggt cctgtagttc gaatcacgcc agcatatcgc cgtgccgacc gagcctaaat gtgctggttg cgggtgaaga accggcgcct gagccggccg gccgtcaagg gagacggaac ttcccggtca acgcctcagc atagtcatcc cagcataatg gattccggat cagaactatg gaggttgtag ggacatcagc agttttgtga tttgggatat ggttaaattc ctcaaatatc caacaatact gagggtcgtc ttccgcagct accgacagtg agagttccag cggtggcttc caagtccgac cgcaatcgat cgtcgaggaa ccaggtccgc cggaacctac ctataccgcg gatcggcttc aatcaagcag ttaccagccg ggaacatgtg cagcgaggtc cgaaaagcgt cgacctggtc gcggctgccg cgcttttctg cgccgctctc gaatttcttc ctttgcgcag gatcgcgatt tgcgcgcccg gaccgtcgtc tcccggcctg gccctacatc aggcgcttac tgcgttctcg catggtgctt cgctgcaacg ggaatcggca tgacttgcga gaggtagccg aaaggcctgg acgccacaat gcaaatccag acgctgtgtg gtccagcact aggtcgcggc ggacaaagct gcgcgtgtgg caattgtact catggatctc cacagaccgg ctaacggtcc acatgaacgt agctgtgctc tcggtcggac agctcgatgt agagctctca gcacctgtcg acggggagcc acaccgggaa tcagcctctt cggagcagaa ttcgctcctt caaacgcgaa cctgcaaacc cggataatat aatctatcta atgaccgccc atgacacaca tcgatcgtta ctgatcgacg aaggctcaag aagaagttct gagatcgaac gctctcgcaa ctgaagaaga ggcgaattcc gactactaca accgaggacg ctgggtctcg gccgatggat ctcacccgtc cgtgccttcg ggctatgtcg gtcaccggga gccgacgcag tcagtggagc aaacggcgac tcggtgcttg accgaggttt cctcgctacg ttgatcgcaa gccgtccgcg tttggttatt accggcttca gtctccatca gctcttggca ggcatcaccg gcaattgccg attacgtcct aggccggaag aagaagcctt gaattggaat atgtcacgat ggcgtggcaa gcggcctcaa acaagttgta tccaggtcat ggcacggaca ccgcctatcg tctcgatttg gtcttcagac aggatttcgc gagcggtgaa ggatcaggtc cgaccgttct gggagaagac cgagcctgac cagcatagcg ccctggccat ccaatccccg gctccgtgtt gcatccaatc cgccgtggcc cactcagcgc agtttcgcgg atatctagaa tctcgccatc tttcgtcaaa gatataccat tgcgttcgcg acacgaaaac ctctcggcct gctcgagcac ccggcaaaac gccgcggcga tgtgcaagca cgatcgtaaa tttgggagcc ctgacgccaa cgttcgccat acaacatcac cctatctgac cgtgcgtggc cgcttttcta cggagttcct ccctgcctgc gccacttcga ccaactaaca tcaagatgcc gtatcatcga tcaccgctgc ccctttggac gcattctgcc tccccttggg aaaccgtcaa tcgctctcct accttctggc gcgaagacgc tgacgaggct cagcgtatct caggacagaa atatcgtaca

32820

32880

32940

33000

33060

33120

33180

33240

33300

33360

33420

33480

33540

33600

33660

33720

33780

33840

33900

33960

34020

34080

34140

34200

34260

34320

34380

34440

34500

34560

34620

34680

34740

34800

34860

34920

34980

35040

35100

35160

35220

35280

35340

35400

35460

35520

35580

35640

35700

35760

35820

35880

35940

36000

36060

36120

36180

36240

36300

36360

36420

36480

36540

PL 219 153 B1 gatgagcctc cctcgcactt cttccgggag gattcccaga ggtctcacca tacgacggac gcagatgccg ttgctggcca aactggatga atctatggtt ctggtcgcgg gaggctataa aaatggcaga gcgatcgtcg ctgaccttca tttgattggc cggccgcagg acgttgggca ctctaactga tgggccagca aagtgaggga ccgttgcgga tcttgcgatc ttgaactgct gcttgagcat acgttgcagc ttgagcaggc cagcctatgg ccaatcccga cgaaaatcga acaacatgca tgaccgagta actacatcac ctttcgacga cagcgctcct aggtcgtaag tgcagatcat tgcgcatggt ctgcaatcat ccgaagccgc aggcggcatc ttcgagaact tccttttttg ccgtcgagta tcgttgcgat tggctcgatc ggccgagcag agtgagccgt aaggcagttg cggagctgac tgcgctcctt cctgaacgtc ggaatatcgt gattcttgag caagcgattg cggctgcggt actgcgtttg gcctgttggc cctcaacaag aggggcattg ggttgagacc tcttctgaag agaacgccgc ggtgatctgc ttcgtgctga gcttactgat cctcgctcgt tcttgttcgt tgggccggat gcatcctttc ttccgcttgg ccgacgtcat tgctcgcgct gcatggtgct gggcgatacc ccatgtggca gcttgtcccg tcgcattcct tgaatgcgcc cagcgtttca tgaatgccgt gatcggacca aacaggttca tctcgatttc aaagcaggtt gttcaaccgt gccggaaaag cgggatggtg cggcctgaaa tcttcagggc cctttcggga aatcattctt ggagctcatc gcaggcagcg caacgcaacg cggtcgcttc ggaactgcag cgacaagtcc ggccgacctt tgctcgcaga ttcaaacctg ggatgcttca caaaacgcag tcaagtccga cctgacatac cgccaagaac catcgtgacg ggagtagact ctggaagcaa tgcgaacgta gcgaccaatc gcgatcatcg gattacttgc gagcgttcat gaaacgcaca ctcctgcaga atggtgtgga cggaagtcct tacggcctgc aagggacatc gatagcgtct cgtgggatcg ctcccccgtc tttgaactcg tgttgcgagt aaaccgcatc cccatggctc cccttgtttt ggctatcaca caatcgagca ggttatggct cgattacgcc ggcctgggtc tgtcggtgcg tgaaatcaac cggcttcttt tgcgctgctg gcagacaatc ttacattctt agccatcggg tcctcctgcg gttcaccgtg catcaatgcc cgccatctgg aaaatgaacg gcgcgcaaca tggtacggag actgctttga atgcacgatc aaaaatttag tttcagaagc atccgtggca gcggcactct gggcagcaac ttcgatgaac gcggagttgc cggatatcga aacgagttct ggttaagggg gacctgaccg gtcaatgctc caactcgatg cagcccgtcg gagcgtgtgg cttaacaggg ctggctggcg ctccaggacg atgatggaag ctggagcggg ggcgatgatg tcatgccgag gcttccgcga tggtagcaga tccgtcagtc tcttgggcgg cgcgcccctt gctcgaagac gggtttcgcg cgatgctgac acgacaccag tgaacatcgg agtaatagcg ctgtcgatcg gccgcccgtc tcgatagccc agtgtatcgc tcccagctct gtcatcggat ggcgccatct gctggcatat caacatcatc gcagacagcc cgacgcaacg ttcttggtcg ttcctgaccg ggaacctgcc ggtctttacc gtcaccaatc gtctatctcg atcctgccga cgcgaaggcg ccggctgcgc gaaaccgccc cctgtggatg atgcccatcc gccgcgactg atacgcttca acacttcgac ttctgatcca aattccacgc tcggcccgtc tttaccctgg tggctcaggg caaacccgtt tcaccaagaa ggaatgaggt agcgtttgtg ccacatcggc gagaccagta catacaccgc tcacgaatcc gaaacatgac gacaagtatc tcatcggcaa ccatgcagag cgaacgacct gcgatctcgc gtgttgtctc cgctcgatgc agcacatcga accagcgctc tcggagatca tttcgactga cgtcgttatc ggaaggttat aaggcaacca gtttatgaaa agaggcgctg ttccgttcag gaccaggata gaagggacgg agaaccgtcg ccgggatgaa aagcaaggaa atcagggtag actcgatcgg gaaaggcggc agtgcgctgt aaacggtgaa tgggcctgag gcacctcgct tgcgcagaat caaacgattt ggcttctttc caatcgtggc acttcatatt cgttgatagc agtttccgtc tggttatgtt tcgaagagta tcgctggtgt ccgatcttgg tcgtcatcgt ccttcggtct ggcctggtat cgatcatcac cgagctttcc agatgttcaa gtgttgtcct ggcttcgacg cgtcagtaaa tcccgaacgc gctcaagaag aggctgcggc caaccggtac catggatccg tccgaaatcg gagccttctt gaaggaccgc catcgcccgt tctggacccg cacgatcgtc ctacatgcac gcagaacgaa gatggatcac cgatatgggg cgacaagaca aaccgccgaa gcgacggatc caagaacatc tgcagggttc tttccagaac tgtactctat gatcacattg tgctaccaat tcgccctcgc gtacaggaag atcgccgggg gatctggttg atgcgagccc cccaagcccc gaacttctcg ttgaaccatc gagatccacc cgactgtttg cgcatcgttg gacgcaattc actgtttccg aagcgcggtg gagcctttgc aaaaggctga gacgaaatcc gttctcgatt tgcgggaaga ggcctccgcc tcgctgcagg ttcgccgccg tctcgacatc cgccggcttg cgaccttttc acggcgaccc cgtcacggct tgcgagaaag accgtcgatt ccggacggtt tgcgacgaga cggtgcggac ccttaccggt gatcggcgct ctttatcaac ctggatatca gatgttcatg caatcttggc cctgccagag ctgcgcgctg gtcaaccttc aagagcacgc gagggcgcga atcctgatcc atttatgaaa gatgagcgag ctccatcagt acgctggccc atcgccaccg atcgtcacgc ctgggcgaga aaaacgcagc actattcgag cgaatcgctg ctggcagatg acggcggctg gtcggggcga gccaagcgcg agcacattgg aacgacgcga aacggcctct tgcgctcacc cttgctgaga gccgaaactg atattggcgt tatgtggact ttgtcgattc atgtgcgcag tttttgatgc ctcgcagcaa gcgagatatc ttggtccgac cgcgtcgcga atgtcagcat gtactgtgcg attgccctca aagacggaga agttcacttc ccgggccagg atagcgacac ggacagtcca tttcctgcag atgatcgatc

36600 36660 36720 36780 36840 36900 36960 37 02 0 37080 37140 37200 37260 37320 37380 37440 37500 37560 37620 37680 37740 37800 37860 37920 37980 38040 38100 38160 38220 38280 38340 38400 38460 38520 38580 38640 38700 38760 38820 38880 38940 39000 39060 39120 39180 39240 39300 39360 39420 39480 39540 39600 39660 39720 39780 39840 39900 39960 4 002 0 40080 40140 40200 40260 40320

PL 219 153 B1 tggcagaatt gcttggttct cgaccagcct gggtctggac gcacatcgag gaagacgcag ccgatttttc ttggcgggcg cgcaagtgcc cgtggccgca cgacgcccgc ccagctcgca ttacgccgat tcagtttttc gcacgtgtcc gccgtttgca ttatccaggt cgccgagaca gctcgaggcg cggcgttgcc gatcgcccgt cccgaccaca aggtgccttc ggagccgccg ccagatcgat gcgccgggtc tcaggatcac cattggaaat ccagtctcat gcgagcgaga gcatgatctt ccggtcggct acgtgcagaa gcgccgatgc aagaccctga ggcaaatcat atatccatga gcgaggtagt atggcgaaga tccttgcagt ccatgtactc ggcggttttg gaccatcgat tcaaggcttt agagagcctg tggcatcgga cattgccatt cggtttcggc caagctcctc caccggcgcg actgataggg catcgtcggg cgatagcgcc ttcgagctta aagacatggc ctcgtcgcct atttacgatg ttttatgtaa acgctttttg cccagcctgc aactcgctga atcattgcga gaggagatcg tgcgcggcat ggtcgacgag ccagacaagt cagtccagca cagtcttcct tgcatcaagt cataagtctg acaataaatc gaataagcgg ctggcgataa tacacggatg gaccctgata gtctggaaag ccggtgcagg ggctttaata atgatggcct tccggggtcg tccaactccg ggcaaggatt aacaaggact gatgtcgtca ggttatggcg ttctcctaca caggaaagtt gaagccaacg gtacgcgacc ggggctcacc ccctgccggc ccgttgcgta cgtgaccgcg ccaggaatat cggctacgtg cgcattcgca tctctcaggc actgcttctg gaggctgatc cgtcctgttg cttcgacggc ggactgggtt tattgaacga tcgacgagct cgctggctga gtaaactggg ctggtcccaa acgatgacgt ggggcgcgca tcgcgtgcct ccgttcgcgg gctgacgcta tcttggctgc ctttcgctct gcaggaggta ggtgctgtgc attcgcaagc gcaagctcac tcttcatgtt cgccccggca gcgagctcat gcactgtgct ttgtccttcg tctgggcatt tcgcccttcg accagaagca aggaaaagca gttttgccag tcggtgttcg cgcttcaaca atgtcgcctg cgggtggttt gatatataga cgtatttctg gtgtctgttt ccgtagcatt cggacggtga cgctggtgtt gctttctcga aaaacgccgc ccggttccaa ccaaggacgg agaagatcga gtttcaaggc ttgagccggt acccggctgc aggcggacca tggcccacaa actgggaagg tcatcccgat gcgtcaccta cggcgcttac aaaacctaca caggtggtag aatcgactga ttgtctcggt gctctggtcg cctttctggc cttctggagc ggtcagcgac gttgatgagc gtcgagatct gcgcaggctt acgcctgacc gccatgcaga gaacgggcgg atccttcggt tctatggggg cgcgtgccta actttaccac tgacttcgac atcttgcgcc tccaggagat gtttcctgac tcgaagaaat aactcgtcaa accggtttga tcggtgcaac tgatcctcat gggttcaata gccgagccgc ctgctggcag aggcggcgac cactccgctt ggcggtgcct gccgatcgca gcttctcgtc gtcaattggc ggttgaagct cattgaaaat ccatgggggt gccgataaat cgttaagatg agggcaatcc gcgcgattgc ttttcgttta gaaatgtgca tggatcgatg tgcaatgcct catggtcgcc cgcctataca tcacctcgcg tcagatcgaa tccgatcgct cgccttcggc ggatctcaag tccatcggca tttctcgggc ggctgtcgcc gattgtctca tctgaccccg ctcggcgctc ctccttcaag cgcgtgcaaa tcatgtttta aaaccggcga gtttgatcgg ccgaacccac ccgatctcag agcggttgac gcagtttttt gcgttggttt agcgcgtcgg cgaccgcttc gcaaagaacg tcgttcaacg aactcgacac agcaagccca aagagcgctt gtggcggcgg cgcgctgatt cgaagggctc gcgctggcgt tatcgtcggt agcgcccgtc catcattgcg gctcaccttc cgatgaaaag ctatgcggtc catcaatttc gctcaacacg tatcgtcatc atgccagttt gagctcattc atcatgacaa attcttagcc tgggacacgc attgctttcc cttttcctga tcgatcctgg ttcgtcggaa atctcatcca gcgtggtacc aaagtccgtc tatcgtggtg agacgacatc ctccggcgaa agcaaatgcc gttgagcaag gttctgtcat gagaacctga gctcaggcag gacattccga ccggtcgaag gaaaagaccg gccatgcggg gtcgcctgtg tacgagatgg ggcaagaagc ttgctgaagt aaacatgaca aattccgtca atcttcaagt gaactgcagg ctgaaggaat gaaaactggt taagcacgtt aaggcgggga caaggcgctg tccttcggga gtcaggcaag ggtcgcgcgc cgtaatggaa acgccgctac gacggcccat tatcgcacgc gctcgaccct aaacctgccg gattatcggc agctgcactc ggatgatgcc ggcaggagcc ccaccactgt tatatcatcg gatcgcggct gatatcgcac atcctcgttt tactacgtgt atcctgctcg gcaacgattg caggcagagg caaccacagg cgtgaatcgg tcgattgacc gtcatgctcg cacattccct agtggatcgg aagatacgat gcgcctttcc tcaacatggc ttgccgctcg tcgttgcatc gacctggact agctccttta ccggggcaag tgttggtctg gccaaaaact ccaacgcgtt gtattttgag tgatccagga tctacgatag ttgcgttccc atttctgtgg tgaaaaagct aattcaaact cggatgccag atccggctgt gcaagaaggt ccggtcggct ccggcttccg aaatcattac tcgccttcac ccgagtacaa attcggtcct tgaagcgcat cgcagacgtt aaaagatcaa tccagacatc ctgtcgttcg tgaccaataa acgagaatgc aacgggatca gccggcaaat atctttctag cgccgtatcg aacgtgctct cccgcaggct gccgacaaac gcgctggagc aaaacctcac gcggtcatca ctgcgtgctg acccgcatct gaagaagagc ttgtgatggc tcatcaggtc ttgccgttgc ggcgtttcct agggacttga ccatcccgat gccgctcaat ttgcaatgtt gctttatcgc ccatccgtgc taatgccgcg ccgtcatcgg gatacgagta ccgaatacgg tgatggcagc ttggctgcta ctgggcgttt acctcgcctg gacgcttggg caacaccacg acggtccatc gcttgccggc cgaaacgatt tcgcatacag

40380 40440 40500 40560 40620 40680 40740 40800 40860 40920 40980 41040 41100 41160 41220 412 8 0 41340 41400 41460 41520 41580 41640 41700 41760 41820 41880 41940 42000 42060 42120 42180 42240 42300 42360 42420 42480 42540 42600 42660 42720 42780 42840 42900 42960 43020 43080 43140 43200 43260 43320 43380 43440 43500 43560 43620 43680 43740 43800 43860 43920 43980 44040 44100

PL 219 153 B1 gttatcgact cgctgggaca ggcctcaagc atcgtcattc ctcgtgtgag tgcagtctaa gttgacttcg ctcttgcagc cgccggaggg tgtcggcgca ggatcatcat aggaatgctg gctgtgtccc cgggagcgat ttttgcctgc cacacggcag taacttaaca acgggcaatt cgcttcaagg aaggaactcg tttgccgagc ggtgaagctt cctgcatctg tttctgaaaa gccctcgaaa gcgaccaatt cgtcggccct ccaaccccgt ttgcgatgat cttcgcgcgc ttcgcgaaaa agcaactggt cgcctgccgg atcagcaggc gcgtggtcta gctgcggacg cgcctgtcgt gtgctgctcg accaccaata gtgcgcttcg ctgcagaact gactatccgg gttctcgtct ttcaattcga ctgcctccgc gaagcggtgc ctgactgcga atgacgctgg gtggtccgcc atcatgtttc acagccgttg gctgcttttg gttccggtgc aagtcggccg cgatgtcgtc tgccgacgtc tgcgtggaat gatgccggcg gcgctacgag caacgtcgaa tctgagcacg cttcaagggc gcgggtcgcc acgcgattgt tcaacatcag ttcagtcctc tggccacggt cctgtttaac gttcgtgcgt tccataattc gctcgcgcaa gctgccggct tttgaacatt gtaccgcgct tggtggatcc gaccccgcag ctcgaatcag ctcgtgttca ctgtcctctc cacggatcac ccgcacgctc cttactccgc cggcgctcgg cgggtgcgcc gcccggtatg tcaacggaac atcgtatcac cacggctacg aaagccagat cgacctccat cgatatcgtc ccgcaacgcc gctgctggag gggaacaccg tgatgcaatg tgtcaagctg tgcgtttacc acgtaagtca atgtttatct ttctcgaccg gtaccgtctt ttccgattgc aggaattgcc ggataatcgg aatatatgac ggaaccagct tcttccagat tgtttggcct tgatctatct aaaagagcag cagcccttct tgccgggcga ttgtcagctt cctttacggc gtttggcctc tgatcttgct gaaacccggc gtgatcggtg agattcgtga tcactccatc aagaccgagg gagcggtatc ggcgctctgg accggcactt gtgcagattc atcgttggcg gccgcaggtc ggaatcggcg tttgaacatg tatcctggcc gtcaaggctt tcttattcaa cagtaatctg ccaacccgtc ggcgatatag ctgtcgcggg gagctcgaac gctgaattgt gaaagtctcg gcagcgacat tcgaagtttg tgcccatcat agacatgacc cattcttgcc tggcagtcag ttacgcctca acagatggat gatcggtcac cgaagtcgaa ggcattcctg gcagatcgga gacggattcg actttctctc atctaccaca ggcatcgaac cagttgatcg ttttccgaac atggaacatc tgccgaccat aaggaagatg attcaagctg gccaaggaga ctatctgacc taccggcctg catcggcctc gcaggtgttt tccggtgctg cggtttgatc tgcaaggggc cctgtttttc tgaaggcagt cggtattccg ggattggtac gttcacgatc tgtggtgatg ctggatggcg ggccggcaac gccggtcgca ggtgcaactg tgcgtaaaaa cgggccaggc tccttgatgc tgttttcacc cggcctatcc attttcccat aggtcgtcgc ggcgacatcc attcggcgga gcggaaattc ctgccttcgt atcctcggcc ttggcctggc gagtgggtct tcgggtcccg agtcgagggc gatatatgga ttgagacttt cgcgtgcgct ccgggctcgt agcttcgcga gtgcgccact catgagtgcg gttccttgct acgggaaaat cggcgacgat gaaaagacct gaagccatcc ccgaagggcg acaggcttct ttcatcttca ccgatgacag attcagcggg agccttccgc acgatggaag gccgaagtga cagtcaaaca acccggactg cccatgtggt accggatggg tcggtctggg ccatcctcat cggaagtggt gcgaagtcgt aacgcgtgtg gcgccaatgc gtctggattt cctgcagcgc atcctgatga gccgacaagc atgtttgcac ctgatcggtc gacaaccagt agcgtctatg gtgatcgacg ttcctcgccg gagaacgtct gtcgccatgt atcgccattc aagtccgtcg aacttcgagc tttgccgcgg gcactctgga gtaaggaagc tggcctcgca tgaagaaggg ggcatccttt gtcaaggaat agaacgcccg cgatagcaga tttcgttccg ttatgtctcg cggggcgcag ttctgggaat tcgtcggtgc cccaggtaac cggcagctgt ggcaaggccg aggcgctgct acaggaacaa tcggttgctc cgtggtgccg aacctcgcaa tatgacgcta catcgctgaa ctcagggtag accaagaggg ctgccagccg catgaaatct ataacgtgct tcaacaagga aagtcaatcc cgtccaagag ccgtttgtga cccattgggg cattcgcgca tcgaatccat gaacgaccgg agaaacgcgc aaaggcccga cggaacttcg cgagtatctc aatttctgcg cgacacatcc caaccgcccg gctggatatc cgtcgaccag accgcagtct gtcccgaaga ttgccgccat tcgacagcct tgtatccgcc gggttctggc tggcggtgat tcgcccgctg atgtcgcggg cgtggttctt tctcgttctg gttacctcac tcctgccgaa tcagcctgaa cgctgacgat gcacggatta ttgccattgc tgattggccc tgggccgcaa gcaatgtctt tcggcttact cccggtggtg agctcgctgc gaggtggtcg gtcgcagtga cagtggcgag gactatgccg gctgatccct atacttgccg taccgtgttc aggcgggctc gacgatcttc acgcaaggcg tctgcagtgt gaacaaacgt gcaattctcg ataaaacacg caaaatacca cggcacagca ttccttctga ctgacaccgt aacgattaga catcgccgct cagtgcttgc acccgaccac cttcctgtgc aggcggcggt gcacgcgctc ctgggatgtg cagtgcagcg cgtcgaggat ggcggcgcgg tgatcgcctg tgttcgggaa gccgttaatt cgtcgcatga cgcaacacgc aagaccccgc cgtgaccttc ttgtcggatg atcgtcgtca cttccagccg accggtcgtc tcgttgcaag accaacactg ggcactgggt ttccgtcggc tctggcgaaa gatttctctc ttttctgcgg cattgccatg cctcgttgcc cctgtccttc gacgattgcg gcgccgcttg gatcagcccg gggtggggat ctactttctc tccgcgcacg ggttgccatt cttggtcgaa gtattttaca cggacatttt atctgcggcg catggcgaca cgggatggat attatctggc cgtcggtccg cgcgtgccgt gtgcctctgg ttgtgggcca aagtatcaag

44160

44220

44280

44340

44400

44460

44520

44580

44640

44700

44760

44820

44880

44940

45000

45060

45120

45180

45240

45300

45360

45420

45480

45540

45600

45660

45720

45780

45840

45900

45960

46020

46080

46140

46200

46260

46320

46380

46440

46500

46560

46620

46680

46740

46800

46860

46920

46980

47040

47100

47160

47220

47280

47340

47400

47460

47520

47580

47640

47700

47760

47820

47880

PL 219 153 B1 ggtcgccgaa accatctggg tcacgcctca ggaaccggtg tttttgcccg atgaagtcga 47940 tggacacgtg ctgtttcagc gcgctaccgc acgggtgctt ggcggggaga gtggcccagc 48000 agttggcagc cttggtgata ttgtcatggt tcccccggtc cgggacgcac gggatcgcgg 48060 cgtgctgggt tcggtgcggc cattctcaaa ctttgatcgg gatggcgtcg tctggcagga 48120 cgatactaga agcgatcttg acgccgtcat ctggtgcacc gggtttcggc cagcgctcga 48180 tcatctccag gatctcggcg tgatcacgga cgatggcagg gttgatgtgg atgaggggcg 48240 ctcgattaag cagccacgcc tttggcttgc cgggtatggg aattggaccg gggctgcctc 48300 ggcgacgctt ctggggtcag gccggacggc ccgcgagatg atcccgagac ttgtcgcggc 48360 gctgtaggcg cgcaatcccg atgaatgcga caattgcact tgcacccagc gtggtggtaa 48420 tgacgagcga ccacagcgtg ccgatatggg ccatggcaaa cgctagcgca aagggtgcgg 48480 tggccgacag gatcaaccgt gcggccatga ccttgccttg cagcctgccg tagccatcgc 48540 tgccaaacag catcagcggc aaggtaccgg tgacgatgct gaaaagaccg ctgcccaaac 48600 cgaagacaac ggcaaaagcc atggctcctg ctaccgacgg agcggtgagg gtcaggatga 48660 gtacgccccc ggggatcaat gtggcggcaa tcgttgccaa agcgagcggc ggcagattgc 48720 cgccgagcac catgttggca aaccggctca gcacctgcga cggaccaaac agcgtgccga 48780 caatggcggc ggtggcccca aggccaagcc ccgacagcag cggcaccata tgcaccagga 48840 tcgccgcact gacgagagat tgcagcgaga accccaccac catcagcttg aacccgaact 48900 gccggacgtc cgggctgaga cttccctcca cgatctgcgc cgtgccggct tgtttctgtg 48960 ctctaccctt ggcaaggccg taagacagcc aggcgtggag cggcaggcag acgagcaagt 49020 tgagcgcggc gaacaccagg tagacattct gccaggagag atgggcgtgc agagccgttg 49080 tgatgggcca gaagatcgtt gaggcgaagc cggcgatcag ggtcagatag gtgatgctgc 49140 gctgggcggt gcgggggctt gcctgcacca gcagcgcgaa ggcggcgcca tattgcacga 49200 gattggcggc gatttcgacc acgatcaggg cggcgacgaa gccgctcttg cccggcgcat 49260 aggcacagac gatcagcgcg gctgcggcaa tcgcggagcc ggccgtcatc acctgtcctg 49320 cgccgaaatg atcaatggcc cggccaaggt agggcgcagt caagccgcct agaagaagtg 49380 ccgcggaaag tgcggcgaaa atccactccg tagaccagtt caggtctcgc gccatatcgg 49440 gtgcaaggat gctgaaactg tagtagaggg ttccatagcc aatgatctgg gtgaggccca 49500 gggcaaggat agtgccgacc ggcgggcgct cgctcatatt gatttcagat ccacgcgctg 49560 ttcgagcttt gcggcctctt ccttcctctc gctatagcgg tcggtcaggt agtcggaggc 49620 atcgcgggtc agcagtgtga acttcaccag ttcctcgcag acatcgacga cgcgatcata 49680 ataggcagag ggtttcatgc gaccctccgt gtcgaactcc tgccaggcct tggcgaccga 49740 cgactggttc ggaatggtga tcatccgcat ccaacggccc agtatccgca actgattgac 49800 ggcgttgaac gactgcgagc caccggagac ctgcatgacg gccagcgtct ttccctgtgt 49860 cggtcgcacc gaaccggtcg tgagggggat ccagtcgatc tgggccttga tgatgccggt 49920 catcgcgccg tgccgctcgg ggctgaccca gacatggcct tccgaccaca gagaaagctc 49980 gcgcagttcc tgaacctttg ggtctgtatc cggcgctcca tcgggaaggg gcagaccctc 50040 gggattgaag atctttacct cgcatccgag gtgctcgaga agccgtgcag cttcttccgc 50100 caaaagacgg ctgaacgaaa tctttcgcag cgatccgtag aggatgagga tccgtggctt 50160 gtgctgcgaa taagccgggc gaagcgcgtc aaggtcgggc tgggaaatga gatcaagcga 50220 ggcggctggc agatcggcca ttggggctac tccgtattgt aggatttagg cgtttgtatt 50280 ccggggccgt tatgaatctg atccggcaag ttctgggggc acgtcaccgc cgtcagattg 50340 acccgaacaa cagttctcca tcaggaaatg agcgaggccg ttgagggtct cgaagctcgc 50400 getgtagacg atggagcgtg actcccgctg agcactaatc agaccagcat gttccagttc 50460 tttgagatga aaggaaatgt tggaaggcga gacgttcaca gcttcggcaa ttatacccgc 50520 cgccaatccg cccggaccgg cgacgacgag cttgcgaatg acctgcagtc gggtctgctg 50580 tgacagtgcg cgaaacgcat ccaggacctg ccgctcgttc ataaaatcca atcctcgtaa 50640 aagcgttcta aggtgccagg atatacaagg cttcggcacc tgcgggggat gatcgtattt 50700 cacaccccac ttgttttcat atttcaacta atattgaaat tatgagttag ttgcggctac 50760 gtcaagaagt gttttgcccg tcagtggacc agaagcagcg gaagatcggc tgcagccaaa 50820 acttcccgcg tttcgtgacc catgagccat tccagccact cgctatgact aaaagccccg 50880 gtgaccagaa cgtccgcttt cagggcatcc gcttcacgga cgagctgcgc gccgatcgtt 50940 ttgtcggaac ggggcagaat atgaacttct ggtgtgacgc ctgagccttg catcacagta 51000 tttagcgtcc tatcggcgtt gctttcatcc gttacgcgaa gtgcgctgac acgttctgcg 51060 gcttcgagcc atggtccggc agtctctatt gcgcggcgag ctagatcgct gtctgtgagg 51120 cccacggcga catgcgaaaa ccttgcgcgc gctcctgctt tccaaccggg cggaaccagc 51180 agaaccggcc ggtgcgccgt gaagatctca gcgtggaaag catcggcggc atccatgttt 51240 ctattatgcg acaagacgac gagggcgata tccgcggtcg tctcccgtaa aacggtctgc 51300 gcctccggcc cggtaatcgt gcgcaattct atcgaaggcg cttcgggtcg caaaactata 51360 ttccattcgc cgaacgcgga tttgatagcg tccgcacgct gttgcagcga gccttcgtca 51420 tgggtgcgaa gctcctgcat gtcgatttcc tcgggagggc agacgagatg tgcaggatcg 51480 acgatgacat tcaacgcttc gatcgacgag caggtcacgg atgctgccgc cataactgca 51540 gcatccatcg ttcccgcgac tgtatcgcct tttgtcagta cagccagaat tctcatgtta 51600 gtgctcccat catttcccga accgtgcagc accaccaagt tctgcctcga tctccagcag 51660

PL 219 153 B1 ccgattgtat acccatggcg aatgacatag cgtgccgatc tgcaatgaag gagagcgttg cgagacgatc cttgtttcct agcaggatcg ttcgacaatg gtcgccgaca ctcggcccca ttcctggaaa gatgggcaga tgcggcggcg ggatttgttc aggatcccgt aacgcccttg gccagtggag gctgacgcga gatgaaggct cgggaaatcc acgaccggta agaatacgtg attgttcctt cgcgacgagc gcgttcgccg cggcgcgacg gccggtcgcg ctcctgccag acgaatgaag ctgcaaagcc cgcttgtcct aagcaccagc cacccaaacc cgtgactttg gtgcttgtag aagcttgtcg gaaaccctcg ggcattcata accaaaccag gccgatttcg tgcggtggta gttcatgtcg cttcggcacg aacgaagcag gatcatgcaa ggcaaatagg gacgaagaac gaacagaccc gatcgttgca aagggcgtag gggcaggatg tgccagtcca aaagccgatg gctccaggcg ctcgtattgc cgtgccgaag ggcggatgtc ggcggttccc gatgaacgga cagattgttg gccagccact ttcgcaatcc acagcgaaat ttccagccgg tggttgagct tgggtattgg gtgatggcct gggaattttt tgcccgctgc agcgcgatag acctcgcagg ctggtgctga aaacggaggg tccatgccgg tggacggccc gcccggcaga ggcgagccgt cccttcagaa ccaccatagc gcgccggagg agcgtcggat ctcatggact ctagattggg ctcccaccga atcatcgact caccatggcc acggctcatc aggaacagga cgggccgcgt aggcctgaaa ttgccggtga gtggcgaatt tgctgacatg tgcccaatga gaagccaagc cgctccgagg agtgcttctg acgatcacct cgcgacgcaa tcctgaagct attcctgctg ctactcttgc gtggaatgca gcaagggacc cgcatatggc cccacgcgct gcgaccgcga gcgagcggcg tccggtggcg agcggcgtca ttccaggccc tcctcgggat accaagccaa gccttgtagg aaggccacgg ccttcaccag tggcaggtcc atccggccaa actgcaccaa agtttaaaga tcgcgtccag gccatgcgca ccgccctcgg ggcatacaga ggtcagagcg cggcgatgaa cattacggca tgatcagtgc tgacgaggtt tgtagccgtc cgacccaggt gcgtcaggcg caatatcgtc cctcctcgtt gaccgcgctt cttcagcaaa aatcggcgtg caacgccacc gcgcctggga cgagttcgat gaggagcgat ggctggcgtc gaacggacga taccccgcga tgctcctgct cggttggcat cctgtttgag ggtataactg caatcctccc ccgcgatcat cggcaaagat cgccaagctt gcacaaggaa tatagaccat cggagttcga agagcccaca gccgtatcaa aagcgtgcgg aacacgatca ccgccgccac tgtttttcag tcatctcgac tgccgctgtt acttcgcctg ctgaggtctt gcctgtgttg ggagccggac gaaccgagat gcgaaaggta tgtagacgga tgttggtcgc caccgagaac cctcaccacc aactccagta tgggggacca gcaggatcaa cggacgatgc aggcaatcac cgccgctcag agtctgcgac ttgtcaggac acccggccgc ccttaccgaa ctgaaccgcc gtggcacgcc cggacttgcc agatcagcca cgaggctgaa gctgtcttcc gagctggatc cgcattgcag gtcgtccccg ccaatcgttc ctcgaacagg atagagcccg gcctggccgg gctccggagc cgacaggata tgttggcgca catgccgcca cagataggcg aaccccaagg cattgccgcg ccgctgattg accgtcgcgc ggtgccgaca atcgaggatc gccgagatgg cttctatttc ggtttcgtcg gaaaccaggc agttgttatc cacgacaccg ggaaacgaag cagcgctcga taaccagctt catcccagcg cgccgatctt ggggccagct cgtgagacca cggcaatatt gatagaccaa gttgtgatgg gagcgcgcca gcacatggtc cgaatatccg caggaccagt ctcccgcggt cgtcacgatg cttgccgaca gtcaggagga gatgctggaa gtgggttgcc gcccgcgaag gcccgcgaca cttgaagcca atcgatgtga taccccaagc gcttgcgaga caggtgagaa aaccttcagc ataggcgatg aatggcggcc ttccaaggca aatgcctgcc ggcgctcgca gaccagatgg gccacccggc aaactttccg aggaaactcg cccgtcttga gtctcgcccg gcgctgatcg gccttctcct acgatctgaa tcatcatggc ctgaccatct tcctcaaaga tagcctgcgg ttcggtgcaa gatttcaggg ccatgcgggt ttgagcacgt taaagaggaa atggcattgg tcgagcgccg acattgtcga agttccacgg atgccattgt tccagggcgg cggctttagt tttttctcga tcgccatacc gtaccactcg tcttggtctt agccagttcg acaaccgaca aaatagcaaa ctgctggaga gcgagcagaa ggcgaagatc ggcaaggagg gcaaacagtc gacggcgtgc gaccgtctcc acgacgtccc tgagtccggc agatccggat aagtgtgtat tctcgataga ttcatataga atgggccttt aagtcgccga atgtcgttgg tggccgctgc ccgaaaagct acggcgacga gcactgccga gcgcttagag tctgggcgga cccagatatt accggacgca agttctgcga atcagcacgg gcataatgtg agcaaggcag aagaccgcgc atcaacagga aggctgccgc gtcagcacgg tcgtggattt taggcccaca aaccgtagtt tctgaccgcc agcggtgcga tctcggtcac cgataccctt tccggtcgcc tgtcctcgat cctcggacgt acgaactggc cctcgattgc atccaccttc catgaaacgt agagcatgaa tcatcatggg ggtcgtggct ctccaagctc cttgatgtga cggctttacg cctcgttggc cgagatgaac tgatgttttc gctttccaat tctgatcgaa tcctccagcc cgccacaagc aagccctgta gaagtgtcag acatgtcgat tccaggatgc ccgacgacgg tgacgatggt gctgtcagcg cttttcatgt cagccatcga cgggaaacac ttcaggatgt actgttccag agaattcctc tggggatttc ggtgagcgac gcggcttggc tacggaccat cggtgagggt gcgcattggc ccgcagctgt agaggtaggc cgatgcccat aaccgagagc gagccgcacc tgatgatcgt agaagccgag ctcgtgttcc gcggggcata agaaatgcgc cgtcgaggtg tatgcccaat gaagcaatgc cggcaatagg tacgaatgtc ctagctgcac ttgtgacgag gatcgacgat ccatagcaaa ctgtcgcccg

51720

51780

51840

51900

51960

52020

52080

52140

52200

52260

52320

52380

52440

52500

52560

52620

52680

52740

52800

52860

52920

52980

53040

53100

53160

53220

53280

53340

53400

53460

53520

53580

53640

53700

53760

53820

53880

53940

54000

54060

54120

54180

54240

54300

54360

54420

54480

54540

54600

54660

54720

54780

54840

54900

54960

55020

55080

55140

55200

55260

55320

55380

55440

PL 219 153 B1 atcaaggctc cagaggaaca gagcaacgag cgatccgacg gctattgcca tcggaatgac 55500 aatggcgatc cactttgcga gactgcggat ttgctgaaaa cgaaggccga ataatgatgc 55560 gagcgtcatg cgaaagacac tccaccaaaa ctgtcagcag atatgagaaa acacagaaaa 55620 tgaattccag acacgaccct actccttcgc gttatgcgcg ttgagtagga gtcatcagct 55680 tcatcgagga agcggttcgg cgtaatgccc ggcagaatcc attaccgttg aggttaaata 55740 ccgttggaaa gtaactagag tcaaggtccc tcatcccgct catcggagtg atcccgtgca 55800 gatagggcaa gacagactgc ggcgatcacc gggacggtga acaggccggc tatcgtgatg 55860 agctgcattt catggcccca actcaaagtc cgcccaaatc gggtagcggt cggaagcgac 55920 gtcggttgtg tcattgctgg cgactgcgta tcccacggcg cgtcagcaag gcgcttgctg 55980 gcaagcaggt agtcggaacg gaaagtcatg aactccgtat tcgtgaaacc gcgtgccggg 56040 acagtcggcg tcggagtggc ttcaaggctg ttaccgacgt ccacgaaacc ggcccgcaac 56100 aacccggcta tcgtggtcct gtccgctgtg ccgtcctcac gggtgtagcg catacgatat 56160 cgtgcaggca gcaatgccag atcgtcaggc tcaggatcat ccggcgcgac ggaattgaag 56220 tcgccgccaa tcagggtcag tgtggatttc cttgaggatg cctccgtgaa cctgttgatc 56280 ctgcttgcgc ttggatggtc gcttcgcaac cgcgtgcgcg ttggcgtggc tctggctctg 56340 atcttgctcg ttcccggaat cgcgacgttg tggactacct atcagagcct tatggcgccc 56400 gttccgcccc agccgttcct gttggcagtc acaggcacgg gggcgcttgc agtcaacctt 56460 tcctgtgcat ttctgctgac agctttccgt cacgagaacg gtagcctgac gagggccgcg 56520 ttcctttcgg cgcgcaatga cgcgcttgcc aatatagcaa tcatcgtggc cggtatcgtc 56580 acggcctacg cctggcattc cgcctggccg gaccttatcg ttggcctgga gattgccgga 56640 atgaacatgg acgccgcccg cgaggtctgg caagccgctc ggaaggaaca cgccgctgcg 56700 gcttgaagcg attgtcggtg ggtattccaa aggcgaaagc tgcggacgca tgattaccag 56760 gttcacgcat gccgccatac cttcacggca gagatcagca gaatggcggc aagcgccgga 56820 aggagcaagg ccgtcggcac gacaccgagc aactgcccgc caatgaaggc gccagctatc 56880 gagccgagcg ccatgacgat gaggaatgtc ttgttgcgag cgacaacaga gaagctttgg 56940 tcccggctgt agcgcgtaaa gccgaccagc atcgtcggca ggctgacagc aagggagagg 57000 ctgcccgcga gtttaatatc tgcaccgaac agcagcacga gcgttgggat gagaagttcg 57060 ccgccggcaa cgcccaggag cgaggcgact acaccgatta ccagacctgc caaaatgcca 57120 gcgacaatct gcgtcgtgcc agtcacgagg ccagctccgg cggttgcatc gtggccgaac 57180 aacagcacca ctgcgatgac gattagcagc accgcgatca ccttatacag gttttccgat 57240 ctgaggcggg ttgcccagcc cgcgccaaac catgcaccaa gaagacttcc agccagcagg 57300 ttgacgacaa tagtccagtg cgcgacgatc tgatccagtg gaacggtcgc tgcccggaac 57360 ggcaaagcga atgcaacgac aacgaggctc attgctttgt tgaggatgac cgcttcgagt 57420 gccgcgtacc gaaacaggcc gatgagcagc ggcaggcgga actccgctcc acccagaccg 57480 atgaggccgc cgagcgttcc gatcacggca ccccagatga aggctgttgc cgaacgaatc 57540 ttacccgtca tttcttgcct cgtatgggtc ggtgcgctgg tgaaatggtc gcggcacgct 57600 tggtggagtt catgtcaaag ggactgttgg agcgaaagcg ttttcagaga tcgtatgaca 57660 gcgcagcgtt cgatctgcgc tgcgccatcg ttgtaatccg tataaatgtt cacgatattt 57720 gatttttgac cgatcgacga tcagacatcc tgagcaggat gtatccgctc actccggcga 57780 tgattgatcc gcctaggatg ccgaacttga cccgatcctg catgacgggg tcctcgaacg 57840 cgagcaggcc aatgaacaag ctcatcgtga acccaattcc gcagagaagg gagacgccca 57900 gtgtctgtcc ccagctggcc gcggcgggca attccgccca tccgcttcga accatgacaa 57960 aaactgttcc gaaaatgccg agcagcttgc caagaacgag accggcacca acacccagcg 58020 ttaatggctc gatcagagtt gctggcgata cacctgcgaa cgaaacgcct gcatttgcaa 58080 agccgaagat cggaacgatg agaaatgcca cgggcttgtg cagaccatgt tccagcttgt 58140 gaagcggcga agccgctggc gttgcctcag gagtgccggg agtaagacgg atggggatcg 58200 ttagtgcgag aagaacgccg gcaagcgttg cgtgaacgcc tgacatcaaa acaagaaccc 58260 acaggaccgc ccccaggacg agaaatggcc aaagccgcat caccccaagg cggttgaaaa 58320 gcaccagatt cccgatcaca agtgcggccc caccaagggc gtacagattg acatcggccg 58380 tataaaacag cgcaatgacg atgaccgcgc ccagatcgtc aatgatggca agcgttgcca 58440 gaaagatttt cagtgatgcc ggcaccctcg gtcccagcag cgaaagcacc ccgagtgcaa 58500 aggcgatatc ggttgccgac ggaatggccc agccgcgcag ggcggcaggg ttctcgtagt 58560 tgaaggcgat ataaatcagc gccggaacga ccatgccacc ggctgcagcg gctcccggca 58620 gaatgcggcg gctccagctc gagagctggc catcgagcat ttcgcgcttg atctccaggc 58680 ctaccagcag gaaaaagact gccatcagcg cgtcgttgat ccaatgctgt acgctcagcg 58740 gtccaacata gacatgcagg agtgcgaaat attggtcggc aaaaggtgaa tttgccacga 58800 tgatggcgag tagcgcgact gccataagca ccaggccgcc tgatgcctca ttgtcgagga 58860 actgacgaag cgtagagtta atgcgacccc gcaacgggcg ggactgaatt gtggacatag 58920 atctgcgtcc tctgtgcaag agttgttgtt gttctccgta atagggggat ccctggcgca 58980 cgcagcacac gccatagcat tcaatatatt catcaattgt gcagatggcc agcaaaaccg 59040 gtacttcctc ggacagaacc gggatccctg cacctctgca atacgactca gacatctgga 59100 gatttcgtga gcaggtctgc ggcaggaaac ggccgacggg acgggctaac aaggattaga 59160 actgcctttc ggaggtgcga tggtcagcaa gcagcgactt ggatcgcccc acccgcaagc 59220

PL 219 153 B1 gaaccaattc ccgcaagggg cccgtccccg tcgaaatgtc tgatggtccc aagctgtctc ggacattccc atgcgtttca cttgcctcgg tcgagggaga ctgtcgtagc tcgtaatagc aggcctttca cagaccgcac gcatcccgac cgaagcgagg gcctcgtcct atcggcaatc atgctcggct gctgcctgca gtactcgtcg caccaagagg tgatgactgc tgacctgcgc cgaaggtgac cgagcaccga agcaaggcag tcgccgcgat gcacgtggct tcggcgcgtg gcaaggaagg cgtttctcag ttggtcggcg ccacgtgctc gctccgactc aaaactcagt cgttctcgat tcgggtcact cggtgccatg gatccggatc cgtcatgtgg gaccgctttt cgagccaggt gccgagcctc gcgcacaaac cggcttctcg tggcaccatc cgcggccgag agccgaactg gcgccaggcc gccggctcgc gatcattatc accgtatctc gatcggcggc ggtgaccctc gctcacgggg gatccgcaaa gatcgacgcc gctggccgag gcgcacgacc ctacatggcc gcgctacgat aggtctcacc cgctctcatg tccgctagca tgcctttttg gcacgatctt ggtcaccgtc actggcattt gccgattgcc ggtcggcgat cgcagggctg agccgagctc tgcgatagcc ggaccgtctc cgccagcgtg attagcgcct acggaccagc ccgggcgaca gttgcatcat tgacggcgct acggcttcta cgcgcgccgt ccgctgcttt agactacccc gcctgccgcc ctcgtgcccc cgtctccttc tgccatcgca ctagatgact ctgctgcgcg gacaggtgtg ggggccccat cgtgaagcca cccgcgacac gtcacgtcgc aatcgctgga tacgccgacc gagatggtca ggcgagctga ctggacggac accgatcgcg accacgcagg cagagcgtcc ttctgctcgg ttccggctgt gctggtctcg ggtcgcaatg gcctcgatca ggcggcacct acgcttcata acagactggc aaatacgcgg ctcctcgacg gcaaccggcg accagtacga ggttatatcg gtctgccggt tatttcgagg accgagggcc gatcaggtgc cacgggatca aaggctggcg gcctatggcg aacagcgcca gaggcggcgg cgatggcgtc ggctgcggcc gagccatcga gtcctcgcac ttcgaggtcg cgctgagctc ttctgtgcat cttttcacgc gtcgcgctcg gcgcgcccgc gctcgccgtg cagattgcac atcgcgcatc ggataggttt agacgttgca gcgcctggtc tccgctcgtc tgcgccctac ccttgtctac ccccagccgc cgccttcgac atgaggaaga ttcgccgccg tacatcgtga gaggcgaagt gccgccagca gatcgcgccg gcgccgctcc ggtgcagtgg catcgccggg tgaacgattg tggcgagctt ctgtggtcaa gcggttacga acgggggtgc tccggccact tcgtcggcgc gcacgctgaa acaccgcgat accgagggcg gttatgaagg acgagcatct cgatcgagga atgtggcgtc gaggcgctta cggccgccga gcgtcaatgt acgctcgcgt gcggaaccgt acctgctccc gcggtgtcga cgcggccggc cggcgctcga gcgcggagct cccgactgct atgaaggcat gagcgtcact tgatcaccac ccgtctcggc tctatgccgc ccaagctcgc tgcccgctat cgcgtgcggc ctggcccagg gctcatggct gcgggattgg agtcccacgc acggcgaata gccggctccc tgggccacca acgtcgtcga tcgacgaggc aagacgaagc cgcggcggct cctgtgcgct caaaaatacc tcgacaagaa ccgactgcgg gccgtcggcg ctgttcagcc aagccactgt tggaagccgc ctcgttcaga tacgtcgcgc gtttgagcgc aacgcactgt agaccacgat ccgcgaccgt tgaatgctgg taatccgcgc tcgccgtcgg tgcttcccct caagagccac ctgtgcaacc tgccgttcga gaacgctctg tcccgccacc cccgaccata gctcgacgag ctatccgttc tgcaatgtgc cgcctcgccc ggcactcgcc cggctgcgcc ttccgcctgg aggactggaa gaagagcctg cgatctcgtc tcagggcgca cggctgcgtg ggcggcacgt tcgtcagaag cgcgtacaat agttgacggc agttcctgct cctcgaggaa cgcccagatg ccccgaggcc caccgttatc gaccgtcacg gggccgcacg gaagggcggc cggcgacgtc cgccaagaac cgtcttcacc cgggcatgag tccgatcttc ttgccatcgc cccgctcccg cttccagctt tggcgtttat ggaacagcgt cgtccttcag gatgcgcggc gcagcagttc gaagccgtcg ccggcaggag gtgcgagttc ccttgaccct gagcgaggtc caaacctgac gcatactcgg tcggcatcgg ttgtcgccgc gacaggcctg tcgcgctctg cgctgctgct tttcactttg gacgtttgcc ggcggcaatc gaccttcgac ttatccggcc aggtgccgtt cctgtctctg gatcgtcgcg ggcctatgag tcctcccggg ccgggcgtaa caggcgatgg gacagggtgc agcgcgcttg ctccgccggc agcgatcata gcggtcgacg tgcggccatt gacgtcgagc gcgagctcgc cgcgacgaac gccggccgtg gtggtcgcca gtcatcggcg caggtggcgc ccgtcgaaga tttgccggca gacacgctcg ggtatcgcct gcgcgtattg attcctggcc ctgccgcgat ttcgcccgtg gagcccgaga tccggcatcg cgtgacggtc cccaacatcg atcgtggtcg accggccgcg gccctcaatg gatccgcagg atccgcgttt cacgatcaac ggtgatcgcg gatggagcct tcccgtgacc ctgaacagtc ctcgatcagc cactcgctcc ggcaacggcg acggacttca ctcgtgggtg gccgaccttc ggcgcgcttg gtagttgcta gaacatgaat gacgccagag cgccatcgcc cggcgcctgg aacggcgggc tgccgatggg gttcgcgacc ttccgcctga atcgcgtcgg gtcgacaaca cccggtgtcg gacgctaaga cacccgacgc ggcgccgtcc gcgggtcttg ggcttcggct acgaagattc acaacccggc cgtttccgga tcgggtccga gtgttgcgtt cggagcgtac gcgacctcgt acaccggcca cgctgggcat gcggcgcact cacagtcggc tctgcgcgac gttccaccga ctctgttcgg accgaccctt ccggctcggc tcatcggcag ccctgatccg ttactgctga tgtctgggct atcgcgacgg ccgctggcaa tcgagaccgt cgctgctggt ccggcgtcaa tcggcgcggc cttaccgcgc acgatgtcca aaggccttgg acgaccgcat accagttcgt gcgacagcct tcgcaagcgt cgacgatcgg

59280

59340

59400

59460

59520

59580

59640

59700

59760

59820

59880

59940

60000

60060

60120

60180

60240

60300

60360

60420

60480

60540

60600

60660

60720

60780

60840

60900

60960

61020

61080

61140

61200

61260

61320

61380

61440

61500

61560

61620

61680

61740

61800

61860

61920

61980

62040

62100

62160

62220

62280

62340

62400

62460

62520

62580

62640

62700

62760

62820

62880

62940

63000

PL 219 153 B1 tctcgatcag ggccgatgct cagcattcag cacgatcttt caaggacatc tcctgccgat ggcacagcgc gttcggcccg caactgcatg cacctgcctc cataaaggag tcatgatgtg cagcgcttcg aatggaggct gggcgcgcat gagcgccgtc cagatgcgcc gagttcgcgg accgtgaccg cagttcctgt catggccacg cgcgatgtac tcccactcgg gaattggttg gtcaagggca ctcggcaacc gcgagcgccg ccggtcgaga gcccgtcaga caggctgatg cggcgtgtcc caacagggcc cttcagattg cccgatcgaa gatccaggag ccggctgttc gacatatttc ccggttttcc cggggtgaag gggcctgagg gtatgcatcg cacgaagtcc ccgcggctca caaccgctct catgttgaac tcggtcggta gcgtgagacg ggcggaagat acggaggacg ttctcgttcc gcgatcagcg cagaacggcg cacgccgcca accggcagcc atccaaggtc tgcagatgcc ccgacggcaa ttgcgcagcc ttctcgacaa ttccaggtga atcgccagcc ttccactggg ggattgcgca gtgccgcgcg gctggcggtc accgcggctc ccttacctca gccaaactct gatcggtatg gcggacttga ggccgtcccc gcggaaggct gatggccaga gcgcgccatc cgttccttca cgttgcagcg tcccatggcg cgcgacagga aatgggtcga agcatcgcct ccgacccgct cgtcgatggt tcgacctcct gaggcgtgct caggccagcg gggatcacag atcttcttgg agccatagcc cggatcgcct cgatccttcc ttccgtttca tagcaacaca gcatcgaagc atcccgccca ggatctttgt atgacctcgc agaggtcttt gccagcatta agtgcatcgg aaggcccatc gaacagcgcg gtgatgccac cacacaccca atcaaatcct aggaaccggc ccgtcggcgc gccgcgcagg atcgccggcg ccatccctga gcacgctcat agagcaaccg ggaacatcgg agtcgccaga ccggtagttt tcggacaggc gccaaagatc cggtcgcgtc gcagagccgg gaagggcggg agttctccaa tggagagatt acgcggccac tccagagctt gcaggacggc catgatgcgc agcagtcagc cactcgccgc gtttgctcgg tcgcgatccg ccacggtcga cctgctgcgc acgtcggcgg cgatgctggg gccggccgat tccagcacct ttcacaaccg gcctcacgaa acggcgcgat gggagagacg ggagatgtcg ccggcaccga agaagcagtc tcaggcgctt ccagttccac tttcgaagta gcctgaagcc tgtactggat ttcgcctgaa gactatcgtc cgatgagtat gctctgtccc ggacggcggc aggtcacgcc ggcagccgga cgatataggc gctcccgcca cctcgaaccc ggacggtggt catcaaacct cccagacagg ccgcgggccg cttcagcccg gcagcattgc ttccctggcc cgcacgtcag cgcgccccgg gatcgacgtt gcagcgtcgc gccgttcatt ggatcacgcc ccatatccca gaggcatcga cgttcaaagg cgccgaggat cagaatttgc aggcaacgcc ccgtgcggta t tcgccttcc ctgctctccg ggctgaggtt cgccatcgcg gatgtcggca ctgccctccg gagcgccagc gcaggtcccc gctcgatcca tccgggcgtc gcgccgcttt ctcaagccca ccgcgacact cgcccacatc ccagggtctc ggggctgaag cgggtgagca tgcggttatc cgagcacggt ccgtcgcgtt cggaagcgcg tcagcctgcc gcgcctgttc gagcctgcgt cttgtcggcg ctcgacgagg ggctgaaggt gttcagatat gcgatcggcc gccgacgcgc gtcgatgatg ggatgcggac tttgccggcg ctgacgggtg cgcgccatat cggcgtctcg cgcattccgg ctcgatggtg ctcgatcgcc tcgcagcgac ggccgtctgc cggtcgccce aagctcgtcg gagatgcagc gccgccccgc aatgcctctt cgtgtggcgg ggcagtgaag gccgatgacc ggttgcccga atagggcgcc cgtgatcggc tgccagatcg aagcgcagta catccaggca gaagtcgacc gacatcatcg agccaaaacg agaggtagtg tctgccgcct tccgtgatcc tcccgcagct atgaccgcgt cgaccgaaag tccaggagcg cgcagccggg tcggtcagtg taatggttgg gtccgcttat gattttccgg agctttttcg gtgtgctgcc tcccgtccgc cgatactcga cgcagcgctt cgtgggctta ctcgcgccgg accgtcgatg ctcgcagcac caatcggcgt gcgccgccgt ttcgacggcg gcgccgggct gttcgcggtc atcagccacg cgtggctgca tttctgtcgt agaagatcct caggcgttgg ttctcagact ccgacatgca agttgccccg ttaccggcgg tcgtcgagtt gagccggcat acaaccccga ttgaagcgcc cgctcatcga gcattgttcg cggaatcgtt atccattcga agcctttctg tgcacctcac aggtgccgtt gtgtcgggat acagcatcat ccgcattgca gacaatctgc ccttcctcgc gcgcgcgagc atgtcgtcgc ggctccggga tagaccggtc aggcgatgaa cgcgcccggt agcttgccga tggccggaga tagatgtatt gttcgaaagg ccgaaccgcg atgtcgtcat gtcatgagcc caacccgtgc tgcggtatgg cgtccatgaa tggagcattc ggctgacgcg ggccgatctt cttcatccgc cctcgactat ccgccaccgc accagtcagc cgtcatcgac gcgacgacag gagccttttc catcgcggac tctcgacata cgatctccat tcaagctcgt aaggtgccga acctcgcgga tttcgttcgg caagggcgtt tccataagct cgccgctcct ctcgactcgg gcgcgactga cgggggcacc ctgaccggct tgtccaggcg ccgcctgtgc gacatcggtc cccgcaggca gcgtgcgcgc gaagcgggcc gtccgcctgg gtccgagcgc agccgttgaa agggccggtt agacgtcttc gatgttctcg tctcgcggtc ccgaaagacg cctgttcgcc ttcgcccgtc cgtcgcgcat cttcccgcgc ccggggagat gaaccatcga tcgtcaggag cggtcagccc gacgcttgtc gtgctgcgaa agaggtgctc tgcgcgcggt ggccgcgcca gctggacgat gatgggtcgc tccgcgagcg ctggccgcaa ccttcgcaag cctttctggc agagcgccgc cgaccctgag gtaagcctcc gcctccgacg ccgatcgaat cgcctggaac caggcacccc gaagttgctg ttccgacggc gggcacaacg cgtctgctca taccgtgtgg cttctgggtc gattccgtac gcgccccggc cgtcagcttg acgcaagcgc accccggttg gccggtcgtc

63060

63120

63180

63240

63300

63360

63420

63480

63540

63600

63660

63720

63780

63840

63900

63960

64020

64080

64140

64200

64260

64320

64380

64440

64500

64560

64620

64680

64740

64800

64860

64920

64980

65040

65100

65160

65220

65280

65340

65400

65460

65520

65580

65640

65700

65760

65820

65880

65940

66000

66060

66120

66180

66240

66300

66360

66420

66480

66540

66600

66660

66720

66780

PL 219 153 B1 aaggacagcc agttcctcga aacagcgcgc tagcgacggc cccgtcgcta gaggcaatcc atgtatttca acgcgcagca ttctgctcca cgaggtttta gtgcctgcgg ggcgcaacct ccggcatctt tcgaacaatt caccagcatt cttccatgca gcaacttcag gttcgtcgag aggtgtggcg cgcttgccct ccagccaaag gcgccagcac cgtggctgac tgaggacatt gcaagcggat ggctcctcaa cttcctggag tgttgcggcc tctcgcgaaa cgcgctcggt atgattgccg aaagcttgtc gaagcgccag gggctctgtt aggcgcgcaa tcaggtcgtg tcagcttctc taacagactg cggccgcgat ctcacctcaa gtaagacaga gacgacctcg ttccggctga tttgcacctt ccgcaaaatg tgaagagaga aggctgggtt gtagcgagat ccaagggcga gtatgcgggt ccgtcgagac cggccggttc tccgggcggc cccatactga gcttcgcgaa tgtgtgtcac acggaacgct gccggcttgg gtgatgtttt gcctgcgtcc cccaaagaag ttcgcccggc tcaaggagga agacgaggaa ccggaggcgg cttccccggc gcaattctgg tccggtcgcg tcccactgta ggcgcaacag ccccgatcag gccagtcctc ccgacgcccc ttttccagag catgggtcag ccgtccgaag cgattccaac aacgcgcagt atccaggtag aagaggatcg tacccatccg catcatgtgc ccggaagacc acacaatggt gtcgacactg gacacggatc ggtccgttcc ctcgcgcccc tgcaccgacc ccgcaggccc ctgccaggtg caggagatac ggcaacattg ataggtgaaa gagcgctgct acgtcgcgcc gtctcggcgc gctgttgggc atcgtagctg ggcggctgcg ccgcagcgtc tttcccgccg gcgaagggga acacagagtc aggtcattca cgctggcgag gcaggccatg cgggaaggaa cgagatcgag tgcccttgat cattatcgtc tatcttcggt cgccgagcta gatcagccta tgccagctgg gatcaaccgc tcaccatgga gggtggcgcc cgaggctgct gtatctcagc tcagcggccc tgctgatcgg ccacgccgac ggtggaaaaa tgcaccggcc ctgaagagga gccgacgaca ctcgagcccg gactactccc atcacggcct agcctcgatg ggcatcgcgc tgtttcgggc agcaccgagc ataggcattg ttccaggaac tggtgccggc cgccgtcagc gacgaagacg tgggaaggtg tcccaggcct atgtgagtgc ccaatcaagc atctgttcac ggagtgacgt acctcccaag tcggatgttt gctcgaactg ggatgttcga aacgccgcgt ttgctaccct ggctccgtcc gtcgtgacga ggatcctcgc cgatccaggg gcagcgaccg ggcgatttgg accgaccggt gcatggaagg tcggcaagaa gaacgaaccc tcgtcatcgc acttcatcca gaaagatccg ggacgggctc atgtcgtcaa aggataatgg tgaattttat cggcatgccg cccttgcggc agcaatgata cgactccggg ggcaaggaaa acccatgccg ttggtgacca tcggggttgc gtctcgactg cgttatcttc aatctgctgc aaagtgagcg aagatcctgt atcgatgcga acaggcggtg gacatacagc ctgcgcatcc gactggaatg ggaggcgtgc cttgacccgg aggcgaggtc tcgtaccggg catctatgag gccgtcacaa acatccagaa atctggcgca ggctttgaga ggaagccttt acattgcgct attaccgccg agccagaacc cccatccggt ggccaggaag agcggatttt gcacgacgac cgaccgcagc tttcgatgcg ggcggtacgc gcacgagcag cgaggtcgat cggccggggg ccgcccatac tgtccttttc ttgacctatt attcatgcag tggcaatggc tcgggaactc gcaattcggc tcccgtctgg aaaggaaccg ctatggcccc cgatcattcc tccagctcgc ctgcgacatc agcgcatcca ccaacgtggg caagaatgaa ccgacagcct tgaagaagag gagcccgtcc cgttgatcgt cgtccttccc ccctgggcgg caagggacgc ttttgctctt aattagccgc atacagtggg gtaccaagcg gccggggatg ccctggaggg ggccatctga ctgaagattg gatggcaaag gcgaggggcc gttgggaggg ttcggctcgg tgagtttggc gctgggcgcc ttgtggcagc tcgccgagga aggttttgaa cgcctgcacg ccgacgggca gtgaggatct tcagatggaa cgtggtagcg tctgttcgac gtgggggagg tcgctgcctg cgccgtgctc caggattgag gattgggtcg gagttaagtc gccgcagacg ggagatactc acagattgac gcggattttc cgcgtttcat gtcgatcatt gctatggccc cgcgccgata cgacagcata cccgaaccgc catgggccgc caagcggctg cagaaggagc gcgcggttgc acgcttcagc cggcgccagt gatccagagc gaacaacgca aagacgacca gatatcgcgt gccgccgttc ctcttcaaga ggccgagatg gtgccgatca gatcaggata gcaagctcga cggcatgccg gtggacgacg ctggggcatc cggcgggaaa gtgctgcgaa tctgacgaga ctcattgagc ttcgccatgg cgcgtccgtc cacgcggccg ttgtcaagcg agcgatgaag gtttgatcct ctgtaatttc tcttgtctgg ggcgcgccga gtcactcccc ttacggtagc gcgtgggccc cgctgaccac cgcaattgag agccaccgca aacagacggc tctcggctgt gcaaatggag cccgccgcat ggccggcgtt cggcacttcg gccggcatgc cagattgtcg cactaggtca cagagcctcg cagcaacgtc gccgtgaccg ctcggcggcg ctcgccgccg gtcgagacga gcggataaag ctgcaggaat gtcgatcctc ctcttgagtg cacaggggtc tcctggcttt agcaaacgct tgggatcggc tgaaccgcaa ctgcaccgta gccccttccg cgttcgcgcg cttccccgat gaaaggcgca acgcgctcgg cggaaagatc agacttgccg ttgcgctcgc cgcaagccga gtccgtgcgc gtccgtcgcc gcccatcggt cgcgccggag gccgcccaga tcccaaccat aagaaccggt tccacgaggt ccatcaaccg ctgttctcct atcgcatcgc cgtcacagcg tcgacgaggc cgctttgccg ccggtgcaaa agaagctggc gagaagaaaa gtattggaaa tatcgccgcg ctcagtgacg ccggagggat aacaaggaca cgatcgcctt gcatttgtca atttgggcag gattggcgcg gccactcgat ggaatgcgcg gccgcactgc aattctcaag tcgtggcttc aaggaaaaga caagggaggc ccggaaggtg gtccggcaaa

66840

66900

66960

67020

67080

67140

67200

67260

67320

67380

67440

67500

67560

67620

67680

67740

67800

67860

67920

67980

68040

68100

68160

68220

68280

68340

68400

68460

68520

68580

68640

68700

68760

68820

68880

68940

69000

69060

69120

69180

69240

69300

69360

69420

69480

69540

69600

69660

69720

69780

69840

69900

69960

70020

70080

70140

70200

70260

70320

70380

70440

70500

70560

PL 219 153 B1 cccgaaggaa gacccgtcag cgatgaacca ctacatgttc attcatgacg ttacttccac catcatcgag tatctggagc agcgcgaggg gctcaccgat ccccgacgcc cgcgaggttc catcacgggc ggcgtctatc gccgaagagt ggcggcgatg agtcctaccg atcacgccgc acggtcaagc ccatgagtaa tgccctctca cgctaacgat acgcgcgata ctatctcgat tgtcgccgcc geaccagaaa gttccgtcgg cgagcgcgcg tttcacgccg cggcggccgg accctatcgc cgcccgcctg ggcaccgatc ggaccgcgct tgacatgctg ggccgatacc gttgcccgaa cttccgcaag aatcaggccg tccggacttc atgccggccc gccggccgat cggcgagatc cgaccggtcg caaaggtcgc cctgatccgc cgatctccag caaccacaca tcgccaaccg cgaggactac gattgctccg gaatgaacga tgatgtggtc gacggcggac ggtcgagctc tgatctccgg tgtcgtcgcc gcttggttcc atggggaacg ccctcagatc tgacaccgaa ctggaccgat catcgcgccg cagccaatgt cagatgttct gcagcgctct gagatcctgc ggttcggtaa ggttactgcg cgcgaaagcc atcacggcgg cagcgcaccg ttgaccgaag attgcggctt tcgatcgcgg tcctgcccgg tgatgtcgaa gcgacccaaa atggtgttga caagccacct agtaggcacc cggcgctcac taaccttttt tccggactaa gacgatcccg gccaaagcgt ggcgatgatc attctgaccg gtgctgatcc ccgggcgagg gtttgcgaga gagttcatta gtgctcgaac gacgccgcct cttcagccga tacgatctcg taccggtcgc aagcccggcg acggcacgcg ggcagctttc cgcaagcccg gccaccgagg gtgctcggca cgcgatgacg ctctatgacg gtcgatctgc aagggcctga acgggtaatg gatgcagtgc gtgcgattgc gtcgtttccg aacctcgcac gatctggaga ccggccgccc ggccacgtcg gacgagctgg ggatatctct gaccccgcct ccatccgaca ttcgtcaggc tggacggtgg agccgccgcc ttcgacgtgt gccgcgcgcg ccggatcgaa aggaaattcg ccaaccatac cgcttttcga acgccggtga cgccgctgtg cctcggtgtt atcttttcga gacccgtccg acgcctaccg tcatgctctg acgaggtagc gagggaggat tcgggtcgac cgaaagtgaa ctgcaagctg cacaaatgaa gttttttaat ctcgatcgtt gtcggccgct gcaccgtcga cactcgatcg gcattggcat atccgacacc cgcgaccggc gtcgtcttgc caaatgagat gctttaccgg tcgatttccg gcgattacgc tccgcgcaat cgggtatcgg atgtgaccgg aggcgcggat ccatcggcaa ttggccttcg cgctcgccgc agcatatcgc gccgtgacgc gagagccgga acgaaggcgc cacacgccct aggatctcga gcgagccgac agccgagagg tgcagatgct gggtcccgga gcgaggtcct gcatcgcctg ttcaagagga cgttccgcga cggacacggc cgacgattac atatcgacca gcgaggccat caggggccgt atgagcgcaa tcacagcccg aaaagatgga acgcacggca acgccggcga tcaaggatgc acaagctcca ccgaccggct acggctccca cataattcga tcgccatgcc gtggttcgaa gatctgcggc ctttgccctc cagctcgaac aacaatcacg cggctatgcc gtgcacggct ggccaagctc gagatgcttt gctgaggcaa cagccaggcc cccgagggta gactggtttc ggtgcttctc ttccacgacg tcaagccaac tgtcgtgcgc gcctgatacc ccccatttgt tccctctcct ccttccaagc tacgacgtgg tgagcgaaac cttcggcgcc caaaggctgg gtcgcttgcc ctgggctggg cacggggctg gatcgagctc catcaatggc tccacccttc tttgcacgac cttcgtcacc caagtcggcc cggcacggat gggaaatcag catcagggtc gacctccggc cgccgccctc accgatcgat cggctccgtt cgacggctcg aaagcacgtc gaaggcgcag gtcgagtttt tatcgagacc cgatcccgat gaaaccgggg ctcacctgcc tgtcgcggag cttccgcgat ccgcacaaag tgtccgcgcc cctcggcgca ggcggaaatc gttcggttac cctgctgtct ggacggcgag aaggatcaag ggcccgcgat cctgagactc aagatctttg aagcgaccca atttcggaag tctacgttcg aggatcgatg gtcgaagcga cgcgatgaac ggcgatcgct aagggaacga ccggttcagt cgttcccgct atggcggctt tctgacttgt tcaggccgct acgtcaagcg tggaggccat acgcgatgca ccaaaatcgc tggcaccaca ctcgacatgt ggaggcttcg cccttaatgc cagatggaac aaggagcgcg gacgtaccca ggcgagctcg gacgatattg cgctgcaccc gtccggaaac ttccctgccc gatccggtca gattttgccc tccgatcgca tatttcatcg tcacatggca gacttgatcg gtcgttgtcg ctgtggctcg aatcgctggt ccgttcggcg gccgctgcaa attgatctgg cgcgagggca gccgtgccgg cggatcgtct gaagccgatc gtgcgcgatt ggcgaggtca tgctggctgg ccgatttttt gatgcgctcg ctgttgcaca ccggccgatg ctcgccgccg ctccaggagg ccttggatcc cgcatctacc agcgccgctg gacgcgctga cgccgggtcc caggcattcc tacaatgacc cctggcgcct aggggcgtgc cgcggggcca ccgaacacga ccatgcgcga ggctgatccg tgagactggc gtcttgagca ggccgcctgc cgctgaagct tccgttatct cgaaaaagta tcgcaattta cggagataac cgtgatctac cgccacgttc gatggccgcc cttgtcgctc ctctctcagc aggagaaacc ttggcagttc agccggttgc cttctccaaa gggcaaactt cgctcaccaa tcacgcgcga ccaatggcat gttcttcgct aatatgcgca tgggctggcg tgatgccgca ccgcccgcat gcacggatct ccgtccgctc ctcggtcgat ccatggacaa gggcaatccg acatcctctt atatcgatga ttggtcggca agacctacac tcgatctatt aggaagaact gcttcttcct tcaccgtccg caaagctgat ggccatggcg tcgggccgat aggaaacgca tcgcctcgat ccgaacgcgt ccgtcgtgct gcgatccggc gatcgtggaa cgcaggcagc tccagccggc cggccgccga acatgccgga gcacatcgga atagccgggt tcaatgtcgt aggactgggt gtttcaacaa ctggcgcctt

70620

70680

70740

70800

70860

70920

70980

71040

71100

71160

71220

71280

71340

71400

71460

71520

71580

71640

71700

71760

71820

71880

71940

72000

72060

72120

72180

72240

72300

72360

72420

72480

72540

72600

72660

72720

72780

72840

72900

72960

73020

73080

73140

73200

73260

73320

73380

73440

73500

73560

73620

73680

73740

73800

73860

73920

73980

74040

74100

74160

74220

74280

74340

PL 219 153 B1 tattttgtat tcttgcccat gcgccggctt ggcggcgcgc caacttcacc tgcgatcatc acagatgatt ggaccgcgtt aggcttggcg cgtcgtcgac aaagggcatc cgtcgaaacg tacgctcggc cggattgcac aatccagcct ggagctgatc atacgtgaag ggcactgttc cgagggtccc tgcggcgatc caatctgctc acgccccgac cggcacgatc gctgatccgg cgaagccaag ctcgtctgaa cctcgatgtg gggcaaccag cagcatgtgg tacctcgatc caaggcgatc cgcacggctc gatgcgcgat ggacatcgcg agaacatgcc gcagctccag tgatggtgag cggtgcggac gctggagcat cgaggccgag cgatgagctc cgccatcgca ggtagagact atgtcctgca ctcccttcgc cattcgcgcc gggaaagaac gccatcccgg atgctcggtc aaatgaagac cccatgcaaa cagtcgaagt atcgttcagc gccggccatc gtcgttgatg gaagcgctca acagaggaag ctgcttgcca gagcagcagc gcgcacaagc aaaaagcgca atcgaatggg gtcgaaggtt gggcaccaga gccgtcggcg ggcctgatcg gagtttctag aaagacaagc atcacgcatt caggacgagt tcgcgcaagc acccgcaagg gaggcacagg gatccgaacg aagaaccccg gaaatgtttt gagttcgacg tcgggcaaat gccatgttcc gtgcccaaca aagacctatc gccaagcccg gacctgcgcc gtccgcaatg ggcaaagact aatgtcgaaa cttggggtgc cagcgactgt acgatgggca ccatggctgc cacgaagagg caaaacaacg aggcggctcg gcatccggtg gagcggctgc gcagagcgcg cggcttcagt gagcgcaagg caggagggtg cggttcggca tacgagatcg ggactcggcg cgccggctga ggcgccaaga ggctttttgc tgtaatttct aatggcgctt gggtcgagcg gcagcgtgcg cgattgctga ctactcgtcc gcagttgcgt aggaagggcc tcatcaaggt cgtcgccgca cgccggtggt gccgtgtgcg cagccaacga atccggtaga cgatcgccgt atgtcctgcc tacgggtgat caaagaaggg tgtatgccag tggaggatct ttcttggcgc aacgcggcat ccggtaagac ccaaggcgat gactctatcc gtgcccggtt cggcgttccg tgcagctcta gcctcgaacg acgaccttct agttccgcaa gctcgcagcg gccgctcact cgatccagcg cctgggcctc acaagccggt gctcgtttgc tctcgaccgg agcagaccct gcgacgacat tcgtcatgcc cctacgggat tcgatctacc agtcccgcgg cgggatcgca tcggcgatgt cgggcgtgaa cgtcgcagat tcgatatctt agcgtaaagc aagacgttgg atgaacggtt gggccgccca aaatcgaggt cgaccaccgg aggccggccg aagttcatct agggcgacgg atctggcgat gcttcgagga gttcgtatca agaagcaact ctgggctcca cgacctcatc ggcaatggct ccctttttgc cgggccagcc tcgatcctcc ttcgcagggc cagtccggcc ggcatggcgc tgacccgcgc ggccgatgcg cgcaccggaa ccttgccatc caacggcgcg ccaatggcga cgctcttgct agctatgctg cgcggccgcg tgatacggcg ggacgcgagc cttcgcaccg ccagcacgaa ctggcggatc gatgaccatg gctggtcgtg aaatgcccgc tctgtctcgt tttcatcgcc tgaggatctg gctgaaggaa gaccatctcc gctgtccttc cgcctgggat ggtgctcgct cctgctcggc ctgcttcggc cagccgcttt cgatgtggtg ccggcggcag cggcagcagg cctgctgtcc ggcggctgaa ctggaaggat aggggctgcc cttctcggcc aatcgccttc cagggccggc cgctcaagcg cgaacagcga cgcttatgcc ccggttcatt cgaaggggcg gatgcagaag cgaggacgat ctcagcccgg cgacgccttc ggcgttgatg ggcgacgatc ctatcgctac cacggtgacg ggaacagcgt gtcgcgcatc tcgcgagatc ttccagtcgt catgtctgat ttcggagtcg gttttcgttt cttcaataga tgccgacgca tgtcagcccc gatcagcggt cggtccggaa gcgttgaagg ctgatgctgg acggatggcg gccgcaggcc atgcgttcca ggtgttgaac cttcccgtcc gagcagatgg ggccaagtcg ccatggtggc ttcggtgacg gccgacgagg tggatgacga atcgccgatg gcggcagcca cccggccatt attctcgttg gcggcgactg gtgccctcaa ctgaccaagg ggtcttcagg gaaatgggcg gccaccaaca ctctatgtca tccggcacgc catgctgcgc gacacgacca gcgtcgttcg atgccggatg atcatgacgg atcaaggcga gtcatcactg aacgaggaga accggcgagg cagatgatct taccgcttca atgcaggact aaggttcgtt cggctgaagg gaaggccgga acagagggtt gccgcggccc gccaaccagt gcaggcttgg caatatgccg cggatcgccg acgatgacgg aaggagatac ggcggcttca gagacgctgc ccgctgggcg cagtatcgct ggcggcgctt gaggaagaac ggcatcgacg gatcacttcc tccgggttag cctggcaagg ggaatggagg gctgctcaac gcttgttctt ccgggagatg ctctctagac aaaaccccga ccacgatcaa gaaatggtta tcgaagaaat tggtcgagaa gccttgttgc gccagatccg cgctgggcga atcagaaaga agatcgccaa atctggctca acggccgcta acaatctgcc gctcgaccta tcatggagca gccttgcgca ccgacgagac caacgtggga ccttcgagca tcgacagcga agcggctcga tcgatcagat tgtcgacgct aatcccgcta cgataacgaa ttgccgaacg ccgaactcga tgaacgtgcc acctgcggca ccaagccgac tcgagcagcg atgggcgcca acaacaagct cgatctatcg tctccgatct tccgcgacga acaagaagac tcctgatagg cgctccatca tcgtccgtca cgctcgatgc tgtcgggaga ttgccatggc aggccgatat tccgtcggca aaatcggcca ttctaggtaa tcacactgct atctcgttta ttcggcgtac caatctcacg ggcggctcga tccagttcgg tggctgcatc aaggatcgcg cgttcagatg acaaagggcg tcctgcgtgc agaaggagga cgccacctgc cgcagcaggg tcttcgagaa aaggacaaat ccggatgcgc ggccgtcggc tatcattgac cgaaatcctc cagcgttcgc actaggctgg caagctgcgc catgccgtcc agtctggaag tgcgctgacg ggcctacggc caccaccaat gaaacgcggc

74400

74460

74520

74580

74640

74700

74760

74820

74880

74940

75000

75060

75120

75180

75240

75300

75360

75420

75480

75540

75600

75660

75720

75780

75840

75900

75960

76020

76080

76140

76200

76260

76320

76380

76440

76500

76560

76620

76680

76740

76800

76860

76920

76980

77040

77100

77160

77220

77280

77340

77400

77460

77520

77580

77640

77700

77760

77820

77880

77940

78000

78060

78120

PL 219 153 B1 gcgatcgtcg tacggcaagc cagaccgtgc tcggtcactg acgcagaagg ggtcgcgcgc cagaatgtcc cgtcatgccg cggatcgccg agcggcatgg atgggctcaa gaggcatcgg ttcgcgtacg ctcgagtgga ggggaaagcc gtcgaaggcg gatcagaggg atcatttggg acctggtcct cgatccgtcg tggcggatga tggccaaact agagagcggt tccatctgtc ggtacgagga cctatgagcg aaatccatgg atcagcgtca gcatgacgga gatttctggt tcgcgcgcca atgggtcatg cgagacccag ggcgaccaca tcgggagatc caggctggcg gctgcatccg tgcgatgtca ggacccgtgg aaggccgctt ggtctgctca gacctgtgaa gcacgggccg cccaatcgct cgcctcacat gtcgtcgaca agtctgtccg tcctttgtcg cgcgacgcaa ggctatgaca cacgccctgc acctggaagc gccgaagctc ttcatgttcc tgggtgcgcg gcaacggctt cccctgactt ggaagtcatg tcggatcatt caacaccggt gaacgtggtg gacgttcaag cgtcgtcttc aggtcaacag cgtccaagtc attaccgcat gcggcgatga gccacgacat cgatcgagga gcatcgactc tcggactgtt cccgctcggt tcgcgcgctt aggacttcct tccagccgcg aacacttcgt tccgggcagg gtaccgatga aaactgagga ttgcagcatg ggtggagttt tgccatggtc gccactcgca agcagagttc gaaccgcatg cgtgtacgcc gacagagcgc agactgcgaa gtcgatggct gcgtgcgctc tgccgtcgac ggtcgtggcg ggcaagcgac cgctgaatat atcgacatcc cggcatctcg gtgaaggtcc gtcgaccgcc atgcaggagc gcgatatagg tcgtcatggt cggactgccc gcgcgccgcg ggtcaagacc gccacccgtc gaaccgcttc ccaacaccag gccccgacgc gcgatggcat aaggcctcgg gatccgcgca cggccaaggc gcgccgccca gcatggcagc ccttcgaccg agttggccgc gaggcaggcc cctatcgcgg tgccgtcctc cggacctccg gccaggaaaa gaggatctcg ggccggatca ctcctgtggt caatccctcg gccagccgct ctggggccag cgaccatacg gcccgaggcg caccgacgca gatcggcgat tgatatgctg cggcgcagat tgacgagcat gctgatcgac cgccggcgag cttgtgcttg cccgaaggtc gcatgcgtcg cgcggacacg tccatcggta tgcggatctg accgccgcct gccaccactg acatcacaga gatctgacgc cgggcccgtg caaacccgca gagggcgtcg aatgccaagg tgggcgatcg gagaagaccg gccgagggcg ttcatagtca aagatcggcg gaatatgcgg gatggcccct gcctattgag attgtctgac ggagccgcgc ttgccttcga aggtcatcgg aggacccgaa gggcttggcc ttcttgttcg gggcggccga tgctggcccg ccttgccggt gcaagccaag gtcgtcgcaa cacccaggcg ccgcagcctt cgagaaggcg tggcgccggg gtccaacgat gcgcaagcgg cgagggcgca gccggtcgaa tttcggataa ctcgcagggg cccgtcccgc cacgctgttg tgacggaccg cggataaaga aacagggcgt cccggcccgt cggagcaggt aactgggcgg tcaccaagtc ccggaactgc gcgctctacc gcgaagccga gtcgccacgc ttccgcactg atggcgctga ggcaccttgt ggcaagctcg gtcctctcgt gctattggcg tcgcgtcagg cgcgaaaccc gcccgcttcg ggtggcatcg gatcagccag cccgaccatg tccagtcgaa cggacggcct gcggctttgc gcgccgactt tcgccgagac tttcggccag tcgcccacat tccatccgct tagcgatctg tccgcaatac agagctgggc cgtcggcaat gaggccatat ggcgggggcg cctccttcat gccgctggcg tcgccagatt gcggcaccgg gcgctgggtc ggcgttcctg gcgaaaggac atgtctgtcg ctgcggtctg tccagcctct caaccctacc tcctggtcgt gaaggaacag tcccgcaaag tccaagatcg cacgagcggc atgcagatcc caattctact gcccgtgacg gagttcgcgg gtcgcggctt aatccgggcg cacattggcg cccgcctttt tcggcggtcc cggccgttcc cgacaggcgc tcgcatcgat gcgtccctgg gcgacacaac atcgcggggc ggccgtgcgc cgaagcggac cgaaaaaggg tcgatcgtga agggtgctgt cgaaagcccg atgccctgca tggtcctggc acggcggcaa ccttcgatca gccggcgggg ccgacgcttt cactggaagc gcgcggcact caccgcctgc gcgccacgcc aacacaatac atgtgcatga catgacacca gcccgtggcc ttttattgca catcgggcat cgctggtcac cacaccatgg gacatcaggg gctgcggaag ctttccggac ttggcccgac caaggatcgc cttgtccgat ccgcggtggc gttcggcttc tggctggaga aaagcaatcg gcggcgcgcg tccagtcccc gaactcgaca catcgcgacc ctggcgatgt cttgccttgg aaccggcggc ctgcgcgagg ctgctggctc ccgcatcgaa acatggccaa gtgcaaccct cgacaagctt tgatcgtcga acctccagcg cccgcgccgt aggatctcga ccgacatggg acgaacaggt catcactcga gggtcgcacc ctcatgtcaa tgcaggagcc ggtgcatggc ggtcttcaag atctacaccc atgaaaccat ggcctcccct ttcgcgtcgt aagggcgaga gggaatggca atcccaagtt cggcaaggtc tggcgacgga gcccgacgtc cgatgcgctc gttcgccggc gcgcttctcg ggacacgctt catgtcgaac cctgccaaac ctcttgcgcc cgtcgagcat cgacgagttg ccaggatgaa cgacgatgtg cgaagacgtc cccacccccg cgcatcggtg agcgcccgtg gacggccggg aaacgcgatc ggcggatcgc catgggggct gatatgccct ctgttcacca gcctgggaga cgggcgttcg cagcgccccg gaagaacgcc gtcatcgatc aaccgggggg gcgcccggcg ccgcaagaca gtctctacca tgatcgcctg gcgagcctgt cctacccggc gattgatatc cggtcgtttc gcaggctcgc agccagatcg gggcagaccg gccctctacc cgaaatggtc cggcacggca gaccgccgaa catcgtcggg cacagaggcg tggtccggtc tgtccaatcg catcggcgag ccgcaaagca ccgccctttc aaatgaaagc gggcacccat cgcaccatcg aaaaggagaa ggatcacaga ggagcgctgc attccggcat cgatgtggat ccggctcgac acgaggttga

78180

78240

78300

78360

78420

78480

78540

78600

78660

78720

78780

78840

78900

78960

79020

79080

79140

79200

79260

79320

79380

79440

79500

79560

79620

79680

79740

79800

79860

79920

79980

80040

80100

80160

80220

80280

80340

80400

80460

80520

80580

80640

80700

80760

80820

80880

80940

81000

81060

81120

81180

81240

81300

81360

81420

81480

81540

81600

81660

81720

81780

81840

81900

PL 219 153 B1 tcgggagatc gccccaaagc cgtcgatcgc ctactccccg cggatacgcg gggacgtgac tgcagaactc gcggccggat ggctatcttc gccggaagtg cggccgcgtg ttccccagat tgatgaacgg gatatcgcaa gattgaggca ggcgaatgcg ctgcgggctc aacggcaagc gggaccccag tcattccggc cgcgatgggc tcacctccac cccgcatcgc gcagcgtcga cggtcaagct aaggcgagga ggggctccgc cgagccaggt gcgagggtgc aacgctcttt tccgcgatcc aggagatggg cgcatgcgac gttggcaatc gcggtagacg caccgcgtcc cagcaactca tcaggtgtcg ggcctgcggc tcgcgcaatt acattttccg agatcgagat ccagcaatcg aggccttccg ttgcgaccgt ttgaccagtt ttcggctcac cagagagtat gtcgtctctg tgagagccca cggacctctg gcgatccgtc cgagctttcc tttgcctgac gctttagctg agagggtcgg gttcgatata atgcgtccaa gacagacgga aagccgagct ttgatcagta gatgaacgat tggcctcaat ccgttcctga tattatgcgc tttttccgca gtcatggact gctgtgctca ctatcgcgct ggcagttgct catgcatcct caggcggcgg gatgtgaagg attttcatca cgacggtttc cttggtctgc tgggcgcagt gtgcagcacc gcggaacgcc gataaggcat cgtaaatttc ctcggctcct cttatcaggt gcggcccgaa cgaaaacggc ccgggtcgaa gctgggcgcc cgacgatccg tggcctccag cgccggcgga cctgcttttt cgggccggaa gagcgcccgc ctgaccccgc acgatgacga gctgcggagc atcacggcag acacagccag ttgtcgagct tcgccatcag ataagtcctc cgatccctgc cctggccgcc caagggcaaa ctcctttgaa tgggccggtt atacgaggat atctgtcttc cgatcaggcg tgatctcggg ctccgtccac gactgatgac gcgcgcagcc gcagaccgct agagatggtt cgatcacgta gagatcaagg gcctctggtg ctcgatcgat gaggtgatag cgacagttgt gcaccgggcg gtggtcttcg tcccaggtaa gagatcaccg ttgatggacg aggcctattc cgccggccaa ataccggcgc atatccagat gccatgaggc atgcaaagga tcctctgcgc atctgcagtc ctcatgcgca ctgcggcctg tgttggtcct tgagcgtcgg tgacgcattg cagcaagcgg ggtctgaggg attgccatat gtctgaccgg ttaccccgga cctctcccac gcggtccgat catgagaaaa ttcaccggct accccctccg gcctggcaga agcttcccgg ctcatctggt gccttctcct tggtggcata tgacggcgtc acgaaatcgg catcccgccc tcgaacagca gcggcgagat agcaggacgg gcgtggtctc aggccatcga aattttcccc cgcttcgctg gatgtccgca acaggccgca ctcggcctga acagattgga tcagcaccag atcgccgaga gtcgcgtccg atcggtcgct agcatcgata gacgcaggcg cgagctcgca ggatactgcg atggtcgctt ttcatatcgc tgttgcgccg aacaattcaa ccgatgcgtc atggcataga ggctgggcga gaatcgatgg gtccgccttt ccgatcccgg ccgagaatat gtcgtgacat cggcattctt ggtgttcaac ggtcgttgat agtcatccgt gccgcccttt gacccactgg ccggaccgag cgatcttggc gtggctctcg gcgcgctgtg acgctcaggc tgagaccctg atttgggttt atcctccagg gccagtgttg ggcgtagcgc cccttcacgt agaccggctg gcccacctac taacaaatct catcaccggt ggaatacgac ccatccgcac acaagggccc aaacctcaga ctcctatcta cccgcccgaa ctgccgagaa ccgagacggg aaggacgagc ctcccccact cgccctgcga catcgaagaa ccagaccgag aagcgttgat tgtgtaaggt catcagggat gccgcttcgc cggccgtacc atcgacaagg agctttcttc agctcgcgat gcaggcgccg ggctgtctac ctcctgccgt ggccatgcgc cgatttccaa tcggcaattc aagcgatcac gcctcggcga atcgcgacga ctctacaatt tcttcggtgc agttgattgt ccgcgtcttt cccaacgccg agcgtgccat tcatggtgag tcggggaatg ggcgtacggc taacgatcct cggcgccaca ccaccaaagc cgatggcctc gtcgagcagg ccgatcgcgc cacgggggca gagtcgtttc acggcggcgg cgggcacggg atcgcaccgg gtgctggcca aatttcctgc gcggtcgtta cgcaatgtca acgggatggt cagcgatttg acaggcacgg aggatgccat cagagtttcc cgcctcaatc cccactcgac gcgacttgcc cctttgacag aatggcaacc gctcgccctc gcagttccgc acagggccgc cgcaacgctc ccgggactga ctcaaagcag ggatatgctg ggttccccca cgccgccgct tgtcgtcttt ctgcgcgccg ctggacctgg gccgagccgc gtcgaaaggc gttgcagtcc gtctcctcgc gatgcaatcc agaaaccacc ccttggcaag caagatcccg ataacggcgt ggcccgtcca cacggatgag gaagcttgaa gcgccagctc ggatttttgc caccataaca ctggagtgag tgatccttct ccatggctct agctggcgca acggtatccc ctcttgctcg cataagacag attcttctca aggatcgcgc attcagtttt tctattcgct cccgcgatag atagtcggct gctatcgctt ttctaccgtg tcgacggtct ggctcgagag accaagccta gcgatgcagg agaatcgggt aagaactcat agctcgaacc acgacaggcg attccttgca ccaccggtgg gcatccagcc ttgcgctcaa cgagcgcaac cttgtccccc tcgtgcccat ggcaacccat gttttcccgc aagtcgagcg gccctccatt ctatcgaggt atcggcacat aacgtcaagg gtctacgctg gactacctct gccgaagttg ttgacatcac taccctgcat ctcagatcgg atttcgcgcg ggcggtcgca cacaaactca agctcaagaa ctcaagcgga ccttctgagg cgagacattg ggtcgtcggg gcgccaaaat tccttgtccc atgcaacgcc gtgatcggtc ttcttcgtcg tgtgcaacgg ggttctggcc gacgcggagc ggacccctga cgttgcgcat gccctcaatc tttccggtat cccaaatatg cacggggtaa caatttcaat aacgccactg cggtggcgtt aagtgatgaa gcctctccga gcatccgtgc aatcgggcct gtgaagtatg ggagcgaacg ccgactgcca tgctcgtctg tcgcgaacga acctgtgcct

81960

82020

82080

82140

82200

82260

82320

82380

82440

82500

82560

82620

82680

82740

82800

82860

82920

82980

83040

83100

83160

83220

83280

83340

83400

83460

83520

83580

83640

83700

83760

83820

83880

83940

84000

84060

84120

84180

84240

84300

84360

84420

84480

84540

84600

84660

84720

84780

84840

84900

84960

85020

85080

85140

85200

85260

85320

85380

85440

85500

85560

85620

85680

PL 219 153 B1 cgcaggcttc atttccaatg gctcgccgga atctgctcat agttgctttg atctcgactg atcgctgaga ccataggttt tttcggccgg tcgagaagga aatgagccga gcgacgaaca acgagaccgg acaccggaaa tcggactcgg gagaggttca cagacatcgg cggacgccgc tcttccttcg tctttcgggt ggcgccacct ggaattgtca gatccgaacg ggctgatcgg ccgatcacga tccgcctcgc gcggcgttgc gcacctgtca ccggcaaatt gatccggcag agaaagatca agggtcaatt aacatcagtg gctgtcattg ggccttgatc gcgcagtcct tcttgcctct ccgcgccagc cttttccgtt cctgaaggtc cgatgcgttc cttcgcggat aatgatggga ccaaagcgtc aattatacgt tcaacctgtt cagtcagcat actgcgccag gtcttctgca tcgccgatcg agaaacgggt cctccgagca gtatggttgc cgacattgcg cagacggcca gcgccgagga cgcttgccgg tgacacccac aaaaccggct ggcgcgcgga cccgggagag acgacgcggc gcctcgattg ccaatatctc gtccacggtt accacatcgc cggcacgcat atcgggttcg tcgttgttcc aactgatcca cgcgcatctg catcgcgtgc agagagcgcg tgatcacccg cgtcggtcgt catagttcgg atgtctccgg agttgtcgta tgcggacggt cgatgatcgc taacgcggcc tcccgccatg cgagcacgat cattggatgg ccgacgtagt aaccatcgaa cccgaaacga tgccgccgcc catgcagcgc cgatcaccgc ttgttgccgg gcgaaagtcg cgacgcccca gcccgatcgc tggcctctgc cgatggcgat ccgaatgcct ctcgtcttcg gccttgacga gctgtggtca actgagcgac cgatccggct ggcgtcgtcg ggcgtcacgc tttcgacgtt tgagggtccc agcatttggc cgctgacgcg gatttcgttt cgtcgcccgt gatggactac cgaggagttc ctcggtctcg cgatgcccaa gaacatcgcg agactgggtc gcctctgagc gcccatgcgc cttcaatgcc gctggatatc aattcatatc ggcgacagct gaatgtccgg aagcgttttc cctcttccag cgagcggatc atcgcccggt tccatggaag gcgaccgcat tcgcaggact tgacgaaccc acaacgccgg gctcgcgctt gccgatcgac cgtctcaagg tcccggcatc cgccagacct tcccgacgcg atagctcagc cgtcatgttc gatttcctga ccgcagcgtc cgtcagcagc gctctcgctc ctgaccgatc gacatcacgg atcaagtacg cttgaaaccg gcagagcagc gagtgccgcc gtctgcgaac gcgtttaccg gacgcgcagc gtcgacgtag cattccttcc ccctgcggtc agcacttgcg cgtttttccg catcaccagc ccgcgccgat cttcgatcaa tcaggccgcc gccgctgcat gttgccgacg ttggttccgc acttcgatct gtttccgctt ggcttcttca cgattttttc gaatgatccc acgttctgct gcaagaagga ggctctggcc gagcgggaag gtcatccctg ggtgcctcgg ctcgccaagg ctgatgcaag tatcacgatg gaggacgggt aatgacgccg tttcgtgacg cgcatcgatg ggcgtcggcg gggtcacgta cgcatccagc gacaaccagg agtctgatgg aactttacct ctctggattt cggttatcgc cgaagcggcg tcgtgcggct ctcgcctgaa gagatatagt tcgaaccact tgatagatca atcctcatga gccccgtcac ccgtgggttt atgtcatcgg caatgtgttt acgaacgctg agccgcgccc tgattcttct tgcaagccgg atgatccagg cagtcgaggg ccggccttaa atcagcgtgc ccggagcccg ggtgacttgc gtgctgtcgc agtttctctg cggatgcgtt gcgaacatgc gacaggatcg cgaacgacgg ttgatgttga atatagggca aaactggcga ggcggaacaa tgcgatcaga cagaccgagc caattcgatc ccgctcaagc atgttccggt gaaaccgctt ctccaagtcc gcttcagctg tcggaatgca ccggcaggac gccgctcgac tttgccccct gcgctccacc gcagcgcagt cacgcacgat ctgatgcgcc aggcgttctg acatcaccat acttcgttgc cacctggcaa tcggtgccaa gcaaaatcat gatggttcgc gccgatcctt cgacagccat agcttgagcg gcaatcccgg acgtggcgaa cgcggatcat ctggtgtcag gggttctccc caacgcagga catttccccc ggatcaatgg agctgcggct ccgcggtctc tgctggtggc tgagaagcgt aacccaggcg gattatagat ccagcgtttt tcgaaaaggt ctttgatcgc caacgttctc gcagctttgg tttccgtatg acgcccgaaa aggcgaccgc cattaaaccc tccgatgcgc cgccccattt cgaacacgat ccccggtgcc gatcgacacg cttccggcag tcggctcgga cagagaacag acctggccgc caatggcgat ccgatccctg gcgacagtcc gccactgttc cggcgagcag cgggatcgct aacagcgcgc ttctcgcggg ctcgccagcc cgctccagcg cgccacgtcc ggccttcagc ttcttgcagg atctccagtc aggtacaaat aagagcggat ggtggggtca cgtggccgtc gctgtctgcg cgactacaca agactggctc gaacaaggtc cgcgctgccg cgagcatctt cccgcatgtc gaaggtcact ctatgaactc tgtccagaac cgaaaagcag cgagcgaaaa gatcgaattg tattgtgctc aatcctccat gcagcatctg gacgccagcg tcagaccttg cttcatgtcg ggtgaacaca tcggctggca gacctggtcg cggatcgttg gtcgcgtccg gatcccgtac agcgacctcg ggcgttcagg gagatccagt cgaaccggac attggcatag ctttacgaaa ctccggttcc accggacagg gaaatcgtcc agcgatatcc gatatcggga cttgaccatc cagcgccgtt gccatgcgac ccatgtctca ataccgctcg tttcatccat acgcgagaat agctgcggca aggcgcctgt gacggcgccc ggcactgagg gattcggccg gatccccggc gatcctattc ccgcctcatc gtttttcata catccttctt tggcccgcag gcactctttt tcgaacgctg gcaatgcggc cgggcaagtt atgtccgtgg ttgtacctcg ccaagggcgc cctcttgcga ccgcatttct gcctaccggc ggcaagcagg cgcaccatga gaggcgttcg atcgagctct acgacgaagg cacctgatga gttcgtggat tgggcgggtg cggcacctgg ggtatcgagc tcagaaatgg caggaggagc gatctgatca cgctatgtcg gacgtgctgc cggtacacga

85740

85800

85860

85920

85980

86040

86100

86160

86220

86280

86340

86400

86460

86520

86580

86640

86700

86760

86820

86880

86940

87000

87060

87120

87180

87240

87300

87360

87420

87480

87540

87600

87660

87720

87780

87840

87900

87960

88020

88080

88140

88200

88260

88320

88380

88440

88500

88560

88620

88680

88740

88800

88860

88920

88980

89040

89100

89160

89220

89280

89340

89400

89460

PL 219 153 B1 cgcgcgagat gatcatcaca tctcggatga tgatcggccg aagcggccgg aaaaggaagc gtcgcgatca cgaagcagat tcggtgatcc atcgcatcgg acgcgtcact acggtcggat ggaaccgcga tgcggatgct gtcacgcctt tcctcaagaa ccaccccggg tagagcagcg agggggcgac cctatgtggc tcgccaaggc tcgactacga tgcatctggt agaaacagaa tcaagggccc caggcatcac atccgggttt agccggagac cgcagacaac agaccggcat cgcctgcctt agcatgaagc cgccatcggc ctgccggtct ccaaggccgt caaacggcga tgaagtcggc cgctggcatt aatgatattg tacgttatcg tctgcgcgtc gcgcgcggcc cgaggcgagg gatcaagaca tgatggcgta acggcacgat cggctcatgg gcaagaggtg ccgtggtcgc tcttcccgct gctatttcct atctctgggt cggcgctttg ctctcaccgg gcatactgtt gtctcgtaac ccgccgcatc tgggcgcgag ttcggcaggc tctggacgcc tagtcgccgg atgcgcatgg gtccatggga gatccgcctt tggcgtccgt gcagaaaacg cgccggcgcc ctatcgtgtc gggtattctt gctcgacgac ggcactgctt cgaacagctg ctacgccgaa cgatctcgcc gatgggatcg gtacgatccg caataccctg caaaaccgaa tgaaagctcg gcgtatcgtt gttctacaac cgtcgacagg gatgacccgt gggcggcctg gaagggcgcc caatgtcgcg gctctttgat gaatacccaa gacgttcccg gaagaagcaa cgcgttcaag gcttgcgaag cttcgccgga ggcgcgaaac gcaagagcgg caggcagacg cgaatatgcg gtccgagcgt gacctttcac ctggaacagc gaagcaggct gcgatgcctg gtggctgccg aacatgacgc cggtccggcg cagcgcggat gtcatcgcgt ccgatcgcca caaagcgaaa gattcccggt ttgacctatg cggggcggtt tctgtgggcg ggcggcgtca cagcctcagt gacgatgcgg tctgccgcca tccagaatgg ccggatcggg ggggacaaat tctcggccgc tgccggaaca aacgcttgaa cgcggcggtc ggggcgtgtc gcgatggaca gaggccgaga cagaagatca gccatcgagc ggcaagacca gttggcgccg tcccgcacat aagacagtca gtcgaagagg cagccgatcg ctcgaaacca cgcggcaaca accttgaagt gcccattcct gcgcgcgcca gatggtgtcc cttggcgtca gccgaaattg aatgtcgatc gtcaaggttc catcgagagg gccgagcttt ttctatcgcg cgcaccctcg ctcaccgccc gtgacctcga aaatcgatcg tggcaggagg gcggtcaatg atcgcagctg gcgaatgaga ctcgagcgct gcaatccgcc cttgagcgga ctggccgaca ttcggagaac aaaataacgg atgcgcactg gaaacagcgc aaagcactgc gcctgctgat cgagtgagcc atacagtttt atctccgccc tggcgggaca gatcccgcat tggtgcggcc atttcgggcc cgccgtgagg ggctggagcg cgatcaccaa cggggtttgc ttctgggtcg tcgggctcgg ctcggcatca ggatggtggg ccggctatcg cagattcttc gatcaatccc cgagagaccg cgtttctggc gtcgatgcgg ctctatcgcg ggagagactg tggcaaaccg tcgaggcggt acgttgcagg cgatgatgaa ccctggcggg tatcctcctg tggtcctcga caacggtgcg aggcaggtgc tctatcgcca tcgccaaggc cacaagctgt cgctgatcct agctggtcga gccatttcgc agaacggcat gtgaaggcga atggatatgc tggcctcgct atatcggcgt tatcgcgtac cggcccttcg ttcgcgaccg gcttggcgac aacccgacat accatgccgt tcacgacacg tcgatgccat agccggaaag aggcggcgcg atgtgacggc tcaaggtctc tccgcgatgc gaaacgtgaa gcagcctgct ccgggatgac tgcagcaact ggcaaaccca gatgtctcgt cgtcttcttt gctcggcctc cgtctgcccg gggactttgc gcgcgtggac catggagaag cggagaggta ggtacctgtt tcaggatgac gccaggcgtt cgcggatcgc catccggcgt cggcggcatc caaaatcagc caggctgggc ggcttgtcgc ccattgccct cggaggggtg ttcgacttca tcgtcgtgct ggaatgagct ttggctacga agcgcatgcc gcggcgcccg gtcgatctgg gttcgagcgc tcaagagcgg ggcggcgcgc aaaggcggcc ggaactccgc cgaagccggc aggggcaaag cgccttcagg gcgcgagcaa tgtcgagtcc cgaaaacctt cgcacacctt gcgcggcctt tgctggagat gctggccaag acatcgcaaa gaccacgatc ctccctcgat ctattatggc gaactcaaag cttcgccgac cctcgactgg gatccgcgca ggaggcaaag tgaggatcgc ctttatccaa gctgaaagat gtttggagcg cgacacggcg gcgcgtcgag catcgacatc gatcgatcgc agctgagctt gccgatctcg cccttcgcag cgccgcgcac gactaagggg caacgaagct gcggcgggtc tggcgcatta cctgacaatg cccggtgggt gtcaccgatc gacggacagg tatttgcatt tcaggtgtgc tgccgttctc cctgctccct agcggccctc cgcagagttc gtctttcgtt acgctatctg gcatccgctg gttgacagcc gtcaggtcta gcgtggtgtc acgtgacctg tcccgagagc gcaaggaacg caacgtcatg tgtgccggtt cgccaacctc ctgtcgcagc cataagcgcc attgcagccg gaggcctggg gaaggattgg tgggcccaag atggtctctt ctcattctca gccatcactg tggatgcgcg tacagcgcaa atttccgatt cgccgcgacg gtcgatgacg cggatcgtct gtggtggaag gctatcagcg cataagagtc cgtcacctga gcgcgatcct gaaacgacgc gcgcgcggcc accgttcgcc cagctcggtc ccaatggtat ctagtcgccg gtcttcgccg ccggcaagag ctcaagggca cttgtcaacg gcggagcgca cctgccctct aacgatcttt gaaggctttg gcaaaagatg aaaagcgaag gagcgcacca ctttctctga ccgcattgat ggattggtgg ttccgctgac ccgccatgcg tcgcaccgtt gcatcgccat ggcgatctct ccaacttcat tcggtctggc gtcccgcttg gcggcaacac gtcgcggccg tttgctgagg gctgtccatg ctcatcttgg acggcggccg ggcctgatcg tggctttggt gaccttgaaa gtgacggctg acactgggct cacgtgactg gtggccatcg tcgatgtggc ttggccaatc

89520

89580

89640

89700

89760

89820

89880

89940

90000

90060

90120

90180

90240

90300

90360

90420

90480

90540

90600

90660

90720

90780

90840

90900

90960

91020

91080

91140

91200

91260

91320

91380

91440

91500

91560

91620

91680

91740

91800

91860

91920

91980

92040

92100

92160

92220

92280

92340

92400

92460

92520

92580

92640

92700

92760

92820

92880

92940

93000

93060

93120

93180

93240

PL 219 153 B1 ccgtcgtcga tgtggcccat gctggtggac ccgctctgtt catggatgct gcagttcgta gcggctcatc gtatgtcgga gaaggacgcg gacgaggatg cagtgaggtg cgaaggtgaa agtttcttcg gccctcagac tgggcagaag gacaattgcg cgtcgtgcgg gccgttgagc gaccgcccac catcttgatc ctctgcgaaa atcgcgctga gagcaccccg cttaccgaag ggccgcgacc tgccattcag tccccgctcc gaagcggtaa cggcttgcca cagccccaat cagcttggcg tatgcgtccc gttctcctct ctcaccttcg tgcgatcgct ggcttttgat ggcggcgcct tgcaccgtca agagctatat gatcttctgt ggttgatgca gaaacctttt tcgccgaaaa ggtctgcgcc tgcaacatgg agatttctgc ttccgcgagt ccttgatggt cgcgtcgcga gggagattat gatcagtcca tatgccttcg tggcagaaaa cagcttataa gagcagaaaa ccggtcgcca cttgccagtg acgcgtcttg aagcaggtga ctggagcagg aatctggcca gatctggcgt gacatttgcg ggtcgcgggc tctccagtcg gacgggtggc cggcgttccc gcctttatcg gccgctgtcg cttgtaccaa caggccgtcg tccgcgctga ttttcaaaga cttccgcaga agcgtgtttc gatgccgcag gaaaaggagg tagtgctgta acattgaggt accgccttca cgagacgggt ttccgtgcga ggcccgtcgt ttgcggtcgt tcgcgcagga aaccggttag cctagcggat gtatgaaggt cggaaatctc aatgcctggc accgcccaag tcggcatcga accagtccgg aattcgtcgg cgcgcccgtg acgacaggca gaatcgacat tgaccatatt gcattgtccg gtggtcagga cgtatgctgg atggcaaggt gtcctgattg ggtcgtcgag cccegatcgc ccccgagagc cgacacgggc gttcgctcta tcaggggcca aagcaaaatc caacttacgc tccttctgac ggatgtcaaa tggtcaaggg tcaacattcg tctatgacac ggcgcgcttt acttcttttc ccgccaacgg atatggagat agcacatgcg actacattcg caaagtatgc atcatgcgca atcaggcctt cgtgcatcct cgaaagatcg atgctacacc aacatcgtcg cttgtgattt cggaatgcgc gtcctggcga aaccgaagac tgcgtgtggg aaccagatct tcatgcgcat tcttcgaaga aggcggagga acaaacctgc ttggaaccgc tccgacttcg cgttcagtac gttttccaat agatgatgcc gggattgctt ctcgaagatc acaattcgga cggcttcgag cgaattttcg cggggtatgt gaaggctcgc gaccaatgct gacctgtcag ctccgcccag tctgccaatc tctggcgctt cattcagcat cggccaccaa ccgttgtcat cgacacggaa cctggaggag ggatcttgat aaaaagccat ttttggactt tggttaagtt cggctacgtg gatttctttc tgtcatctgt ctgagcttca cgcaatttta aatgggtcct tgaagctgag cgtggtttgc gattgaatat tgcgacgcat ctgggtcgag cgctctggcg tccggggcag gctggactac cgcctggtct gaaagccgct tgcgatgtcc cgatgcgatt ggtcacgccc ctggctgtcg tggcgtccgc ggtggtggct gggcgtatag gatggttgcc cgcctcttat gacccgacgc ccatccagcg ccttcaatac cgatctctcc tcccctggct cccagacgag cctgacacag ggttgaccca cgtttcaaag tgccgtttac tccaggtggt tgatgccacc gggaattcgg acgacaggta atcagccaga agctcgatcg gtccacctgg tgagcccttc gaccatcatc ttcagctatc aaagcacacc ccggcgtgga gcccagatag attcgcaaag ctcgacaacc tccgtccagc tcgctcgtgg cgggaagcga tgaattcacc gtcagtgccg cgcctgctcc ttccaccgcc gctgaccggg cgccttgacg cttgaaggcg ggattcagcg cagagatgcc cgtcaagttg gacgactgcg ggggatgatg tcgacggtca cgttcgaggg cgggcaagct tccatgtaaa atcgcttggc aattccgaga gccttattct tccgccactg aaactgctgg aatcttgctg acctatgcgg cggttcatcg ggcgaagccg gattttaaca atgctgacct atggctgcct tccatcgagg cttggcaaaa tctgcgattg ttggctatac cccagaatgt tcgagatagg ctgctacgag gatcgttttg cgctagcgcc ctgaactttg ctgaaacccg gtcacggtca gcaatggagg ttcccggcgg tgcgaaaatc tggtatggca gcctggaaca acaatcgtcg gcctcccaga gtcgatttgt aaatatcagg cccggcgcgc aacactgcaa ctgtcgtgtt gcgacatccg agcggattga ggcaggtcgc ttcactgtat tcgctgaaac atgcgaccga ccgggaggcg tcgagcgctt tctccgtggg agcgttgcaa aagccgcgtt gttacccgtg ctgaggacct aattccggat tcaacgggag tggccagcag cgattgggat gctctcccct cccggttttt atctctcacc gtaaagagcg gagtgatcga tatcaagcag tgcgatgtct cagcgcgtat gctcggtgtc gcatttctca caattgtgag aaacgattta ttgccagatc cggaacaggt atatcaccgt atcggttcga tctccaacta atccggtcat acaagagctc ttcgctcggg ttgcatcggc cagcggtcgc aaaagatcgt cggtcgaggt acgatgtcag gacgcggcct gcagcagggt caatattggc cagctcgtac atcggcaatg aaagcctggt gagccttcgt ccatcgtcga aatccggagg tcatacgcca gtgtcggcgt ttcgcatggg acccaacgag ccggccagtt atcggaagga gcgaagggga cccggatcgg gatcaggttc ggatcagctt ggttggtgtg cattgaaggc tcggcacacc tgacctcgat cgaggacccc cgcccaaata ggctcggcgt accgaagtcc gcagaacacg gctcggcccg gctggaccag gcgctgcaaa tcgcgccatc tcgtgccaag cagcagcctt ccagtgcatc tgacaaccat aacggctttt tgccggtcag tcgccagcgg cgcgcccgct ctccgttcgg tagcgctcct cgacaatcat cggtagggca cacaggcagg gatatcgtcc gtgggtaagc aaacaatgac ctgacacgtt gaaaaccatt actgttcgca gcgatccaca gatcggaaat ttttgtgggc cgatatcgac gcggcaggcc gctgtcaaaa cgtttccatc gaagccttcg ccagcttcat cttgacgccg gatcgctgaa aacgcgctac gatttaggct cgtcagggct atcgccaaga

93300

93360

93420

93480

93540

93600

93660

93720

93780

93840

93900

93960

94020

94080

94140

94200

94260

94320

94380

94440

94500

94560

94620

94680

94740

94800

94860

94920

94980

95040

95100

95160

95220

95280

95340

95400

95460

95520

95580

95640

95700

95760

95820

95880

95940

96000

96060

96120

96180

96240

96300

96360

96420

96480

96540

96600

96660

96720

96780

96840

96900

96960

97020

PL 219 153 B1 agctccttac aacagtttgc agcccatgca tcggcgtcca acccctggcg aggaacctgg cggcgggcac caccagcgct gtcggctcgc aatgaaacgg cctcgccgtg agttctgcat ggtcgcagtg aacgccttgc gcgtcgattt tcgtacgcac ccatcgatcc tcgacgtcac gttttggttt attcgaacgc gcgatctcgc cgatcccggc attacaagga agtcggcgag agctacgcgt gggtctgacc tcaacagctg aggctctcat gggccgtcac acctgatgtg ccaccggccc ttgcacccgg atttcccgag gcggattgtc tctatcgtcg ctccggtttg cgcttggtgt agcccgtgcg cctcaaccgc tagcccggcc gcgacgcggc gtggcgaggg agcgccgccg tagccctgcg atgacatccg cgtccgagta atgtgctggc atggtggccg tggttcggca tgtccgttcg tcagaggcgc tttcccagct aggctggcca agtcgggcca tgctttatct ggctggaata atctgatcag ccgaaccgca ataccgatgc gcgctgctcg ttcattaatg ccaagctcaa gagtatgcca cggctttaac gatgttcacg ggagccctat tgttcaactc atcggggagt acatacgtcc caaaccggtg tatagcgacc ggccagcgat gtgatcgtcc aagttgcgtt cgccgccgaa ctggaagcgg aaagacgggc cataacctac gacctacccg tgtcgcgcgg gcccgagatg ttccatcccg ctccgccgaa gtatctcgtc tttaagtccg tatcgcgctt gacaaaactc gatcacgata atatgcggga gagataaacc ggatcaggca aatcgacggt gtgcaatgat gacgcttctc tatctatgag cctggaaacg gcacggtatc ggcggggctc ctgcggtatc cgcggctccc catatctgcc cataatttcc ggatctggat cgaaggtctc tggaactcgc aaccgaaggt agtctgttcc tccagacgac gtttggtacc tcacctgcgc ggatgacgga ggtagccgag gatcggcatt cgttattggt ccgagatttt tccgctgtcg accattcttc gctcttcttc cgggctgctc cgaaggtcga gtccccggga caaagaacac gattgccgag aaagcgggct gcgtctcgct gttcgatcgg gtcagccggc gatcgcatcg cagcggcttc ccaaaacagg ttgtaaccga acggctcccc tgcttcgggt taaccacatc tgaagaagga aatagtcaaa tgaaccacga atcggttggc atattgacac tcggtgacgg caccttgctt gatgcgtggg gagggctttt ctgatgtttc atatcggata gactgggagg caccagatgg cgggaacgtg attctcggcc ggttgcgcca tgagccgacc atatctggct ttgttcattc tttcgcctgc gattgcgagc cgcgcggatc tacgacgtct ggaacgagaa ggcaaggctt gagacgctgg gccgttgaag ttcgaagttt ctttatgcag tgatccagga gggaaagaca ggtgggctga cgcaaagttc cggaaccgcc gcggaaatag agccatgccg cagaacgcgg ctgcggaatg tgtgatccgg gccgcgcttc atccttgatg ctggcccatc ggtcggctgc gaccttcagc ctgctgttca ttccgactcc aatcggcttg ttcgcgatcc ggccgggacg tgagatgccg cggcaggcga ctggagcgac cgccggcgtg ggaaagcctc tttggcggtg agttcattga atcgtgagac agatcgactg aatgcgcggt gcacactcag gaccataggt tacaaagccc cgcgccaccg gactggaggc cgaagttaac aagcaatcag tgatcattcg gatctctcgc aagcgctcca cgacggtgat tatccaccta tgcgccagct tggaagacgc aagccggccg atctggtcag cagtgttcga agtgcctcta tttcgcatca cgatctcggc gcccgccagt cctccgccaa tggttcaagc gaaaacgcgt gcgacgaata gcctttatgg tccgcaacac tgtgcctcga tcggcatgct tgtcgaacta aggttggccg cagaggaagt gatatcggcc gttgtcccaa atgtcctggt acattcagat ctgcgtgccg atatcgatgc tgattattga ccgatctgca ctttggccaa agaagaaaat cccggcaaat aattcatagc tcggcgttga aaacccgatt cggtctgttg ggcgagtcaa cgcaggactt atttgcggtc gcctccacct ccgatgatgc ttcgagcctg tagacaagga ttgagccgtt tggaccatat gcgccacctg actagtacct tctttccccg acagattttc gctcgacaag cctcgccatt tcgcccccgc cccatggacc cgaggaattc ggaggcagcg cagatttgtt gttgtcgctt ctcggcattg gctacagcac atctctgcgg cgatttttcc tttcatacag cggtgatttt tctgttgaag gccattcgat aatacgccat tcgcgccatc tgctcatcgg gctacatgga ctggagcgcg cacgacccgc ggcggccact ctttgacaat gcggcatctt gcatcaatac ctttcacgac cgatgctctg aaccctgcgg gtttgcgggt tgaggaaaca gttgctggct cgagccgcac cgcagacggc tcgcacgcgc gcgcaaaaat ggcggttgcg cgacgagaac tcttggaaat cgtcagaggc cggtaccaat ccttgtcaga gtgtagagcc acgagacctt gcccggtggc cggagatgat gtgactgttg agaaatcttc tcatggccgc tcctggtgtt acgcagtcgc gttcgcgctg ggcgctcttc gtgtctgggt cgtctttcac cttcatccgg caccggcgac tcatgccctt ctgtctctcc atgacacaga gtccgtcgat agcgtgcctt tgcccgctcc 97080 cggtgacgga 97140 caatcggtcg 97200 atagttcctg 97260 tttagttccg 97320 ggcgccctaa 97380 cgtactgcct 97440 ggcgtccgag 97500 tggtgtccaa 97560 cgatgcctct 97620 gatcccttga 97680 cggattgtca 97740 gacgttaagg 97800 tcggtctatc 97860 gatgctccgt 97920 ggctatgtca 97980 tggcgagaac 98040 gggatcggcc 98100 ctctctttga 98160 agtgaatggg 98220 gcgagcgatc 98280 ctcggcaagg 98340 agctacatca 98400 cttgccctga 98460 acccgcatat 98520 ccagccaaga 98580 acccgttatc 98640 cagctcggat 98700 cggccggctt 98760 ctgatgccaa 98820 gcaaacctga 98880 ctttccgtgg 98940 ttgtgcgaat 99000 ctagcgcgcg 99060 tatggtcgct 99120 atgcagcagg 99180 gcagccagcg 99240 gcaacatgtg 99300 gttgaacttg 99360 cgtctgctcc 99420 tgtatcctgt 99480 cagtgcaaca 99540 gaacccgcca 99600 attcgggaag 99660 gctgtcatag 99720 gctgtcgtag 99780 gccggtaatc 99840 gggtacaacc 99900 cttcgaagtc 99960 ggcgtagaga 100020 gctggagata 100080 acgggcctga 100140 ttcgcggcga 100200 tcgtgcctgc 100260 tgctggcgtg 100320 cccgcgcttc 100380 aattctgtcg 100440 gacgactgcg 100500 ttcctgcgcg 100560 ttagtttcgc 100620 ataggcccgc 100680 gtcgatcaac 100740 gtcatccgtt 100800

PL 219 153 B1 atgacagtga tcgctgtgaa atgtcgccgg gtgagcgcgt aggcaaaggc acgccggaaa atgcgataat tgaccggata ttcggcttcc acgccgccgt gcggcctctt agctggatat tcagacggtt tcgaccttcc agctcgatgt aggaagatga ttggagagcg gtcgccgtga gtattcattg aggccgatgg gctatgccgc gtccagtcga acggtcgcat tgggtcgagg acgacggcat atgaccctgg agcttgtcga tagccaaaac gctgccctta ttctctgggg tgccgctccg ttagccaggc gctgcggatc gcgccggcgg gcagcgccag cgaatagtct ggcacgtaca tgaaattgat cgggagatca cggacagcaa agaaggccaa gcgatcaccg agtccgaact tctgcaggtg ttggcgaatg ctgacgagct gcaattccaa gtggtCtCCC ccttcctgcg acccgcaatt gccagaagtc ctgtttctcg tgcgatcaag gacggtgctg tgctcgcttt ttttgcgttt tggccatcgg aactgctcag tcagaccaac tcggcatagg atgctctgtc cagatgtgat ttttggatct aaccccaccc gcctgatcgg cgatcgcgct ctgttccggt gcatcgatca cgaggacagc tgacgatccg gtgcgcgcgg agggcgcgct cggaattggt ccggatactc gataggtgcg tgacgatcag agcgcaccgt cgcagacctg cttttccgtc tggttccctt ccaaaagcgc aagtcccctg gattgagccg gaaatcggcg tctgataggt tcacggcctt gatcgcttgt caggcgtgat catcggcata cctcgacgat tgattaccgc cgtaagaacc cgcgttgcgc gcggctgacc caaggatgga ctgcggcttg tcgaagaccc ccgcaagaaa ccatgccgcc tggcgatgat cgccgatatt taacgagcgc agtccttggt gatacatctc tcacgaccat gcactttcgc aggccgtacc tcggtccttg cggcgaacca tctcgatggt accctttggc caaaagccgg cgctgttgga gggtaggtct gacatcagga atcagcttcg cgccgttgaa gcagccacgt gcgcaacctg ccgattccga ccgtcaggct tggcatagtt attgaaagcg cctgatcgac cgggcagctg gctcggccaa ttttaacgcg cgtggcggtt tgcggcgggg ctggcaacca gcctccccgt cttgtcgata gttttgcccg aaactgaatg gccactcaga catcgtctga gaagccgacg tcttgaggtc gtgaattgcc gtccccgaca taaaggtgag agcgcccgtt agcctcattc aagtgcggtc cccttacagt gatcgtcgcc tgtcgcaatt ctggttagac ttcgaatggc cctaagaagc agagcggaaa ttcgatctgc gtacggcacg catgccgagg gtatcgttcc tgccatattg gggcgaggct gccggcatag tgctcctgaa cgccgcccgt agcggcgcct agtgacggac gaacaccacg tggttcgttg catcagtttc gaacgacgag gaccatgacg tgcaaatgcg tgacatcttc tcctccggca cgtcagcacg gctgtccagt ggcgagaatc cgcggttgta gtgagcaatc gatcgtcatt tcgacgaacc accatagccc ttctcaccat gaattccttc ccccatcatc ctgcgctgca catgtttcgg tgcggccttg tgaggacagg ctgcttcagc gatatcccgc cgccgtgttt ctgactgatc gcttcgagcg gaccctgcct cctgttacag gagagaagaa cggatggtga ttgtagtcga ccagagacca taggtcttct gaataggcga atacgagcat cgggccatgt gtcaccacca tgcccccctg agcacgtcgc cagacgacag gtcaccagtc gtcgtcaggc atgcagcaaa tgcgcggtcc tcgtcctggg tccttgccct agcgcgacga gagttgccgc gcataggtcc ctggtgataa tggggaaatc agtttgacct ctcaagatgc gaccattcct ttttccctgc cccttgccac gccccgggcg ccaaagctag gccgattgtg gcagcgaagg gctccctgaa acggcgatgc gcgagcccga atgccgaccg ccgccaagcc gagacaaaga gccgatatcg gttgctaccg ccgatctgaa aaggcaaaga gatgcggcct cagaagagag atctgggtct acgacaggaa ggttcaccat gaaaaatgtt ggcgctgccg tcgaccttca cgccgagctt gtcatctgct atctcgtggc agcgagtcca agtgtgctgg tctgtcccgc acatcatccg agccggttga tgcagcatat tgtgtcagct cggccgcgaa gctcggcata tcgaaggcgc cggcagcgac ttttctgctg taatcatcat cgaagaggac gcccgtctga aggcaagttg taatgtcgga actggttcgg tcgacgtcac cagcaccgga gcacgatctc acggctgcgt cccgctgccc tctgggcaaa gcgctgcccg agtcgaagtc gcgcggtgat tgcggtcccg tgttgttcac ggaaccaggc tgtcgatgta agccgccaag cggcggagac gcgtgctcag cgaccgtccg gccttgcggc cttaaattta gagcctggtc acccgatcgc cgccaatccc ctgctgcata aagcgccctg cgacaccctg cggcgatcgc ttagtacctc aaaacgcgta caagcatgat ttgctgcgac ccagtgcatt tcagaccggc aaagactgtc atcccacaaa gcaatgccaa atttcgccgc gaagagacgt cggtgacaag tcgaccttca gcgcggaggt acagcgagca tcttttcgcc gtgccagatc gggatacgag cgacctggag tcgtatcctc cgatggtgtc tggcggcggc cgctccccat ggtcgttttc tctcgtagat gattgtcgac atctgatgcg 100860 acgtccagct 100920 ggggctcgtc 100980 aaagggaaaa 101040 acgccagccg 101100 attgttcttc 101160 cggcgcatcc 101220 atagacgcgc 101280 ctctggcggc 101340 cagtctcgtc 101400 gtgcgatttg 101460 cagacccgcc 101520 tgttgccggc 101580 cccaccctga 101640 ctcaccgaac 101700 acgccatttg 101760 acccgatgtc 101820 atttaacctt 101880 cttgacatag 101940 cgccaccgtg 102000 ttcgtactca 102060 ctcgatggcg 102120 attgatcttt 102180 ttgcttctgc 102240 cgtggcccgg 102300 ggtgtttccc 102360 atacagtgag 102420 ccatgcggag 102480 aagatacggg 102540 cgatttgtcc 102600 gagcttcgcg 102660 cttctctttg 102720 gcgaagagta 102780 tcctgcccca 102840 gccgccatgg 102900 gataatgttc 102960 aagtgcggtc 103020 ggaaccaata 103080 gaccagatat 103140 catcccggcg 103200 gagtgaaaat 103260 atcctcgaaa 103320 attgaagacg 103380 caccacggct 103440 catgatccgc 103500 ccaaacagcg 103560 gtccatcacg 103620 cagaacagag 103680 tagcagagcg 103740 tcttctctcc 103800 gttgcgcctc 103860 aagatgcgac 103920 gccggaggtg 103980 cttgtcggtc 104040 accacgcagc 104100 agctttcatt 104160 ctcgctgtcg 104220 gcgattggta 104280 agtctgtaga 104340 agagaaagag 104400 gacttggccc 104460 gttcagctgg 104520 ttgcaggccg 104580

PL 219 153 B1 gagcttttaa ggaggtcgac gagctgtgca ttgttggcaa gctgtgtcca ctcggttgca 104640 gcgcccgtcg ctgagccggc aaatgctggt gccgaagcgc agactgcaaa agctgccacg 104700 atagcggtcg cggattttct tctgagcgat aggatatggt caggcatagc gattgatccc 104760 tctttcattg agccattggg tcggccagtc tttgccgtag gttgagagaa gttcccggat 104820 ccgagcgagg tcggctttgc cggaagcacc gacgaaggag agggtgagcg gccccagcgc 104880 catatcgaaa aggcggcgtc cgtccggcga cgtcacgtaa tattcccgct ttggaatggc 104940 ggctgcgacg atttcgattt ggcgaggatt aaagccgatg cgctcataga attctcgtgt 105000 cccggactcg cgtgcagccc cattcgggag gcagatcttg gttgggcagg attccttcag 105060 gacatcgatg atgcccgaac gctctgcgtc cgaaattgac tgagtggcga gaacgacggc 105120 gcagtttgcc tttcgcagca ccttcagcca ctcgcggatt ttgtcgcgga aaaccgggtg 105180 gccgagcatc agccaagcct catcgagaat gatgaggctt ggtgcccccg tgagccgctt 105240 ttcgatcctg cgaaacagat aggtcagcac ggggacgaga tttcgctcgc ccatattcat 105300 cagttgctcg atctcgaagc actggaattg accgagggtc agcgaatcct gttcagcgtc 105360 gagaagctgg cccatggggc cgtcaacagt atagtggtgc agcgcgtcct tgatctcccg 105420 catctgcacg ccactcacaa aatccgacag cgaccggcct ggagcccccg ccatcaaacc 105480 gatctgccga gatatggcgt ttcggtggtc cgggttgacc gtgacaccct gcagggagac 105540 gagtgtttcg atccactcgg aagcccaggc gcggtcggtc tcggtcgaga ggtcggagag 105600 agggcaaaag gcaagcctag ccccctcccc tgcctcgccg ccgatttcgt aatgattacc 105660 atcaacggcc agcgtcagcg gcagaataga gttgcctttg tcgaaggcga aaacctgcgc 105720 acccttatac cggcgaaatt gcgctgcgat gagcgcgaga agcgttgact tgccggaacc 105780 ggttggtccg aaaataagcg tatgcccgac atcatccaca tgaaggttca gtcggaaggg 105840 tgacgatccg gaagccacct gcgtcagtgg cggcgcgtcc ggtggataga acgggcaggg 105900 cgcaagtgga ctgcccgacc agacggaatt gagggggatg aggtccgcga ggttgcgggt 105960 gtttatcagc ggttcccgga tattgcagta ccagttgcct ggcaggctcc cgaggaatgc 106020 gtccgtcgca ttcaacgtct cgatccgcgc gccaaatecc tcagcctgga tcaaccttcg 106080 aaccgactca gctttatcgg cgagcttttc tctgctctcg tcgaatagaa tgatgaccgg 106140 cgtgtagtag ccataagcga ccagctgcga agaagcctcg gcgatcgcgt cttcagtctc 106200 agcgaccatg gccattgcgt cctggtcaac cgatcggctt tgcgtctgga agagttggtc 106260 gaagaacggc cgcaccttct gttgccattt cttgcgcgtg cgctccaacc gctgtttggc 106320 ttcctcggca tccagaaaga taaagcgtga cgaccagcga taggtgagcg gcaagagatc 106380 gaggctattc aagatgcctg gccagctctc ggccggcaaa ccgtcgatcg caatcgcgct 106440 gaggaaccgg ttttcgactt tcggggtaag gccgtgctct agctccgcgg tcgccagcca 106500 atccaaatac atgggaattt caggcagaca gactgggtgg ttttcaccgg tgatgcagaa 106560 ccggatgaac tggaacagct catcgtagcg ggcaatgcgg gtgccaccgc gttccggcac 106620 ctcacgcgtc cgcatacgct caatggagat gacgttgccg aggtattgct caatctctcg 106680 ggtggagcgc ctgaaactgt cgagcaccgt gtcggcatag gtcgccgtcc ggctctcagt 106740 gtccgagtag atataacgcg tgacgccaga tcgccggcgc tcgggagggc gatatgtcag 106800 gacgagcgca tgccggctct cgaaatgccc gcgctcttgt tcgaagtgct tgcgccgctc 106860 atcatcgatc attcgagtga cagcatcggg gaaatgactg cgttccgcag aaggatagtc 106920 agttgttggg atgcgcacgg cctcgacctg gatcatccag ccggaaccta gccgtgaaag 106980 gatcgtattg atctgacggg acagatcgtt gcgctcgaaa tccgtggcgc tctcggagtc 107040 agggccggca aaataccacc ccgccatgag acttccgtcc ttgagaagaa tggtcccatt 107100 gtcgaccagt ccggcatagg gcacgagatc ggcgaacgac ggtgcagacg ggcgaaggga 107160 acacaaagcg accatcatgg cacctctaaa aacgccgcca cggcgaagac gtgggcaggt 107220 agtgatgccg gtagcgcaaa tgccgcacgt agacatgacg catgagggga tcggattttg 107280 ccatcatgcg cagtgcgccg acgatcacga accagatggc gatgccgaac agcgctgaat 107340 acagggtgag cacgacgaag atcaggatga tcgccaccag ccctgtgaca agcaggagct 107400 ctcggtctgc ccccatcagc agattcggtc gtgaaagagc gcggtgaatg cgattgcgtt 107460 ggagagcgga atgcggctca cccattggcc ccctcccctc ttgcaacgga catcggctgg 107520 gaaacggtcc ctggcaaact tgtggcagtg atgccgatcg acgcgccggt cgcaccgaac 107580 agtccgacaa tcgtcgtcgc ccccagcagg ataccggcga ccagtacgat gtagacgagg 107640 cgtcgcgcga aatcgttgag ctcgccgccg aagatcagca ttccgccggc gatcgccatg 107700 gcggcgaggg caattgctcc tgcgactggc ccagtgatgg attcctgaat ctgttcaagc 107760 ggcccctccc agggaagact cccaccggaa ctggcaaggg ctggcgcggc aagcgccgcg 107820 cagaacatcg cagcgagcag tccgaggcga aaagagcgat tatgcagcat gaatgtcctc 107880 atcaatttga gcgtaatgtt cggtctggta ccggctaccg ctgaagccct cgacattgat 107940 gacctctcgt acccgtctcc ccctccccgc gcgctcgatc gagatgacaa gatcaacggc 108000 ctcgccgatc acagcctgca tcggttgctg gctgacctcg gcggtcagtt gctccagacg 108060 acgcaaggcg gacatggcgg tattggagtg gacggtggtg acgccaccgg gatggccagt 108120 attccaggct ttcagcagcg ttagtgcggc gccgtcgcgg acttcgccaa cgatgatgcg 108180 gtcgggacgg aggcgcatgg tgctcttgag cagtcgcgcc atatcgatcg tgtcactggt 108240 atgcaggcac accgcattct ctgccgcaca ccggatttcc gcagtatctt caagaatgac 108300 catgcggtcg tccggagctg aggctatgat ttcggcaatt acggcattgg ccagtgtcgt 108360

PL 219 153 B1 tttgcccgag aatgactgcg cagccgtgac cccttcaaag cgcctcagat catctcaccc gttgagcatg tgcttcttga gctgattgat tacctcgcga ccagttccgc gcttgggcct gctcgccgcc cggtgcccgc tgaagagcgt gcgggcgcaa atctcgacga agcttgcgca ttgggggaga ttctctgtcg ccgcaattac ccgtcatcac ggatcgtgaa caatgggaag gtgcgacgga tgccctgccc ccccagggtc caaggcggga aaaaagcggg tttcctgcac gatgttaagc cttgtcagcg cgttggggac ttcgcccgaa gccgatgact taaccgctcg gtcgagggcg atgcgactga acggcaccaa ggtggcgc cgattggcga acataatcgt gcaacaaccg atgatcggcc gtttccgctg ataaaaactc atacatagac agcattgcga gctgtccacg ttgcgctcct 108420 caagcgggat 108480 ggggcagcag 108540 gctcttcgtc 108600 ctgtcgccgc 108660 tgccgtctgg 108720 gatcgcccag 108780 cgttctcctc 108840 tacaaatttg 108900

10893Θ8

Claims (18)

1. Nowy szczep Agrobacterium tumefaciens zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2039p.

2. Nowy szczep Paracoccus alcaliphilus zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2040p.

3. Wyizolowany plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.

4. Sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) uzyskanie szczepu biorcy;

b) wprowadzenie plazmidu pSinA przedstawionego na SEKW. ID. NR 1 do szczepu biorcy.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że etap b) przeprowadza się przez:

i) koniugację trójrodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1 i szczepu pomocniczego niosącego plazmid pomocniczy, albo, ii) koniugację dwurodzicielską z wykorzystaniem szczepu donora zawierającego plazmid pSinA przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.

6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że szczepem donorowym jest Agrobacterium tumefaciens zdeponowany pod numerem KKP 2039p lub Paracoccus alcaliphilus zdeponowany pod numerem KKP 2040p.

7. Sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych według zastrz. 4, znamienny tym, że w etapie a) uzyskiwania szczepu biorcy dodatkowo wprowadza się do szczepu biorcy gen kodujący dodatkowy marker selekcyjny, korzystnie kodujący oporność na antybiotyk.

8. Sposób wytwarzania szczepów bakteryjnych według zastrz. 7, znamienny tym, że gen kodujący dodatkowy marker selekcyjny wprowadzany jest na plazmidzie, korzystnie za pomocą koniugacji trójrodzicielskiej z szczepem bakteryjnym zawierającym plazmid obejmujący gen kodujący dodatkowy marker selekcyjny oraz z szczepem pomocniczym zawierającym plazmid pomocniczy.

9. Sposób według zastrz. 4 - 8, znamienny tym, że szczepem biorcy jest szczep bakterii wyizolowany ze środowiska naturalnego, korzystnie z środowiska skażonego arsenem.

10. Sposób według zastrz. 4 - 9, znamienny tym, że szczepem biorcy jest szczep bakterii należący do Alphaproteobacteria i Gammaproteobacteria.

11. Nowy szczep bakteryjny zdolny do chemolitotroficznego utleniania arseninów wytworzony sposobem według zastrz. 4 - 10.

12. Kompozycja do biologicznego usuwania arsenu obejmująca nowy szczep bakteryjny według zastrz. 1 - 2, nowy szczep bakteryjny według zastrz. 11, plazmid według zastrz. 3 lub ich kombinację.

13. Zastosowanie nowego szczepu bakteryjnego według zastrz. 1 - 2, nowego szczepu bakteryjnego według zastrz. 11, plazmidu według zastrz. 3, kompozycji według zastrz. 12 lub ich kombinacji do konstrukcji szczepów bakteryjnych zdolnych do chemolitotroficznego utleniania arseninów.

14. Zastosowanie nowego szczepu według zastrz. 1 - 2, nowego szczepu bakteryjnego według zastrz. 11, kompozycji według zastrz. 12 lub ich kombinacji w porcesach biologicznego usuwaniu arsenu.

15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że biologiczne usuwanie arsenu obejmuje bioremediację, korzystnie bioaugumentację lub biometalurgię arsenu.

PL 219 153 B1

16. Sposób bioaugumentacji środowiska skażonego arsenem, znamienny tym, że obejmuje etap wprowadzenia nowego szczepu według zastrz. 1 - 2 albo 11, kompozycji według zastrz. 12 lub ich kombinacji do środowiska skażonego arsenem.

17. Sposób usuwania albo odzyskiwania arsenu poprzez chemolitotroficzne utlenianie arseninów, znamienny tym, że etap chemolitotroficznego utleniania arseninów prowadzony jest przez nowy szczep określony w zastrz. 1 - 2, nowy szczep określony w zastrz. 11, kompozycję określoną w zastrz. 12 lub ich kombinację.

18. Sposób usuwania albo odzyskiwania arsenu według zastrz. 17, znamienny tym, że po etapie chemolitotroficznego utleniania arseninów następuje etap strącania powstających arsenianów do formy nierozpuszczalnego osadu i/lub adsorpcji arseninów, przy czym korzystnie strącanie lub adsorpcja jest prowadzone z wykorzystałem wapna palonego (CaO), wodorotlenku wapnia Ca(OH)2, żelazowych rud darniowych lub ich kombinacji.