CN104313168B - 一种引物选择合成测序分析pcr产物单体型的方法 - Google Patents
一种引物选择合成测序分析pcr产物单体型的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104313168B CN104313168B CN201410605987.XA CN201410605987A CN104313168B CN 104313168 B CN104313168 B CN 104313168B CN 201410605987 A CN201410605987 A CN 201410605987A CN 104313168 B CN104313168 B CN 104313168B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- sequencing
- dna
- haplotype
- pcr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 84
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 62
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 19
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 claims description 19
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 19
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 14
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 12
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 12
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 7
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 claims description 6
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 2
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 2
- 101150029996 Mmp7 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000005257 nucleotidylation Effects 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 101000990912 Homo sapiens Matrilysin Proteins 0.000 description 3
- 102100030417 Matrilysin Human genes 0.000 description 3
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylyl sulfate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O IRLPACMLTUPBCL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000007347 Apyrase Human genes 0.000 description 2
- 108010007730 Apyrase Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004523 Sulfate Adenylyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010022348 Sulfate adenylyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033962 Fontaine progeroid syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710183568 Serine/threonine-protein kinase PknK Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 101150051821 era gene Proteins 0.000 description 1
- BEGBSFPALGFMJI-UHFFFAOYSA-N ethene;sodium Chemical group [Na].C=C BEGBSFPALGFMJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000009415 formwork Methods 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L magnesium chloride Substances [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 108700002783 roundabout Proteins 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明采用一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法对两个或者两个以上位点变化（如SNP，突变等）的PCR产物（多个DNA模板）进行单体型分析，PCR产物被特定测序引物杂交后分成两份，各自加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸，然后对未封闭的引物继续合成测序，得到特定DNA模板的序列信息,从而确定PCR产物的单体型。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种采用引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法。
背景技术
在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础，对生命科学至关重要。随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。在基础研究方面，研究疾病基因的遗传规律，克隆致病基因；在应用方面，直接寻找疾病的易感基因突变位点，可以获得有关与该疾病相关基因型的信息。通过DNA序列信息的分析可以为理解生命的起源、疾病发生、以及个体化医疗等提供有用的相关核酸序列信息。人的基因组中存在诸多的基因变异引起的疾病，如目前已经确定4000多种遗传疾病是由单碱基突变引起的，而一些重大疾病如癌症、糖尿病、心血管疾病、抑郁症、哮喘等，是受众多基因相关。然而基因型的信息本身是一种低外显度遗传变异，加上病例-对照研究方法的局限性，可能会出现假阴性和假阳性结果；另外,在预测功能性SNP 时,主要集中在可能引起蛋白质中氨基酸改变和影响转录调节区活性的位点上,这样势必漏掉一些其他重要的功能位点,。已有的研究发现,位于同一条染色体上的不同位点基因型之间不是孤立的，相邻的等位基因往往倾向于同时出现。如果相邻的等位基因同时出现的频率超过了随机发生的概率时,称为连锁不平衡，处于连锁不平衡的、相邻的SNP 等位位点也倾向于以一个整体遗传给后代。位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传给后代的基因型 的组合叫作单体型，单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量。
目前普遍采用间接的方法则是利用多个基因型的分型结果，以统计方法推断单体型，这种方法得到广泛了的应用，且用于构建单体型的相关软件也非常之多。然而，软件分析的结果对于临床样本而言，如果得不到直接的实验证实终究是不踏实的，临床检测也很难接受这样的分析结果。通过实验方法得到自然状态下真实的单体型情况需要进行单分子测序(如克隆测序、高通量测序等)，这些方法由于成本高，不适于大规模的个体样本分析。对于常规PCR产物中包含多个SNP位点的实验分析单体型方法，均采用一种等位基因特异引物-PCR(AS-PCR)的方法，以第一个SNP位点为扩增起始点，用两种特异引物将起始为两种的不同DNA模板分别进行扩增，然后分别进行测序，以确定其它SNP位点的碱基信息。然而，这种方法由于需要等位基因的特异扩增引物，因而扩增引物的优化设计受到限制，其扩增效率会因不同的扩增片段而不相同，甚至无法扩增出目的片段，操作繁琐、效率不高；同时需要标记两个特异扩增引物，费用也不低廉。
现有AS-PCR方法分析单体型是将不同的DNA模板分别扩增，然后进行序列分析来实现的。如果能将不同DNA模板同时进行PCR扩增，但分别进行测序，同样可以达到单体型分析的目的，且扩增引物可以优化设计，适合所有两相邻基因型位点间的序列分析。基于上述原理，本发明提出一种PCR产物的单体型分析方法，该方法可以设计优化PCR引物扩增需要分析的核酸序列片段，然后进行序列分析，适合任意两（多）位点间的单体型分析，操作相对简便，价格低廉，可以用于临床检测。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：
提供一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，当待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板时，沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
提供一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型方法，针对待检样本中一段核酸序列中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板，可沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型，具体步骤为：
步骤1）扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行扩增；
步骤2）DNA单链制备：将PCR产物利用5’端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结合，并通过变性将未固定的PCR另一条DNA链清除，获取固定的单链DNA模板；
步骤3）测序引物的杂交：根据检测位点所包含的可能信息，在PCR单链DNA模板的第一个分析位点前，杂交完全互补的测序引物；
步骤4）测序引物的封闭：根据检测位点所包含的可能信息，加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸；
步骤5）测序引物的延伸测序：当测序引物被部分封闭后，未封闭的测序引物采用现有技术延伸，实现对DNA模板序列的测定；
步骤6）DNA模板单体型的确定：根据步骤5）测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得到碱基信息，构建DNA单体型。
上述的一种PCR产物的单体型分析方法中，序列变化位点包括SNP、突变、插入或缺失等造成的碱基序列发生变化。
上述的一种PCR产物的单体型分析方法中， PCR引物5’端修饰的活性基团是在热条件下稳定的丙烯酰胺、生物素或氨基，所述载体为丙烯酰胺、表面修饰亲和素或醛基或羧基基团的载体，使得PCR引物5’端修饰的活性基团能够与载体、或者载体表面基团发生化学反应而固定到载体上。
上述的一种PCR产物的单体型分析方法中，3’端羟基封闭的单体试剂包括ddNTPs，3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基等修饰的核苷酸；合成测序包括包括单核苷酸加入焦磷酸测序、两核苷酸加入焦磷酸测序，桑格测序技术，在焦磷酸测序方法测定分析序列时，测序引物经封闭反应后，其测序反应体系可以直接用于测序反应；而在使用桑格技术测序时，应先将测序引物经过封闭反应后的反应液清除，配制桑格测序反应液、使测序引物延伸，延伸单链产物用于电泳测序分析。
采用一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法来分析MMP7 (U25346)基因PCR产物，该PCR产物包含A/G (rs11568818)和C/T ( rs11568819)核酸片段的单体型，具体步骤为：
(1)将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板，PCR扩增引物为SEQ IDNO:1，即5’-AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3’和SEQ ID NO :2，即5’-biotin-CTATGAGAGCAGTCATTTGACTTTG-3’；
(2) 将PCR扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应，使修饰生物素的DNA链固定到磁珠上，在0.2M NaOH溶液下变性，将未固定的另一条DNA链清除，然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板，分成两份用于下列实验；
(3)将测序引物SEQ ID NO:3，即：5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’与磁珠固定的其中一份单链DNA模板进行杂交；
(4)在焦磷酸测序反应体系中加入ddATP使测序引物完成一个碱基延伸；
(5)将上述（4）的反应体系置于焦磷酸测序仪（PSQ 96MA system (Biotage AB,Uppsala, Sweden)）中，按照指定的单个核苷酸加入顺序对未封闭测序引物杂交的DNA模板进行序列测定。
(6) 按照(3),(4),(5)的流程，将测序引物SEQ ID NO: 3，即：5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’与磁珠固定的第二份单链DNA模板杂交，在焦磷酸测序反应体系中加入ddGTP使测序引物完成一个碱基延伸, 最后反应体系置于焦磷酸测序仪中进行序列测定。
(7)根据(5),(6)得到的测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得碱基信息，构建DNA单体型。
本发明的有益效果是：
提供了一种引物选择合成测序分析PCR产物的单体型的方法对两个或者两个以上位点变化的PCR产物进行单体型分析，PCR产物被特定测序引物杂交后分成两份，各自加入一种3’端封闭的单体试剂，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸，然后对未封闭的引物继续合成测序，得到特定DNA模板的序列信息,从而确定PCR产物的单体型。
与现有等位基因特异引物-PCR(AS-PCR)技术分析单体型相比，本发明对PCR引物没有限制，可以随意在包含分析片段内的区域设计、优化PCR引物，对分析的片段区域没有限制，并扩增出足够可用于序列测定的DNA模板量，适合所有片段的单体型分析。
附图说明
图1.为一种测序引物选择合成分析PCR产物的单体型分析方法的一般流程。图中1为固相载体，2为PCR产物（DNA模板），3为互补杂交测序引物。PCR扩增产物的一条单链通过与载体1结合得到固定、并变性后制备出单链DNA模板2，与测序引物3杂交（a）； 加入ddATP，测序引物3在DNA模板第一个SNP位点碱基T的指导下发生合成反应（b），此后，该测序引物被封闭，不能继续合成；加入dNTP进行焦磷酸测序反应（c），测序信号均来自含有“C”的DNA模板，当测序测定第二个SNP位点的碱基信息时，便能知道第二个SNP位点碱基与第一个位点碱基C的关联，从而确定单体型。
图2为MMP7 (U25346)基因PCR产物包含A/G (rs11568818)和C/T ( rs11568819)核酸片段的测序结果。（1）为单链PCR产物与测序引物杂交、且当测序引物用ddATP封闭后，按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸的焦磷酸测序结果，其序列特征表明：第一个SNP位点碱基G相关联的第二个SNP位点的碱基信息为T和C; （2）为单链PCR产物与测序引物杂交、且当测序引物用ddGTP封闭后，按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸的焦磷酸测序结果，其序列特征表明：第一个SNP位点碱基A相关联的第二个SNP位点的碱基信息为C，与T无关联。
具体实施方式
下面将结合说明书附图，对本发明作进一步的说明。
实例1： MMP7 (U25346)基因PCR产物包含A/G (rs11568818)和C/T (rs11568819)核酸片段的单体型分析
(1)将血样本采用传统的蛋白激酶K与苯酚/氯仿抽提法提取外周血中的基因组DNA；
(2)将PCR引物（5’-AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3’, 5’-biotin-CTATGAGAGCAGTCATTTGACTTTG-3’， 200 ng基因组DNA，0.2mM dNTP，1 U Taq DNA聚合酶, 1×扩增缓冲液, 1.8 mM MgCl2的50μL PCR扩增体系进行扩增。扩增条件为：94℃起始变性5分钟，35个热循环：94℃变性30秒～61℃退火45秒～72℃延伸45秒，最后72℃延伸7分钟。
(3) 将PCR扩增与亲和素修饰的磁珠反应，使修饰生物素的DNA链固定到磁珠上，在0.2M NaOH溶液下变性，将未固定的另一条DNA链清除，然后用洗液(10 mM Tris–Acetate, pH 7.6)洗涤，得到固定的单链DNA模板，分成两份用于下列实验；
(4) )将测序引物（5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’）与磁珠固定的其中一份单链DNA模板模板在反应体系（(10 mM Tris–HCl, 2 M NaCl, 1 mM EDTA(乙二胺四乙酸钠),0.1% Tween 20, pH 7.6) 80℃下放置5分钟，然后自然冷却至室温，完成杂交；
(5) 在焦磷酸测序反应体系(0.1 M Tris-Ac (pH 7.7), 2 mM EDTA(乙二胺四乙酸钠), 10 mM Mg(Ac)2, 0.2% BSA(小牛血清蛋白), 10 mM DTT(二巯苏糖醇), 10 mMAPS(磷酰硫酸腺), 0.4 mg/mL PVP(聚乙烯吡咯烷酮), 4 mM D-luciferin(虫荧光素), 2U/mL ATP sulfurylase(三磷酸腺苷硫酸化酶), 0.4 mM luciferase (荧光素酶), 2 U/mL apyrase VII(三磷酸腺苷双磷酸酶VII), 2 U/mL DNA聚合酶 I (Klenow fragment,exo–)中加入ddATP使测序引物在室温下完成一个碱基延伸；
(6) 将上述（5）的反应体系置于焦磷酸测序仪（PSQ 96MA system (Biotage AB,Uppsala, Sweden)）中，按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸对未封闭测序引物在DNA模板指导下进行合成测序。得到图2（1）中的图谱，根据系列特征可以得出，第一个SNP位点碱基G相关联与第二个SNP位点的碱基T和C均由关联。
(7) 按照(4),(5),(6)的流程，将测序引物（5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’）与磁珠固定的第二份单链DNA模板模板杂交，在焦磷酸测序反应体系中加入ddGTP使测序引物完成一个碱基延伸, 最后反应体系置于焦磷酸测序仪中，按照仪器上编辑程序依次加入单个核苷酸，对未封闭测序引物在DNA模板指导下进行合成测序。得到图2（2）中的图谱，根据序列特征可以得出，第一个SNP位点碱基A相关联的第二个SNP位点的碱基信息为C，与T无关联。
(8)根据图2中的图谱，构建出的DNA单体型为下列三种：
单体型1（SEQ ID NO:4)： 5’GTTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTTGTCTTTCAAA-3’
单体型 2（SEQ ID NO:5):5’GTTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTCGTCTTTCAAA-3’
单体型3（SEQ ID NO:6) : 5’-ATTATTGGCAGGAAGCACACAATGTATTCGTCTTTCAAA-3’
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (5)
1.一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于：一段核酸序列的待检样本中含有两个以上的序列变化位点组成的单体型DNA模板，沿着第一个序列变化位点有选择地限制特定的测序引物进行合成测序，从而测定相应DNA模板的序列，确定其单体型，具体步骤为：
步骤一扩增：利用包含一个5’端修饰活性基团的PCR引物，对待检样本进行扩增；
步骤二DNA单链制备：将PCR产物利用5’端修饰活性基团与其它经过修饰的载体结合，并通过变性将未固定的PCR另一条DNA链清除，获取固定的单链DNA模板；
步骤三测序引物的杂交：根据检测位点所包含的可能信息，在PCR单链DNA模板的第一个分析位点前，杂交完全互补的测序引物；
步骤四测序引物的封闭：根据检测位点所包含的可能信息，加入一种3’端封闭的单体试剂，即ddNTPs或3’-O-烯丙基、3’-O-氰乙基、3’-O-叠氮甲基修饰的核苷酸之一，测序引物在DNA模板指导下延伸位点发生变化的一个碱基后，该测序引物3’端被封闭而不能继续延伸；
步骤五测序引物的延伸测序：当测序引物被部分封闭后，未封闭的测序引物采用现有技术延伸，实现对DNA模板序列的测定；
步骤六DNA模板单体型的确定：根据步骤五测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得到碱基信息，构建DNA单体型。
2.根据权利要求1所述的一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于序列变化位点包括SNP、突变、插入或缺失造成的碱基序列发生变化。
3.根据权利要求1所述的一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于所述PCR引物5’端修饰的活性基团为在热条件下稳定的丙烯酰胺、生物素或氨基之一，所述载体为丙烯酰胺、表面修饰亲和素或醛基或羧基基团的载体之一，使得PCR引物5’端修饰的活性基团能够与载体、或者载体表面基团发生化学反应而固定到载体上。
4.根据权利要求1所述的一种引物选择合成测序分析PCR产物单体型的方法，其特征在于所述合成测序包括单核苷酸加入焦磷酸测序、两核苷酸加入焦磷酸测序，桑格测序技术，在焦磷酸测序方法测定分析序列时，测序引物经封闭反应后，其测序反应体系可以直接用于测序反应；而在使用桑格技术测序时，应先将测序引物经过封闭反应后的反应液清除，配制桑格测序反应液、使测序引物延伸，延伸单链产物用于电泳测序分析。
5.一种对MMP7基因PCR产物进行分析的方法，该方法是根据权利要求1所述方法进行的，该PCR产物的核苷酸序列包含rs11568818 SNP位点和rs11568819 SNP位点相关联所组成的单体型，具体步骤为：
a.将所有需检测的样本处理后提取DNA用作扩增模板，PCR扩增引物为SEQ ID NO:1，即5’-AGTCTACAGAACTTTGAAAGTATGTG-3’和SEQ ID NO :2，即5’-biotin-CTATGAGAGCAGTCATTTGACTTTG-3’；
b.将PCR扩增产物与亲和素修饰的磁珠反应，使修饰生物素的DNA链固定到磁珠上，在0.2M NaOH溶液下变性，将未固定的另一条DNA链清除，然后用洗液洗涤，得到固定的单链DNA模板，分成两份用于下列实验；
c.将测序引物SEQ ID NO:3，即：5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’与磁珠固定的其中一份单链DNA模板进行杂交；
d.在焦磷酸测序反应体系中加入ddATP使测序引物完成一个碱基延伸；
e.将上述d的反应体系置于焦磷酸测序仪中，按照指定的核苷酸加入顺序对未封闭测序引物杂交的DNA模板进行序列测定;
f. 按照c、d、e的流程，将测序引物SEQ ID NO: 3，即：5’-CTAAAACGAGGAAGTATTACATC-3’与磁珠固定的第二份单链DNA模板杂交，在焦磷酸测序反应体系中加入ddGTP使测序引物完成一个碱基延伸, 最后反应体系置于焦磷酸测序仪中进行序列测定;
g根据e、f得到的测序信息，辨识出DNA模板中序列变化位点得碱基信息，构建DNA单体型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410605987.XA CN104313168B (zh) | 2014-10-30 | 2014-10-30 | 一种引物选择合成测序分析pcr产物单体型的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410605987.XA CN104313168B (zh) | 2014-10-30 | 2014-10-30 | 一种引物选择合成测序分析pcr产物单体型的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104313168A CN104313168A (zh) | 2015-01-28 |
| CN104313168B true CN104313168B (zh) | 2016-11-30 |
Family
ID=52368477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410605987.XA Expired - Fee Related CN104313168B (zh) | 2014-10-30 | 2014-10-30 | 一种引物选择合成测序分析pcr产物单体型的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104313168B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104762406B (zh) * | 2015-04-23 | 2017-08-25 | 东南大学 | 一种两核苷酸不同步合成测序分析pcr产物单体型方法 |
| CN104894246B (zh) * | 2015-05-21 | 2018-03-20 | 东南大学 | 一种两核苷酸合成测序分析多模板pcr产物的方法 |
| CN106591285B (zh) * | 2015-10-19 | 2019-11-29 | 浙江安诺优达生物科技有限公司 | 一种构建高可利用数据率的Hi-C文库的方法 |
| CN109536594B (zh) * | 2017-09-20 | 2022-11-01 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 一种用于Small RNA的测序方法、测序试剂和应用 |
| CN112033743B (zh) * | 2020-07-16 | 2024-04-30 | 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） | 一种帕金森粪便液提取装置 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102634587B (zh) * | 2012-04-27 | 2013-11-27 | 东南大学 | Dna芯片组合延伸检测碱基连续突变的方法 |
| CN103602740A (zh) * | 2013-11-06 | 2014-02-26 | 毅新兴业（北京）科技有限公司 | 质谱仪鉴定血清中游离dna的方法、试剂盒及其应用 |
-
2014
- 2014-10-30 CN CN201410605987.XA patent/CN104313168B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104313168A (zh) | 2015-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20230416729A1 (en) | Nucleic acid sequencing adapters and uses thereof | |
| US9249460B2 (en) | Methods for obtaining a sequence | |
| EP2341151B1 (en) | Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing | |
| CN104313168B (zh) | 一种引物选择合成测序分析pcr产物单体型的方法 | |
| US20170051343A1 (en) | Strand exchange hairpin primers that give high allelic discrimination | |
| JP2012120542A (ja) | ウルトラディープ配列決定を用いて配列変異体を決定するための方法 | |
| US20180223350A1 (en) | Duplex adapters and duplex sequencing | |
| CN101979659A (zh) | 一种快速检测绵羊多胎FecB基因的方法 | |
| CN104894246B (zh) | 一种两核苷酸合成测序分析多模板pcr产物的方法 | |
| Yamagata et al. | Selection criteria for SNP loci to maximize robustness of high-resolution melting analysis for plant breeding | |
| CN117925802B (zh) | 用于hla-i和hpa多重pcr的引物组合物、应用和基因分型方法 | |
| US20100297633A1 (en) | Method of amplifying nucleic acid | |
| CN109923215A (zh) | 序列变体的检测 | |
| JPWO2003102178A1 (ja) | 遺伝子多型のタイピング方法 | |
| CN104762406B (zh) | 一种两核苷酸不同步合成测序分析pcr产物单体型方法 | |
| Labbé et al. | Targeting discriminatory SNPs in Salmonella enterica serovar Heidelberg genomes using RNase H2-dependent PCR | |
| US11248261B2 (en) | RhD gene allele associated with a weak D phenotype and its uses | |
| JP2005530508A (ja) | プライマー伸長反応および多型検出反応をモニターするための方法および組成物 | |
| CN106916882B (zh) | 用于辨识核苷酸基因多型性的基因型鉴定芯片的双重等位基因特异性聚合酶链锁反应的方法 | |
| CN104928349B (zh) | 一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法 | |
| JP2019154310A (ja) | 核酸検出方法及び核酸検出装置、並びに、核酸検出キット | |
| JP2005204538A (ja) | Ｃｙｐ２ｄ６の変異の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット | |
| Yang et al. | Preparation of Single-Stranded DNA for Pyrosequencing by LATE-PCR | |
| US20110117547A1 (en) | Target dna detection method and target dna detection kit | |
| JP2009232764A (ja) | ハプロタイプの検出方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20150128 Assignee: JIANGSU SUPERBIO STOCK CO.,LTD. Assignor: Southeast University Contract record no.: 2018320000261 Denomination of invention: Method for analyzing haplotype of PCR products by primer selection sequencing-by-synthesis Granted publication date: 20161130 License type: Exclusive License Record date: 20181030 |
|
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20161130 |