CN102634602A - 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的原料配方及制备、使用方法。其原料配方为：1000~2000μL反应液，100~200μLBstDNA聚合酶，50~100μL阳性对照，50~100μL阴性对照，1mL-2mL液体石蜡，1mL-2mL超纯水；反应液包括内引物混合液、外引物混合液、LAMP反应缓冲液、Mg2+及dNTP，五种液体于反应液中体积比为2:2:2.5:2:1。制备方法包括以下内容：第一，最佳反应温度与时间的确定；第二，特异性检测、敏感性检测和临床应用性检测；第三，试剂盒包装。本发明对山羊养殖场绵羊肺炎支原体感染山羊疑似病例病原检测具有快速、简易、准确的特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法。
背景技术
绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae, Mo）为山羊传染性胸膜肺炎（Contagious Caprine Plneuropneumonia, CCPP）主要病原之一，可感染绵羊及山羊，山羊感染Mo后临床表现为呼吸障碍、消瘦、高热、卧地不起等症状，病死率较高，给山羊养殖业造成严重的经济损失。
目前，国内外对于Mo的检测主要依靠病原分离鉴定、血清学试验以及聚合酶链式反应技术。对比三种诊断方法，传统的分离鉴定由于支原体生长条件要求较高、生长速度缓慢的特点，因此诊断成本高且难度大、耗时长，无法立即解决快速诊断问题；血清学试验主要为间接血凝试验、补体结合试验与竞争ELISA，三者敏感性差或特异性差，且不能作为病原诊断方法；聚合酶链式反应技术具有快速、准确、灵敏、特异等优点，但是其试剂成本高、操作复杂、检测设备要求高，不适宜基层兽医单位使用。因此，本发明设计了针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因环介导等温扩增试验特异性内外引物，通过优化反应条件及体系，建立一种快速、灵敏、特异、简易的Mo检测方法并制备检测试剂盒，为山羊源Mo防控提供了一定的技术支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法，能够避免临床对于绵羊肺炎支原体感染山羊疑似病例的病原检测盲目性与繁琐性，并降低以聚合酶链式反应技术进行绵羊肺炎支原体检测的高成本、高设备要求，为山羊源绵羊肺炎支原体防治提供技术支持，以克服现有技术存在的诊断成本高且难度大、耗时长等诸多不足。
本发明的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒原料配方为：1000~2000μL反应液，100~200μL Bst DNA聚合酶，50~100μL阳性对照，50~100μL阴性对照，1mL-2 mL液体石蜡，1mL-2 mL超纯水。
所述反应液包括内引物混合液、外引物混合液、LAMP反应缓冲液、Mg2+及dNTP，五种液体于反应液中体积比为2:2:2.5:2:1。
所述内引物与外引物为针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的环介导等温扩增试验特异性内引物FIP与BIP、外引物F3与B3，内引物浓度为20μmol/ L，外引物浓度为5μmol/ L，引物序列见表1：
表1 内外引物序列
| 引物 | 序列（5’—3’） |
| FIP | ACTTCATCCTGCACTCTGTGTCTTTT CAGCAGTAAGGAATATTCCACA |
| BIP | TTAGGGATGTAAACTGCTGTTGTTTT CCGTCAAGACTAAATCATTTCC |
| F3 | ATTGAGATACGGCCCAGA |
| B3 | GCCGTCACTTTCTAATAAGGT |
所述LAMP反应缓冲液为10×ThermoPol Reaction Buffer，它包括200mmol/L Tris-HCl、100mmol/L（NH4）2SO4、100mmol/L KCl、20mmol/L MgSO4和1%Triton X-100。
所述Mg2+为MgCl2溶液，其浓度为25mmol/L。
所述dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为10mmol/ L。
所述Bst DNA聚合酶，其浓度为8.0U/μL。
所述阳性对照为绵羊肺炎支原体16S rRNA基因部分序列克隆质粒，其浓度为1.0×105copies/μL。
所述阴性对照为不含绵羊肺炎支原体16S rRNA基因的pMD18-T空载体质粒。
所述液体石蜡为分析纯石蜡油。
所述超纯水为双蒸水。
绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备方法，包括以下内容：第一，最佳反应温度与时间的确定；第二，特异性检测、敏感性检测和临床应用性检测；第三，试剂盒包装。
绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法，包括以下过程：①取出试剂盒内所装试剂置冰上彻底溶解；②取无菌PCR反应管，向内依次加入所述试剂；③上述试剂于PCR反应管混匀瞬时离心后，加入20.0μL灭菌液体石蜡覆于液面上，并置PCR反应管于金属恒温仪或水浴锅中，以60℃保温反应60min后80℃灭活5min；④取8μL扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果判定：阳性对照应出现清晰的“瀑布状”条带，主要于100bp—500bp间出现6条较亮条带，阴性对照无任何条带出现；若待检扩增模板出现与阳性对照相同“瀑布状”条带，则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阳性，若无任何条带出现则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阴性。
本发明有益效果：本发明将改变绵羊肺炎支原体感染山羊无快速检测试剂盒使用的局面；本发明所建立试剂盒适用于检测临床疑似绵羊肺炎支原体感染山羊病例病料，能够对临床疑似病例进行病原快速检测，为山羊养殖场及时采取措施预防控制该病暴发提供技术支持与理论依据，并降低传统方法检测病原的繁琐性与盲目性及聚合酶链式反应技术的高成本。
本发明与现有技术相比，具有以下技术效果和特点：
（1）便捷性好：本发明以环介导等温扩增试验为技术基础，相比传统病原分离鉴定及聚合酶链式反应技术，不仅能快速对疑似病例进行病原检测，并且降低了检测成本，缩短了检测时间。
（2）特异性好：本发明设计合成针对于Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因环介导等温扩增试验特异性内引物与外引物，两对引物保证了特异性扩增Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA靶基因序列。
（3）敏感性高：本发明基于环介导等温扩增试验技术，可检测病原核酸量最低至1.0×102copies/μL。
附图说明
图1为本发明绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备流程图。
具体实施方式
本发明的实施例：所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒原料及配方为：1000~2000μL反应液，100~200μL Bst DNA聚合酶，50~100μL阳性对照，50~100μL阴性对照，1mL-2 mL液体石蜡，1mL-2 mL超纯水。
所述反应液包括内引物混合液、外引物混合液、LAMP反应缓冲液、Mg2+及dNTP，五种液体于反应液中体积比为2:2:2.5:2:1。
所述内引物与外引物为针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的环介导等温扩增试验特异性内引物FIP与BIP、外引物F3与B3，内引物浓度为20μmol/ L，外引物浓度为5μmol/ L，引物序列见表1：
表1 内外引物序列
| 引物 | 序列（5’—3’） |
| FIP | ACTTCATCCTGCACTCTGTGTCTTTT CAGCAGTAAGGAATATTCCACA |
| BIP | TTAGGGATGTAAACTGCTGTTGTTTT CCGTCAAGACTAAATCATTTCC |
| F3 | ATTGAGATACGGCCCAGA |
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所述LAMP反应缓冲液为10×ThermoPol Reaction Buffer，它包括200mmol/L Tris-HCl、100mmol/L（NH4）2SO4、100mmol/L KCl、20mmol/L MgSO4和1%Triton X-100。
所述Mg2+为MgCl2溶液，其浓度为25mmol/L。
所述dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP、dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为10mmol/ L。
所述Bst DNA聚合酶，其浓度为8.0U/μL。
所述阳性对照为绵羊肺炎支原体16S rRNA基因部分序列克隆质粒，其浓度为1.0×105copies/μL。
所述阴性对照为不含绵羊肺炎支原体16S rRNA基因的pMD18-T空载体质粒。
所述液体石蜡为分析纯石蜡油。
所述超纯水为双蒸水。
所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备方法，它包括以下内容：
第一，最佳反应温度的确定和最佳反应时间的确定。
最佳反应温度的确定过程如下：首先取6支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，阳性对照1.0μL，超纯水13.5μL；然后每管加入20.0μL液体石蜡覆于液面上，于60℃~65℃（以1℃间隔递增）反应60min，80℃灭活5min，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测效果以确定最佳反应温度。
最佳反应时间的确定过程如下：首先取4支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，阳性对照1.0μL，超纯水13.5μL；然后每管加入20.0μL液体石蜡覆于液面上，于60℃分别反应30min、60min、90min、120min，80℃灭活5min，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析以确定最佳反应时间。
第二，特异性检测、敏感性检测和临床应用性检测。
特异性检测过程如下：取8支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL与Bst DNA聚合酶1.0μL后，从第1管至第8管依次加入绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、链球菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、巴氏杆菌及山羊痘病毒的基因组DNA各1.0μL进行环介导等温扩增反应，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析以检测试剂盒特异性。
敏感性检测过程如下：取7支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL与Bst DNA聚合酶1.0μL后，从第1管至第7管依次加入浓度为1.0×106copies/μL ~1.0×100 copies/μL的阳性对照1.0μL进行环介导等温扩增反应，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析以检测试剂盒敏感性。
临床应用性检测过程如下：以所建绵羊肺炎支原体基因检测环介导等温扩增方法分别对不同疑似绵羊肺炎支原体感染山羊病变肺组织、胸腔积液及鼻腔分泌物进行检测，并与传统支原体分离及生化鉴定结果进行比较
第三，试剂盒包装。
首先将试剂原料按类别分别装入平底聚丙烯管（规格：2mL）内，贴标签后以全封闭式焊头封闭各管管口；其次将已装原料各管正面放置于泡沫试剂托盘上并装入试剂盒内；然后于试剂盒内放入使用说明书后胶封试剂盒；最后将包装好的试剂盒置–20℃保存。
绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法，包括以下过程：
①取出试剂盒内所装试剂置冰上彻底溶解；
②取无菌PCR反应管，按表2向内依次加入所述试剂；
表2 试剂添加及用量
| 试剂及添加量 | 阳性对照 | 阴性对照 | 待检样本 |
| 反应液 | 9.5μL | 9.5μL | 9.5μL |
| Bst DNA聚合酶 | 1.0μL | 1.0μL | 1.0μL |
| 阳性对照 | 1.0μL | 0 | 0 |
| 阴性对照 | 0 | 1.0μL | 0 |
| 待检样本 | 0 | 0 | 1μL ~3μL |
| 灭菌超纯水 | 补足25.0μL | 补足25.0μL | 补足25.0μL |
③上述试剂于PCR反应管混匀瞬时离心后，加入20.0μL灭菌液体石蜡覆于液面上，并置PCR反应管于金属恒温仪或水浴锅中，以60℃保温反应60min后80℃灭活5min；
④取8μL扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果判定：阳性对照应出现清晰的“瀑布状”条带，主要于100bp—500bp间出现6条较亮条带，阴性对照无任何条带出现；若待检扩增模板出现与阳性对照相同“瀑布状”条带，则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阳性，若无任何条带出现则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阴性。
使用时请注意：试剂盒内所装试剂尽量避免反复冻融，以免试剂失活。
本发明需要登录GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取绵羊肺炎支原体 Y98株16S rRNA基因序列（登录号：NR_025989），以LAMP primer designing software PrimerExplorer在线引物设计软件PrimerExplorer V4设计针对于Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因环介导等温扩增试验特异性内引物与外引物，合成引物并纯化后，对扩增体系及条件进行优化，制备成商品化绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒。
Claims (15)
1.一种绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：其原料配方为：1000~2000μL反应液，100~200μL Bst DNA聚合酶，50~100μL阳性对照，50~100μL阴性对照，1mL-2 mL液体石蜡，1mL-2 mL超纯水。
2.根据权利要求1所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：反应液包括内引物混合液、外引物混合液、LAMP反应缓冲液、Mg2+及dNTP，五种液体于反应液中体积比为2:2:2.5:2:1。
3.根据权利要求2所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：内引物与外引物为针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的环介导等温扩增试验特异性内引物FIP与BIP、外引物F3与B3，内引物浓度为20μmol/ L，外引物浓度为5μmol/ L，引物序列见表1：
表1 内外引物序列
。
4.根据权利要求2所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：LAMP反应缓冲液为10×ThermoPol Reaction Buffer，该LAMP反应缓冲液包括200mmol/L Tris-HCl、100mmol/L（NH4）2SO4、100mmol/L KCl、20mmol/L MgSO4和1%Triton X-100。
5.根据权利要求2所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：Mg2+为MgCl2溶液，其浓度为25mmol/L。
6.根据权利要求2所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为10mmol/ L。
7.根据权利要求1所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：Bst DNA聚合酶浓度为8.0U/μL。
8.根据权利要求1所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为绵羊肺炎支原体16S rRNA基因部分序列克隆质粒，其浓度为1.0×105copies/μL。
9.根据权利要求1所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：阴性对照为不含绵羊肺炎支原体16S rRNA基因的pMD18-T空载体质粒。
10.根据权利要求1所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：液体石蜡为分析纯石蜡油。
11.一种绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备方法，其特征在于：它包括以下内容：第一，最佳反应温度与时间的确定；第二，特异性检测、敏感性检测和临床应用性检测；第三，试剂盒包装。
12.根据权利要求11所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备方法，其特征在于：最佳反应温度的确定过程如下：首先取6支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，阳性对照1.0μL，超纯水13.5μL；然后每管加入20.0μL液体石蜡覆于液面上，于60℃~65℃（以1℃间隔递增）反应60min，80℃灭活5min，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测效果以确定最佳反应温度；
最佳反应时间的确定过程如下：首先取4支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL，Bst DNA聚合酶1.0μL，阳性对照1.0μL，超纯水13.5μL；然后每管加入20.0μL液体石蜡覆于液面上，于60℃分别反应30min、60min、90min、120min，80℃灭活5min，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析以确定最佳反应时间。
13.根据权利要求11所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备方法，其特征在于：特异性检测过程如下：取8支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL与Bst DNA聚合酶1.0μL后，从第1管至第8管依次加入绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、大肠杆菌、链球菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、巴氏杆菌及山羊痘病毒的基因组DNA各1.0μL进行环介导等温扩增反应，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析以检测试剂盒特异性；
敏感性检测过程如下：取7支PCR反应管，每管中均加入反应液9.5μL与Bst DNA聚合酶1.0μL后，从第1管至第7管依次加入浓度为1.0×106copies/μL ~1.0×100 copies/μL的阳性对照1.0μL进行环介导等温扩增反应，1.0%琼脂糖凝胶电泳分析以检测试剂盒敏感性；
临床应用性检测过程如下：以所建绵羊肺炎支原体基因检测环介导等温扩增方法分别对不同疑似绵羊肺炎支原体感染山羊病变肺组织、胸腔积液及鼻腔分泌物进行检测，并与传统支原体分离及生化鉴定结果进行比较，以验证方法的临床应用性。
14.根据权利要求11所述的绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的制备方法，其特征在于：试剂盒包装过程如下：首先将试剂原料按类别分别装入平底聚丙烯管内，贴标签后以全封闭式焊头封闭各管管口；其次将已装原料各管正面放置于泡沫试剂托盘上并装入试剂盒内；然后于试剂盒内放入使用说明书后胶封试剂盒；最后将包装好的试剂盒置–20℃保存。
15.一种绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法，其特征在于：它包括以下过程：①取出试剂盒内所装试剂置冰上彻底溶解；②取无菌PCR反应管，向内依次加入所述试剂；③上述试剂于PCR反应管混匀瞬时离心后，加入20.0μL灭菌液体石蜡覆于液面上，并置PCR反应管于金属恒温仪或水浴锅中，以60℃保温反应60min后80℃灭活5min；④取8μL扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果判定：阳性对照应出现清晰的“瀑布状”条带，主要于100bp—500bp间出现6条较亮条带，阴性对照无任何条带出现；若待检扩增模板出现与阳性对照相同“瀑布状”条带，则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阳性，若无任何条带出现则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阴性。
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