CN102409101A - 通用荧光标记探针的pcr-ldr基因多态性测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法，利用通用模板和通用荧光标记探针完成LDR标记探针的标记，简化了标记过程，降低了成本，缩短了操作时间，不会产生非特异性的检测结果。可应用于多重PCR-LDR系统，利用了测序系统的高通量，可同时进行多样本的检测，加快了检测的速度。

Description

通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法

技术领域

本发明属于基因多态性位点检测领域，特别涉及一种通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法。

背景技术

随着人类药物基因组学的发展，越来越多的研究成果将要运用于临床诊断中，这就要求有大规模的基因多态性位点检测方法。这些年来，将连接反应用于检测基因多态性位点越来越引起人们的重视，国外学者已经做了大量的研究(France Barany et al.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，88：189-93(1991)，The Ligase Chain Reaction(LCR)in a PCR World，PCR Methods andApplications，1：5-16(1991))。连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)是指在反应中设计两对探针，使得连接反应可以指数扩增模板。连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)是在反应中仅加入一对探针，模板被线性扩增。

近几年，出现了将LDR技术和PCR技术关联使用，以及LDR技术、PCR技术和基因芯片技术，测序技术关联用于基因多态性位点检测(Norman P.Gerry1 et al.，J.Mol.Biol.(1999)292，251-262，U.S.Pat.Pub.No.2003/0032016A1)，这些技术的出现大大方便了基因位点的检测，但同时在这些技术中，存在着大量的需要荧光标记的探针，而这些标记的探针往往成本昂贵，为开发和应用造成不便。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法，以填补现有技术中通用标记探针完成探针标记的空白，克服检测过程复杂的缺陷。

本发明的第一方面提供一组用于基因多态性测序的核酸序列包括：

a)至少一条LDR标记探针，包括三部分，第一部分位于5’端且和待测模板严谨配对，第二部分位于3’端且和通用模板5’序列严谨配对，第三部分位于上述两部分序列中间，是一段用于调整探针长度的、和待测模板或通用模板或其他探针序列均无同源性的随机序列，该探针的5’磷酸化；

b)2到4条LDR检测探针，每条包括两部分，一部分位于3’端且和待测模板严谨配对，另一部分位于5’端是一段用于调整探针长度的、和待测模板或通用模板或其他探针序列均无同源性的随机序列，且该2到4条检测探针通过设计长度不同的随机序列使检测位点上不同的2到4种碱基对应不同的LDR产物长度；

c)至少一条通用荧光标记探针，该探针的5’端磷酸化，3’端用荧光标记并且和通用模板

d)的5’端序列严谨配对；

d)至少一条通用模板，其5’端序列和所述通用荧光标记探针c)严谨配对，其3’端序列和所述LDR标记探针a)严谨配对。

上述的一组用于基因多态性测序的核酸序列的一种优选方式为，所述的待测模板为待测序的多态性序列经PCR扩增后的产物。

上述的一组用于基因多态性测序的核酸序列另一种优选方式为，其特征在于，所述的LDR标记探针a)和LDR检测探针b)与待测模板严谨配对部分的长度范围均为10-25个核苷酸。

上述的一组用于基因多态性测序的核酸序列又一种优选方式为，所述的核酸序列a)-d)中的只是一种为DNA。优选地，所述的核酸序列a)-d)均为DNA。

本发明的第二方面提供一种基因多态性测序方法，包括如下步骤：

(1)提供权利要求1所述的一组核酸序列；

(2)LDR反应，获得荧光标记的2到4条长度不同的LDR产物，对应检测位点上2到4种不同的碱基；

(3)通过荧光标记检测长度不同的LDR产物。

上述的基因多态性测序方法的一种优选方式为，在所述的LDR反应之前有一个PCR反应以扩增待测序的多态性序列，且PCR引物与所述的核酸序列a)-d)均无同源性。

本发明的第三方面提供一种基因多态性测序试剂盒，包括含权利要求1所述的一组核酸序的LDR反应试剂。优选地，所述的试剂盒还包括PCR反应试剂，更加优选所述的试剂盒还包括核酸提取试剂。

本发明的通用荧光标记探针的PCR-LDR基因多态性测序方法的关键在于探针设计，其具体实施方式之一为：

①针对检测的位点，设计一系列LDR产物的分子量系列；

②设计一个具有特异性的通用荧光标记探针；

③设计一个具有和上述荧光标记探针相同特异性的通用模板；

④在检测的位点的前后分别设计10-25碱基长度的检测探针和标记探针，检测探针的检测位点设计在3’端；

⑤在标记探针的3’端引入通用模板配对序列和与PCR产物的序列没有同源性的序列，检测探针5’端引入与PCR产物的序列没有同源性的序列；

本发明所述的LDR检测的一种实施方式为：取PCR产物1μl、探针各40fmol-10pmol、DNA连接酶15U以及连接酶缓冲液，相互混合进行LDR反应，反应的条件为94℃30秒，40-70℃1-10分钟，循环1-40次。；结果检测为，取上述LDR产物1-5μl，混合测序系统的上样缓冲液，上样，进行LDR产物分离鉴定。

其中，所述LDR检测中的通用荧光标记探针序列可以设计为通用于不同目标序列检测的序列，例如：GCATCACTCAGAGGG。

同样，通用模板序列也可以设计为通用于不同目标序列检测的序列，例如：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG。

本发明所述的PCR检测的一种实施方式为：取待检测DNA1μl、PCR上下游引物各10-30pmol、DNA聚合酶2U以及聚合酶混合液，相互混合进行PCR反应。所述聚合酶混合液组分为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂。所述PCR反应的条件为：94℃30秒，40℃-68℃30秒-2分钟，60-72℃45秒-2分钟，循环25-40次。

所述LCR检测中的连接酶缓冲液组分可采用商品试剂成分，例如：20mM Tris-HCl，50mMKCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM二硫苏糖醇，0.1vol％聚乙二醇辛基苯基醚，pH 8.3。

如本发明所述，“基因多态性“包括单位点基因突变、基因缺失、插入、以及微卫星等多种情况，本方法所述的基因多态性位点检测典型地可以针对基因单位点突变，即单碱基突变，以及插入和缺失，并且在突变位点周围大约20个碱基内没有其他单位点突变。

利用通用荧光标记探针，PCR和LDR关联利用测序仪进行基因多态性位点检测时，针对每一个突变位点，涉及到4种探针，第一种是探针是标记探针，包含三个部分，其中一部分为和PCR产物模板配对部分，另一部分为和通用模板5’序列完全匹配，同时在两部分序列中间引入随机序列来调整探针的长度，该探针的5’磷酸化；第二种探针为检测探针，包含两个部分，一为和PCR产物模板配对部分，另一部分则是随机序列来调整探针长度。该类探针可以是两根也可以是三根或者四根，探针中3’端为检测位点，通过设定随机序列长度来区分每个检测探针的长度，同时实现不同的核酸碱基对应不同的LDR产物长度；第三种探针为通用荧光标记探针，该探针能和通用模板的3’的序列完全匹配，其5’磷酸化，3’FAM荧光标记。第四种探针为通用模板，其5’序列和通用荧光标记探针序列互补，其3’序列和标记探针序列互补。

本方法是通过引入一个通用荧光标记探针和一个通用模板，并在标记探针的3’端引入通用模板配对部分，使得四类探针在LDR过程中，一方面通过探针与PCR模板配对进行连接实现碱基的特异性检测，另一方面通过通用模板的互补配对，实现通用荧光标记探针和标记探针的连接，以实现对连接产物的标记。原理示意图见图1。

LDR反应结束后，将LDR产物放入测序仪，利用测序仪的genescan功能，通过结果中已知分子量的一系列内参，来确认不同LDR产物的长度，从而判读位点的多态性。

本发明PCR-LDR关联的单位点多态性测序检测，同时经过适当调整，也可以用于HPLC和微流芯片等高分辨率的核酸分离检测系统。

如本发明所述，“无同源性”指在聚合酶或连接酶作用的常规条件下，两段核酸序列之间连续的严谨配对碱基数小于等于10个碱基、优选小于等于9个碱基、优选小于等于8个碱基、优选小于等于7个碱基、优选小于等于6个碱基、优选小于等于5个碱基、优选小于等于4个碱基的性质。

有益效果

本发明利用通用探针完成标记探针的标记，利用通用方案，大幅降低了了应用成本；在操作过程中，没有增加特殊的标记过程，不影响操作时间；本发明和普通的PCR-LDR测序的结果完全一致，由于测序结果的直接性，解决结果的假阳性和假阴性问题，也不会产生非特异性的结果，可应用于多重PCR-LDR系统。利用测序仪的5色荧光检测系统，同时利用4种荧光，测序仪系统也可同时进行一百多个位点的检测；利用测序系统的高通量，可同时进行多样本的检测，与芯片技术相比，大大加快了检测的速度，具有良好的应用前景。

附图说明

图1原理示意图

图2为实施例1DNA多态性进行检测结果图；

图3为实施例2DNA多态性进行检测结果图；

图4为实施例3DNA多态性进行检测结果图；

图5为实施例4DNA多态性进行检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

以乙型肝炎病毒(HBV)DNA 1896位点突变举例，突变位点间隔是5个碱基。

HBV1896位点附近序列为

5’GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3’

1.引物和探针设计

(1)普通PCR引物设计

(2)通用荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG；

通用模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG通用荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)

(3)标记探针

注：*表示探针要进行5’磷酸化

(4)检测探针一

(5)检测探针二

2.PCR反应，反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl2，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)反应条件为：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒，循环30次；

3.LDR反应，反应混合液为20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)

X-100，探针各0.01μM，Tth连接酶15U，1μl PCR模板DNA；反映条件为94℃30秒，60℃2分钟，循环30次；

4上测序仪器进行检测结果见图2，图2上显示只有1896G野生型病毒株，图2下显示不仅有1896G野生型病毒株，还有1896A突变型病毒株。

实施例2

以HBV1896位点和YIDD/YMDD突变为例对单位点DNA多态性进行检测，每个突变位点间隔是5个碱基；

HBV1896突变：

5’GCTGTGCCTTGGGTGGCTTTG/AGGGCATGGACATTGACCCG3’

HBV的YIDD/YMDD突变

5’CTGTCTGGCTTTCAGTTATATG/TGATGATGTGGTATTGGGGG 3’

1.引物和探针设计

(1)普通PCR引物设计

	HBV1896引物序列(5’→3’)	长度(nt)
			上游引物	CACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGT	30
下游引物	ACACAGAATAGCTTGCCTGAGTGCTGTATG	30
				HBVYIDD/YMDD引物序列(5’→3’)	长度(nt)
上游引物	CAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCC	23
			下游引物	GG(CT)A(AT)AAAGGGACTCA(AC)GATG	23

(2)通用荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG；

通用模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

通用荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)

(3)标记探针

注：*表示探针要进行5’磷酸化

(4)检测探针一

(5)检测探针二

2.PCR反应，反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)，反应条件为：94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒，循环30次；

3.LDR反应，反应混合液为20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％0v/v)

X-100，探针各0.01μM，Tth连接酶15U，1μl PCR模板DNA；反映条件为94℃30秒，60℃2分钟，循环30次；

4上测序仪器进行检测结果见图3，图3最上方表示检测结果为是1896混合型(既有野生型又有突变型)，YMDD野生型，中间为1896野生型和YMDD野生型，最下是1896野生型，YMDD/YIDD混合型。

实施例3

同时对5个SNP位点(rs4652678、rs199930、rs7043268、rs6424820和rs4133072)进行SNP分型，每个SNP突变位点间隔是5个碱基。

1引物探针设计

(1)普通PCR引物设计

(2)通用荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG；

通用模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

通用荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)

(3)标记探针

注：*表示探针要进行5’磷酸化

(4)检测探针一

(5)检测探针二

2.PCR反应，反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)，反应条件为：94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，循环30次；

3.LDR反应，反应混合液为20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)

X-100，探针各0.01μM，Tth连接酶15U，1μl PCR模板DNA；反映条件为94℃30秒，60℃2分钟，循环30次；

4上测序仪器进行检测结果见图4

结果

	rs4652678(C/T)	rs199930(C/T)	rs7043268(G/A)	rs6424820(C/G)	rs4133072(A/G)
						上	C/T	C	G/A	C/G	A
中	C	C	A	G	A
						下	C/T	C	G	C	A

实施例4

同时对6个SNP位点(rs348475、rs499776、rs4646642、rs2161811、rs561712和rs4646580)进行SNP分型，每个SNP突变位点间隔调整为3个碱基。

1引物探针设计

(1)普通PCR引物设计

(2)通用荧光标记探针：GCATCACTCAGAGGG；

通用模板：CCCTCTGAGTGATGCGAGTACAGGTTTGCG

通用荧光标记探针要进行5’磷酸化和3’探针标记(本例用FAM)

(3)标记探针

注：*表示探针要进行5’磷酸化。

(4)检测探针一

(5)检测探针二

2.PCR反应，反应混合液为200μM dATP，200μM dTTP，200μM dCTP，200μM dGTP，2mM MgCl₂，2U Taq DNA聚合酶，各1μM的上下游引物，1μl基因组模板(浓度大于5ng/μl)，反应条件为：94℃30秒，62℃30秒，72℃45秒，循环30次；

3.LDR反应，反应混合液为20mM Tris-HCl，pH 8.3(at 25℃)，50mM KCl，10mM MgCl₂，1mM EDTA，1mM NAD+，10mM DTT，0.1％(v/v)

X-100，探针各0.01μM，Tth连接酶15U，1μl PCR模板DNA；反映条件为94℃30秒，60℃2分钟，循环30次；

4上测序仪器进行检测结果见图5

Claims (10)

1.一组用于基因多态性测序的核酸序列包括：

a)至少一条LDR标记探针，包括三部分，第一部分位于5’端且和待测模板严谨配对，第二部分位于3’端且和通用模板5’序列严谨配对，第三部分位于上述两部分序列中间，是一段用于调整探针长度的、和待测模板或通用模板或其他探针序列均无同源性的随机序列，该探针的5’磷酸化；

b)2到4条LDR检测探针，每条包括两部分，一部分位于3’端且和待测模板严谨配对，另一部分位于5’端是一段用于调整探针长度的、和待测模板或通用模板或其他探针序列均无同源性的随机序列，且该2到4条检测探针通过设计长度不同的随机序列使检测位点上不同的2到4种碱基对应不同的LDR产物长度；

c)至少一条通用荧光标记探针，该探针的5’端磷酸化，3’端用荧光标记并且和通用模板d)的5’端序列严谨配对；

d)至少一条通用模板，其5’端序列和所述通用荧光标记探针c)严谨配对，其3’端序列和所述LDR标记探针a)严谨配对。

2.根据权利要求1所述的一组用于基因多态性测序的核酸序列，其特征在于，所述的待测模板为待测序的多态性序列经PCR扩增后的产物。

3.根据权利要求1所述的一组用于基因多态性测序的核酸序列，其特征在于，所述的LDR标记探针a)和LDR检测探针b)与待测模板严谨配对部分的长度范围均为10-25个核苷酸。

4.根据权利要求1-3所述的一组用于基因多态性测序的核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列a)-d)中的只是一种为DNA。

5.根据权利要求4所述的一组用于基因多态性测序的核酸序列，其特征在于，所述的核酸序列a)-d)均为DNA。

6.一种基因多态性测序方法，包括如下步骤：

(1)提供权利要求1所述的一组核酸序列；

(2)LDR反应，获得荧光标记的2到4条长度不同的LDR产物，对应检测位点上2到4种不同的碱基；

(3)通过荧光标记检测长度不同的LDR产物。

7.根据权利要求6所述的基因多态性测序方法，其特征在于，在所述的LDR反应之前有一个PCR反应以扩增待测序的多态性序列，且PCR引物与所述的核酸序列a)-d)均无同源性。

8.一种基因多态性测序试剂盒，包括含权利要求1所述的一组核酸序的LDR反应试剂。

9.一种基因多态性测序试剂盒，包括PCR反应试剂、和含权利要求1所述的一组核酸序的LDR反应试剂。

10.一种基因多态性测序试剂盒，包括核酸提取试剂、PCR反应试剂、和含权利要求1所述的一组核酸序的LDR反应试剂。

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