CN111424105A - 一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR分子标记和方法 - Google Patents

一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR分子标记和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴定水稻香味等位基因Badh2‑E7的PCR/LDR分子标记和方法，属于水稻育种技术领域。本发明所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，PCR引物对正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。LDR探针包括一条荧光标记探针Probe‑FAM，序列如SEQ ID NO.3所示，一条非Badh2‑E7等位基因特异探针Probe‑non，序列如SEQ ID NO.4所示，一条Badh2‑E7等位基因特异探针Probe‑E7，序列如SEQ ID NO.5所示。本发明方法不仅能准确快速的鉴定水稻品种或育种群体中各个株系中是否携带Badh2‑E7等位基因，而且能实现较多样品的高通量检测。

Description

一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR分子标记和 方法
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR的分子标记和方法。
背景技术
水稻是我国最主要的粮食作物，随着生活水平的提高，人们对大米品质的要求也越来越高。香米由于具有特殊的香味，受到了市场的青睐。近年来关于香米形成的分子机理的研究取得了很多进展。研究发现，水稻甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehydedehydrogenase,BADH2)基因和香米的形成相关。当BADH2基因发生突变时，其编码的水稻甜菜碱醛脱氢酶活性丧失，导致2-乙酰-1-卜吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline,2AP)这一挥发性香味物质在稻米中累积。BADH2基因位于8号染色体，具有15个外显子和14个内含子(图1)。到目前为止已经有18个BADH2基因的突变等位基因被报道。这些基因资源是育种家进行香米水稻新品种选育的重要材料。
badh2-E7是水稻中发现的第一个BADH2基因的突变等位基因。badh2-E7在第7外显子发生了8bp的缺失，导致其编码的蛋白质提前终止(图1)。badh2-E7是目前香米水稻品种选育用比较常用的一个BADH2的等位基因(Bradbury LMT,et al.,The gene forfragrance in rice,Plant Biotechnol.Journal,2005,3(3):363-370)。
由于badh2-E7的序列和BADH2基因相比有8个碱基的缺失，在以往的标记辅助育种工作中主要根据这个缺失位点设计的Indel标记来进行。然而Indel标记在PCR后，需要进行聚丙烯电泳的方法来检测PCR产物，比较费时费力。本发明利用PCR/LDR技术，开发了用于鉴定水稻香味等位基因badh2-E7的分子标记方法，可用于快速的鉴定水稻种质资源和育种群体中的不同株系是否携带香味等位基因badh2-E7，相对于传统的分子标记方法具有经济、高效和高准确率的优势。
发明内容
本发明的技术问题：水稻香味等位基因badh2-E7的第7个外显子有8个碱基的缺失。基于此，本发明针对传统基于PCR、电泳技术的分子标记技术的检测过程相对繁琐，不利于进行较多样品时的高通量分析等缺点，设计了一种基于PCR/LDR技术的分子标记，用于快速、准确的鉴定水稻香味等位基因badh2-E7，为筛选鉴定携带有badh2-E7香味等位基因的水稻种质资源和香米水稻品种的标记辅助选择育种提供参考。
本发明的第一个目的是提供一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTCTGTTAGGTTGCATTTAC-3’；
反向引物序列：5’-AAAATATCCACAGAAATTTGG-3’；
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non，和一条Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TACCAGTTTCATAACTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCAGCTGAAGCCATAATCTTTT-3’；
所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATAGGAGCAGCTGAAATATA-3’。
进一步地，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段19个碱基与模板配对的序列和25个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
进一步地，所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non由22个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的与模板配对的序列组成；所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7由24个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的与模板配对的序列组成。
本发明第二个目的在于提供上述分子标记在水稻育种过程对香味等位基因Badh2-E7的鉴定中的应用。
本发明第三个目的是提供一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)水稻植株基因组DNA的提取；
(2)用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTCTGTTAGGTTGCATTTAC-3’；
反向引物序列：5’-AAAATATCCACAGAAATTTGG-3’；
(3)以PCR扩增产物为模板，用LDR探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non，和一条Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TACCAGTTTCATAACTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCAGCTGAAGCCATAATCTTTT-3’；
所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATAGGAGCAGCTGAAATATA-3’；
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
本发明提供的鉴定水稻香味等位基因badh2-E7的分子标记方法具体包括以下步骤：
(1)水稻植株叶片基因组DNA的提取：取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl 1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05M NaCl，PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA，放-20℃冰箱备用。
(2)PCR扩增体系：25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mM Tris-HCl(pH＝8.8),1.5mM MgCl2,50mM KCl,0.8％(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM，以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
(3)LDR反应体系：10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5)；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM NAD+；3条LDR探针各LDR 0.2pmol；2U的Taq DNA连接酶；4μl的PCR产物。LDR反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。反应结束后的LDR产物用ABI 3730DNA测序仪分析，根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品是否携带香味等位基因badh2-E7。若FAM荧光峰值在89个碱基的位置，则对应样品不含有香味等位基因badh2-E7。若FAM荧光峰值在91个碱基的位置；则对应样品含有香味等位基因badh2-E7；若存在89和91两个峰，则对应样品为杂合型。
本发明与现有技术相比，其有效效果为：本发明提供的一种鉴定水稻香味等位基因badh2-E7的分子标记方法，采用PCR关联LDR方法(聚合链式酶反应关联连接酶检测反应)进行检测，本发明提供的方法能够方便的鉴定出水稻香味等位基因badh2-E7，得到的结果具有可靠、稳定、操作简便、快速的特点，适用于较多样品的高通量检测，在水稻种质资源香味等位基因badh2-E7鉴定和耐高温水稻新品种的分子辅助育种中有较大的应用价值。
附图说明
图1为水稻香味等位基因badh2-E7和BADH2基因序列的比较。
图2为实施例1的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
1、水稻材料
申繁24是三系杂交粳稻恢复系品种，不含有香味等位基因badh2-E7，南粳9108是由江苏省农科院育成的常规粳稻品种，携带有香味等位基因badh2-E7，所使用的F1来源于申繁24与南粳9108的杂交。
2、水稻基因组DNA提取：
申繁24、南粳9108及其杂交F1代水稻植株各取50mg左右叶片，用剪刀剪碎，放入2ml离心管，加入600μl1.5×CTAB溶液(1.5％CTAB，75mM Tris-HCl，15mM EDTA，1.05MNaCl，PH8.0)和一粒直径5mm的钢珠，在快速研磨仪上70Hz的频率震荡研磨90s；研磨后的样品在56℃水浴锅中温浴20min，加入450μl氯仿，剧烈震荡后，12000转/min离心10min；取450μl上清液到另一个1.5ml的离心管中，加入900μl的无水乙醇，混匀后在-20℃冰箱放置10min，12000转/min离心10min，弃上清，晾干后加入200μl的双蒸水溶解DNA，放-20℃冰箱备用。
3、PCR扩增：
PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTCTGTTAGGTTGCATTTAC-3’；
反向引物序列：5’-AAAATATCCACAGAAATTTGG-3’。
申繁24、南粳9108及其杂交F1代水稻基因组DNA，进行PCR扩增，所用PCR正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。PCR扩增体系：25μl的PCR反应体系包括50ng水稻基因组DNA，正向引物和反向引物各0.5pmol，10mM Tris-HCl(pH＝8.8),1.5mMMgCl2,50mM KCl,0.8％(v/v)NP-40,dATP、dGTP、dCTP和dTTP 200μM，以及5U of Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为：95℃预变性2分钟；然后40个循环的94℃变性30秒，56℃退火90秒，72℃延伸60秒；最后72℃延伸10分钟。
4、对PCR扩增产物进行LDR反应：
LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non，和一条Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TACCAGTTTCATAACTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCAGCTGAAGCCATAATCTTTT-3’；
所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATAGGAGCAGCTGAAATATA-3’。
LDR反应体系：10μl的LDR反应体系包括50mM Tris-HCl(pH 7.5)；10mM MgCl2；10mM DTT；1mM NAD+；3条LDR探针各LDR 0.2pmol；2U的Taq DNA连接酶；4μl的PCR产物。LDR反应程序：95℃变性2分钟；40个循环94℃变性15秒50℃退火链接25秒。
LDR反应产物的检测：
反应结束后的LDR产物用ABI 3730DNA测序仪分析，根据FAM荧光峰值的位置确定检测样品是否携带香味等位基因badh2-E7。若FAM荧光峰值在89个碱基的位置，则对应样品不含香味等位基因badh2-E7。若FAM荧光峰值在91个碱基的位置，则对应样品含有香味等位基因badh2-E7；若存在89和91两个峰，则对应样品为BADH2/Badh2-E7杂合基因型。申繁24、南粳9108及其杂交F1三个样品的检测结果见图2。
实施例2
实施例2中所用水稻样品为申繁24、南粳9108杂交F2代群体的66个株系，其他检测的步骤和方法与实施例1相同。
检测结果发现，在66个F2代株系中，有12个株系携带纯合的香味等位基因badh2-E7，35个株系为杂合株系，19个株系不含有badh2-E7香味等位基因。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，同样落于本发明所要求的保护范围之内。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR分子标记和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttctgttagg ttgcatttac 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaatatcca cagaaatttg g 21
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taccagtttc ataactccct tttttttttt tttttttttt tttt 44
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttttttttt tttttttttt ttagcagctg aagccataat ctttt 45
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttttt tttttttttt ttttaccata ggagcagctg aaatata 47

Claims (7)

1.一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的PCR/LDR分子标记，其特征在于，所述分子标记包括一对PCR引物和三条LDR探针，其中，所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTCTGTTAGGTTGCATTTAC-3’；
反向引物序列：5’-AAAATATCCACAGAAATTTGG-3’；
所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non，和一条Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TACCAGTTTCATAACTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCAGCTGAAGCCATAATCTTTT-3’；
所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATAGGAGCAGCTGAAATATA-3’。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段19个碱基与模板配对的序列和25个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non由22个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的与模板配对的序列组成；所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7由24个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的与模板配对的序列组成。
4.权利要求1-3中任一项所述分子标记在水稻育种过程对香味等位基因Badh2-E7的鉴定中的应用。
5.一种鉴定水稻香味等位基因Badh2-E7的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)水稻植株基因组DNA的提取；
(2)用PCR引物对水稻植株基因组DNA进行PCR扩增；所述PCR引物序列为：
正向引物序列：5’-TTCTGTTAGGTTGCATTTAC-3’；
反向引物序列：5’-AAAATATCCACAGAAATTTGG-3’；
(3)以PCR扩增产物为模板，用LDR探针进行LDR反应；所述LDR探针包括一条荧光标记探针Probe-FAM，一条非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non，和一条Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7；
所述荧光标记探针Probe-FAM序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-P-TACCAGTTTCATAACTCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM-3’；
所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non序列如SEQ ID NO.4所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGCAGCTGAAGCCATAATCTTTT-3’；
所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7序列如SEQ ID NO.5所示：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATAGGAGCAGCTGAAATATA-3’；
(4)LDR反应产物用ABI3730测序仪对LDR反应产物测序，根据LDR产物的大小确定检测水稻样品的基因型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述荧光标记探针Probe-FAM由一段19个碱基与模板配对的序列和25个碱基的寡聚核苷酸T组成，寡聚核苷酸T的长度可以调节，根据需要可通过调节寡聚核苷酸T的长短来调节LDR产物长度；所述荧光标记探针在3’端进行FAM荧光基团标记，5’进行磷酸化标记。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述非Badh2-E7等位基因特异探针Probe-non由22个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的与模板配对的序列组成；所述Badh2-E7等位基因特异探针Probe-E7由24个碱基的寡聚核苷酸T和23个碱基的与模板配对的序列组成。
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