CN117646080B - 一种基于双探针实时荧光定量pcr技术的肺炎支原体快速检测方法和试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双探针实时荧光定量PCR技术的肺炎支原体快速检测方法和试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒中包含一组检测肺炎支原体的引物探针组，可在1个小时内完成肺炎支原体的核酸检测，具有检测速度快、通量高的优点。该试剂盒中还包含一组内对照引物探针组，该内对照引物探针组可以同时监控核酸提取和扩增效果，有助于发现和避免采样不合格导致的假阴性结果。本发明提供的检测方法和试剂盒灵敏度高、准确度高、重复性好，具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及肺炎支原体的检测技术领域，具体地，涉及一种基于双探针实时荧光定量PCR技术的肺炎支原体快速检测方法和试剂盒及应用。
背景技术
支原体感染可导致儿童上呼吸道和下呼吸道感染，一些病例还可能发展成为严重的支原体肺炎，对支原体感染的早期精准诊断对尽早启动合理的抗生素治疗具有重要意义。目前临床上用于肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，MP）核酸检测的技术主要包括荧光PCR技术、等温扩增技术、PCR毛细管电泳技术以及微流控芯片技术等，其中比较常用的是荧光定量PCR技术。然而，目前使用荧光定量PCR技术检测肺炎支原体核酸时存在的主要问题是灵敏度不足，造成一些病例的漏检。因此，迫切需要开发新的更加灵敏的肺炎支原体核酸检测荧光PCR方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术中存在的上述缺陷与不足，提供一种基于双探针实时荧光定量PCR技术的肺炎支原体快速检测方法和试剂盒及应用。
本发明的第一个目的是提供一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的引物探针组。
本发明的第二个目的是提供一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的组合物。
本发明的第三个目的是提供一种上述的引物探针组和/或组合物在制备用于检测肺炎支原体的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种用于检测肺炎支原体的试剂盒。
本发明的第五个目的是提供一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的反应体系。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明针对肺炎支原体基因（CP039789.1）的保守序列（核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示）设计基于双探针实时荧光定量PCR技术的肺炎支原体检测引物和探针，并建立了检测方法：提取待测样本DNA后，利用本发明的检测引物和探针进行双探针实时荧光定量PCR扩增，并根据荧光PCR仪显示的Ct值判断结果：
①MP检测通道（FAM通道）Ct值≤40，RNP检测通道（Cy5通道）Ct值≤45，判为MP-DNA阳性；
②MP检测通道（FAM通道）Ct值>40，RNP检测通道（Cy5通道）Ct值≤45，复查，复查后Ct值≤40，判为MP-DNA阳性；
③MP检测通道（FAM通道）Ct值>45，RNP检测通道（Cy5通道）Ct值≤45，判为MP-DNA阴性；
④RNP检测通道（Cy5通道）Ct值>45，建议重新提取核酸或重新采样复查。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的引物探针组，所述引物探针组由正向引物F1、反向引物R1、荧光探针P1、正向引物F2、反向引物R2和荧光探针P2组成；
所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，荧光探针P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，荧光探针P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述荧光探针P1和荧光探针P2的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
更优选地，所述荧光探针P1的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；
所述荧光探针P2的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1。
一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的组合物，所述组合物包含任一上述的引物探针组。
优选地，所述组合物还含有内对照引物探针组，所述内对照引物探针组由正向引物F、反向引物R和荧光探针P组成；
所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQID NO:8所示，荧光探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
优选地，所述荧光探针P的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
更优选地，所述荧光探针P的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。
任一上述的引物探针组和/或组合物在制备用于检测肺炎支原体的产品中的应用。
一种用于检测肺炎支原体的试剂盒，所述试剂盒包含任一上述的引物探针组。
优选地，所述试剂盒还含有内对照引物探针组，所述内对照引物探针组由正向引物F、反向引物R和荧光探针P组成；
所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQID NO:8所示，荧光探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
更优选地，所述荧光探针P的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
更优选地，所述荧光探针P的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。
更优选地，所述试剂盒还包含2×Taq酶预混液、阳性对照参考品、阴性对照参考品、无RNA酶和DNA酶的超纯水中的一种或几种。
一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的反应体系，所述反应体系包含任一上述的引物探针组。
优选地，所述反应体系还含有内对照引物探针组，所述内对照引物探针组由正向引物F、反向引物R和荧光探针P组成；
所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQID NO:8所示，荧光探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
更优选地，所述荧光探针P的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
更优选地，所述荧光探针P的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。
优选地，在反应体系中，上述的引物探针组中正向引物F1、反向引物R1、正向引物F2、反向引物R2的终浓度均为155～165 nM；
上述的引物探针组中荧光探针P1和荧光探针P2的终浓度均为115～125 nM；
上述的内对照引物探针组中正向引物F、反向引物R、荧光探针P的终浓度分别为155～165 nM、155～165 nM、115～125 nM。
更优选地，在反应体系中，上述的引物探针组中正向引物F1、反向引物R1、正向引物F2、反向引物R2的终浓度均为160 nM；
上述的引物探针组中荧光探针P1和荧光探针P2的终浓度均为120 nM；
上述的内对照引物探针组中正向引物F、反向引物R、荧光探针P的终浓度分别为160 nM、160 nM、120 nM。
更优选地，所述反应体系中还包含2×Taq酶预混液、无RNA酶和DNA酶的超纯水。
优选地，所述反应体系的反应条件为95℃ 5min；95℃ 15s、60℃ 30s，45个循环，在每个循环的60℃阶段同时检测荧光信号。
更优选地，在每个循环的60℃阶段同时检测FAM和Cy5两个通道的荧光信号。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了一种基于双探针实时荧光定量PCR技术的肺炎支原体快速检测方法和试剂盒及应用。本发明提供的试剂盒中包含一组检测肺炎支原体的引物探针组，可在1个小时内完成肺炎支原体的核酸检测，具有检测速度快、通量高的优点。该试剂盒中还包含一组内对照引物探针组，该内对照引物探针组可以同时监控核酸提取和扩增效果，有助于发现和避免采样不合格导致的假阴性结果。本发明提供的检测方法和试剂盒灵敏度高、准确度高、重复性好，具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为基于双探针实时荧光定量PCR方法检测肺炎支原体的原理示意图。
图2为MP-DNA阳性样本的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图。
图3为MP-DNA阴性样本的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图。
图4为采用实施例2的试剂盒检测浓度为500 copies/μL的MP DNA阳性参考品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图5为采用实施例2的试剂盒检测浓度为50 copies/μL的MP DNA阳性参考品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图6为采用实施例2的试剂盒检测浓度为5.0 copies/μL的MP DNA阳性参考品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图7为采用实施例2的试剂盒检测浓度为1.0 copies/μL的MP DNA阳性参考品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图8为采用实施例2的试剂盒检测浓度为0.5 copies/μL的MP DNA阳性参考品的实时荧光定量PCR扩增曲线。
图9为采用实施例2的试剂盒检测特异性测试样本的实时荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的方法
一、设计引物
针对肺炎支原体基因（CP039789.1）的保守序列（核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示），设计了两条探针及其相对应的上下游引物（设计方案详见图1），其核苷酸序列如SEQID NO:1～6所示。同时针对人核糖核酸酶P（human ribonuclease P，RNP）基因的序列（AK312900.1），设计一对引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7～9所示。将人RNP基因作为检测内对照，可以监测采样和核酸提取的效果。
引物和探针均由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物和探针序列详见表1，其中荧光探针P1的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；荧光探针P2的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；荧光探针P的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。
表1 引物和探针序列
二、DNA样本提取
取200 μL鼻咽拭子样本，使用达安基因全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂提取核酸。具体步骤按试剂说明书。
三、进行双探针实时荧光定量PCR反应
配制双探针实时荧光定量PCR反应体系，详见表2。
表2 反应体系
使用ABI QsDx荧光定量PCR仪（Life technologies公司）进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；95℃ 15s、60℃ 30s，45个循环，并在每个循环的60℃阶段同时检测FAM和Cy5两个通道荧光信号。
三、结果判读
根据荧光定量PCR仪显示的Ct值判断结果：
①MP检测通道（FAM通道）Ct值≤40，RNP检测通道（Cy5通道）Ct值≤45，判为MP-DNA阳性（如图2所示）；
②MP检测通道（FAM通道）Ct值>40，RNP检测通道（Cy5通道）Ct值≤45，复查，复查后Ct值≤40，判为MP-DNA阳性；
③MP检测通道（FAM通道）Ct值>45，RNP检测通道（Cy5通道）Ct值≤45，判为MP-DNA阴性（如图3所示）；
④RNP检测通道（Cy5通道）Ct值>45，建议重新提取核酸或重新采样复查。
实施例2 一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的试剂盒
一、组成
①检测肺炎支原体的引物探针组（SEQ ID NO:1～9）：
正向引物F1（MP-F1）：AGACCGGGTTTGATGTGGAT（SEQ ID NO:1）；
反向引物R1（MP-R1）：TGTCGGAGTCAGCTTCCTTT（SEQ ID NO:2）；
荧光探针P1（MP-P1）：AACTCTGAAAACACCAAGCAGGGCT（SEQ ID NO:3）；荧光探针P1的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；
正向引物F2（MP-F2）：CTGATTCTGTACGATGCGCC（SEQ ID NO:4）；
反向引物R2（MP-R2）：AGTGATCAACGCGGTCAATG（SEQ ID NO:5）；
荧光探针P2（MP-P2）：TTATGCGCGCAACCGTACCGC（SEQ ID NO:6）；荧光探针P2的5'端标记FAM，3'端标记BHQ1；
正向引物F（RNP-F）：CGGTGTTTGCAGATTTGGACC（SEQ ID NO:7）；
反向引物R（RNP-R）：CAAGGTGAGCGGCTGTCTC（SEQ ID NO:8）；
荧光探针P（RNP-P）：TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGGAC（SEQ ID NO:9）；荧光探针P的5'端标记Cy5，3'端标记BHQ2。
②2×Taq酶预混液、阳性对照参考品、阴性对照参考品、无RNA酶和DNA酶的超纯水。
二、使用方法
依照实施例1的检测方法进行检测和结果判读。
实施例3 灵敏度实验
一、实验方法
将MP DNA阳性参考品定量到570 copies/μL，用无RNA酶和DNA酶的超纯水将其稀释至500 copies/μL、50 copies/μL、5 copies/μL、1 copies/μL，0.5 copies/μL后作为DNA模板，采用实施例2的试剂盒进行灵敏度检测。
二、实验结果
浓度为500 copies/μL、50 copies/μL、5 copies/μL、1 copies/μL，0.5 copies/μL的MP DNA阳性参考品的扩增曲线分别如图4、图5、图6、图7和图8所示。结果表明实施例2的试剂盒检测MP DNA的检测限（LOD）为0.5 copies/μL，具有高灵敏度特性，优于目前市场上试剂盒的灵敏度。
实施例4 特异性实验
一、实验方法
取临床分离的金黄色葡萄球菌菌液、铜绿假单胞菌菌液、大肠埃希氏菌菌液、鲍曼不动杆菌菌液、结核分枝杆菌阳性痰液以及广州邦德盛生物公司生产的含人冠状病毒OC43RNA假病毒阳性样本、含人冠状病毒HKU1 RNA假病毒阳性样本、含人冠状病毒229E RNA假病毒阳性样本、含人冠状病毒NL63 RNA假病毒阳性样本、含新型冠状病毒SARS RNA假病毒阳性样本、含中东呼吸综合征症状病毒MERS RNA假病毒阳性样本、甲型流感病毒阳性质控品、乙型流感病毒阳性质控品、呼吸道合胞病毒阳性质控品、新型冠状病毒阳性质控品各200 μl，作为特异性测试样本。
使用达安基因全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂提取测试样本的核酸作为DNA模板，具体步骤按试剂说明书。
采用实施例2的试剂盒进行特异性检测。
二、实验结果
不同测试样本的扩增曲线如图9所示。结果表明上述测试样本均未出现扩增曲线，表明实施例2的试剂盒的特异性较强。
实施例5 本发明的试剂盒与其他试剂盒的性能比较
一、实验方法
对临床采集的218例患者的鼻咽拭子样本，使用达安基因全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂提取核酸作为DNA模板，具体步骤按试剂说明书。
分别用实施例2的试剂盒及达安基因肺炎支原体核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）进行检测。
二、实验结果
218例患者鼻咽拭子样本中，实施例2的试剂盒检出121例为MP DNA阳性，而达安基因肺炎支原体核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）检出104例为MP DNA阳性，实施例2的试剂盒比达安基因肺炎支原体核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）检出MP DNA多17例。通过Ct值分析发现这17例样本的Ct值较大，由此说明这17例样本的MP DNA浓度较低，表明实施例2的试剂盒比达安基因肺炎支原体核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法）在检测灵敏度上具有优势。
对比例1 单探针对实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的影响
一、实验方法
1. 临床采集7例患者的鼻咽拭子样本，使用达安基因全自动核酸提取仪及配套核酸提取试剂提取核酸作为DNA模板，具体步骤按试剂说明书。双探针实时荧光定量PCR法依照实施例1的检测方法进行检测。
2. 单探针实时荧光定量PCR法：
配制单探针实时荧光定量PCR反应体系，详见表3。分别使用引物探针组A和引物探针组B进行检测：
引物探针组A：正向引物F1（MP-F1）（SEQ ID NO:1）、反向引物R1（MP-R1）（SEQ IDNO:2）和荧光探针P1（MP-P1）（SEQ ID NO:3）、正向引物F（RNP-F）（SEQ ID NO:7）、反向引物R（RNP-R）（SEQ ID NO:8）、荧光探针P（RNP-P）（SEQ ID NO:9）。
引物探针组B：正向引物F2（MP-F2）（SEQ ID NO:4）、反向引物R2（MP-R2）（SEQ IDNO:5）和荧光探针P2（MP-P2）（SEQ ID NO:6）、正向引物F（RNP-F）（SEQ ID NO:7）、反向引物R（RNP-R）（SEQ ID NO:8）、荧光探针P（RNP-P）（SEQ ID NO:9）。
表3 单探针实时荧光定量PCR反应体系
使用ABI QsDx荧光定量PCR仪（Life technologies公司）进行PCR扩增。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；95℃ 15s、60℃ 30s，45个循环。
二、实验结果
结果如表4所示。从表4可以看出，单探针模式下，引物探针组A检测7个标本的Ct值均大于引物探针组B和实施例1相应的Ct值，而且引物探针组B检测7个标本的Ct值均大于实施例1相应的Ct值，Ct值越大，表明需要更多的扩增循环才能检出有效荧光信号。因此，相比较而言，实施例1所使用的双探针模式是最佳的。
表4 不同MP引物和探针的Ct值比较
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的组合物，其特征在于，所述组合物包含基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的引物探针组；
所述引物探针组由正向引物F1、反向引物R1、荧光探针P1、正向引物F2、反向引物R2和荧光探针P2组成；
所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物R1的核苷酸序列如SEQID NO:2所示，荧光探针P1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，反向引物R2的核苷酸序列如SEQID NO:5所示，荧光探针P2的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有内对照引物探针组，所述内对照引物探针组由正向引物F、反向引物R和荧光探针P组成；
所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ IDNO:8所示，荧光探针P的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述荧光探针P1、荧光探针P2和荧光探针P的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。
4.权利要求1～3任一所述的组合物在制备用于检测肺炎支原体的产品中的应用。
5.一种基于双探针实时荧光定量PCR技术检测肺炎支原体的反应体系，其特征在于，所述反应体系包含权利要求1～3任一所述的组合物。
6.一种用于检测肺炎支原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求5所述的反应体系。
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