BR102014024784A2 - método de transformação de soja - Google Patents

Abstract

método de transformação de soja. a presente descrição refere-se, em parte, a um método para identificação de um transformante de linhagem germinativa de soja a partir de uma população de transformantes de soja através de incorporação de um agente de seleção no meio de enraizamento usado em cultura tecidual durante o processo de transformação de soja. os transformantes de linhagem germinativa de soja são selecionados a partir de uma população de transformantes de soja os quais são compreendidos de uma combinação de transformantes de linhagem germinativa de soja e que não são de linhagem germinativa. os transformantes que não são de linhagem germinativa de soja são identificados e eliminados mais cedo no processo de transformação. os transformantes de linhagem germinativa de soja são identificados e selecionados para cultura em plantas de soja maduras. o método é facilmente aplicável ao rastreio e obtenção um transformante de linhagem germinativa de soja em um estágio inicial do processo de transformação de soja.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente Pedido reivindica prioridade sob 35 USC § 119 (e) do Pedido Provisório dos Estados Unidos N°61/8 86.945, depositado em 04 de Outubro de 2013, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE

[002] É incorporada por referência na íntegra uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos enviada concorrentemente com este e identificada como segue: um arquivo ACM de 8 KB (texto) com o nome "23157_ST25" criado em 30 de Setembro de 2014. CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente descrição refere-se a um método para transformação de células de soja. Em vários aspectos, transformantes de soja de linhagem germinativa são produzidos e identificados a partir de uma população de transformantes de soja compreendendo transformantes de linhagem germinativa e transformantes que não são de linhagem germinativa. Consequentemente, os transformantes de soja que não são de linhagem germinativa podem ser identificados e eliminados antecipadamente no processo de transformação. Os transformantes de soja de linhagem germinativa são detectados através da identificação de rebentos de soja transformados que produzem raízes viáveis e, então, podem ser selecionados para cultura em plantas de soja maduras. Em várias modalidades, o método é facilmente aplicável ao rastreio e obtenção de um transformante de soja de linhagem germinativa em um estágio antecipado no processo de transformação. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Ao longo dos últimos trinta anos, aprimoramentos em me- todologias de transformação resultaram em aumento da eficiência de transformação de soja. Como um resultado, traços agronomicamente valiosos podem ser rotineiramente incorporadas no genoma de soja. Por exemplo, novos produtos de soja transgênica, tal como a soja En-list™, estão comercialmente disponíveis em todo o mundo e oferecem soluções aprimoradas para os desafios cada vez maiores causados por ervas daninhas. Tais produtos inovadores não seriam possíveis, a não ser pelo desenvolvimento e aprimoramento de metodologias de transformação de soja. Metodologias novas e aprimoradas de transformação de soja que podem ser utilizadas para detectar e selecionar transformantes de soja de linhagem germinativa em estágios antecipados no processo de transformação da soja são importantes para continuar a aprimorar a eficiência do processo de transformação de soja.

[005] A identificação e seleção antecipadas de transformantes de soja de linhagem germinativa em um processo de transformação é altamente desejável porque esses transformantes de soja de linhagem germinativa compreendem um transgene integrado de forma estável o qual é herdado pelas gerações subsequentes. No entanto, em virtude das deficiências relativas ao processo de transformação, um grande número de transformantes devem ser produzidos de modo a identificar e selecionar transformantes de soja de linhagem germinativa desejáveis dos transformantes de soja que não são de linhagem germinativa indesejáveis. Em média, cerca de 40 a 70 por cento de todos os transformantes isolados são transformantes de soja que não são de linhagem germinativa indesejáveis, tais como transformantes de soja que não são de linhagem germinativa ou quiméricos, que têm de ser "abatidos" (ou seja, descartados) a favor dos transformantes de soja de linhagem germinativa desejáveis. No entanto, usando métodos tradicionais, o processo de abate ocorre apenas após os transformantes se- rem mantidos durante todo o processo de transformação e avançaram até a maturidade. Usando métodos tradicionais, a manutenção de transformantes indesejáveis, tais como transformantes de soja que não são de linhagem germinativa, resulta em uso ineficiente de recursos e um aumento indesejável dos custos despendidos para produzir plantas transgênicas a partir de transformantes que não são de linhagem germinativa. Tais custos excedem as preocupações pecuniárias e incluem o uso do tempo dos cientistas, materiais e espaço de laboratório. A presente descrição fornece métodos que exibem propriedades desejáveis e confere vantagens relacionadas para identificação e seleção transformantes de soja de linhagem germinativa. A presente descrição demonstra que a identificação e seleção de transformantes de soja de linhagem germinativa nos estágios iniciais da transformação de plantas podem ser realizadas usando um meio de enraizamento seletivo contendo um agente de seleção. Através de uso do meio de enraizamento seletivo, transformantes de soja que não são de linhagem germinativa ou quiméricos indesejáveis podem ser abatidos sem o requisito de manutenção durante o processo de transformação e sem avançar até a maturidade. Como um resultado, a produção de plantas transgênicas pode ser mais eficiente e um aprimoramento em alocação de recursos para produzir plantas transgênicas pode ser obtido.

[006] Os exemplos precedentes da técnica relacionada e limitações associadas à mesma se destinam a ser ilustrativos e não exclusivos. Outras limitações da técnica relacionada serão evidentes para aqueles versados na técnica quando de leitura do relatório descritivo. BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] É descrito aqui um método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa. Como uma modalidade, uma população de células de uma planta de soja é transformada com um transgene. Em uma modalidade subsequente, a população de células transformadas é regenerada em rebentos. Em uma outra modalidade, rebentos são produzidos a partir da população de células e isolados. Em uma modalidade, os rebentos são contatados com um meio de enraizamento seletivo, em que o meio de enraizamento seletivo contém glufosinato. Em ainda outra modalidade, os rebentos regenerados isolados são cultivados na presença de glufosinato, em que os rebentos regenerados isolados produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis na presença de glufosinato e os rebentos isolados produzidos pelas células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raízes viáveis na presença de glufosinato. Em uma modalidade subsequente, os rebentos criados a partir dos transformantes de soja de linhagem germinativa são identificados ao detectar se os rebentos criam ou não raízes viáveis.

[008] Em outro aspecto, é aqui descrito um método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa. Em uma modalidade, uma população de células de uma planta de soja é transformada com um transgene, em que a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células que não são de linhagem germinativa transformadas. Em uma outra modalidade, rebentos são regenerados a partir da população de células transformadas. Em ainda outra modalidade, rebentos produzidos pela população de células transformadas são isolados. Em uma modalidade subsequente, os rebentos regenerados isolados são submetidos a um meio de enraizamento seletivo, em que os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis e os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raí- zes viáveis. Em uma outra modalidade, os rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa são identificados ao detectar se os rebentos criam ou não raízes viáveis.

[009] Em um aspecto adicional, é descrito aqui um método de identificação de um transformante de soja de linhagem germinativa. Em uma modalidade, uma população de células de uma planta de soja é transformada com um transgene. Em uma modalidade subsequente, rebentos são regenerados a partir da população de células transformadas de uma planta de soja que compreende o transgene. Em uma outra modalidade, o rebento regenerado é isolado da população de células transformadas de uma planta de soja, em que a população de células transformadas de uma planta de soja compreende o transgene. Em uma modalidade adicional, o rebento isolado regenerado é contatado com um meio de enraizamento, em que o meio de enraizamento compreende um ou mais agentes de seleção. Em uma modalidade final, o rebento isolado regenerado é cultivado em meio de enraizamento de modo a produzir raízes viáveis, em que a produção de raízes viáveis identifica o transformante de soja de linhagem germinativa.

[0010] Em outro aspecto, é descrito aqui um método para produção de um transformante de soja de linhagem germinativa ou um transformante de soja que não é de linhagem germinativa, o método compreendendo a etapa de cultura de uma ou mais rebentos regenerados em um meio de enraizamento contendo um agente de seleção, em que o um ou mais rebentos regenerados são isolados de uma população de células de soja transformadas com um transgene, em que o um ou mais rebentos regenerados que compreendem um transformante de soja que não é de linhagem germinativa não produzem raízes viáveis e o um ou mais rebentos regenerados que compreendem um transformante de soja de linhagem germinativa produzem raízes viáveis.

[0011] Em um outro aspecto, é descrito aqui um método para impedir a produção de raízes viáveis a partir de uma população de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas. Em uma modalidade, uma população de células de soja é transformada com um transgene, em que a população de células de soja transformadas compreende uma população de células de soja transformadas de linhagem germinativa e uma população de células de soja transformadas que não são de linhagem germinativa. Em uma outra modalidade, um ou mais rebentos são regenerados a partir da população de células de soja transformadas. Em uma modalidade subsequente, os um ou mais rebentos regenerados produzidos a partir da população de células de soja transformadas são isolados. Em uma modalidade, o um ou mais rebentos regenerados isolados são contatados com um meio de enraizamento, em que o meio de enraizamento compreende um agente de seleção. Em ainda outra modalidade, o um ou mais rebentos regenerados isolados são cultivados sobre o meio de enraizamento, em que o um ou mais rebentos isolados de células de soja de linhagem germinativa transformadas produzem raízes viáveis na presença do meio de enraizamento contendo um agente de seleção e o um ou mais rebentos isolados de células de soja de linhagem germinativa não transformadas não obtêm produção de raízes viáveis na presença do meio de enraizamento contendo um agente de seleção.

[0012] Além dos aspectos exemplificativos e modalidades descritas acima, aspectos e modalidades adicionais serão evidentes pelo estudo das descrições a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] A Figura 1 ilustra um mapa de plasmídeo de pDAB9381.

[0014] A Figura 2 ilustra uma seção mediana vertical de um meris-tema apical de soja, conforme descrito em Clark, S. (2001) Nature Re-views; Molecular Cell Biology 2; 276-284.

[0015] A Figura 3 ilustra uma seção transversal da haste da soja mostrando expressão do transgene de proteína de fluorescência amarela em camadas de tecido de soja. Expressão do transgene de proteína de fluorescência amarela no interior da camada de tecido de soja L1 indica transformantes que não são de linhagem germinativa e as camadas de tecido de soja L2/L3 indicam transforma ntes de linhagem germinativa. Transformantes das camadas de tecido L1 produzem a Proteína Fluorescente Amarela apenas na camada de células epidérmicas, conforme observado por microscopia confocal. Transformantes das camadas de tecido L2/L3 produzem a Proteína Fluorescente Amarela nas células da epiderme e núcleo, conforme observado por microscopia confocal.

[0016] A Figura 4 ilustra a expressão de Proteína Fluorescente Amarela em células do córtex que compreendem as camadas de tecido L2/L3 e o subsequente desenvolvimento de estruturas de raiz em meio de enraizamento contendo 1 mg/L de glufosinato.

[0017] A Figura 5 ilustra o fenótipo de plantas de soja cultivadas em meio de enraizamento contendo 1 mg/L de glufosinato. Os transformantes que não são de linhagem germinativa resultaram em três fenótipos: (1) nenhuma raiz foi produzida; (2) raízes foram produzidas e se tornaram marrons; e (3) raízes foram produzidas e se tornaram pretas. Comparativamente, os transformantes de linhagem germinativa resultaram em um fenótipo no qual raízes saudáveis viáveis foram produzidas.

[0018] A Figura 6 ilustra a expressão da Proteína Fluorescente Amarela em raízes que foram desenvolvidas em meios de enraizamento com e sem seleção com glufosinato.

[0019] A Figura 7 ilustra o processo de transformação de soja e compara o método descrito com métodos atualmente usados para transformação de sojas.

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão Geral [0020] A presente descrição fornece, em vários aspectos, métodos que permitem a identificação e avanço de transformantes de linhagem germinativa de soja e a eliminação ou abate de transformantes de soja que não são de linhagem germinativa. Resumidamente, células de soja são transformadas, seguido por regeneração de rebentos a partir dos transformantes e cultura em um meio de enraizamento contendo um agente de seleção. De acordo com os métodos descritos, os transformantes de soja resultantes compreendendo um transgene integrado de forma estável podem ser identificados e selecionados antecipadamente no processo de transformação de soja. Transformantes de soja de linhagem germinativa podem ser identificados de acordo com a expressão de um transgene no interior das camadas centrais (por exemplo, L2 e L3) de rebentos de soja. Transformantes de soja de linhagem germinativa identificados podem, então, ser selecionados e cultivados em plantas de soja maduras. Além disso, transformantes de soja que não são de linhagem germinativa podem ser identificados usando os métodos descritos e podem ser eliminados do processo de transformação em um estágio antecipado comparado com métodos tradicionais. Como tal, transformantes das plantas de soja podem ser cultivados em um meio de enraizamento contendo um agente de seleção para identificar e selecionar transformantes específicos os quais têm um transgene inserido dentro dos tecidos de linhagem germinativa.

[0021] O desenvolvimento do método de transformação de soja que pode ser utilizado para identificação de transformantes de soja de linhagem germinativa em um estágio inicial do processo de transformação de soja é favorável, uma vez que o método pode aprimorar a eficiência do processo de transformação de soja.

[0022] Tal método é descrito no presente Pedido: um método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa é fornecido. O método compreende: a) transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene, em que a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células que não são de linhagem germinativa transformadas; b) regeneração de rebentos a partir da população de células transformadas; c) isolamento dos rebentos produzidos pela população de células transformadas; d) contato dos rebentos com um meio de enraizamento seletivo, em que o meio de enraizamento seletivo contém glufosinato; e) cultura dos rebentos isolados na presença de glufosinato, em que (i) os rebentos isolados produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis na presença de glufosinato e (ii) os rebentos isolados produzidos pela células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raízes viáveis na presença de glufosinato; e f) identificação dos rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa ao detectar se o rebento cria ou não raízes viáveis.

[0023] Em uma outra modalidade da presente descrição, é fornecido um segundo método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa. O método compreende: a) transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene, em que a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células que não são de linhagem germinativa transformadas; b) regeneração de rebentos a partir da população de células transformadas; c) isolamento dos rebentos produzidos pela população de células transformadas; d) sujeição dos rebentos regenerados isolados a um meio de enraizamento seletivo, em que (i) os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis e (ii) os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raízes viáveis; e e) identificação dos rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa ao detectar se o rebento cria ou não raízes viáveis.

[0024] Em ainda outra modalidade da presente descrição, é fornecido um método para identificação de um transformante de soja de linhagem germinativa. O método compreende: a) transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene; b) regeneração de um rebento a partir da população de células transformadas de uma planta de soja que compreende o transgene; c) isolamento do rebento regenerado a partir da população de células transformadas de uma planta de soja, em que a população de células transformadas de uma planta de soja compreende o transgene; d) contato do rebento isolado regenerado com um meio de enraizamento, em que o meio de enraizamento compreende um ou mais agentes de seleção; e e) cultura do rebento regenerado isolado no meio de enraizamento de modo a produzir raízes viáveis, em que a produção de raízes viáveis identifica o transformante de soja de linhagem germinativa.

[0025] Em outra modalidade da presente descrição, é proporcionado um método de produção de um transformante de soja de linhagem germinativa ou de um transformante de soja que não é de linhagem germinativa. O método compreende a etapa de cultura de um ou mais rebentos regenerados em um meio de enraizamento contendo um agente de seleção, em que o um ou mais rebentos regenerados são isolados de uma população de células de soja transformadas com um transgene, em que o um ou mais rebentos regenerados que compreendem um transformante de soja que não é de linhagem germinativa não produzem raízes viáveis e o um ou mais rebentos regenerados que compreendem um transformante de soja de linhagem germinativa produzem raízes viáveis.

[0026] Em ainda outra modalidade da presente descrição, é fornecido um método para evitar a produção de raízes viáveis a partir de uma população de células de soja que não são de linhagem germinati-va transformadas. O método compreende as etapas de: a) transformação de uma população de células de soja com um transgene, em que a população de células de soja transformadas compreende uma população de células de soja de linhagem germinativa transformadas e uma população de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas; b) regeneração de um ou mais rebentos a partir da população de células de soja transformadas; c) isolamento de um ou mais rebentos regenerados produzidos a partir da população de células de soja transformadas; d) contato do um ou mais rebentos regenerados isolados com um meio de enraizamento, em que o meio de enraizamento compreende um agente de seleção; e e) cultura do um ou mais rebentos regenerados isolados em meio de enraizamento, em que (i) o um ou mais rebentos regenerados isolados de células de soja de linhagem germinativa transformadas produzem raízes viáveis na presença do meio de enraizamento contendo um agente de seleção e (ii) o um ou mais rebentos regenerados isolados de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas evitam a produção de raízes viáveis na presença do meio de enraizamento contendo um agente de seleção.

[0027] Em outra modalidade, o método descrito utiliza a incorporação do agente de seleção, glufosinato, no meio de enraizamento para identificação e seleção de transformantes compreendendo um transgene inserido em tecidos de linhagem germinativa de soja. Em várias modalidades, a incorporação do agente de seleção, glufosinato, em concentrações específicas no meio de enraizamento de explantes de tecido de soja (por exemplo, semente dividida, meristema apical, etc.) que sofreu organogênese para identificação e seleção de transforman-tes de soja compreendendo um transgene inserido dentro do tecido de linhagem germinativa é descrito pela primeira vez. Em uma modalidade, descobriu-se que a incorporação de glufosinato em meio de enraizamento de tecidos de soja transformados usando um sistema de transformação organogênico não era inibitória e não interferiría com o desenvolvimento das plântulas. Em uma modalidade, sistemas de transformação organogênicos podem compreender transformação mediada por Agrobacterium de nós cotiledonares, metade de sementes ou transformação de semente divididas e bombardeamento de partículas meristemas de rebentos. Em ainda outra modalidade, o método descrito permite seleção fenotípica de plântulas com base em observações visuais de fenótipos de raiz para identificar e separar transfor-mantes de linhagem germinativa de transformantes que não são de linhagem germinativa. II. Termos [0028] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme co-mumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente descrição se refere. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. A menos que requerido pelo contexto, termos no singular devem incluir o plural e termos no plural incluem o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência na íntegra para todas as finalidades como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência, a menos que apenas seções específicas de patentes ou publicações de patentes sejam indicadas como sendo incorporadas por referência.

[0029] De modo a esclarecer ainda mais a presente descrição, os termos, abreviaturas e definições a seguir são fornecidos.

[0030] Conforme usado aqui, os termos "compreende(m)", "compreendendo", "inclui(em)", "incluindo", "tem(êm)", "tendo", "con-tém(êm)" ou "contendo", ou qualquer outra variação dos mesmos, se destinam ser não exclusivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas estes elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que expressamente indicado em contrário, "ou" refere-se a um ou inclusive e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer uma das seguintes opções: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente) e tanto A quanto B são verdadeiros (ou presentes).

[0031] Também, os artigos indefinidos "um" e "uma" precedendo um elemento ou componente de uma modalidade da descrição se destinam a ser não restritivos em relação ao número de casos, isto é, ocorrências do elemento ou componente. Portanto "um" ou "uma" deverá ser lido como incluindo um(a) ou pelo menos um(a) e a forma da palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número seja obviamente destinado a significar o singular.

[0032] O termo "invenção" ou "presente invenção", conforme usado aqui, é um termo não limitativo e não se destina a referir-se à qualquer modalidade única da invenção em particular, mas abrange todas as possíveis modalidades, conforme descrito no pedido.

[0033] Conforme usado aqui, o termo "planta" inclui uma planta inteira e qualquer descendente, célula, tecido ou uma parte de uma planta. O termo "partes de plantas" inclui qualquer (quaisquer) compo-nente(s) de uma planta incluindo, por exemplo e sem limitação: sementes (incluindo sementes maduras e sementes imaturas); um corte de planta; uma célula de planta; uma cultura de células de planta; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutos, rebentos, folhas, raízes, caules e explantes). Um órgão de planta ou tecido de planta pode ser uma semente, protoplastos, caules ou qualquer outro grupo de células de planta que estão organizadas em uma unidade estrutural ou funcional. Uma cultura de células ou tecidos de planta pode ser capaz de regeneração de uma planta tendo as características morfológicas e fisiológicas da planta a partir da qual as células ou tecidos foram obtidos e regeneração de uma planta que tem substancialmente o mesmo genótipo que a planta. Em contraste, algumas células de planta não são capazes de ser regeneradas para produzir plantas. Células regeneráveis em uma cultura de células ou tecidos de plantas podem ser embriões, protoplastos, caules, células meristemáticas, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raízes, seda, flores, sementes, espigas, sabugos, cascas ou colmos.

[0034] Partes de plantas incluem partes colhíveis e partes úteis para propagação de plantas descendentes. Partes de plantas úteis para propagação incluem, por exemplo e sem limitação: semente; frutas; um corte; uma muda; um tubérculo; e um porta-enxerto. Uma parte colhível de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta incluindo, por exemplo e sem limitação: flor; pólen; mudas; tubérculo; folha; colmo; frutas; semente; e raiz.

[0035] Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica da planta compreendendo um protoplasto e uma parede celular. Uma célula de planta pode estar na forma de uma única célula isolada ou um agregado de células (por exemplo, um caule friável e uma célula cultivada) e pode ser parte de uma unidade organizada maior (por exem- pio, um órgão de planta, um tecido de planta e planta). Assim, uma célula de planta pode ser um protoplasto, uma célula que produz ga-metas ou uma célula ou uma coleção de células que podem se regenerar em uma planta inteira. Como tal, uma semente, a qual compreende múltiplas células de planta e é capaz de se regenerar em uma planta inteira, é considerada uma "célula de planta" em modalidades aqui.

[0036] Conforme usado aqui, um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou polipeptídeo) significa um componente que tenha sido substancialmente separado, produzido fora de ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente ocorre naturalmente (isto é, outro que não DNA e RNA cromossômico e extra-cromossômico e proteínas), ao mesmo tempo em que causa uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossoma ao romper as ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que tenham sido "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por meio de métodos de purificação convencionais. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados através de expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

[0037] Conforme usado aqui, os termos "polinucleotídeos", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são usados indiferentemente e podem incluir um único ácido nucleico; múltiplos ácidos nucleicos; um fragmento de ácido nucleico, variante ou derivado do mesmo; e construtos de ácido nucleico (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e DNA de plasmídeo (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeos de uma sequência de cDNA de comprimento total, ou um fragmento da mesma, incluindo sequências não traduzidas 5' e/ou 3' e sequência(s) codificadora(s). Um poli-nucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de qualquer po-lirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, o qual pode incluir ri-bonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos não modificados ou ribonu-cleotídeos ou desoxirribonucleotídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de DNA fita simples e fita dupla; DNA que é uma mistura de regiões de fitas simples e dupla; RNA fita simples e dupla; e RNA que é uma mistura de regiões de fitas simples e dupla. Moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA podem ser fita simples, fita dupla ou uma mistura de regiões de fitas simples e dupla. Os termos precedentes incluem formas química, enzimática e metabolicamente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.

[0038] Deverá ser entendido que um DNA específico refere-se também ao complemento do mesmo, a sequência do qual é determinada de acordo com as regras de emparelhamento de bases de deso-xirribonucleotídeo.

[0039] Conforme usado aqui, o termo "gene" refere-se a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou polipeptí-deo/proteína). Um gene pode incluir sequências reguladoras que precedem (sequências não codificadoras 5') e/ou antecedem (sequências não codificadoras 3') a sequência que codifica o produto funcional.

[0040] Conforme usado aqui, o termo "sequência codificadora" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Uma "sequência reguladora" refere-se a uma sequência de nucleotídeos localizada a montante (por exemplo, sequências não codificadoras 5'), dentro ou a jusante (por exemplo, sequências não codificadoras 3') de uma sequência codificadora, as quais influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras incluem, por exemplo e sem limitação: promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; sequências de reconhecimento de poliadenilação; sítios de processamento de RNA; sítios de ligação de efetuador; e estruturas de haste-alça.

[0041] Conforme usado aqui, o termo "polipeptídeo" inclui um único polipeptídeo, múltiplos polipeptídeos e fragmentos dos mesmos. Este termo refere-se a uma molécula compreendida de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptídeo" refere-se a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento ou tamanho específico do produto. Consequentemente, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, proteínas, cadeias de aminoácidos e qualquer outro termo usado para referir-se a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos na definição de "polipeptídeo" e os termos precedentes são usados como sinônimos de "polipeptídeo" aqui. Um polipeptídeo pode ser isolado de uma fonte biológica natural ou produzido por meio da tecnologia recombinante, mas um polipeptídeo específico não é necessariamente traduzido a partir de um ácido nucleico específico. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer modo adequado incluindo, por exemplo e sem limitação, através de síntese química.

[0042] Conforme usado aqui, o termo "nativo" refere-se à forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo que é encontrada na natureza com suas próprias sequências reguladoras, se presentes. O termo "endógeno" refere-se à forma nativa do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo em sua localização natural no organismo ou no genoma do organismo.

[0043] Em contraste, o termo "heterólogo" refere-se a um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo que não é normalmente encontrado em sua localização no organismo de referência (hospedeiro). Por exemplo, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que é normalmente encontrado no organismo de referência em um local genômico diferente. A título de exemplo adicional, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que não é normalmente encontrado no organismo de referência. Um organismo hospedeiro que compreende um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser produzido através de introdução do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo no organismo hospedeiro. Em exemplos particulares, um polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência codificadora nativa, ou uma porção da mesma, que é reintroduzida em um organismo fonte em uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo correspondente. Em exemplos particulares, um gene heterólogo compreende uma sequência codificadora nativa, ou uma porção da mesma, que é reintroduzida no organismo fonte em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma sequência codificadora nativa que é uma porção de um gene quimérico, incluindo regiões reguladoras não nativas, que é reintroduzida no hospedeiro nativo. Em exemplos particulares, um polipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo nativo que é reintroduzi-do no organismo fonte em uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente.

[0044] Um gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser um gene ou um polipeptídeo que compreende uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo funcional que codifica um polipeptídeo funcional que é fundido a outros genes ou polipeptídeos para produzir um polipeptídeo de fusão ou quimérico ou um gene que codifica o mesmo. Genes e proteínas de modalidades particulares incluem sequências de comprimento total especificamente exemplificadas e porções, segmentos, fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e exclusões internas e/ou terminais comparado com as moléculas de comprimento total), variantes, mutantes, quiméricos e fusões destas sequências.

[0045] Conforme usado aqui, o termo "modificação" pode referir-se a uma alteração em um polinucleotídeo de referência particular que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Uma modificação pode também referir-se a uma alteração em um polipeptídeo de referência que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada do polipeptídeo de referência. Alternativamente, o termo "modificação" pode referir-se a uma alteração no polinucleotídeo de referência que resulta em atividade aumentada ou aprimorada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência, bem como uma alteração em um polipeptídeo de referência que resulta em atividade aumentada ou aprimorada do polipeptídeo de referência. Alterações tais como as precedentes podem ser feitas por meio de qualquer um dos vários métodos bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo e sem limitação: eliminação de uma porção da molécula de referência; mutação da molécula de referência (por exemplo, através de mutagênese espontânea, através de mutagênese aleatória, através de mutagênese causada por genes mutantes e através de mutagênese de transposon); substituição de uma porção da molécula de referência; inserção de um elemento na molécula de referência; expressão negativa da molécula de referência; alteração da localização celular da molécula de referência; alteração do estado da molécula de referência (por exemplo, através de metilação de um polinucleotídeo de referência e por meio de fosforilação ou ubiquitinação de um polipeptídeo de referência); remoção de um cofator da molécula de referência; introdução de um RNA/DNA antissenso que objetiva a molécula de referência; introdução de um RNA/DNA interferente que objetiva a molécula de referência; modificação química da molécula de referência; modificação covalente da molécula de referência; irradiação da molécula de referência com radiação UV ou raios X; recombi-nação homóloga que altera a molécula de referência; recombinação mitótica que altera a molécula de referência; substituição do promotor da molécula de referência; e/ou combinações de qualquer um dos precedentes.

[0046] Orientação quanto à determinação de quais nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos podem ser modificados em um exemplo específico pode ser encontrada comparando-se a sequência do poli-nucleotídeo ou polipeptídeo de referência com aquela de polinucleotí-deos ou polipeptídeos homólogos {por exemplo, homólogos de levedura ou bacterianos) e maximizando-se o número de modificações efetuadas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou sequências de consenso.

[0047] O termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de ácido nucleico co-dificadora ou RNA funcional. Nos exemplos, a sequência codificadora controlada está localizado 3' a uma sequência promotora. Um promotor pode ser derivado, em sua totalidade, de um gene nativo, um promotor pode ser compreendido de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou um promotor pode mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tipos de tecidos ou células ou em diferentes estágios de desenvolvimento ou em resposta à diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Exemplos de todos os promotores precedentes são conhecidos e usados na técnica para controlar a expressão de ácidos nucleicos heterólogos. Promotores que dirigem a expressão de um gene na maioria dos tipos de células são, em sua maioria, comumente ditos como "promotores constitutivos". Além dis- so, embora aqueles versados na técnica tenham tentado (em muitos casos sem sucesso) delinear os limites exatos de sequências reguladoras, veio a ser entendido que fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica. A atividade promotora de um ácido nucleico particular pode ser ensaiada usando métodos familiares para aqueles versados na técnica.

[0048] O termo "operativamente ligado" refere-se a uma associação de sequências de ácidos nucleicos sobre um único ácido nucleico, em que a função de uma das sequências de ácidos nucleicos é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência codificadora quando o promotor é capaz de realizar expressão desta sequência codificadora (por exemplo, a sequência codificadora está sob o controle transcricional do promotor). Uma sequência codificadora pode estar operativamente ligada a uma sequência reguladora em uma orientação senso ou antissenso.

[0049] O termo "expressão", conforme usado aqui, pode referir-se à transcrição e acúmulo estável de RNA senso (mRNA) ou RNA antissenso derivado de um DNA. Expressão pode também referir-se à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Conforme usado aqui, o termo "superexpressão" refere-se à expressão que é mais elevada do que expressão endógena do mesmo gene ou de um gene relacionado. Assim, um gene heterólogo é "superexpresso" se sua expressão é maior do que aquela de um gene endógeno comparável.

[0050] Conforme usado aqui, o termo "transformação" ou "transformar" refere-se à transferência e integração de um ácido nucleico ou fragmento do mesmo em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo um ácido nucleico de transformação são ditos como organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados". Métodos conhecidos de transformação incluem, por exemplo: transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes; transformação por fosfato de cálcio; transformação por polibreno; fusão de protoplastos; eletroporação; métodos de ultrassom (por exemplo, sonoporação); transformação de lipossomas; microinjeção; transformação com DNA nu; transformação com vetores de plasmídeos; transformação com vetores virais; transformação biolística (bombardeamento com micropar-tículas); transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS; feixe de aerossol; e transformação mediada por PEG.

[0051] Conforme usado aqui, o termo "introduzido" (no contexto da introdução de um ácido nucleico em uma célula) inclui transformação de uma célula, bem como cruzamento de uma planta compreendendo o ácido nucleico com uma segunda planta, de modo que a segunda planta contenha o ácido nucleico, conforme pode ser realizado utilizando técnicas convencionais de melhoramento de plantas. Tais métodos de melhoramento são conhecidos na técnica. Para uma discussão de técnicas de melhoramento de plantas vide Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4a Edição, AVI Publication Co., Westport CT.

[0052] Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um ácido nucleico em uma planta. Esta técnica tem sido usada há décadas para introduzir traços em plantas. Um exemplo de uma descrição de retrocruzamento (e outras metodologias de melhoramento de plantas) pode ser encontrado, por exemplo, em Poelman (1995) supra; e Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY. Em um protocolo de retrocruzamento exemplificativo, uma planta original de interesse (o "progenitor recorrente") é cruzada com uma segunda planta (o "progenitor não recorrente") que traz um ácido nucleico a ser introduzido. Os descendentes resultantes deste cruzamento são, então, cruzados novamente com o progenitor recorrente e o processo é repetido até que uma planta convertida seja obtida, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas de- sejadas do progenitor recorrente são recuperadas na planta convertida, além do ácido nucleico do progenitor não recorrente.

[0053] Os termos "plasmídeo" e "vetor", conforme usado aqui, referem-se a um elemento cromossômico adicional que pode trazer um ou mais genes que não fazem parte do metabolismo central da célula. Plasmídeos e vetores são, tipicamente, moléculas de DNA fita dupla circulares. No entanto, plasmídeos e vetores podem ser ácidos nuclei-cos lineares ou circulares, um DNA ou RNA fita simples ou fita dupla e pode, ser derivados de qualquer fonte, nos quais um número de sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em um único construto que é capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA codificadora junto com qualquer sequência 3' não traduzida apropriada em uma célula. Nos exemplos, plasmídeos e vetores podem compreender sequências de replicação autônoma, sequências de integração genômica e/ou sequências de nucleotídeos ou fago.

[0054] Polipeptídeo e "proteína" são usados aqui indiferentemente e incluem uma cadeia molecular de dois ou mais aminoácidos ligados através de ligações peptídicas. Os termos não se referem a um comprimento específico do produto. Assim, "peptídeos" e "oligopeptídeos" estão incluídos dentro da definição de polipeptídeo. Os termos incluem modificações pós-traducionais do polipeptídeo, por exemplo, glicosila-ções, acetilações, fosforilações e similares. Além disso, fragmentos de proteínas, análogos, mutantes ou proteínas variantes, proteínas de fusão e similares estão incluídos no âmbito do significado do polipeptídeo. Os termos também incluem moléculas nas quais um ou mais análogos de aminoácidos ou aminoácidos não canônicos ou não naturais estão incluídos como possam ser sintetizados ou expressos de forma recombinante usando técnicas de manipulação de proteínas conhecidas. Além disso, proteínas de fusão da invenção podem ser derivati-zadas, conforme descrito aqui, por meio de técnicas bem conhecidas de química orgânica.

[0055] O termo "proteína de fusão" indica que a proteína inclui componentes polipeptídicos derivados de mais de uma proteína ou polipeptídeo progenitor. Tipicamente, uma proteína de fusão é expressa a partir de um gene de fusão no qual uma sequência de nucleotí-deos que codifica uma sequência polipeptídica de uma proteína é ligada em rede com e, opcionalmente separadas por, um ligante de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência polipeptídica de uma proteína diferente. O gene de fusão pode, então, ser expresso por uma célula hospedeira recombinante como uma proteína única. III. Modalidades da Presente Invenção [0056] Em uma modalidade da presente descrição, é proporcionado um método de identificação de rebentos criados a partir de trans-formantes de soja de linhagem germinativa. O método compreende: a) transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene, em que a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células que não são de linhagem germinativa transformadas; b) regeneração de rebentos a partir da população de células transformadas; c) isolamento dos rebentos produzidos pela população de células transformadas; d) contato dos rebentos com um meio de enraizamento seletivo, em que o meio de enraizamento seletivo contém glufosinato; e) cultura dos rebentos isolados na presença de glufosinato, no qual (i) os rebentos isolados produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis na presença de glufosinato e (ii) os rebentos isolados produzidos pela células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raízes viáveis na presença de glufosinato; e f) identificação dos rebentos criados a partir de transfor-mantes de soja de linhagem germinativa ao detectar se o rebento cria ou não raízes viáveis.

[0057] Nesta modalidade, uma população de células de uma planta de soja é transformada com um transgene por qualquer um dos vários métodos de transformação conhecidos na técnica. Ácidos nuclei-cos introduzidos em uma célula de planta de soja podem ser usados para conferir traços agronômicos desejados em plantas de soja. Uma ampla variedade de plantas de soja e sistemas de células de plantas podem ser manipulados para as características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas aqui usando um ácido nucleico e vários métodos de transformação. Modalidades aqui podem usar qualquer um dos métodos conhecidos para transformação de plantas (e produção de plantas geneticamente modificadas) que são conhecidos na técnica. Numerosos métodos para transformação de plantas foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformação biológicos e físicos para plantas dicotiledôneas, bem como plantas monocotiledôneas (vide, por exemplo, Goto-Fumiyuki et ai (1999) Nat. Biotechnol. 17: 282-6; Miki et ai (1993) Methods in Plant Molecular Bioloqy and Biotech-noloqy (Glick, B. R. and Thompson, J. E., Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, páginas 67-88). Além disso, vetores e métodos de cultura in vitro de células de plantas e transformação e regeneração de tecidos de plantas são descritos, por exemplo, em Gruber et al. (1993), supra, nas páginas 89-119.

[0058] Metodologias de transformação de plantas disponíveis para introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo e sem limitação: transformação com T-DNA desarmado usando Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes como agente de transformação; transfecção com fosfato de cálcio; transformação com polibreno; fusão de protoplastos; eletroporação (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-505); métodos de ultrassom (por exemplo, sonoporação); transformação de lipossomas; microinjeção; contato com DNA nu; contato com vetores de plasmídeos; contato com ve- tores virais; biolística (por exemplo, bombardeamento de partículas de DNA (vide, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327: 70-3) e bombardeamento com micropartículas (Sanford et al. (1987) Part. Sei. Technol. 5: 27; Sanford (1988) Trends Biotech. 6: 299, Sanford (1990) Physiol. Plant 79: 206; e Klein et al. (1992) Biotechnology 10: 268); transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS™ (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9: 415-8); transformação com nanopartícula (vide, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos N° US2009/0104700A1); feixe de aerossol; e absorção mediada por polietileno glicol (PEG). Em exemplos específicos, um transge-ne pode ser introduzido diretamente no DNA genômico de uma célula de planta de soja através de um dos protocolos de transformação previamente descritos.

[0059] Um método amplamente utilizado para introdução de um cassete de expressão gênica compreendendo um transgene em uma planta se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacte-rium. Horsch et al. (1985) Science 227: 1229. A. tumefaciens e A. rhi-zogenes são bactérias no solo patogênicas para plantas que se sabe serem úteis para transformar geneticamente células de plantas. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, trazem genes responsáveis pela transformação genética da planta. Kado (1991) Crit. Rev. Plant. Sei. 10: 1. Detalhes sobre sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de genes mediada por Agrobacterium também estão disponíveis, por exemplo, em Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al. (1989) Plant Cell Reports 8: 238 e Patentes dos Estados Unidos Nos 4.940.838 e 5.464.763.

[0060] Se Agrobacterium é usada para transformação, o DNA a ser inserido é, tipicamente, clonado em plasmídeos especiais, quer em um vetor intermediário ou um vetor binário. Vetores intermediários não podem se reproduzir em Agrobacterium. O vetor intermediário pode ser transferido para A. tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). O sistema Japan Tobacco Superbinary é um exemplo de um sistema deste tipo (revisto por Komari et al. (2006) Methods in Molecular Bioloqy (K. Wang, ed.) N° 343; Agrobacterium Protocols, 2a Edição, Vol. 1, Humana Press Inc., Totowa, NJ, páginas 15-41; e Ko-mori et al. (2007) Plant Physiol. 145: 1155-60). Vetores binários podem se replicar tanto em E. coli quanto Agrobacterium. Vetores binários compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou sítio de clonagem múltipla os quais estão em quadro pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Holsters, 1978). A Agrobacterium compreende um plasmídeo trazendo uma região vir. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula de planta. T-DNAs adicionais podem estar contidos.

[0061] As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens dirigirão a inserção de uma T-fita contendo o cassete de expressão gênica e marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula é infectada pela bactéria usando um vetor binário de T-DNA (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-21) ou o procedimento de cocultivo (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-31). Geralmente, o sistema de transformação de Agrobacterium é usado para manipular plantas dicotiledôneas. Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-84; Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118: 627-41. O sistema de transformação de Agrobacterium pode também ser usado para transformar, bem como transferir ácidos nucleicos para plantas mono-cotiledôneas e células de plantas. Vide Patente dos Estados Unidos N° 5.591.616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3: 3039-41; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311: 763-4; Grimsley et al. (1987) Nature 325: 1677-9; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40; e Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95: 426-34.

[0062] As manipulações genéticas de um hospedeiro recombinan-te aqui podem ser realizadas usando técnicas convencionais de DNA recombinante e rastreio e podem ser realizadas em qualquer célula hospedeira que é adequada para manipulação genética. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante pode ser qualquer planta de soja ou uma variedade adequada para modificação genética e/ou expressão gênica recombinante. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante pode ser um transformante de soja de linhagem germinativa. Métodos convencionais de DNA recombinante e clonagem molecular usados aqui são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo e sem limitação: Sambrook et al. (1989), supra; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Har-bor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, and Wiley-lnterscience, New York, NY.

[0063] Em algumas modalidades, um tecido de planta de soja é transformado através de um método mediado por Agrobacterium de explantes de meia-semente modificados (Paz M., et al., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213), um método de transformação do nó cotiledo-nar (Zeng P., et al., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482) ou uma semente em divisão com o método de transformação de soja por eixo de embrião parcial (Depósito dos Estados Unidos N° 61/739.349). Usando qualquer um destes métodos ou qualquer outro método de transformação de soja conhecido, o transgene é distribuído a tecidos de plantas de soja os quais compreendem o tecido do manto externo (camada L1) ou distribuído aos tecidos subjacentes localizados mais profundamente no interior da planta, tais como os tecidos de núcleo (camadas L2 e L3). O tecido do manto (camada L1) se dividirá para formar os tecidos da epiderme e no solo, os quais compreendem células que não são de linhagem germinativa. Os tecidos de núcleo se dividem para formar os tecidos meristemáticos e vasculares, os quais compreendem células de linhagem germinativa. Apenas os eventos transgênicos com células de linhagem germinativa transformadas podem passar o transgene para a próxima geração.

[0064] Nesta modalidade, a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células que não são de linhagem germinativa transformadas. Uso de um transgene para transformação de células de núcleo (camadas L2 e L3), as quais compreendem as células meristemáticas e vasculares da planta, resulta na transformação de uma célula de linhagem germinativa de soja. As células de linhagem germinativa são capazes de regeneração para produzir uma planta transgênica madura (isto é, trans-formantes de linhagem germinativa).

[0065] O uso de um transgene para transformação de células do manto (camada L1), as quais compreendem as células dérmicas e no solo da planta, resulta na transformação de uma célula de soja que não é de linhagem germinativa. Células que não são de linhagem germinativa não são capazes de regeneração para produzir uma planta transgênica madura (isto é, transformante que não é de linhagem germinativa).

[0066] Nesta modalidade, rebentos são regenerados a partir da população de células transformadas. Rebentos de plantas são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem as partes aéreas vasculares das plantas (incluindo, porém sem limitações, caules, ramos, brotos, órgãos reprodutivos, folhas e estruturas derivadas de rebentos, tais como estolhos, colmos, rizomas ou tubérculos), tecidos de plantas e células de plantas que se desenvolvem a partir de uma semente ou corte.

[0067] Células de plantas de soja transformadas que são produzidas por qualquer uma das técnicas de transformação supra podem ser cultivadas para regenerar uma planta de soja madura que possua o genótipo transformado e, assim, o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de determinados fitormônios em um meio de crescimento de cultura tecidual com base, tipicamente, em um marcador biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido junto com as sequências de nucleotídeos desejadas. Regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans, et ai, "Protoplasts Isolation and Culture" em Handbook of Plant Cell Culture, páginas 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração também pode ser obtida a partir de caules da planta, explantes, órgãos, pólen, embriões ou partes dos mesmos. Tais técnicas de regeneração estão descritas de modo geral em Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467 486.

[0068] Metodologias para regeneração de plantas são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em: Plant Cell Culture Protocols (Meth-ods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). Plantas de soja geneticamente modificadas descritas aqui podem ser cultivadas em um meio de fermentação ou cultivadas em um meio adequado, tal como terra. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superiores pode ser qualquer meio de crescimento de plantas incluindo, porém sem limitações, terra, areia, quaisquer outros meios em partículas que sustentam o crescimento de raízes (por exemplo, vermiculita, perlita, etc.) ou culturas hidropônicas, bem como luz, água e suplementos nutricionais adequados que facilitam o crescimento da planta superior.

[0069] Nesta modalidade, os rebentos produzidos pela população de células transformadas são isolados. Conforme usado aqui, o termo "isolado" ou "isolamento" refere-se à remoção dos rebentos de outras estruturas ou tecidos de planta, de modo que o rebento removido esteja substancialmente livre de outras estruturas ou tecidos de plantas. Como tal, os rebentos são desprovidos de outros componentes, no todo ou em parte, com os quais os rebentos estão normalmente associados com cultura tecidual.

[0070] Nesta modalidade, os rebentos são contatados com um meio de enraizamento seletivo, em que o meio de enraizamento seletivo contém glufosinato. Conforme usado aqui, o termo "contatado" ou "contato" refere-se a manter o rebento isolado em contato com o meio de enraizamento seletivo. Consequentemente, "contatado" ou "contato" pode resultar em um toque do rebento isolado com o meio de enraizamento de modo a manter o rebento isolado em estreita proximidade física com o meio de enraizamento. Além disso, "contatado" ou "contato" pode resultar em um rebento isolado que está incorporado no meio de enraizamento. Conforme usado aqui, o termo "meio de enraizamento seletivo" refere-se a um meio de cultura tecidual compreendendo sais basais, fontes de carbono, vitaminas, minerais e fitormô-nios de plantas. Nas modalidades, os fitormônios de plantas podem ser fornecidos em concentrações ou proporções variáveis, em que tecidos de raízes se desenvolvem e proliferam a partir de células não diferenciadas colocadas sobre o meio de enraizamento seletivo. Nas modalidades, o meio de enraizamento seletivo contém glufosinato. Nas modalidades, o meio de enraizamento seletivo contém 2,4-D.

[0071] Nesta modalidade, os rebentos regenerados isolados são cultivados na presença de glufosinato. Conforme usado aqui, o termo "crescimento" ou "cultura" refere-se a uma planta, parte da planta ou célula de planta propositadamente cultivada (aumentos no tamanho da célula, conteúdos celulares e/ou atividade celular) e/ou propagada (aumentos no número de células através mitose) sob condições de cultura tecidual. Na modalidade, os rebentos regenerados isolados produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis na presença de glufosinato. Na modalidade, os rebentos regenerados isolados produzidos pelas células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raízes viáveis na presença de glufosinato. Conforme usado aqui, o termo "raízes viáveis" refere-se à raízes que são capazes de propagação dentro do meio de enraizamento seletivo. Consequentemente, raízes viáveis são capazes de regeneração tecidual e crescimento dentro do meio de enraizamento seletivo. Raízes de plantas são bem conhecidas por aqueles versados na técnica e referem-se à partes de plantas (incluindo, porém sem limitações, raízes primárias, raízes secundárias, raízes terciárias, raízes quaternárias, raízes laterais, pelos radiculares, raízes de coroa) que permanecem no subsolo ou abaixo da superfície de um meio de cultura tecidual e obtêm nutrição que é subsequentemente translocada através da planta.

[0072] Em determinadas modalidades, os transformantes que não são de linhagem germinativa produzem raízes não viáveis que são de cor marrom. Em outras modalidades, os transformantes que não são de linhagem germinativa produzem raízes não viáveis que são de cor preta. Em outras modalidades, os transformantes que não são de linhagem germinativa não produzem quaisquer estruturas de raiz.

[0073] Nesta modalidade, os rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa são identificados ao detectar se os rebentos criam ou não raízes viáveis. Conforme usado aqui, o termo "identificado" ou "identificar" refere-se a determinar qual(is) re-bento(s) da planta é(são) criado(s) a partir de um transformante de soja de linhagem germinativa e separando este(s) rebento(s) da planta de outro(s) rebento(s) da planta que é(são) criado(s) a partir de um transformante de soja que não é de linhagem germinativa.

[0074] A presente descrição pode ser utilizada para identificar plantas de soja transgênicas específicas que compreendem transfor-mantes de soja que não são de linhagem germinativa, particularmente transformantes derivados da camada tecidual L1. Em particular, os transformantes de soja que não são de linhagem germinativa produzidos pelos métodos de transformação de soja descritos são identificados antecipadamente no processo de transformação através de observação visual das raízes em desenvolvimento. Em determinadas modalidades, os transformantes que não são de linhagem germinativa produzem raízes não viáveis que são de cor marrom. Em outras modalidades, os transformantes que não são de linhagem germinativa produzem raízes não viáveis que são de cor preta. Em outras modalidades, os transformantes que não são de linhagem germinativa não produzem quaisquer estruturas de raiz. Os transformantes de soja que não são de linhagem germinativa produzidos pelo método de transformação de soja descrito compreendem um transgene integrado dentro da camada tecidual L1 incapaz de transmitir o transgene para gerações subsequentes de plantas de soja.

[0075] Uma célula, caule, tecido ou planta de soja transformada pode ser identificada e isolada por meio de rastreio ou seleção do material de planta manipulado quanto a traços codificados pelos genes marcadores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, seleção pode ser realizada crescendo o material de planta manipulado em um meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida ao qual o construto gênico de transformação confere resistência. Ainda, plantas e células de plantas transformadas também podem ser identificadas ao rastrear a atividade de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes de β-glucuronidase, luciferase ou GFP) que possam estar presentes nos construtos de ácido nucleicos recombinantes. Tais metodologias de rastreio e seleção são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0076] Uma planta de soja transgênica contendo um transgene de acordo com a presente descrição pode ser produzida através de melhoramento seletivo incluindo, por exemplo, cruzando sexualmente uma primeira planta progenitora que compreende a molécula e uma segunda planta progenitora, deste modo, produzindo uma pluralidade de plantas de primeira geração. Então, pode ser selecionada uma planta de primeira geração que é resistente a um marcador selecioná-vel (por exemplo, glufosinato, resistência ao qual pode ser conferida à planta descendente pela molécula heteróloga aqui). A planta de primeira geração pode, então, ser autopolinizada, deste modo, produzindo uma pluralidade de plantas de segunda geração. Então, pode ser selecionada uma planta de segunda geração que é resistente a um marcador selecionável. Estas etapas podem incluir ainda retrocruza-mento da planta de primeira geração ou da planta de segunda geração com a segunda planta progenitora ou uma terceira planta progenitora.

[0077] Deverá também ser entendido que duas plantas de soja transgênicas diferentes podem ser cruzadas para produzir descendência que contêm dois gemes exógenos de segregação independente adicionados. Cruzamento de descendência apropriada pode produzir plantas que são homozigóticas para ambos os genes exógenos adicionados. Retrocruzamento com uma planta progenitora e cruzamento com uma planta não transgênica são também considerados, bem como propagação vegetativa. Outros métodos de melhoramento comu-mente usados para diferentes traços e culturas são conhecidos na técnica. Melhoramento por retrocruzamento tem sido usado para transferir genes para um traço simplesmente herdado, altamente hereditário para um cultivar homozigótico ou linhagem pura desejável, a qual é o progenitor recorrente. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos do progenitor recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejado transferido a partir do progenitor doador. Após o cruzamento inicial, indivíduos que possuam o fenótipo do progenitor doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzamento) com o progenitor recorrente. Espera-se que o progenitor resultante tenha os atributos do progenitor recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido a partir do progenitor doador.

[0078] Um transgene pode também ser introduzido em uma área predeterminada do genoma da planta por meio de recombinação homóloga. Métodos para integrar de forma estável uma sequência de polinucleotídeos dentro de um sítio cromossômico específico de uma célula da planta através de recombinação homóloga foram descritos na técnica. Por exemplo, integração sítio específica, conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2009/0111188 A1 envolve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeos doadora em um alvo cromossômico. Além disso, o Pedido de Patente Internacional N°WO 2008/021207 descreve recombinação homóloga mediada por dedo de zinco ao integrar estavelmente uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras em localizações específicas do genoma. O uso de recombinases, tais como FLP/DRF, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N°6.720.475, ou CRE/LOX, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 5.658.772, pode ser feito para integrar de forma estável uma sequência de polinucleotídeo em uma localização cromossômica específico. Finalmente, o uso de me-ganucleases para objetivação de polinucleotídeos doadores a uma localização cromossômica específica foi descrito em Puchta et ai, PNAS USA 93 (1996) páginas 5055-5060).

[0079] Outros vários métodos para integração sítio específica den- tro de células de plantas são geralmente conhecidos e aplicáveis ( Kumar et ai, Trends in Plant Sei. 6(4) (2001) páginas 155-159). Além disso, sistemas de recombinação sítio específica que foram identificados em vários organismos procariotas e eucariotas inferiores podem ser aplicados para uso em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, porém sem limitações: o sistema de recombinase R/RS do plas-mídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) e o sistema Gin/gix do fago Mu (Ma-eser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).

[0080] Em algumas modalidades descritas aqui, a transformação emprega um método de transformação escolhido do grupo que consiste em transformação com Agrobacterium, biolística, transformação com fosfato de cálcio, transformação com polibreno, transformação por fusão de protoplastos, transformação por eletroporação, transformação por ultrassom, transformação de lipossomas, transformação por micro-injeção, transformação por DNA nu, transformação por vetor plasmí-deo, transformação por vetor viral, transformação mediada por carbo-neto de silício, transformação por feixe de aerossol ou transformação por PEG. Em algumas modalidades, a transformação emprega um método de transformação com Agrobacterium.

[0081] Em algumas modalidades descritas aqui, a população de células de uma planta de soja compreende um tecido de planta de soja. Em outras modalidades, o tecido de planta de soja é uma camada tecidual L2/L3 ou uma camada tecidual L1. Em algumas modalidades, a camada tecidual L2/L3 compreende uma célula de linhagem germi-nativa. Em algumas modalidades, a camada tecidual L1 compreende uma célula que não é de linhagem germinativa.

[0082] Em uma outra modalidade, a camada tecidual L2/L3 é selecionada do grupo que consiste em um tecido meristemático de planta de soja, um tecido de raiz de planta de soja e um tecido vascular de planta de soja. O tecido meristemático compreende meristema apical, meristema primário ou meristema lateral. Estes tecidos não diferenciados sofrem divisão de novas células as quais são usadas para o crescimento ou reparação dos tecidos de plantas e são caracterizados como zonas de células em divisão ativa. A divisão celular ocorre unicamente nos tecidos meristemáticos. Meristemas apicais, os quais estão localizados nas pontas dos rebentos, estão diretamente envolvidos em alongamento de rebentos. Meristemas laterais, tal como o meristema vascular, estão envolvidos em crescimento interno. Células do meristema lateral envolvem o colmo de uma planta estabelecida e fazem com que ele cresça lateralmente. O tecido vascular é uma mistura de células que consistem em células diferenciadas, células esclerenqui-máticas, células fibrosas e outras células envolvidas em transporte (por exemplo, vasos, traqueídeos, xilema ou floema). Estes tipos de células transportam fluidos, tais como água e nutrientes, internamente dentro da célula de planta.

[0083] Em ainda outra modalidade, a camada tecidual L1 é selecionada do grupo que consiste em um tecido dérmico de planta de soja, um tecido no solo de planta de soja e um tecido do manto de plantas de soja. Os tecidos dérmico e no solo são tecidos não meristemáticos (isto é, tecidos que não se dividem) os quais são constituídos por células do parênquima, células do esclerênquima e células do colênquima. O tecido dérmico compreende as camadas de células mais exteriores das plantas, folhas, raízes, caules, frutos ou sementes. Os tecidos no solo são tecidos simples, não meristemáticos compostos de células de parênquima, células de esclerênquima, clorênquima e células de colênquima. Estes tipos de células geralmente formam a medula e córtex dos caules.

[0084] Em algumas modalidades, o tecido meristemático de planta de soja compreende um ou mais de um meristema apical, um meris- tema primário ou um meristema lateral. Em outras modalidades, o tecido vascular de planta de soja é selecionado do grupo que consiste em xilema ou floema. Em uma outra modalidade, o tecido dérmico da planta de soja compreende epiderme. Em ainda outra modalidade, o tecido dérmico da planta de soja compreende periderme.

[0085] Em algumas modalidades, o transgene está contido dentro de pelo menos um cassete de expressão gênica. Um método amplamente utilizado para introdução de uma cassete de expressão de genes compreendendo um transgene em uma planta baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium, conforme descrito anteriormente. Em algumas modalidades, o cassete de expressão gênica inclui um gene marcador selecionável. Em algumas modalidades, o gene marcador selecionável é o gene de acetiltransferase de fosfino-tricina. Em outras modalidades, o cassete de expressão gênica compreende um gene de traço. Em algumas modalidades, o cassete de expressão gênica compreende um gene de RNAi.

[0086] Em uma modalidade, o agente de seleção compreende glu-fosinato. Glufosinato (DL-fosfinotricina) é um herbicida de contato não seletivo que controla um amplo espectro de gramíneas anuais e perenes e ervas daninhas de folhas largas. O glufosinato é um inibidor de sintetase de glutamina e se liga irreversível mente ao sítio de glutamato dentro da enzima sintetase de glutamina. A tolerância ao glufosinato, conferida pelos genes pat e dsm-ll, permite o uso de um modo adicional de ação como parte das estratégias eficazes de manejo de resistência a herbicidas. Herbicidas de glufosinato também podem ser usados como agentes de seleção em sementeiras para selecionar plantas tolerantes a herbicidas para manter a pureza do traço na semente. Glufosinato pode ser comercializado sob as marcas LIBERTY®, BASTA® e IGNITE®. Em algumas modalidades, a concentração de glufosinato no meio de enraizamento seletivo é de pelo menos 1,0 mg/L.

Em outras modalidades, a concentração de glufosinato no meio de enraizamento seletivo é de 1,0 mg/L a 10,00 mg/L. Em uma outra modalidade, a concentração de glufosinato no meio de enraizamento seletivo é de 1,0 mg/L a 6,0 mg/L. Em ainda outra modalidade, a concentração de glufosinato no meio de enraizamento seletivo é de 1,0 mg/L.

[0087] Em uma modalidade, o agente de seleção compreende ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Aplicações de 2,4-D são usadas principalmente para controlar as ervas daninhas de folhas largas, uma vez que a maioria das espécies perenes são tolerantes ao 2,4-D. A maioria das formulações de 2,4-D são aplicadas às porções foliares de uma planta e absorvidas e transportadas ao longo dos tecidos da planta. A tolerância ao 2,4-D, conferida pelos genes aad-1 e aad-12, permite o uso de um modo adicional de ação como parte das estratégias eficazes de manejo de resistência a herbicidas. 2,4-D pode ser comercializado sob as marcas WEEDAR 64®, BARRAGE® e FRONTLI-NE®. Em algumas modalidades, a concentração de 2,4-D no meio de enraizamento seletivo é de pelo menos 2,0 mg/L. Em outras modalidades, a concentração de 2,4-D no meio de enraizamento seletivo é de 2,0 mg/L a 120,0 mg/L.

[0088] Em várias modalidades, o meio de enraizamento seletivo compreende um sal básico, uma vitamina, um mineral e uma fonte de carbono. Em algumas modalidades, o sal básico no meio de enraizamento compreende sal básico B-5 de Gamborg (Gamborg, O.L. et al., Nutrient Requirements Of Suspension Cultures of Soybean Root Cells. Exp. Cell Res. 50, 151-158 (1968)), sal básico de Schenk e Hilde-brandt (Schenk, R.U. e Hildebrandt A.C., Médium and Techniques For Induction and Growth of Monocotyledonous and Dicotyledonous Plant Cell 50(1): 199-204 (1972)), sal básico de White (White, P.R., The Cul-tivation of Animal and Plant Cells, 2a edição, Ronald Press, New York (1963)), sal básico de Chu (N6) (Chu, C.C. et al., Establishment of an Efficient Médium For Anther Culture of Rice, Through Comparative Ex-periments on The Nitrogen Sources Scientia Sin. 18, 659-66 (1975)), sal básico DKW/Juglans (Driver, J.A. e Kuniyuki, A.H., In vitro propaga-tion of Paradox walnut Juglans hindsii x Juglans regia rootstock. HortScience 19, 507-509), sal básico N° 2 de Hoagland (Hoagland, D.R. e Arnon, D.I., The Water-Culture Method For Growing Plants Without Soil Univ. Calif. Coll. Agric. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA 347-353 (1938)), sal básico de Murashige & Skoog (Murashige, T. e Skoog, F., A Revised Médium For Rapid Growth and Bioassays With Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962) ) e combinações dos mesmos.

[0089] Em uma modalidade, o sal básico é sal básico de Murashige & Skoog. Em outra modalidade, a vitamina é selecionada do grupo que consiste em vitamina B-5 de Gamborg, vitamina MEM, vitamina de Murashige & Skoog, vitamina de Schenk e Hildebrandt e combinações das mesmas. Em ainda outra modalidade, a vitamina é vitamina B-5 de Gamborg.

[0090] Em várias modalidades, a fonte de carbono no meio de enraizamento compreende glicose, dextrose, manose, frutose, galactose, glucuronato, lactose ou glicerol. Em uma outra modalidade, a vitamina usada no meio líquido compreende vitamina B-5 de Gamborg (Gamborg, O.L. et al., Nutrient Requirements of Suspension Cultures of Soybean Root Cells. Exp. Cell Res. 50, 151-158 (1968)), vitamina MEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), vitamina de Murashige e Skoog (Murashige, T. e Skoog, F., A Revised Médium For Rapid Growth and Bioassays With Tobacco Tissue Cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962)) ou vitamina de Schenk e Hildebrandt (Schenk, R.U. e Hildebrandt A.C., Médium and Techniques For Induction And Growth Of Monocotyledonous and Dicotyledonous. Plant Cell 50(1): 199-204 (1972)). Outras modalidades fornecem meios de enraizamento com- preendendo minerais, compostos antimicrobianos, hormônios, agentes de seleção, sais, aminoácidos, um segundo um sal básico, uma segunda fonte de carbono e/ou uma segunda vitamina. Finalmente, modalidades da presente descrição fornecem um meio de enraizamento em uma forma líquida ou sólida. Agar ou PHYTAGEL™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) podem ser adicionados ao meio de enraizamento para solidificar a composição. Várias concentrações de agar ou PHYTAGEL™ podem ser incorporadas e são conhecidas por aqueles versados na técnica. Em uma modalidade, a fonte de carbono é saca-rose.

[0091] Em determinadas modalidades, o meio de enraizamento seletivo é um meio líquido. Em outras modalidades, o meio de enraizamento seletivo é um meio sólido.

[0092] Em outra modalidade da presente descrição, é fornecido um segundo método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa. O método compreende: a) transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene, em que a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células que não são de linhagem germinativa transformadas; b) regeneração de rebentos a partir da população de células transformadas; c) isolamento dos rebentos produzidos pela população de células transformadas; d) sujeição dos rebentos regenerados isolados a um meio de enraizamento seletivo, em que (i) os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis e (ii) os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células que não são de linhagem germinativa transformadas não criam raízes viáveis; e e) identificação dos rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa ao detectar se o rebento cria ou não raízes viáveis. As moda- lidades anteriormente descritas do método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa são também aplicáveis ao segundo método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa descritos aqui.

[0093] Em ainda outra modalidade da presente descrição, um método para identificação de um transformante de soja de linhagem germinativa é fornecido. O método compreende: a) transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene; b) regeneração de um rebento a partir da população de células transformadas de uma planta de soja que compreende o transgene; c) isolamento do rebento regenerado a partir da população de células transformadas de uma planta de soja, em que a população de células transformadas de uma planta de soja compreende o transgene; d) contato do rebento isolado regenerado com um meio de enraizamento, em que o meio de enraizamento compreende um ou mais agentes de seleção; e e) cultura do rebento regenerado isolado no meio de enraizamento a fim de produzir raízes viáveis, em que a produção de raízes viáveis identifica o transformante de soja de linhagem germinativa. As modalidades anteriormente descritas dos métodos de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa são também aplicáveis ao método de identificação de um transformante de soja de linhagem germinativa descrito aqui.

[0094] Em outra modalidade da presente descrição, é fornecido um método de produção de um transformante de soja de linhagem germinativa ou um transformante de soja que não é de linhagem germinativa. O método compreende a etapa de cultura de um ou mais rebentos regenerados em um meio de enraizamento contendo um agente de seleção, em que o um ou mais rebentos regenerados são isolados de uma população de células de soja transformadas com um transgene, em que o um ou mais rebentos regenerados que compreendem um transformante de soja que não é de linhagem germinativa não produzem raízes viáveis e o um ou mais rebentos regenerados que compreendem um transformante de soja de linhagem germinativa produzem raízes viáveis. As modalidades anteriormente descritas do método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa e do método de identificação de um transformante de soja de linhagem germinativa são também aplicáveis ao método de produção de um transformante de soja de linhagem germinativa ou um transformante de soja que não é de linhagem germinativa descrito aqui.

[0095] Em ainda outra modalidade da presente descrição, um método para evitar a produção de raízes viáveis a partir de uma população de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas é fornecido. O método compreende as etapas de: a) transformação de uma população de células de soja com um transgene, em que a população de células de soja transformadas compreende uma população de células de soja de linhagem germinativa transformadas e uma população de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas; b) regeneração de um ou mais rebentos a partir da população de células de soja transformadas; c) isolamento de um ou mais rebentos regenerados produzidos a partir da população de células de soja transformadas; d) contato do um ou mais rebentos regenerados isolados com um meio de enraizamento, em que o meio de enraizamento compreende um agente de seleção; e e) cultura do um ou mais rebentos regenerados isolados em meio de enraizamento, em que (i) um ou mais rebentos isolados de células de soja de linhagem germinativa transformadas produzem raízes viáveis na presença do meio de enraizamento contendo um agente de seleção e (ii) um ou mais rebentos isolados de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas evitam a produção de raízes viáveis na presença do meio de enraizamento contendo um agente de seleção. As modalidades anteriormente descritas dos processos de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de soja de linhagem germinativa, o método para identificação de transformantes de soja de linhagem germinativa e o método de produção de um trans-formante de soja de linhagem germinativa ou um transformante de soja que não é de linhagem germinativa são também aplicáveis ao método para a impedir a produção de raízes viáveis a partir de uma população de células de soja que não são de linhagem germinativa transformadas descrito aqui. IV. Sequências que Codificam Traços Agronômicos [0096] Algumas modalidades aqui fornecem um transgene que codifica um polipeptídeo compreendendo um cassete de expressão gêni-ca. Tal transgene pode ser útil em qualquer uma de uma grande variedade de aplicações para produzir plantas de soja transgênicas. Exemplos particulares de um transgene compreendendo um cassete de expressão gênica são fornecidos para fins ilustrativos aqui e incluem um cassete de expressão gênica compreendendo um gene de traço, um gene de RNAi ou um gene marcador selecionável.

[0097] Em manipulação de um gene para expressão em plantas de soja, a tendência de códon da(s) planta(s) hospedeira(s) em perspectiva pode ser determinada, por exemplo, mediante uso de bancos de dados de sequências de DNA publicamente disponíveis para encontrar informações sobre a distribuição códon de genomas de plantas ou as regiões de codificação de proteína de vários genes de plantas.

[0098] Na concepção de regiões de codificação de ácido nucleico para expressão em plantas, os códons primários ("primeira escolha") preferidos pela planta deverão ser determinados, bem como as segunda, terceira, quarta, etc. escolhas de códons preferidos, quando há várias opções. Uma nova sequência de DNA pode, então, ser concebida, a qual codifica a sequência de aminoácidos do mesmo peptídeo, mas a nova sequência de DNA difere da sequência de DNA original pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido, etc.) para especificar o aminoácido em cada posição na sequência de aminoácidos.

[0099] A nova sequência pode, então, ser analisada quanto a sítios de enzimas de restrição que possam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados podem ser adicionalmente modificados através de substituição dos códons pelos códons preferidos de primeira, segunda, terceira ou quarta escolha. Outros sítios na sequência que podem afetar a transcrição ou tradução do gene de interesse incluem estruturas de haste-alça, junções de éxonsdntrons (5' ou 3'), sinais de adição de poliA e sinais de término de RNA polimerase; estes sítios podem ser removidos pela substituição de códons de plantas. A sequência pode ser ainda analisada e modificada para reduzir a frequência de duplas AT ou CG. Além das duplas, blocos de sequência G ou C que têm mais de cerca de seis resíduos que são os mesmos podem afetar a transcrição ou tradução da sequência. Portanto, estes blocos podem ser modificados por substituição dos códons de primeira ou segunda escolha, etc. pelo próximo códon preferido de escolha.

[00100] Uma vez que uma sequência de DNA otimizada (por exemplo, uma otimizada para planta) tenha sido concebida em papel, ou in silico, moléculas de DNA reais podem ser sintetizadas no laboratório para corresponder precisamente, quanto à sequência, à sequência concebida. Tais moléculas de ácido nucleico sintéticas podem ser clo-nadas e de outra forma manipuladas exatamente como se fossem derivadas de fontes naturais ou nativas.

[00101] Um ácido nucleico descrito aqui pode ser clonado em um vetor para transformação em células procariotas ou eucariotas para replicação e/ou expressão. Vetores podem ser vetores procariotas; por exemplo, plasmídeos ou vetores de transporte, vetores de insetos ou vetores eucariotas. Um ácido nucleico descrito aqui pode também ser clonado em um vetor de expressão, por exemplo, para administração a uma célula de planta. Em determinadas aplicações, pode ser preferível ter vetores que sejam funcionais em E. coli (por exemplo, produção de proteína para estimulação de anticorpos, análise de sequência de DNA, construção de insertos, obtenção de quantidades de ácidos nu-cleicos).

[00102] Em uma modalidade, um transgene a ser expresso é descrito no presente Pedido. O cassete de expressão gênica pode compreender um gene de marcador selecionável, um gene de traço ou um gene de RNAi. Exemplos de um gene de marcador selecionável, um gene de traço e um gene de RNAi são ainda fornecidos abaixo. Os métodos descritos no presente Pedido são vantajosos pelo fato de proporcionar um método para seleção de transformantes de linhagem germinativa que não é dependente da função específica do produto proteico ou outra função do transgene.

Transqenes ou Sequência de Codificação que Conferem Resistência à Pragas ou Doenças [00103] (A) Genes de Resistência a doenças de Plantas. Defesas das plantas são muitas vezes ativadas pela interação específica entre o produto de um gene de resistência a doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de plantas podem ser transformadas com o gene de resistência clonado para manipular plantas que sejam resistentes a cepas patogênicas específicas. Exemplos de tais genes incluem o gene Cf-9 de tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266: 789), o gene Pto de tomate, o qual codifica uma quinase de proteína para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262: 1432) e o gene RSSP2 de Ara-bidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089).

[00104] (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado com base na mesma, tal como uma sequência de nucleotídeos de um gene de δ-endotoxina de Bt (Geiser et al., 1986 Gene 48: 109) e um gene inseticida vegetati-vo (VIP) (vide, por exemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93: 5389-94). Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de δ-endotoxinas podem ser adquiridas da American Type Culture Collec-tion (Rockville, Maryland, EUA), sob números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.

[00105] (C) Uma lectina, tal como sequências de nucleotídeos de vários genes de lectina que se ligação à manose de Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24: 825).

[00106] (D) Uma proteína que se ligação a vitaminas, tal como avi-dina e homólogos de avidina, os quais são úteis como larvicidas contra pragas de insetos de ligação da vitamina. Vide Patente dos Estados Unidos N°5.659.026.

[00107] (E) Um inibidor enzimático, por exemplo, um inibidor de pro-tease ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de proteinase de cisteína de arroz (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262: 16793), um inibidor I de protease de tabaco (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21: 985) e um inibidor de α-amilase (Sumitani et ai., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243).

[00108] (F) Um hormônio ou ferormônio específico para insetos, tal como um eediesteroide e hormônio juvenil e uma variante dos mesmos, um mimético com base nos mesmos ou um antagonista ou ago-nista dos mesmos, tal como expressão em baculovírus de hormônio juvenil esterase clonado, um inativador de hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344: 458).

[00109] (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico para insetos o qual, quando de expressão, altera a fisiologia da praga afetada (J. Biol. Chem. 269: 9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de insetos (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989) e neurotoxinas paralisantes específicas para insetos (Patente dos Estados Unidos N°5.266.361).

[00110] (H) Um veneno específico para inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc., tal como um peptídeo inseto-tóxico de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165).

[00111] (I) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de mono-terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico ou um derivado de fenilpropanoide ou outra molécula não proteica com atividade inseticida.

[00112] (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem um gene callas (Pedido PCT Publicado WO93/02197), sequências que codificam quitinase (as quais podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob os números de acesso 67152 e 3999637), quitinase de ancilóstomo de tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23: 691) e o gene de poliubiqui-tina ubi4-2 de salsa (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21: 673).

[00113] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeos para os clones de cDNA de calmodulina de feijão mungo (Botella et al., 1994 Plant Moiec. Biol. 24: 757) e uma sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de milho (Griess et al1994 Plant Physiol. 104: 1467).

[00114] (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Vide Patentes dos Estados Unidos Nos 5.659.026 e 5.607.914; a última ensina peptí-deos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças.

[00115] (M) Uma permease da membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de um peptídeo lítico de β-cecropina (Jaynes et al., 1993 Plant Sei. 89: 43), o qual torna plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanace-arum.

[00116] (N) Uma proteína vira! invasiva ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas do envelope viral em células de plantas transformadas confere resistência à infecções virais e/ou desenvolvimento de doenças causadas pelo vírus a partir do qual o gene da proteína do envelope é derivada, bem como vírus relacionados. Resistência mediada por proteína do envelope foi conferida à plantas transformadas contra o vírus mosaico da alfafa, vírus mosaico do pepino, vírus da listra de tabaco, vírus X de batata, vírus Y de batata, vírus da mancha de tabaco, vírus da mancha marrom de tabaco e vírus mosaico do tabaco. Vide, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28: 451.

[00117] (O) Um anticorpo específico para inseto ou uma imunotoxi-na derivada do mesmo. Assim, um anticorpo objetivado a uma função metabólica crítica no intestino do inseto podería inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh lnt'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interac-tions, mostram inativação enzimática em plantas transgênicas de tabaco através de produção de fragmentos de anticorpos fita simples.

[00118] (P) Um anticorpo específico para vírus. Vide, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266: 469, os quais mostram que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpos recombinantes são protegidas contra ataque viral.

[00119] (Q) Uma proteína que interrompe o desenvolvimento produzido na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, a-1,4-D-poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e liberação de nutrientes de plantas ao solubilizar a homo-a-1,4-D-galacturonase na parede de células de plantas (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10: 1436). A clonagem e caracterização de um gene o qual codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart et al. (1992 Plant J. 2: 367).

[00120] (R) Uma proteína que interrompe o desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação de ri-bossomo de cevada, que confere uma maior resistência a doenças fúngicas (Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10: 3305).

[00121] (S) Interferência de RNA, na qual uma molécula de RNA é usada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA, em um exemplo, é parcial ou totalmente fita dupla, o que desencadeia uma resposta de silenciamento, resultando em divagem do dsRNA em pequenos RNAs de interferência os quais são, então, incorporados em um complexo alvo que destrói mRNAs homólogos. Vide, por exemplo, Fire et al., Patente dos Estados Unidos N°6.506.559; Graham et al., Patente dos Estados Unidos N° 6.573 .099.

Genes que Conferem Resistência a um Herbicida [00122] (A) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida de imidazalinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Genes exemplificativos nesta categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7: 1241), a qual é também conhecida como enzima AHAS (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80: 449).

[00123] (B) Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância ao glifosato conferida por genes de sintase de EPSP e aroA mutantes, ou através de inativação metabólica por genes, tais como GAT (acetiltransferase de glifosato) ou GOX (oxidase de glifosato) e outros compostos de fosfono, tais como glufosinato (genes pat e bar, DSM-2) e ácidos ariloxifenoxipropiônico e ciclo-hexanodionas (genes que codificam inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 4.940.835, a qual descreve a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob Número de Acesso ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é descrita na Patente dos Estados Unidos N°4.769.061. O Pedido de Patente Européia N°0 333 033 e Patente dos Estados Unidos N° 4.975.374 descrevem sequências de nucleotídeos de genes de sintetase de glutamina que conferem resistência a herbicidas, tal como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene de acetiltransferase de fosfinotricina é fornecida no Pedido de Patente Européia N° 0 242 246. De Greef et al. ( 1989) Bio/Technology 7: 61 descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos os quais codificam atividade de acetil transferase de fosfinotricina atividade. Exemplos de genes que conferem resistência ao ácido ariloxifenoxipropiônico e ciclo-hexanodionas, tais como sethoxydim e haloxyfop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83: 435.

[00124] (C) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e um benzonitrila (gene de nitrilase). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3: 169 descrevem o uso de plasmídeos que codificam genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Sequências de nucleotí- deos para genes de nitrilase são descritas na Patente dos Estados Unidos N° 4.810.648 e moléculas de DNA que contêm estes genes estão disponíveis sob números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA que codifica uma S-transferase de glutationa são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285: 173.

[00125] (D) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga à enzimas dioxigenase de hidroxifenilpiruvato (HPPD), as quais catalisam a reação na qual para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isso inclui herbicidas tais como isoxazolas (documentos EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Patente dos Estados Unidos N° 5.424.276), em particular isoxaflutola, a qual é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilos (documentos EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1 -(2-S02CH3-4-CF3-fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-2,3CI2-fenii)propano-1,3-diona, tricetonas (documentos EP625505, EP625508, Patente dos Estados Unidos N° 5.506.195), em particular sulcotrio na, e pirazolinatos. Um gene que produz uma superabundância de HPPD em plantas pode conferir tolerância ou resistência a herbicidas tais como, por exemplo, aqueles descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos 6.268.549 e 6.245.968 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N°2003/0066102.

[00126] (E) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e os quais podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-1) descrito na Patente dos Estados Unidos N°7.838.733 .

[00127] (F) Genes que codificam resistência ou tolerância a herbici- das de auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e os quais podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas de piridiióxi auxina, tais como fluroxypyr ou triclopyr. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (add-12), descrito no documento WO 2007/053482 A2.

[00128] (G) Genes que codificam resistência ou tolerância ao di-camba (vide, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 2003/0135879).

[00129] (H) Genes que conferem resistência ou tolerância a herbicidas que inibem a oxidase de protoporfirinogênio (PPO) (vide Patente dos Estados Unidos N° 5.767.373).

[00130] (I) Genes que conferem resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (tal como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tal como diuron) os quais se ligam à proteínas do núcleo de centros de reação de fotossistema II (PS II) (vide Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245).

Genes que Conferem ou Contribuem para um Traço de Valor Adicionado [00131] (A) Metabolismo de ácidos graxos modificado, por exemplo, através da transformação de milho ou Brassica com um gene antis-senso ou desaturase de estearoil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico na planta (Knultzon et al., 1992, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89: 2624).

[00132] (B) Teor de fitato reduzido: [00133] (1) Introdução de um gene que codifica fitase, tal como o gene de fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127: 87), o qual aumenta a decomposição de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada.

[00134] (2) Poderia ser introduzido um gene que reduz o teor de fitato. Em milho, por exemplo, isto pode ser obtido por meio de clona- gem e, então, reintrodução do DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al, 1990 Maydica 35: 383).

[00135] (C) Composição de carboidrato modificada causada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Exemplos de tais enzimas incluem, gene de frutosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza et al., 1988, J. Bacteriol. 170: 810), gene de levansu-crase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200: 220), α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen et al, 1992, Bio/Technology 10: 292), genes de invertase de tomate (Elliot et al, 1993), gene de amilase de cevada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268: 22480) e enzima II de ramificação de amido em endosperma de milho (Fisher et al., 1993 Plant Physiol 102: 10450).

[00136] Para expressar um gene de marcador selecionável, um gene de traço ou um gene de RNAi em uma célula de soja, um ácido nu-cleico que codifica a proteína é, tipicamente, subclonado em um vetor de expressão que contém um promotor para dirigir a transcrição. Promotores bacterianos e eucariotas adequados são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Clo-ning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989; 3a ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Pro-tocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra). Sistemas de expressão bacterianos para expressão de um ácido nucleico aqui estão disponíveis, por exemplo, em E. coli, Bacillus sp. e Salmonella (Paiva et al., Gene 22: 229-235 (1983)). Kits para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucariotas para células de mamífero, levedura e células de inseto são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e estão também comercialmente disponíveis.

[00137] O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética para a célula é selecionado levando-se em conta o uso pretendido (por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos e protozoários). Vetores de expressão bacterianos e de animais convencionais são conhecidos na técnica e são descritos em detalhes, por exemplo, na Publicação de Patente dos Estados Unidos US 2005/0064474A1 e Publicações de Patente Internacional WO 05/084190, W005/014791 e W003/080809. Métodos de transfecção convencionais podem ser usados para produzir linhagens de células bacterianas que expressam grandes quantidades de proteína as quais podem, então, ser purificadas usando técnicas convencionais.

[00138] A seleção de um promotor usado para dirigir a expressão de um ácido nucleico aqui depende da aplicação particular. Uma série de promotores que dirigem a expressão de um gene em uma planta podem ser empregados em modalidades aqui. Tais promotores podem ser selecionados de promotores constitutivos, quimicamente regulados, indutíveis, tecido específicos e semente preferidos. Por exemplo, um promotor constitutivo forte apropriado para a célula hospedeira pode ser usado para expressão e purificação das proteínas expressas. Exemplos não limitativos de promotores de plantas incluem sequências promotoras derivadas de ubiquitina-10 (ubi-10) de A. thaliana (Callis, et ai, 1990, J. Biol. Chem., 265: 12486-12493); sintase de ma-nopina de A. tumefaciens (Amas) (Petolino et ai, Patente dos Estados Unidos N° 6.730.824); e/ou vírus mosaico do veio d e mandioca (CsVMV) (Verdaguer et al, 1996, Plant Molecular Bíology 31: 1129-1139).

[00139] Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do Vírus Mosaico da Couve-Flor 35S do núcleo (Odell et al. (1985) Na-ture 313: 810-812); promotor de actina de arroz (McElroy et al (1990) Plant Cell 2: 163-171); promotor de ubiquitina de milho (Patente dos Estados Unidos N° 5.510.474, Christensen et al. (1 989) Plant Mol. Bi- ol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); promotor pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); Promotor ALS (Patente dos Estados Unidos N° 5.659.026); promotor de histona de milho (Chabouté et al. Plant Molecular Biology, 8: 179-191 (1987)); e similares.

[00140] A faixa de promotores disponíveis compatíveis com plantas inclui promotores indutíveis e tecido específicos. Um elemento regulador indutível é um que é capaz, direta ou indiretamente, de ativar a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator proteico que se liga especificamente a um elemento regulador indutível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é, então, direta ou indiretamente convertida à forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico, tal como uma proteína, um metabólito, um regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente pelo calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente pela ação de um patógeno ou agente causador de doença, tal como um vírus. Tipicamente, o fator proteico que se liga especificamente a um elemento regulador indutível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é, então, direta ou indiretamente convertida à forma ativa pelo indutor. Uma célula de planta que contém um elemento regulador indutível pode ser exposta a um indutor aplicando-se o indutor externamente à célula ou planta, tal como por pulverização, rega, aquecimento ou métodos similares.

[00141] Qualquer promotor indutível pode ser usado em modalidades aqui. Vide Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Promotores indutíveis incluem, por exemplo e sem limitação: promotores do receptor de ecdisona (Patente dos Estados Unidos N° 6.504.082); promotores do sistema ACE1, os quais respondem ao cobre (Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); genes In2-1 e ln2-2 de milho, os quais respondem a herbicidas fitoprotetores de sulfonamida (Patente dos Estados Unidos N° 5.364.780; Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991); promotores de um gene de hormônio esteroidal, a atividade de transcrição do qual é induzida por um hormônio de glucocorti-costeroide (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 10421 (1991) e McNeliis et al., (1998) Plant J. 14(2): 247-257); o promotor GST de milho, o qual é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergência (vide Patente dos Estados Unidos N° 5.965.387 e Publicação de Pedido de Patente Internacional N°WO 93/001294); e o promotor PR-1a de tabaco, o qual é ativado por ácido salicílico (vide Ono S, Kusama M, Ogura R, Hirat-suka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Repórter System", Biosci Biotechnol Biochem. 23 de Setembro de 2011; 75(9): 1796-800). Outros promotores quimicamente regulados de interesse incluem promotores reprimíveis por tetraciclina e indutí-veis por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 e Patentes dos Estados Unidos Nos 5.814.618 e 5.789.156).

[00142] Outros promotores reguláveis de interesse incluem um elemento regulador que responde ao frio ou um elemento regulador de choque térmico, a transcrição do qual pode ser realizada em resposta à exposição ao frio ou calor, respectivamente (Takahashi et al., Plant Physiol. 99: 383-390, 1992); o promotor do gene de desidrogenase de álcool (Gerlach et al., PNAS USA 79: 2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19): 6624-6628 (1987)) indutivel por condições anaeróbias; o promotor indutível pela luz derivado do gene rbcS de ervilha ou gene psaDb de ervilha (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265); um elemento regulador indutível pela luz (Feinbaum et al., Mol. Gen. Ge-net. 226: 449, 1991; Lam e Chua, Science 248: 471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20): 9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6): 1129-1138); um elemento regulador indutível por hormônio de planta (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15: 905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15: 225, 1990) e similares. Um elemento regulador indutível pode também ser o promotor do gene In2-1 ou ln2-2 de milho, o qual responde a herbicidas fito-protetores de sulfonamida (Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227: 229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243: 32-38, 1994) e o repres-sor Tet do transposon Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237, 1991).

[00143] Promotores indutíveis por estresse incluem promotores in-dutíveis por estresse pelo sal/água, tal como P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129: 81-89); promotores indutíveis pelo frio, tais como cor15a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93: 1246-1252), cor15b (Wi-Ihelm et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol Biol. 33: 897-909) e ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113: 335-45); promotores indutíveis pela estiagem, tais como Trg-31 (Chaudhary et al (1996) Plant Mol. Biol. 30: 1247-57) e rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18: 287-291); promotores indutíveis pela pressão osmótica, tais como Rab17 (Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17: 985-93) e osmotina (Raghothama et al. (1993) Plant Mol Biol 23: 1117-28); promotores indutíveis pelo calor, tais como proteínas de choque térmico (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19: 665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14: 27-41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47: 325-338); e o elemento indutível por choque térmico do promotor de ubiquitina de salsa (documento WO 03/102198). Outros promotores indutíveis pelo estresse incluem rip2 (Patente dos Estados Unidos N°5.332.808 e Publicação dos Estados Unidos N°2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozak i et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236: 331-340). Determinados promotores são indutíveis por feridas, incluindo o promotor pMAS de Agrobacterium (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343).

[00144] Promotores tecido preferidos podem ser utilizados para objetivar transcrição e/ou expressão aumentada em um tecido de planta em particular. Exemplos desses tipos de promotores incluem expressão preferida em semente, tal como aquela conferida pelo promotor de faseolina (Bustos et al.1989. The Plant Ce//Vol. 1, 839-853) e o gene de globulina-1 de milho (Belanger, et al. 1991 Genetics 129: 863-972). Para dicotiledôneas, promotores preferidos para semente incluem, porém sem limitações, β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lecti-na de soja, cruciferina e similares. Para monocotiledôneas, promotores preferidos para semente incluem, porém sem limitações, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, γ-zeína, ceras, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Promotores preferido para sementes também incluem aqueles promotores que dirigem a expressão de genes específicos para tecidos predominantemente dentro da semente tais como, por exemplo, o promotor endosperma preferido γ-zeína, o promotor críptico de tabaco (Fobert et al. 1994. T-DNA Tag-ging of a Seed Coat-Specific Cryptic Promoter in Tobacco. Plant J. 4: 567-577), o promotor do gene P de milho (Chopra et al. 1996. Alleles of The Maize P Gene With Distinct Tissue Specificities Encode Myb-Homologous Proteins With C-Terminal Replacements. Plant Cell 7: 1149-1158, Errata em Plant Cell. 1997, 1: 109), o promotor de globuli- na-1 de milho (Belenger e Kriz.1991. Molecular Basis For Allelic Poly-morphism of The Maize Globulin-1 Gene. Genetics 129: 863-972) e promotores que dirigem a expressão ao revestimento da semente ou casca de grãos de milho, por exemplo, o promotor de sintetase de glu-tamina específico para o pericarpo (Muhitch et al.,2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase-i_2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163: 865-872).

[00145] Além do promotor, um vetor de expressão contém, tipicamente, uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais necessários para expressão do ácido nucleico nas células hospedeiras, quer procariotas ou eucario-tas. Um cassete de expressão típico contém, assim, um promotor funcionalmente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína e sinais necessários, por exemplo, para polia-denilação eficaz do transcrito, término de transcrição, sítios de ligação ribossômica ou término de tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, intensificadores e sinais de splicing hete-rólogos.

[00146] Outros componentes do vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso pretendido para o gene. Exemplos incluem marcadores selecionáveis, sequências de objetivação ou reguladoras, sequências de peptídeo de trânsito, tal como a sequência de peptídeo de trânsito otimizada (vide Patente dos Estados Unidos N° 5.510.471), sequências de estabilização, tal como RB7 MAR (vide Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692 e documento WO9727207) ou sequências líderes, íntrons, etc. Descrições gerais e exemplos de vetores de expressão de plantas e genes repórter podem ser encontrados em Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" em Me-thods in Plant Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy. Glick et al eds; CRC Press, páginas 89-119 (1993).

[00147] A seleção de um vetor de expressão apropriado dependerá do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão pode incluir, no término 3' de uma sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de término de transcrição e tradução funcional em plantas. A região de término pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de término convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de término de sintase de octopina e sintase de nopalina (nos) (Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1: 561-573 (1982) e Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, N° 20, páginas 7831-7846 (nos)); vide também Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262: 141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64: 671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5: 141-149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2: 1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91: 151-158 (1990); Bailas et al. Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639 (1987).

[00148] Um cassete de expressão pode conter uma sequência líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para aumentar a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, líderes de picornavírus, líder de EMCV (região não codifica-dora 5' de encefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86: 6126-6130 (1989)); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Vírus da Mancha Marrom de Tabaco) (Carrington e Freed, Journal of Virology, 64: 1590-1597 (1990), líder de MDMV (Vírus Mosaico Anão de Milho) (Allison et al., Virology 154: 9-20 (1986)); proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. Nature 353: 90-94 (1991)); líder não traduzido do mRNA do envelope proteico do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al.

Nature 325: 622-625 (1987)); líder do vírus mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256); e líder do vírus da mancha clorótica de milho (MCMV) (Lommel et al. Viro-logy 81: 382-385 (1991)). Vide também Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84: 965-968 (1987).

[00149] O construto pode também incluir sequências que aumentam a tradução e/ou a estabilidade do mRNA, tais como íntrons. Um exemplo de um tal íntron é o primeiro íntron do gene II da variante III de histona H3 de Arabidopsis thaliana (Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225: 569-574 (1992)).

[00150] Naqueles casos onde é desejável ter o produto expresso da sequência de nucleotídeos heteróloga dirigido para um organela particular, particularmente o plastídeo, amiloplasto ou ao retículo endo-plasmático, ou secretado na superfície da célula ou extracelularmente, o cassete de expressão pode ainda compreender uma sequência de codificação para um peptídeo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitações, o peptídeo de trânsito para a proteína veículo acila, a pequena subuni-dade de RUBISCO, sintase de EPSP de planta e Helianthus annuus (vide Lebrun et al., Patente dos Estados Unidos N° 5.510.417), o peptídeo de trânsito de cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson et al. Plant Physiol 117(4): 1235-1252 (1998); Sullivan et al., Planta (1995) 196(3): 477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26): 18999-9004) e similares. Além disso, peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos são conhecidos na técnica, tal como o peptídeo de trânsito otimizado (vide Patente dos Estados Unidos Número 5.510.471). Peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais foram descritos anteriormente nas Patentes dos Estados Unidos Nos 5.717.084; 5.728.925. Aqueles versados na técnica apreciarão de imediatos muitas opções disponíveis para expressar um produto em um organela particular. Por exemplo, a sequência de alfa-amilase de cevada é frequentemente usada para dirigir a expressão ao retículo endoplasmático (Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985).

[00151] Será apreciado por aqueles versados na técnica que o uso de tecnologias de DNA recombinante pode aprimorar o controle de expressão de moléculas de ácido nucleico transfectadas por meio de manipulação, por exemplo, do número de cópias das moléculas de ácido nucleico dentro da célula hospedeira, da eficiência com a qual as moléculas de ácido nucleico são transcritas, da eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e da eficiência de modificações pós-traducionais. Adicionalmente, a sequência do promotor pode ser geneticamente modificada para aprimorar o nível de expressão comparado com o promotor nativo. Técnicas recombinantes úteis para controlar a expressão de moléculas de ácidos nucleicos incluem, porém sem limitações, integração estável das moléculas de ácido nucleico em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, adição de sequências de estabilização de vetor em plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modificações de sinais de controle de tradução (por exemplo, sítios de ligação ribos-sômica, sequências de Shine-Dalgarno ou sequências de Kozak), modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de códons da célula hospedeira e supressão de sequências que desesta-bilizam transcritos.

[00152] Genes marcadores ou repórter para seleção de células ou tecidos ou partes de plantas ou plantas transformadas podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabólitos, tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, redutase de di-hidrofolato, a qual confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13: 143-149, 1994; vide também Herrera Es-trella et al., Nature 303: 209-213, 1983; Meijer et ai., Plant Mol. Biol. 16: 807-820, 1991); fosfotransferase de neomicina, a qual confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2: 987-995, 1983 e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sei USA 80: 4803 (1983)); fosfotransferase de higromicina, o qual confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32: 481-485, 1984; vide também Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5: 103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108: 219-227, 1995); trpB, o qual permite que as células utilizem indola em vez de triptofano; hisD, o qual permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 85: 8047, 1988); isomerase de manose-6-fosfato, a qual permite que as células utilizem manose (documento WO 94/20627); descarboxilase de ornitina, o qual confere resistência ao inibidor de descarboxilase de ornitina, 2-(difluorometil)-DL-ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Bioloqy, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Asper-gillus terreus, a qual confere resistência à blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59: 2336-2338, 1995).

[00153] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma sintase de acetolactato mutante, a qual confere resistência à imi-dazolinona ou sulfonilureia (Lee et al., EMBO J. 7: 1241-1248, 1988), um psbA mutante, o qual confere resistência à atrazina (Smeda et al., Plant Physiol. 103: 911-917, 1993) ou uma oxidase de protoporfirino-gênio mutante (vide Patente dos Estados Unidos N°5 .767.373) ou outros marcadores que conferem resistência a um herbicida, tal como glufosinato.. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém sem limitações, genes que codificam resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2: 987-992, 1983); es-treptomicina (Jones et al, Mol Gen. Genet 210: 86-91, 1987); especti- nomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5: 131-137, 1996) bleomicina (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171-176, 1990); sulfonamida: (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15: 127-136, 1990), bromoxynil (Stalker et al., Science 242: 419-423, 1988); glifosato (Shaw et al., Science 233: 478-481, 1986); fosfinotricina (DeBlock et al., EMBO J. 6: 2513-2518, 1987) e similares.

[00154] Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA que codifica resistência ao glufosinato e, em uma modalidade, pode ser o gene de acetil transferase de fosfinotricina (PAT), gene pat ou gene bar otimizados para milho sob o controle do promotor do vírus mosaico do veio da mandioca. Estes genes conferem resistência ao bialaphos (vide Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37); Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11: 835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631, 1990; e Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219: 492, 1989). Uma versão do gene pat é o gene pat otimizado para milho descrito na Patente dos Estados Unidos N° 6.09 6.947.

[00155] Além disso, marcadores que facilitam a identificação de uma célula de planta que contenha o polinucleotídeo que codifica o marcador podem ser empregados. Marcadores contáveis ou passíveis de rastreio são úteis onde a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula de planta. Exemplos incluem β-glucuronidase ou o gene uidA (GUS), o qual codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos 5.268.463 e 5.599.670); acetil transferase de cloranfenicol (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 N°13, páginas 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é o beta-caroteno ou provitamina A (Ye et al, Science 287: 303-305 (2000)). O gene tem sido utilizado para melhorar a nutrição de arroz mas, neste caso, é usado em vez de um marcador detectável e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourada fornecida. Ao contrário da situação onde o gene é usado por sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor da proteína é suficiente para fins de marcação. Outros marcadores incluem os genes passíveis de rastreio de antocianinas/flavonoides em geral (vide discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990) 2: 115-127) incluindo, por exemplo, um gene de R-locus, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianinas (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al., em Chromosome Structure and Function. Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., páginas 263-282 (1988)); genes que controlam a biossíntese de pigmentos de flavonoides, tais como o gene C1 de milho (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242: 40-48) e C2 de milho (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203: 202-207); o gene B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1: 1175-1183), o gene p1 (Grotewold et al, Proc. Natl. Acad. Sei USA (1991) 88: 4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76: 543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39: 11-19); genes do locus bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119: 185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), dentre outros.

[00156] Outros exemplos de marcadores adequados incluem o gene da proteína fluorescente ciano (CYP) gene (Boite et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), o gene da proteína fluorescente verde (PHIYFP™ da Evrogen; see Boite et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, o qual codifica uma luciferase, a presença do qual pode ser detectada usando, por exemplo, um filme de raios X, contagem de cintilação, espec-trofotometria fluorescente, câmaras de vídeo de baixa luminosidade, câmaras de contagem de fótons ou luminometria com múltiplas cavi- dades (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8: 343); um gene de proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5): 777-844); e DsRed2, onde as células de plantas transformadas com o gene marcador são de cor vermelha e, assim, visualmente selecionáveis (Die-trich et al. (2002) Biotechniques 2(2): 286-293). Exemplos adicionais incluem um gene de β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sei. U. S.A. (1978) 75: 3737), o qual codifica uma enzima para a qual são conhecidos diversos substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica) ; um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. (1983) 80: 1101), o qual codifica uma dioxigenase de catecol que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8: 241); e um gene de tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129: 2703), o qual codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina em DOPA e dopaquinona a qual, por sua vez, se condensa para formar o composto melanina facilmente detectável. Evidentemente, muitos destes marcadores estão disponíveis e são conhecidos por aqueles versados na técnica. V. Ensaios para Detecção de um Transgene ou Produto Expresso de um Transgene [00157] Vários ensaios podem ser usados para detectar o transgene descrito em determinadas modalidades da descrição. As técnicas a seguir são úteis em uma variedade de situações e, em uma modalidade, são úteis na detecção da presença de uma molécula de ácido nu-cleico e/ou do polipeptídeo que codifica um transgene em uma célula de planta. Por exemplo, a presença da molécula pode ser determinada em uma variedade de formas, incluindo usando um iniciador ou sonda da sequência, ensaio ELISA para detectar a proteína codificada, uma Western Blot para detectar a proteína ou uma Northern ou Southern blot para detectar RNA ou DNA. Ensaios enzimáticos para detecção da enzima DGT-14 podem ser empregados. Ainda, um anti- corpo que pode detectar a presença da proteína DGT-14 pode ser gerado usando procedimentos reconhecidos na técnica. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração enzimática e imunocoloração, também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão do construto recombinante em órgãos e tecidos específicos de plantas. O transgene pode ser expresso seletivamente em alguns tecidos da planta ou em algumas etapas de desenvolvimento ou o transgene pode ser expresso em praticamente todos os tecidos da planta, substancialmente ao longo de todo seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de expressão combinatória também é aplicável.

[00158] Análise de Southern é um método de detecção comumente usados, em que o DNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o DNA pelo peso molecular e, então, transferido para membranas de náilon. Ele é, então, hibridizado com o fragmento de sonda, o qual foi radioativamente marcado com 32P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma solução de SDS.

[00159] Do mesmo modo, análise de Northern implementa um protocolo similar, em que o RNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado sobre um gel de agarose para separar o RNA pelo peso molecular e, então, transferido para membranas de náilon. Ele é, então, hibridizado com o fragmento da sonda, o qual foi radioativamen-te marcado com 32P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma solução de SDS. Análise de RNA (por exemplo, mRNA) isolado a partir dos tecidos de interesse pode indicar os níveis relativos de expressão. Tipicamente, se o mRNA está presente ou a quantidade de mRNA aumentou, pode presumir-se que o transgene correspondente está sendo expresso. Análise de Northern, ou outros protocolos de análise de mRNA, pode ser usada para determinar os níveis de expressão de um transgene introduzido ou gene nativo.

[00160] Em análise de Western, em vez de isolar o DNA/RNA, a proteína de interesse é extraída e colocada sobre um gel de acrilami-da. A proteína é, então, transferida para uma membrana e contatada com uma substância de marcação. Vide, por exemplo, Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characteri-zation of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purifi-cation", Molecular Breeding 3: 291-306 (1997); Towbin et al, (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitro-celluiose sheets: procedure and some applications", Proc Natl Acad Sei USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen strueture", Proc Natl Acad Sei USA 76(7): 3116-3120.

[00161] Em análise de Western, em vez de isolar o DNA/RNA, a proteína de interesse é extraída e colocada sobre um gel de acrilami-da. A proteína é, então, transferida para uma membrana e contatada com uma substância de marcação. Vide, por exemplo, Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characteri-zation of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purifi-cation", Molecular Breeding 3: 291-306 (1997); Towbin et al, (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitro-cellulose sheets: procedure and some applications", Proc Natl Acad Sei USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen strueture", Proc Natl Acad Sei USA 76(7): 3116-3120.

[00162] Em análise de Western, em vez de isolar o DNA/RNA, a proteína de interesse é extraída e colocada sobre um gel de acrilami-da. A proteína é, então, transferida para uma membrana e contatada com uma substância de marcação. Vide, por exemplo, Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characteri-zation of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purifi-cation", Molecular Breeding 3: 291-306 (1997); Towbin et al, (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitro-celiuiose sheets: procedure and some applications", Proc Natl Acad Sei USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen strueture", Proc Natl Acad Sei USA 76(7): 3116-3120.

[00163] Outro exemplo de método de detecção é a técnica de pi-rossequenciamento, conforme descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 100: 18-24, 2000). Neste método, é concebido um oligonucleotí-deo que se sobrepõe à junção de DNA de inserto e DNA genômico adjacente. O oligonucleotídeo é hibridizado com o produto de PCR fita simples a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e outro na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, api-rase, adenosina 5' fosfossulfato e luciferina. dNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência de flanquea mento/inserto transgênico em virtude de amplificação, hibridiza-ção e extensão de uma única ou múltiplas bases bem sucedidas. (Esta técnica é usada para sequenciamento inicial, não para detecção de um gene específico quando ele é conhecido).

[00164] Beacons moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência. Resumidamente, é concebida uma sonda de oligonucleotídeo para FRET a qual se sobrepõe à junção do DNA de inserto e genômico de flanqueamento. A estrutura única da sonda de FRET resulta no fato de que ela contém uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescente e de dissipação em estreita proximidade. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA do inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Após amplificação bem sucedida por PCR, hibridização da(s) sonda(s) de FRET à sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções de fluorescência e dissi-pação. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto transgênico/genômica de flanqueamento em virtude de amplificação e hibridização bem sucedidas.

[00165] Ensaio de sonda de hidrólise, de outro modo conhecido como TaqMan® (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Resumidamente, é concebida uma sonda de oligonucleotídeo para FRET com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de flanqueamento para detecção evento específica. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserto e um na sequência genômica de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridização da sonda de FRET resulta em divagem e liberação da porção fluorescente da porção de dissipação da sonda de FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de inserto de flanqueamento/transgene em virtude de amplificação e hibridização bem sucedidas.

[00166] O ELISA ou imunoensaios enzimático é conhecido desde 1971. Em geral, antígenos solubilizados em um tampão são revestidos sobre uma superfície de plástico. Quando soro é adicionado, anticorpos podem se ligar ao antígeno sobre a fase sólida. A presença ou ausência destes anticorpos pode ser demonstrada quando conjugados a uma enzima. Adição do substrato adequado detectará a quantidade de conjugado ligado que pode ser quantificado. Um ensaio ELISA comum é um o qual usa anticorpos policlonais biotinilado anti-(proteína) e um conjugado de fosfatase alcalina. Por exemplo, um ensaio ELISA usado para determinação quantitativa de níveis de lacase pode ser um ensaio em sanduíche de anticorpo, o qual usa anticorpos policlonais de coelho obtidos comercialmente. O anticorpo foi conjugado com fosfatase alcalina para detecção. Em outro exemplo, um ensaio ELISA para detectar tripsina ou tripsinogênio usa anticorpos policlonais anti-tripsina e anti-tripsinogênio biotinilados e um conjugado de estreptavi-dina-fosfatase alcalina.

[00167] Modalidades da presente descrição são adicionalmente exemplificadas nos exemplos a seguir. Deverá ser entendido que estes exemplos são fornecidos a título de ilustração apenas. A partir das modalidades acima e dos exemplos a seguir, aqueles versados na técnica podem determinar as características essenciais da presente descrição sem se afastar do espírito e âmbito da mesma, podem fazer várias alterações e modificações das modalidades da descrição para adaptá-la aos vários usos e condições. Assim, várias modificações de modalidades da descrição, além daquelas apresentadas e descritas aqui, serão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também se destinam a cair dentro do âmbito das reivindicações anexas. O seguinte é fornecido como forma de ilustração e não se destina a limitar o âmbito da invenção.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: RESPOSTA DE CRESCIMENTO DE SOJA A CONCENTRAÇÕES VARIADAS DE GLUFOSINATO

[00168] Estudos de resposta de crescimento a diferentes concentrações de agente de seleção foram realizados usando rebentos de soja não transgênica. Neste exemplo, glufosinato foi usado como o agente de seleção exempiificativo. Rebentos de soja foram regenerados a partir de tecidos de soja de semente em divisão e cultivados so- bre meio de Indução de Rebentos até que rebentos tivessem se desenvolvido e estivessem prontos para transferência para meio de enraizamento. Várias concentrações diferentes de glufosinato (0, 0,25 mg/L, de 0,50 mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L e 6 mg/L) foram incorporadas em meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico e 7 g/L de agar NOBLE™, pH de 5,6) para determinar quais concentrações de glufosinato inibiam o desenvolvimento das raízes. Embora 100% dos rebentos de soja tenham produzido raízes quando cultivados em meio de enraizamento sem glufosinato, nenhuma formação de raízes foi observada para rebentos de soja cultivados sobre meio de enraizamento suplementado com 1 a 6 mg/L de glufosinato. No entanto, 90% e 50% dos rebentos de soja cultivados sobre meio de enraizamento contendo glufosinato em concentrações de 0,25 mg/L e 0,5 mg/L, respectivamente, produziram raízes (vide Tabela 1). A concentração efetiva de glufosinato para inibição de crescimento e desenvolvimento de rebentos de soja foi determinada como sendo de pelo menos 1,0 mg/L de glufosinato. Maiores concentrações de glufosinato (por exemplo, concentrações maiores do que 1,0 mg/L) foram eficazes em inibição do desenvolvimento de raiz.

Tabela 1: Efeito de diferentes concentrações de glufosinato sobre o enraizamento de rebentos de soja regenerados in vitro.

EXEMPLO 2: CONSTRUTO DE DNA

[00169] Um vetor binário único marcado como pDAB9381 (Figura 1) foi construído usando processos reconhecidos na técnica. Vide Sam-brook et al. (1989) e Ausubel et al. (1997). pDAB9381 contém duas Unidades de Transcrição de Planta (Plant Transcription Units - PTUs). A primeira PTU (SEQ ID NO: 1) consiste no promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbilO; Callis J, et al., (1990) J. Biol. Chem. 265: 12486-12493) o qual comanda a sequência de codificação de proteína de fluorescência amarela (PhiYFP; Shagin, et al., (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5), 841-850), que contém um íntron isolado do gene LS-1 indutível pela luz tecido específico de Solanum tubero-sum (íntron ST-LS1; Acesso Genbank N°X04753) e é term inado pela região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta-23 de Agrobacte-rium tumefaciens (AtuORF23 3'UTR; Patente EP N° 222493). A segunda PTU (SEQ ID NO: 2) foi clonada dentro da sequência de codificação de isopenteniltransferase (ipt CDS; Acesso Genbank N° X00639.1), que consiste no promotor do Vírus Mosaico do Veio de Mandioca (promotor CsVMV; Verdaguer B, et al., (1996) Plant. Mol. Biol. 31: 1129-1139), o qual é usado para comandar a sequência de codificação de acetil-transferase de fosfinotricina (PAT; Wohlleben W, et al., (1988) Gene 70: 25-38), terminada pela região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta-1 de A. tumefaciens (AtuORFI 3'UTR; Hu-ang ML et al., (1990) J. Bacteriol., 172: 1814-1822). O vetor binário resultante continha um gene repórter visual e um gene marcador de seleção a antibióticos e foi subsequentemente usado para a transfor- mação de soja. Agrobacterium tumefaciens EHA105 (Hood E., Helmer G„ Fraley R., Chilton M., (1986) J. Bacterioi, 168: 1291-1301) foi ele-troporada com o vetor binário pDAB9381. Foram identificadas colônias isoladas as quais cresciam sobre meio YEP contendo o antibiótico es-pectinomicina. Colônias únicas foram isoladas e a presença do vetor binário pDAB9381 foi confirmada através de digestão com enzimas de restrição.

EXEMPLO 3: PREPARO DE MATERIAL DE PLANTA

[00170] A superfície de sementes maduras de soja (Glycine max cv. Maverick) foi esterilizada usando cloro gasoso em um grande secador PYREX™ durante cerca de 16 horas. Após esterilização, as sementes foram colocadas em uma câmara de fluxo laminar durante cerca de 30 minutos para remover o excesso de cloro gasoso. Sementes esterilizadas foram embebidas em água estéril em placas de Petri™ durante cerca de 16 horas a 24 Ό. A placas de PETRI™ fora m colocadas em caixas pretas para manter as sementes de soja no escuro.

EXEMPLO 4: TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS TRANSFORMAÇÃO DE NÓS COTILEDONARES DE SOJA

[00171] Transformação mediada por Agrobacterium de soja (Glycine max c.v., Maverick) foi realizada usando uma cepa de Agrobacterium abrigando um vetor binário através de um procedimento modificado de Zeng P., et ai, (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482. Neste exemplo, glufosinato foi usado como o agente de seleção exemplifica-tivo. O protocolo foi modificado para incluir o herbicida glufosinato como um agente de seleção. Além disso, outra modificação incluía a germinação de sementes de soja esterilizadas em meio básico B5 (Gamborg et ai, (1968) Exp Cell Res. Abril; 50(1): 151-8) solidificado com 3 g/L de PHYTAGEL™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). A modificação final no protocolo emprega o uso de explantes de nós cotiledo-nares preparados a partir mudas de 5-6 dias de idade infectadas com Agrobacterium, conforme descrito por Zhang et ai, (1999) Plant Cell Tiss. Org. 56: 37-46. Conforme descrito em Zeng et al. (2004), a co-cultura é realizada durante 5 dias em meio de cocultura. Meios para início de rebentos, alongamento de rebentos e enraizamento são suplementados com 50 mg/L de CEFOTAXIME™, 50 mg/L de TIMEN-TIN™, 50 mg/L de VANCOMYCIN™ e solidificados com 3 g/L de PHYTAGEL™.

MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE MEIA-SE MENTE DE SOJA

[00172] Transformação mediada por Agrobacterium de soja (Glyci-ne max c.v., Maverick) foi realizada usando uma cepa de Agrobacterium abrigando um vetor binário através de um procedimento modificado de Paz M., et al., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213. Resumidamente, sementes de soja foram cortadas ao meio por um corte longitudinal ao longo do hilo para separar a semente e retirar a casca da semente. O eixo embrionário foi excisado e quaisquer rebentos axi-ais/brotos foram removidos do nó cotiledonar. Os explantes de meia-semente resultantes foram infectados com Agrobacterium. Meios para início de rebentos, alongamento de rebentos e enraizamento são suplementados com 50 mg/L de CEFOTAXIME™, 50 mg/L de TIMEN-TIN™, 50 mg/L de VANCOMYCIN™ e solidificados com 3 g/L de PHYTAGEL™. Seleção com glufosinato foi usada para inibir o crescimento de rebentos não transformados.

MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA EM SEMENTE DIVIDIDA COM EIXO DE EMBRIÃO PARCIAL

[00173] Transformação mediada por Agrobacterium de soja (Glyci-ne max c.v., Maverick) foi realizada usando uma cepa de Agrobacterium abrigando o vetor binário pDAB9381 através do protocolo de transformação de soja por explante de semente dividida com eixo de embrião parcial descrito no Depósito dos Estados Unidos N° 61/739.349, aqui incorporado por referência. Após transformação, os tecidos de soja foram cultivados usando os métodos de cultura tecidu-al descritos abaixo.

EXEMPLO 5: CULTURA TECIDUAL

[00174] Sementes de soja transformadas foram cultivadas usando o protocolo de cultura tecidual conforme descrito no Depósito dos Estados Unidos N°61/739.349, aqui incorporado por referência. Cocultura das sementes de plantas de soja com uma cepa de Agrobacterium contendo o plasmídeo pDAB9381 foi realizada durante 5 dias em meio de cocultura coberto com um papel filtro. Após 5 dias de incubação em meio de cocultura, os explantes foram lavados em meio de Indução de Rebento (Shoot Induction - SI) líquido durante cerca de 5 a 10 minutos. Os explantes foram, então, cultivados em meio de Indução de Re-bento-l (Sl-I). As sementes de soja foram orientadas de modo que o lado plano da semente de soja estivesse voltado para cima e a extremidade nodal do cotilédone de soja estivesse embebido em meio Sl-I. Após 2 semanas de cultura a 24 Ό com um fotoperíod o de 18 horas, os explantes foram transferidos para meio de Indução de Rebento-ll (Sl-II) suplementado com 6 mg/L de glufosinato. Após 2 semanas em meio Sl-ll, os cotilédones foram removidos dos explantes, um pedaço do rebento embebido foi retirado fazendo um corte na base do cotilédone e o rebento isolado foi transferido para meio de Alongamento de Rebento (Shoot Elongation - SE). As culturas foram transferidas para meio SE fresco a cada duas semanas. Placas de PETRI™ não foram envolvidas com papel filtro ao longo dos estágios de indução de rebentos e alongamento de rebentos. Fontes de iluminação foram fornecidas com uma iluminação de 80-90 pmoles s"1 rrf2 para os tecidos transformados durante indução de rebentos e alongamento de rebentos.

[00175] Os rebentos alongados foram mergulhados em 1 mg/L de ácido indola 3-butírico (IBA) durante cerca de 1-3 minutos para promover o enraizamento antes de transferência dos rebentos isolados para meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico e 7 g/L de agar NO-BLE™, pH de 5,6) em bandejas Phyta. Um agente de seleção de glu-fosinato em uma concentração de 1 mg/L foi incorporado no meio de enraizamento para um subconjunto dos experimentos de transformação.

[00176] Após cultura no meio de enraizamento a 24 °C com um fo-toperíodo de 18 horas durante 1-2 semanas, os rebentos de soja que produziram raízes saudáveis viáveis foram transferidos para o solo. Os rebentos de soja compreendendo raízes viáveis saudáveis foram colocados no solo, o qual estava contido em um copo de sundae de plástico aberto. Os copos de sundae de plástico contendo os rebentos de soja transferidos compreendendo raízes foram colocados em um CONVIRON™ para aclimatização das plântulas de soja. As plântulas de soja enraizadas foram aclimatadas nos copos de sundae abertos durante várias semanas antes que as plântulas fossem transferidas para a estufa.

EXEMPLO 6: USO DE AGENTES DE SELEÇÃO NO MEIO DE ENRAIZAMENTO

[00177] A incorporação de um agente de seleção compreendendo glufosinato em meio de enraizamento para cultura de tecidos de soja foi testada para reduzir a formação de eventos de soja que não são de linhagem germinativa, eventos de transformação de soja quiméricas e escapes. Após transformação mediada por Agrobacterium de soja (cv. Maverick) com o vetor binário pDAB9381, rebentos de soja foram regenerados e cultivados sobre meio de enraizamento que continha um agente de seleção compreendendo glufosinato. Após desenvolvimento de raízes ter iniciado sobre o meio de enraizamento compreendendo glufosinato, as raízes foram testadas quanto à expressão do transgene (proteína de fluorescência amarela). Presença de um transgene de expressão ativa dentro das raízes desenvolvidas indicou que as camadas teciduais L2/L3 foram transformadas, deste modo, resultando em transformantes de soja de linhagem germinativa.

[00178] Um total de 531 rebentos de soja transgênicos foram produzidos usando o método de transformação descrito acima e transferidos para meio de enraizamento contendo o agente de seleção glufosi-nato. Os rebentos foram observados quanto ao desenvolvimento de raízes e rebentos os quais produziram raízes brancas viáveis foram ainda ensaiados quanto à expressão do transgene proteína de fluorescência amarela através de microscopia (vide Tabela 2). Observou-se uma correlação entre expressão do transgene proteína de fluorescência amarela e formação de raízes brancas viáveis, em que uma maioria significativa das raízes brancas viáveis expressava o transgene proteína de fluorescência amarela nas raízes (vide Figura 2, Figura 3 e Figura 5). Resultados de microscopia confirmaram que cerca de 92% das plantas de soja produzidas a partir de meio de crescimento contendo um agente de seleção eram transgênicas, uma vez que estas plantas de soja expressavam o transgene proteína de fluorescência amarela (vide Figura 2, Figura 3 e Figura 5).

[00179] Os resultados foram comparáveis aos resultados observados em rebentos de soja cultivados sobre meio de enraizamento que não contém um agente de seleção. As condições de controle, nas quais nenhum agente de seleção foi incluído no meio de enraizamento, resultaram em rebentos de soja que produzem raízes saudáveis. No entanto, apenas 51% das plantas enraizadas expressavam o transgene proteína de fluorescência amarela em tecidos de raiz (vide Figura 5 e Tabela 2).

[00180] Por outro lado, quando os rebentos transformados que não são de linhagem germinativa ou quiméricos foram transferidos para meio de enraizamento que compreende um agente de seleção, os rebentos não desenvolveram raízes ou as poucas raízes que se desenvolveram se tornaram marrons ou pretas. Os rebentos que produziram raízes marrons ou pretas não expressavam o transgene proteína de fluorescência amarela em tecidos de raiz, o que indica que os tecidos de linhagem germinativa não foram transformados com o transgene proteína de fluorescência amarela. Estes resultados indicam que eventos de transformação de soja que não são de linhagem germinativa não formam raízes ou desenvolvem raízes marrons/pretas quando cultivados em meio de enraizamento compreendendo um agente de seleção (por exemplo, glufosinato). Os rebentos de soja transformados que não são de linhagem germinativa não sobrevivem ou podem ser dis-tinguidos visualmente (por exemplo, identificados pela produção de raízes marrons/pretas) e podem ser eliminados no estágio de seleção em meio de enraizamento da cultura tecidual (vide Figura 5).

Tabela 2: Presença ou ausência de expressão do transgene proteína de fluorescência amarela em tecidos de raiz de plântulas de soja regeneradas cultivadas em meio de enraizamento com e sem o agente de seleção, glufosinato.

Exemplo 7: hereditariedade de “eventos de soja TRANSGÊNICA PRODUZIDA SOBRE MEIO DE ENRAIZAMENTO COMPREENDENDO UM AGENTE SELEÇÃO

[00181] Um total de 153 eventos de soja transgênica foram isolados e cultivados até maturidade. Estes eventos de soja foram autofertiliza-dos para produzir semente que foi obtida e analisada quanto à hereditariedade. Confirmou-se que todos os 153 eventos de soja transgênica continham os transgenes proteína de fluorescência amarela e acetil-transferase de fosfinotricina via análise molecular das plantas de soja progenitoras T0. Para cada um dos 153 eventos de soja transgênica, foram obtidas 15 sementes e germinadas no solo sob condições convencionais de estufa. As plantas de soja transgênicas foram cultivadas até o estágio de desenvolvimento V1 e foram pulverizadas com 411 g ae/ha de glufosinato, o qual foi usado como o agente de seleção exemplificativo neste exemplo. Após tratamento com glufosinato, as plantas de soja foram observadas e classificadas como resistentes ou suscetíveis ao glufosinato. Os eventos de soja transgênica que produziram pelo menos uma muda T-ι foram determinados como sendo um evento hereditário.

[00182] De 153 eventos de soja transgênica analisados, 48% dos eventos produziram pelo menos uma semente de soja que era resistente ao glufosinato e determinou-se que era um evento hereditário. Dos eventos de soja transgênica T-ι testados, 76 dos 153 eventos de soja transgênica foram produzidos a partir de rebentos de soja que desenvolveram raízes marrons/pretas quando transferidos para um meio de enraizamento compreendendo glufosinato. Um total de 93% dos eventos de soja transgênica produziram plantas de soja que eram suscetíveis à aplicação de glufosinato e determinados como sendo eventos não hereditários (vide Tabela 3). Dos eventos de soja transgênica T-ι testados, 77 dos 153 eventos de soja transgênica foram produzidos a partir de rebentos de soja que desenvolveram raízes brancas saudá- veis quando transferidos para meio de enraizamento compreendendo glufosinato. Um total de 90% dos eventos de soja transgênica produziram plantas de soja que eram resistentes à aplicação de glufosinato e determinados como sendo eventos hereditários (vide Tabela 3). Assim, empregando seleção com glufosinato no estágio em meio de enraizamento de cultura tecidual e avançando os eventos de soja transformados de linhagem germinativa compreendendo raízes brancas saudáveis, a frequência de eventos de soja hereditários aumenta de 48% para 90%. Por outro lado, cerca de 93% dos eventos transformados que não são de linhagem germinativa podem ser identificados e são eliminados no estágio de enraizamento da transformação através da identificação e eliminação de transformantes de soja compreendendo raízes marrons/pretas (vide Tabela 3).

Tabela 3: Análise de hereditariedade de eventos de soja transgênica produzida em meio de enraizamento compreendendo seleção com glufosinato.

[00183] Conforme mostrado na Tabela 4, eventos de soja T-ι específicos que eram hereditários e foram confirmados através de análise de confirmação molecular tendo uma cópia do transgene proteína de fluorescência amarela foram derivados de plantas de soja T0 que foram cultivadas em meio de enraizamento contendo um agente de seleção e foram confirmados, por meio de microscopia, como expressando o transgene proteína de fluorescência amarela. Os resultados dos estudos indicam que há uma correlação entre expressão do trans- gene proteína de fluorescência amarela em raízes das plantas T0 e a hereditariedade do transgene proteína de fluorescência amarela para plantas ΊΥ Considerando que as raízes de soja se desenvolvem a partir de tecidos da linhagem germinativa (vide Figura 3 e Figura 4), a incorporação de um agente de seleção dentro do meio de enraizamento permite o desenvolvimento de transformantes de soja de linhagem germinativa e pode ser usado para separar transformantes de soja que não são de linhagem germinativa.

Tabela 4: Correlação entre expressão do transgene proteína de fluorescência amarela em raízes das plantas T0 e confirmação molecular do transgene proteína de fluorescência amarela em plantas descendentes de soja T-,.

EXEMPLO 8: DETECÇÃO E ELIMINAÇÃO DE EVENTOS DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA QUE NÃO SÃO DE LINHAGEM GERMINATIVA

[00184] Um método novo e eficiente é descrito para eliminação de transformantes de soja que não são de linhagem germinativa ou qui-méricos em um estágio antecipado no processo de transformação de soja. A metodologia emprega a incorporação de um agente de seleção no meio de enraizamento para a seleção de transformantes de soja de linhagem germinativa. Neste exemplo, glufosinato a 1 mg/L foi usado como o agente de seleção exemplificativo. Quando os rebentos de soja regenerados são cultivados em meio de enraizamento compreen- dendo glufosinato, eventos de transformação de soja que não são de linhagem germinativa ou quiméricos não produzem raízes viáveis. Os eventos de transformação de soja que não são de linhagem germinativa ou quiméricos produzem raízes marrons/prestas não saudáveis ou não produzem quaisquer raízes. Como tal, os eventos de transformação de soja que não são de linhagem germinativa ou quiméricos podem ser distinguidos visualmente e são eliminados em um estágio antecipado no processo de transformação de soja. Comparativamente, eventos de transformação de soja de linhagem germinativa produzem raízes viáveis saudáveis na presença de glufosinato e as plântulas enraizadas podem ser identificadas e selecionadas para avanço para a estufa para produção de sementes T-,. Glufosinato foi avaliado como agente de seleção no meio de enraizamento para a seleção dos trans-formantes de soja de linhagem germinativa. Descobriu-se que o uso de glufosinato como um agente de seleção em uma concentração de pelo menos 1 mg/L para seleção era eficaz para eliminação de cerca de 93% de eventos que não são de linhagem germinativa (quiméricos) com base no fenótipo da raiz (raízes marrons/pretas ou nenhum desenvolvimento de raízes). Comparativamente, descobriu-se que o uso de glufosinato como um agente de seleção em uma concentração de pelo menos 1 mg/L para seleção era eficaz para identificar eventos de transformação de soja de linhagem germinativa, cerca de 90% dos eventos de transformação de soja avançados que produzem raízes saudáveis viáveis em meio para soja que compreende um agente de seleção foram confirmados como sendo transformantes de soja de linhagem germinativa (Figura 6).

EXEMPLO 9: DETECÇÃO E ELIMINAÇÃO DE EVENTOS DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA QUE NÃO SÃO DE LINHAGEM GERMINATIVA ATRAVÉS DO USO DE UM AGENTE DE SELEÇÃO GLIFOSATO

[00185] Vetores binários compreendendo o transgene dgt-28 podem ser construídos usando procedimentos reconhecidos na técnica. O transgene dgt-28 confere tolerância robusta à aplicação de concentrações comerciais de glifosato. Exemplos de vetores binários compreendendo o transgene dgt-28 são ainda descritos no Depósito de Patente dos Estados Unidos N° 13/757536, aqui incorporado por referência. Um vetor binário que contém o gene marcador selecionável de antibiótico dgt-28 pode ser subsequentemente usado para transformação da soja. Uma cepa de Agrobacterium tumefaciens pode ser eletro-porada com o vetor binário que compreende um gene marcador selecionável de antibiótico dgt-28 . Colônias únicas podem ser isoladas e a presença do vetor binário é confirmada através de digestão com enzimas de restrição.

[00186] Transformação de plantas pode ser realizada usando qualquer protocolo convencional de transformação de soja conhecido. Métodos de transformação de soja exemplificativos incluem o procedimento de transformação de soja de nó cotiledonar modificado de Zeng P. (2004), o método de transformação de soja de meia-semente modificado de Paz M. (2005) ou o método de transformação de soja de semente dividida com eixo de embrião parcial do Depósito dos Estados Unidos N° 61/739.349. Após transformação, os tecidos de soja sção cultivados usando os métodos de cultura tecidual descritos abaixo.

[00187] Sementes de soja transformadas são cultivadas usando o protocolo de cultura tecidual conforme descrito no Depósito dos Estados Unidos N°61/739.349, aqui incorporado por referência. Cocultura das sementes de plantas de soja com uma cepa de Agrobacterium pode ser realizada durante 5 dias em meio de cocultura coberto com um papel filtro. Após 5 dias de incubação em meio de cocultura, os ex-plantes podem ser lavados em meio de Indução de Rebento (Shoot Induction - SI) líquido durante cerca de 5 a 10 minutos. Os explantes podem ser cultivados em meio de Indução de Rebento-I (Sl-I). As sementes de soja foram orientadas de modo que o lado plano da semente de soja estivesse voltado para cima e a extremidade nodal do coti-lédone de soja estivesse embebido em meio Sl-I. Após 2 semanas de cultura a 24 Ό com um fotoperíodo de 18 horas, os explantes podem ser transferidos para meio de Indução de Rebento-ll (Sl-II) suplementado com glifosato a 0,01 mM a 1,0 mM. Após 2 semanas em meio Sl-II, os cotilédones podem ser removidos dos explantes, em que um pedaço do rebento embebido é retirado fazendo um corte na base do co-tilédone e o rebento isolado é transferido para meio de Alongamento de Rebento (Shoot Elongation - SE). As culturas foram transferidas para meio SE fresco a cada duas semanas. Placas de PETRI™ podem não ser envolvidas com papel filtro ao longo dos estágios de indução de rebentos e alongamento de rebentos. Fontes de iluminação podem ser fornecidas com uma iluminação de 80-90 pmoles s"1 m"2 para os tecidos transformados durante indução de rebentos e alongamento de rebentos.

[00188] Os rebentos alongados podem ser mergulhados em 1 mg/L de ácido indola 3-butírico (IBA) durante cerca de 1 a 3 minutos para promover o enraizamento antes de transferência dos rebentos isolados para meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico e 7 g/L de agar NOBLE™, pH de 5,6) em bandejas Phyta. Um agente de seleção de glifosato em uma concentração de 0,01 mM a 1,0 mM pode ser incorporado no meio de enraizamento para um subconjunto dos experimentos de transformação.

[00189] Após cultura no meio de enraizamento a 24 °C com um fotoperíodo de 18 horas durante 1-2 semanas, os rebentos de soja que produziram raízes saudáveis viáveis foram transferidos para o solo. Os rebentos de soja compreendendo raízes viáveis saudáveis foram colocados no solo, o qual estava contido em um copo de sundae de plástico aberto. Os copos de sundae de plástico contendo os rebentos de soja transferidos compreendendo raízes foram colocados em um CONVIRON™ para aclimatização das plântulas de soja. As plântulas de soja enraizadas foram aclimatadas nos copos de sundae abertos durante várias semanas antes que as plântulas fossem transferidas para a estufa.

[00190] A incorporação de um agente de seleção compreendendo glifosato em meio de enraizamento para cultura de tecidos de soja foi testada para reduzir a formação de eventos de soja que não são de linhagem germinativa, eventos de transformação de soja quiméricas e escapes. Após transformação mediada por Agrobacterium de soja (cv. Maverick) com o vetor binário contendo o transgene DGT-28, rebentos de soja podem ser regenerados e cultivados sobre meio de enraizamento que contém um agente de seleção compreendendo glifosato. Os rebentos podem ser observados quanto ao desenvolvimento de raízes e rebentos que produzem raízes brancas, viáveis podem ser ainda analisados quanto à expressão do transgene através de micros-copia. As raízes podem ainda ser testadas por meio de confirmação molecular quanto à presença do transgene. Presença de um transgene de expressão ativa dentro das raízes desenvolvidas é indicativa de que as camadas teciduais L2/L3 foram transformadas, deste modo, resultando em transformantes de soja de linhagem germinativa. Uma correlação pode ser observada entre a expressão do transgene e a formação de raízes brancas viáveis, em que uma maioria significativa das raízes brancas viáveis expressam o transgene em tecidos de raiz.

[00191] Estes resultados podem ser comparáveis aos resultados observados em rebentos de soja cultivados sobre meio de enraizamento que não contém um agente de seleção. As condições de con- trole podem não incluir um agente de seleção no meio de enraizamento e podem resultar em rebentos de soja que produzem raízes saudáveis. No entanto, apenas 50% das plantas enraizadas expressavam o transgene em tecidos de raiz.

[00192] Por outro lado, quando os rebentos transformados que não são de linhagem germinativa ou quiméricos foram transferidos para meio de enraizamento que compreende um agente de seleção, os rebentos não desenvolveram raízes ou as poucas raízes que se desenvolveram se tornaram marrons ou pretas. Os rebentos que produziram raízes marrons ou pretas não expressavam o transgene em tecidos de raiz, o que indica que os tecidos de linhagem germinativa não foram transformados com o transgene. Estes resultados indicam que eventos de transformação de soja que não são de linhagem germinativa não formam raízes ou desenvolvem raízes marrons/pretas quando cultivados em meio de enraizamento compreendendo um agente de seleção. Os rebentos de soja transformados que não são de linhagem germinativa não sobrevivem ou podem ser distinguidos visualmente, conforme identificado pela produção de raízes marrons/pretas e, portanto, podem ser eliminados no estágio de seleção em meio de enraizamento da cultura tecidual.

EXEMPLO 10: DETECÇÃO E ELIMINAÇÃO DE EVENTOS DE TRANSFORMAÇÃO DE SOJA QUE NÃO SÃO DE LINHAGEM GERMINATIVA ATRAVÉS DO USO DE UM AGENTE DE SELEÇÃO

2,4-D

[00193] Vetores binários compreendendo o transgene aad-12 podem ser construídos usando procedimentos reconhecidos na técnica. O transgene aad-12 confere tolerância robusta à aplicação de concentrações comerciais de 2,4-D. Exemplos de vetores binários compreendendo o transgene aad-12 são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos N° 8.283.522, aqui incorporada por referência. Um vetor binário que contém o gene marcador selecionável de antibiótico aad-12 pode ser subsequentemente usado para transformação da soja. Uma cepa de Agrobacterium tumefaciens pode ser eletroporada com o vetor binário que compreende um gene marcador selecionável de antibiótico aad-12. Colônias únicas podem ser isoladas e a presença do vetor binário é confirmada através de digestão com enzimas de restrição.

[00194] Transformação de plantas pode ser realizada usando qualquer protocolo convencional de transformação de soja conhecido. Métodos de transformação de soja exemplificativos incluem o procedimento de transformação de soja de nó cotiledonar modificado de Zeng P. (2004), o método de transformação de soja de meia-semente modificado de Paz M. (2005) ou o método de transformação de soja de semente dividida com eixo de embrião parcial do Depósito dos Estados Unidos N°61/739.349. Após transformação, os tecidos de soja podem ser cultivados usando os métodos de cultura tecidual descritos abaixo.

[00195] Sementes de soja transformadas foram cultivadas usando o protocolo de cultura tecidual conforme descrito no Depósito dos Estados Unidos N°61/739.349, aqui incorporado por referência. Cocultura das sementes de plantas de soja com uma cepa de Agrobacterium pode ser realizada durante 5 dias em meio de cocultura coberto com um papel filtro. Após 5 dias de incubação em meio de cocultura, os ex-plantes podem ser lavados em meio de Indução de Rebento (Shoot Induction - SI) líquido durante cerca de 5 a 10 minutos. Os explantes podem ser cultivados em meio de Indução de Rebento-I (Sl-I). As sementes de soja foram orientadas de modo que o lado plano da semente de soja estivesse voltado para cima e a extremidade nodal do coti-lédone de soja estivesse embebido em meio Sl-I. Após 2 semanas de cultura a 24 T com um fotoperíodo de 18 horas, os explantes podem ser transferidos para meio de Indução de Rebento-ll (Sl-II) suplemen- tado com 2 a 120 mg/L de 2,4-D. Após 2 semanas em meio Sl-ll, os cotilédones podem ser removidos dos explantes, em que um pedaço do rebento embebido é retirado fazendo um corte na base do cotilédo-ne e o rebento isolado é transferido para meio de Alongamento de Rebento (Shoot Elongation - SE). As culturas foram transferidas para meio SE fresco a cada duas semanas. Placas de PETRI™ podem não ser envolvidas com papel filtro ao longo dos estágios de indução de rebentos e alongamento de rebentos. Fontes de iluminação podem ser fornecidas com uma iluminação de 80-90 pmoles s"1 m‘2 para os tecidos transformados durante indução de rebentos e alongamento de rebentos.

[00196] Os rebentos alongados podem ser mergulhados em 1 mg/L de ácido indola 3-butírico (IBA) durante cerca de 1 a 3 minutos para promover o enraizamento antes de transferência dos rebentos isolados para meio de enraizamento (sais MS, vitaminas B5, 28 mg/L de ferro, 38 mg/L de Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico e 7 g/L de agar NOBLE™, pH de 5,6) em bandejas Phyta. Um agente de seleção de 2,4-D em uma concentração de 2 a 120 mg/L pode ser incorporado no meio de enraizamento para um subconjunto dos experimentos de transformação.

[00197] Após cultura no meio de enraizamento a 24 °C com um fo-toperíodo de 18 horas durante 1-2 semanas, os rebentos de soja que produziram raízes saudáveis viáveis foram transferidos para o solo. Os rebentos de soja compreendendo raízes viáveis saudáveis foram colocados no solo, o qual estava contido em um copo de sundae de plástico aberto. Os copos de sundae de plástico contendo os rebentos de soja transferidos compreendendo raízes foram colocados em um CONVIRON™ para aclimatização das plântulas de soja. As plântulas de soja enraizadas foram aclimatadas nos copos de sundae abertos durante várias semanas antes que as plântulas fossem transferidas para a estufa.

[00198] A incorporação de um agente de seleção compreendendo 2,4-D em meio de enraizamento para cultura de tecidos de soja foi testada para reduzir a formação de eventos de soja que não são de linhagem germinativa, eventos de transformação de soja quiméricas e escapes. Após transformação mediada por Agrobacterium de soja (cv. Maverick) com o vetor binário contendo o transgene aad-12, rebentos de soja podem ser regenerados e cultivados sobre meio de enraizamento que contém um agente de seleção compreendendo 2,4-D. Os rebentos podem ser observados quanto ao desenvolvimento de raízes e rebentos que produzem raízes brancas, viáveis podem ser ainda analisados quanto à expressão do transgene através de microscopía. As raízes podem ainda ser testadas por meio de confirmação molecular quanto à presença do transgene. Presença de um transgene de expressão ativa dentro das raízes desenvolvidas é indicativa de que as camadas teciduais L2/L3 foram transformadas, deste modo, resultando em transformantes de soja de linhagem germinativa. Uma correlação pode ser observada entre a expressão do transgene e a formação de raízes brancas viáveis, em que uma maioria significativa das raízes brancas viáveis expressam o transgene em tecidos de raiz.

[00199] Estes resultados podem ser comparáveis aos resultados observados em rebentos de soja cultivados sobre meio de enraizamento que não contém um agente de seleção. As condições de controle podem não incluir um agente de seleção no meio de enraizamento e podem resultar em rebentos de soja que produzem raízes saudáveis. No entanto, apenas 50% das plantas enraizadas expressavam o transgene em tecidos de raiz.

[00200] Por outro lado, quando os rebentos transformados que não são de linhagem germinativa ou quiméricos foram transferidos para meio de enraizamento que compreende um agente de seleção, os rebentos não desenvolveram raízes ou as poucas raízes que se desenvolveram se tornaram marrons ou pretas. Os rebentos que produziram raízes marrons ou pretas não expressavam o transgene em tecidos de raiz, o que indica que os tecidos de linhagem germinativa não foram transformados com o transgene. Estes resultados indicam que eventos de transformação de soja que não são de linhagem germinativa não formam raízes ou desenvolvem raízes marrons/pretas quando cultivados em meio de enraizamento compreendendo um agente de seleção. Os rebentos de soja transformados que não são de linhagem germinativa não sobrevivem ou podem ser distinguidos visualmente, conforme identificado pela produção de raízes marrons/pretas e, portanto, podem ser eliminados no estágio de seleção em meio de enraizamento da cultura tecidual.

[00201] Embora aspectos da presente invenção tenham sido descritos em determinadas modalidades, eles podem ser ainda modificados dentro do espírito e âmbito da presente descrição. O presente Pedido, portanto, se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações de modalidades da invenção usando seus princípios gerais. Além disso, o presente Pedido se destina a cobrir tais desvios da presente descrição conforme dentro da prática conhecida ou habitual na técnica à qual estas modalidades pertencem e os quais estão dentro dos limites das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (24)

1. Método de identificação de rebentos criados a partir de transformantes de linhagem germinativa de soja, o método caracterizado pelo fato de compreender: a. transformação de uma população de células de uma planta de soja com um transgene, em que a população de células transformadas compreende células de linhagem germinativa transformadas e células de linhagem germinativa não transformadas; b. regeneração de rebentos a partir da população de células transformadas; c. isolamento dos rebentos produzidos pela população de células transformadas; d. sujeição dos rebentos isolados a um meio de enraizamento seletivo, em que (i) os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células de linhagem germinativa transformadas criam raízes viáveis e (ii) os rebentos regenerados isolados submetidos produzidos pelas células de linhagem germinativa não transformadas não criam raízes viáveis; e e. identificação dos rebentos criados a partir de transformantes de linhagem germinativa de soja detectando se os rebentos criaram raízes viáveis ou não.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transformação emprega um método de transformação escolhido do grupo que consiste em transformação de Agrobacte-rium, biolística, transformação por fosfato de cálcio, transformação por polibreno, transformação por fusão de protoplastos, transformação por eletroporação, transformação ultrassônica, transformação de liposso-mas, transformação por microinjeção, transformação de DNA nu, transformação de vetor de plasmídeo, transformação de vetor viral, transformação mediada por carboneto de silício, transformação por feixe de aerossol ou transformação por PEG.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a população de células de uma planta de soja compreende um tecido de planta de soja.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o tecido de planta de soja é uma camada de tecido L2/L3 ou uma camada de tecido L1.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a camada de tecido L2/L3 compreende uma célula de linhagem germinativa.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a camada de tecido L1 compreende uma célula que não é de linhagem germinativa.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a camada de tecido L2/L3 é selecionada do grupo que consiste em um tecido meristemático de planta de soja, um tecido de raiz de planta de soja e um tecido vascular de planta de soja.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a camada de tecido L1 é selecionado do grupo que consiste em um tecido dérmico de planta de soja, um tecido triturado de planta de soja e um tecido de manto de planta de soja.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transgene está contido dentro de pelo menos um cassete de expressão gênica.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica inclui um gene marcador selecionável.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gene marcador selecionável é o gene de acetil-transferase de fosfinotricina.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica compreende um gene de traço.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão gênica compreende um gene de RN Ai.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de enraizamento seletivo compreende glufosi-nato ou 2,4-D.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de glufosinato dentro do meio de enraizamento seletivo é de pelo menos 1,0 mg/L.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de glufosinato no meio de enraizamento seletivo é de 1,0 mg/L a 10,00 mg/L.

17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de glufosinato no meio de enraizamento seletivo é de 1,0 mg/L.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de enraizamento seletivo compreende um sal básico, uma vitamina, um mineral e uma fonte de carbono.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o sal básico é selecionado do grupo que consiste em sal básico B-5 de Gamborg, sal básico de Schenk e Hildebrandt, sal básico de White, sal básico Chu (N6), sal básico DKW/Juglans, sal básico de Hoagland N° 2, sal básico de de Murashige & Skoog e combinações dos mesmos.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o sal básico é sal básico de Murashige & Skoog.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracteriza- do pelo fato de que a vitamina é selecionada do grupo que consiste em vitamina B-5 de Gamborg, vitamina MEM, vitamina de Murashige & Skoog, vitamina de Schenk e Hildebrandt e combinações das mesmas.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a vitamina é vitamina B-5 de Gamborg.

23. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é selecionada do grupo que consiste em glicose, dextrose, manose, frutose, galactose, glucurona-to, lactose, glicerol e combinações dos mesmos.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a fonte de carbono é sacarose.