BR102014006213A2 - detecção precoce e eliminação de eventos de linhagem não germinativa no processo de transformação da soja - Google Patents

Abstract

detecção precoce e eliminação de eventos de linhagem não germinativa no processo de transformação da soja. a presente invenção se refere em parte a um método para a identificação de um transformante de linhagem germinativa da soja a partir de uma população de transformantes de soja que seja composta por uma combinação de transformantes de linhagem não germinativa de soja e transformantes de linhagem germinativa de soja. os transformantes de linhagem não germinativa de soja são identificados e eliminados precocemente no processo de transformação. os transformantes de linhagem germinativa de soja são detectados e selecionados para cultivo em plantas de soja maduras. o método é prontamente aplicável à triagem e obtenção de um transformante de linhagem germinativa de soja em um estágio precoce no processo de transformação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETECÇÃO PRECOCE E ELIMINAÇÃO DE EVENTOS DE LINHAGEM NÃO GERMINATIVA NO PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO DA SOJA".

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisória Norte-americana N° de Série 61/789.379, depositado em 15 de março de 2013, para “DETECÇÃO PRECOCE E ELIMINAÇÃO DE EVENTOS DE LINHAGEM NÃO GERMINATIVA NO PROCESSO DE TRANSFORMAÇÃO DA SOJA”.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ENVIADA ELETRONICAMENTE

[002] A cópia oficial da listagem de sequência foi enviada eletronicamente pela EFS-Web como uma listagem de sequência formatada em ASCII com um arquivo de nome “70524SEQUENCES,” criado em 11 de março de 2013, e com um tamanho de 9 quilobytes e depositado concomitantemente com o relatório. A listagem de sequência contida nesse documento em formato ASCII é parte do relatório e é aqui incorporado por referência em sua inteireza.

CAMPO TÉCNICO

[003] A presente exposição se refere em parte a um método para a identificação de um transformante de linhagem germinativa da soja de uma população de transformantes de soja que são compostos por uma combinação de transformantes de linhagem não germinativa da soja e transformantes de linhagem germinativa da soja. Portanto, os transformantes de linhagem não germinativa da soja são identificados e eliminados precocemente no processo de transformação. Os transformantes de linhagem germinativa da soja são detectados e selecionados para cultivo em plantas de soja maduras. O método é prontamente aplicável à triagem e obtenção de um transformante de linha- gem germinativa da soja em um estágio precoce no processo de transformação.

ANTECEDENTES

[004] As metodologias de transformação da soja foram desenvolvidas e aperfeiçoadas nos últimos trinta anos. Essa evolução das metodologias de transformação da soja resultou na capacidade de introduzir com sucesso um transgene compreendendo um traço agronômico no genoma da soja. A introdução de eventos de soja transgênica tolerante a herbicidas em meados da década de 1990s, forneceu aos produtores uma nova e conveniente inovação tecnológica para o controle de um amplo espectro de ervas daninhas, que foi sem precedentes nos métodos agrícolas de cultivo. Atualmente, sojas transgênicas são comercialmente disponíveis por todo o mundo, e novos produtos de soja transgênica, como a Soja ENLIST™, oferecem melhores soluções para desafios crescentes de ervas daninhas. A utilização de sojas transgênicas nas modernas práticas agronômicas só foi possível pelo desenvolvimento e aperfeiçoamento das metodologias de transformação da soja. Novas e aperfeiçoadas metodologias de transformação da soja que podem ser utilizadas para detectar e selecionar transformantes de linhagem germinativa da soja são essenciais para fazer frente aos desafios que novos e complexos traços agronômicos requerem para introgressão no genoma da soja.

[005] É preferível a identificação e seleção precoces de transformantes de linhagem germinativa da soja em um processo de transformação, pois os transformantes de linhagem germinativa da soja compreendem um transgene integrado de maneira estável que é herdável em gerações subsequentes. Como o processo de transformação é relativamente ineficiente, grandes números de transformantes têm de ser produzidos para identificar e selecionar os transformantes de linhagem germinativa da soja preferidos dos transformantes de linhagem não germinativa da soja indesejáveis. Muitos dos transformantes obtidos do processo de transformação são quiméricos ou transformantes de linhagem não germinativa da soja. Em média, cerca de 40 a 70 por cento de todos os transformantes isolados são transformantes de linhagem não germinativa da soja. Esses transformantes de linhagem não germinativa da soja são indesejáveis e são descartados. Porém, esse descarte só ocorre após os transformantes terem sido mantidos durante todo o processo de transformação e avançado até a maturidade. A manutenção de transformantes indesejáveis, por exemplo, transformantes de soja de linhagem não germinativa, resulta em um uso ineficiente de recursos. Esperam-se grandes custos na produção de plantas transgênicas. Esses custos excedem preocupações pecuniárias e incluem o uso do tempo, materiais e espaço de laboratório do cientista.

[006] O desenvolvimento e aperfeiçoamento de um método que possa ser utilizado para a triagem e detecção de transformantes de linhagem germinativa da soja nos estágios iniciais da transformação da planta é altamente desejável, pois o método pode melhorar a eficiência do processo de transformação.

[007] Os exemplos anteriores da técnica relacionada e limitações relacionadas a ela se destinam a ser ilustrativos e não exclusivos. Outras limitações da técnica relacionada ficarão aparentes para aqueles versados na técnica com a leitura do relatório.

EXPOSIÇÃO

[008] Em uma modalidade preferida, a exposição se refere a um método para a identificação de um transformante de linhagem germinativa da soja compreendendo as etapas de: transformação de um tecido vegetal de soja com um transgene; regeneração de um rebento a patir do tecido vegetal de soja transformado compreendendo o transgene; isolamento do rebento regenerado a partir do tecido vegetal de soja transformado compreendendo o transgene; colocação do rebento regenerado isolado em contato com uma membrana, em que um material de planta compreendendo o tecido vegetal de soja transformado compreendendo o transgene é transferido do rebento regenerado isolado e fixado à membrana; ensaio do material de planta transferido para determinar uma localização do transgene dentro do material de planta transferida; determinação de uma localização de transgene dentro do rebento regenerado isolado, em que a localização do transgene é selecionada do grupo que consiste em uma camada de tecido L2/L3 e uma camada de tecido L1; e identificação de um rebento regenerado isolado que exiba uma localização de transgene na camada de tecido L2/L3 como um transformante de linhagem germinativa da soja.

[009] Em um aspecto adicional dessa modalidade, apresenta-se um método para a regeneração de uma planta de soja transgênica madura a partir do transformante de linhagem germinativa da soja i-dentificado, compreendendo: a seleção do rebento regenerado isolado compreendendo o transformante de linhagem germinativa da soja; e cultivo do rebento regenerado isolado compreendendo o transformante de linhagem germinativa da soja em uma planta de soja transgênica madura.

[0010] Em um aspecto adicional, a transformação utiliza um método de transformação selecionado do grupo que consiste em transformação com Agrobacterium, biolística, transformação com fosfato de cálcio, transformação com polibreno, transformação por fusão de pro-toplastos, transformação por eletroporação, transformação ultrassôni-ca, transformação por lipossomos, transformação por microinjeção, transformação por DNA nu, transformação com vetor plasmídico, transformação com vetor viral, transformação mediada por carbeto de silício, transformação com feixe de aerossol ou transformação com PEG.

[0011] Em outro aspecto, o tecido vegetal de soja é selecionado do grupo que consiste em um tecido vegetal de soja meristemático, um tecido vegetal de soja dérmico, um tecido vegetal de soja de sustentação e um tecido vegetal de soja vascular.

[0012] Em outro aspecto, o tecido vegetal de soja meristemático compreende meristema apical, meristema primário ou meristema lateral.

[0013] Em outro aspecto, o tecido vegetal de soja dérmico compreende a epiderme.

[0014] Em outro aspecto, o tecido vegetal de soja dérmico compreende a periderme.

[0015] Em outro aspecto, o tecido vegetal de soja vascular compreende xilema ou floema.

[0016] Em outro aspecto, o transgene está contido dentro de pelo menos um cassete de expressão de gene.

[0017] Em outro aspecto, o cassete de expressão de gene compreende um gene marcador selecionável.

[0018] Em outro aspecto, o cassete de expressão de gene compreende um gene de traço.

[0019] Em outro aspecto, o cassete de expressão de gene compreende um gene de RNAi.

[0020] Em outro aspecto, o isolamento compreende fazer um corte horizontal transversal ao rebento.

[0021] Em outro aspecto, a membrana compreende uma membrana de nitrocelulose, uma membrana de náilon, uma membrana de poli-tetrafluoroetileno ou uma membrana de fluoreto de polivinilideno.

[0022] Em outro aspecto, o ensaio compreende um ensaio de detecção de proteína.

[0023] Em outro aspecto, o ensaio de detecção de proteína compreende um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína ex- pressada pelo transgene.

[0024] Em outro aspecto, a determinação compreende o reconhecimento de um padrão de pontos dentro do material de planta transferido fixado à membrana.

[0025] Em outro aspecto, a determinação compreende o reconhecimento de um padrão de um padrão de anel dentro do material de planta transferido fixado à membrana.

[0026] Além dos aspectos e modalidades exemplificativos acima descritos, aspectos e modalidades adicionais ficarão claros pelo estudo as descrições a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] A FIG. 1 ilustra um mapa plasmídico de pDAB9381.

[0028] FIG. 2, Painel a, ilustra uma imagem quimioluminescente ampliada de um padrão de anel observado em uma impressão de tecido de seção de caule de soja. FIG. 2, Painel b, imagem quimioluminescente ampliada de um padrão de pontos observado em uma impressão de tecido de seção de caule de soja. FIG. 2, Painel c, imagem com iluminação por luz Epi-branca da membrana de nitrocelulose processada usada para identificar a localização das impressões de tecido de seção de caule de soja (pontos escuros). FIG. 2, Painel d, imagem quimioluminescente da membrana de nitrocelulose processada. A ligação de um anticorpor a PhiYFP resultou em um sinal quimioluminescente da impressão de tecido de seção de caule de soja que foi classificado como um padrão de imagem em “anel” ou “pontos”. O sinal quimioluminescente distintamente brilhante no canto inferior direito são 5 ng de proteína PhiYFP purificada que foi distribuída na membrana como um controle positivo.

[0029] A FIG. 3 ilustra as imagens microscópicas de fluorescência confocal de seções de caule de soja iluminadas com parâmetros de excitação/emissão específicos para a detecção da proteína PhiYFP.

Essas imagens demonstram três classes para a classificação dos rebentos de soja: Painel a, Nenhuma fluorescência; Painel b, fluorescência apenas da camada de célula epidérmicas; e Painel c, fluorescência das camadas de medula e cortical.

[0030] A FIG. 4 é uma vista esquemática de um meristema de soja em desenvolvimento. MODO(S) DE REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Panorama [0031] Apresenta-se aqui um método para a triagem e detecção de transformantes de linhagem germinativa da soja nos estágios iniciais do processo de transformação da planta. O método exposto foi projetado para uma rápida identificação e caracterização de transformantes de linhagem germinativa da soja. Resumidamente, uma análise de tecido de rebento de planta de soja transformado que compreende um transgene é completada por colocação do tecido de rebento em contato com uma membrana e ensaio da membrana para determinar a localização do transgene dentro do material de planta. Transformantes de linhagem germinativa da soja são identificados como aqueles que expressam um transgene dentro das camadas de núcleo (L2 e L3) dos rebentos de soja. Uma visão esquemática de um meristema de soja em desenvolvimento é mostrada na FIG. 4. Transformantes de linhagem germinativa da soja identificados são selecionados e cultivados em plantas de soja maduras. Outros transformantes de linhagem não germinativa da soja são descartados do processo de transformação em um estágio precoce. Assim, transformantes de planta de soja podem ser analisados e triados para identificar e selecionar transformantes específicos que tenham um polinucleotídeo de DNA doador inserido nos tecidos de linhagem germinativa.

[0032] O método exposto é um aperfeiçoamento significativo com relação a outros métodos conhecidos que foram desenvolvidos para identificar e selecionar transformantes de linhagem germinativa da soja. Veja a patente norte-americana n° 5.503.998, patente norte-americana n° 5.830.728 e patente norte-americana n° 5.989.915. Esses métodos de triagem anteriores eram aplicáveis para transformação por bombardeamento de partícula e seleção usando um ensaio histo-químico do caule real. O desenvolvimento de um método que possa ser utilizado para triagem de transformantes de soja gerados usando qualquer protocolo de transformação conhecido e que não requeira a submissão dos tecidos de soja transformados a coloração química é altamente desejável, pois o método pode melhorar a eficiência do processo de transformação. Esse método é apresentado neste pedido. Termos [0033] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comu-mente entendido por aqueles versados na técnica a que esta exposição se refere. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. A menos que requerido de outra forma pelo contexto, termos singulares devem incluir plurais, e termos plurais devem incluir o singular.

[0034] Para melhor esclarecer esta exposição, os seguintes termos, abreviações e definições são apresentados.

[0035] Conforme aqui usados, os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tem”, “tendo”, “contém” ou “contendo” ou qualquer outra variação deles se destinam a ser não exclusivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreenda uma lista de elementos não está necessariamente limitado apenas a esses elementos, mas pode inclui outros elementos não expressamente relacionados ou inerentes a essa composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que expressamente declarado em contrário, “ou” se refere a um um inclusivo ou e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente), e tanto A, quanto B são verdadeiros (ou presentes).

[0036] Da mesma forma, os artigos indefinidos “um” e “uma” precedendo um elemento ou componente de uma modalidade da exposição se destinam a ser não restritivos com relação ao número de casos, isto é, ocorrências do elemento ou componente. Consequentemente, “um” ou “uma” deve ser lido como um ou pelo menos um, e a forma de palavra singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número obviamente signifique o singular.

[0037] O termo “invenção” ou “presente invenção”, conforme aqui usado, é um termo não limitativo e não deve se referir a qualquer modalidade única da invenção particular, mas engloba todas as modalidades possíveis conforme expostas no pedido.

[0038] Conforme aqui usado, o termo “planta” incluir uma planta inteira e qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta. O termo “partes de planta” inclui qualquer parte de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente imatura); um corte de planta; uma célula vegetal; uma cultura de células vegetais; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutos, rebentos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido vegetal ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células vegetais que estejam organizadas em uma unidade estrutural ou funcional. Uma cultura de células ou tecido vegetal pode ser capaz de regenerar uma planta com as características fisiológicas e morfológicas da planta da qual a célula ou tecido foi obtido, e de regenerar uma planta com substancialmente o mesmo genótipo que a planta. Em contraste, algumas células vegetais não podem ser regeneradas para produzir plantas. Células regenerá-veis em uma cultura de células ou tecido vegetal podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calor, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raízes, cabelo, flores, grãos, espigas, sabugos, cascas ou caules.

[0039] Partes de plantas incluem partes coletáveis e partes utilizáveis para a propagação de plantas descendentes. Partes de plantas utilizáveis para propagação incluem, por exemplo e sem limitação: semente; fruto; um corte; uma muda; um tubérculo; e uma raiz. Uma parte coletável de uma planta pode ser qualquer parte utilizável de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; caule; fruto; semente; e raiz.

[0040] Uma célula vegetal é a unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. Uma célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula cultivada), e pode ser parte de uma unidade organizada superior (por e-xemplo, um tecido vegetal, órgão de planta e planta). Assim, uma célula vegetal pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gameta ou uma célula ou coleção de células que possa se regenerar em uma planta inteira. Dessa forma, uma semente, que compreende múltiplas células vegetais e é capaz de se regenerar em uma planta inteira, é considerada uma “células vegetal” nas presentes modalidades.

[0041] Isolado: Um componente biológico “isolado” (como um ácido nucleico ou polipeptídio) foi substancialmente separado, produzido a parte ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA e RNA cromossômico e extra-cromossômico, e proteínas), enquanto se efetua uma alteração química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo por ruptura de ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram “isoladas” incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação padronizados. O termo também engloba ácidos nucleicos e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira, assim como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídios quimicamente sintetizados.

[0042] Ácido nucleico: Os termos “polinucleotídeo”, “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico” são usados aqui de maneira inter-cambiável e englobam um ácido nucleico singular; ácidos nucleicos plurais; um fragmento, variante ou derivado de ácido nucleico; e cons-truto de ácido nucleico (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e DNA plasmídico (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeos de uma sequência de cDNA de comprimento total, ou seu fragmento, incluindo sequências 5' e/ou 3' não traduzidas e sequência(s) codificadora(s). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto por qualquer polirribonucleotídeo ou poli-desoxirribonucleotídeo, que pode incluir ribonucleotídeos ou desoxirri-bonucleotídeos não modificados ou ribonucleotídeos ou desoxirribonu-cleotídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto por DNA de fita simples e dupla; DNA que seja uma mistura regiões de fita simples e dupla; RNA de fita simples e dupla; e RNA que seja uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA podem ser de fita simples, fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Os termos precedentes também incluem formas química, enzimática e metabolicamente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.

[0043] Deve-se entender que um DNA específico se refere também ao seu complemento, cuja sequência é determinada de acordo com as regras de um pareamento de bases desoxirribunucleotídicas.

[0044] Conforme aqui usado, o termo “gene” se refere a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou polipeptí-dio/proteína). Um gene pode incluir sequências reguladoras precedendo (sequências não codificadoras 5') e/ou seguindo (sequências não codificadoras 3') a sequência que codifica o produto funcional.

[0045] Conforme aqui usado, o termo “sequência codificadora” se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos específica. Uma “sequência reguladora” se refere a uma sequência de nucleotídeos localizada a montante (por exemplo, sequências não codificadoras 5'), dentro ou a jusante (por exemplo, sequências não codificadoras 3') de uma sequência codificadora, que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras incluem, por exemplo e sem limitação: promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; sequências de reconhecimento de poliade-nilação; sítios de processamento de RNA; sítios de ligação a efetores; e estruturas de haste-laço.

[0046] Hibridização: Um ácido nucleico compreendendo toda ou parte de uma sequência de nucleotídeos pode ser usado como uma sonda que se “hibridiza” seletivamente a sequências de nucleotídeos presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clona-dos ou fragmentos de cDNA (por exemplo, bibliotecas genômicas ou de cDNA de um organismo escolhido) que tenham uma quantidade significativa de identidade de sequência com a sequência de sonda. Uma sonda de hibridização pode ser um fragmento de DNA genômico; um fragmento de DNA plasmídico; um fragmento de cDNA; um fragmento de RNA; a um fragmento de DNA amplificado por PCR; um oli-gonucleotídeo; ou outro polinucleotídeo, e a sonda pode ser marcada com um grupo detectável (por exemplo, 32P), ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo e sem limitação, pode-se prepa- rar uma sonda para hibridização por marcação de um oligonucleotídeo sintético que se hibridize especificamente a um dos presentes ácidos nucleicos (por exemplo, um ácido nucleico com pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO:1). Métodos para a preparação de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas de cDNA e genômicas são conhecidos na técnica. Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Um guia abrangente para a hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrado em Sambrook et al. (1989), supra; e Ausubel et al. (1997), Short Protocols in Molecular Biology, Terceira Edição, Wiley, NY, New York, pp. 2-40.

[0047] Conforme aqui usado, o termo “polipeptídio” inclui um poli-peptídio singular, polipeptídios plurais e seus fragmentos. Esse termo se refere a uma molécula composta por monômeros (aminoácidos) ligados linearmente por ligações amida (também conhecidas como ligações peptídicas). O termo “polipeptídio” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento ou tamanho específico do produto. Portanto, peptídios, dipep-tídios, tripeptídios, oligopeptídios, proteína, cadeia de aminoácidos e qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos na definição de “polipeptídio”, e os termos precedentes são usados de maneira intercambiável com “polipeptídio” aqui. Um polipeptídio pode ser isolado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia recombinante, mas um polipeptídio específico não é necessariamente traduzido de um ácido nucleico específico. Um polipeptídio pode ser gerado de qualquer maneira apropriada incluindo, por exemplo e sem limitação, por síntese química.

[0048] Endógeno e Heterólogo: Conforme aqui usado, o termo “nativo” se refere à forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídio que seja encontrada na natureza com suas próprias sequências reguladoras, caso presentes. O termo “endógeno” se refere à forma nativa do polinucleotídeo, gene ou polipeptídio em sua localização natural no organismo ou no genoma do organismo.

[0049] Em contraste, o termo “heterólogo” se refere a um polinucleotídeo, gene ou polipeptídio que não seja normalmente encontrado em sua localização no organismo de referência (hospedeiro). Por e-xemplo, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que seja normalmente encontrado no organismo de referência em uma localização genômica diferente. A título de exemplo adicional, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que não seja normalmente encontrado no organismo de referência. Um organismo hospedeiro compreendendo um polinucleotídeo, gene ou polipeptídio heterólogo pode ser produzido por introdução do polinucleotídeo, gene ou polipeptídio heterólogo no organismo hospedeiro. Em exemplos particulares, um polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência codificadora nativa, ou sua parte, que é reintroduzida em um organismo de fonte em uma forma que seja diferente do polinucleotídeo nativo correspondente. Em exemplos particulares, um gene heterólogo compreende uma sequência codificadora nativa, ou sua parte, que seja reintroduzida em um organismo de fonte em uma forma que seja diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma sequência codificadora nativa que seja uma parte de um gene quimérico incluindo regiões reguladoras não nativas que é reintroduzida no hospedeiro nativo. Em exemplos particulares, um polipeptídio heterólogo é um polipeptídio nativo que é reintroduzido em um organismo de fonte em uma forma que seja diferente do polipeptídio nativo correspondente.

[0050] Um gene ou polipeptídio heterólogo pode ser um gene ou polipeptídio que compreenda um polipeptídio ou sequência de ácido nucleico funcional que codifique um polipeptídio funcional que esteja fusionado a outros genes ou polipeptídios para produzir um polipeptídio quimérico ou de fusão, ou um gene que o codifique. Genes e proteínas de modalidades particulares incluem sequências de comprimento total especificamente exemplificadas e partes, segmentos, fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e deleções internas e/ou terminais em comparação com as moléculas de comprimento total), variantes, mu-tantes, quiméricos e fusões dessas sequências.

[0051] Modificação: Conforme aqui usado, o termo “modificação” pode se referir a uma alteração em um polinucleotídeo de referência particular que resulte em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada de um polipeptídio codificado pelo polinucleotídeo de referência. Uma modificação também pode se referir a uma alteração em um polipeptídio de referência que resulte em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada do polipeptídio de referência. Alternativamente, o termo “modificação” pode se referir a uma alteração em um polinucleotídeo de referência que resulte em atividade aumentada ou intensificada de um polipeptídio codificado pelo polinucleotídeo de referência, assim como uma alteração em um polipeptídio de referência que resulte em atividade aumentada ou intensificada do polipeptídio de referência. Alterações como as precedentes podem ser feitas por qualquer um dos vários métodos bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo e sem limitação: deleção de uma parte da molécula de referência; mutação da molécula de referência (por exemplo, mediante mutagênese espontânea, mediante mutagê-nese aleatória, mediante mutagênese causada por genes de mutação e mediante mutagênese por transposon); substituição de uma parte da molécula de referência; inserção de um elemento na molécula de referência; regulação para baixo da expressão da molécula de referência; alteração da localização celular da molécula de referência; alteração do estado da molécula de referência (por exemplo, mediante metilação de um polinucleotídeo de referência, e mediante fosforilação ou ubiqui-tinação de um polipeptídio de referência); remoção de um cofator da molécula de referência; introdução de um RNA/DNA antissentido que tenha como alvo a molécula de referência; introdução de um RNA/DNA de interferência que tenha como alvo a molécula de referência; modificação química da molécula de referência; modificação covalente da molécula de referência; irradiação da molécula de referência com radiação UV ou raios X; recombinação homóloga que altere a molécula de referência; recombinação mitótica que altere a molécula de referência; substituição do promotor da molécula de referência; e/ou combinações de qualquer um dos precedentes.

[0052] Orientação na determinação de quais nucleotídeos ou resíduos de aminoácido podem ser modificados em um exemplo específico pode ser encontrada por comparação da sequência do polinucleotídeo ou polipeptídio de referência com a de polinucleotídeos ou poli-peptídios homólogos (por exemplo, de levedura ou bacteriano homólogo), e maximização do número de modificações feitas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou sequências de consenso.

[0053] Promotor: O termo “promotor” se refere a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificado-ra de ácido nucleico ou RNA funcional. Nos exemplos, a sequência codificadora controlada está localizada em 3' com relação a uma sequência promotora. Um promotor pode ser derivado em sua inteireza de um gene nativo, um promotor pode ser composto por diferentes e-lementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou um promotor pode até compreender segmentos de DNA sintéticos. Aqueles versados na técnica devem entender que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios do desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Exemplos de todos os promotores precedentes são conhecidos e usados na técnica para controlar a expressão de ácidos nucleicos heterólogos. Promotores que dirigem a expressão de um gene na maioria dos tipos de células na maioria das vezes são comumente chamados de “promotores constitutivos”. Além disso, embora aqueles versados na técnica tenham (em muitos casos sem sucesso) tentado delinear os limites exatos de sequências reguladoras, entende-se agora que fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica. A atividade promotora de um ácido nucleico particular pode ser ensaiada usando-se técnicas familiares para aqueles versados na técnica.

[0054] Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” se refere a uma associação de sequências de ácido nucleico em um único ácido nucleico, em que a função de uma das sequências de ácido nucleico é afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência codificadora quando o promotor é capaz de afetar a expressão dessa sequência codificadora (por exemplo, a sequência codificadora está sob o controle transcricio-nal do promotor). Uma sequência codificadora pode ser operacionalmente ligada a uma sequência reguladora em uma orientação em sentido ou antissentido.

[0055] Expressão: O termo “expressão”, conforme aqui usado, pode se referir à transcrição e acumulação estável de RNA em sentido (mRNA) ou antissentido derivado de um DNA. Expressão também pode se referir à tradução de mRNA em um polipeptídio. Conforme aqui usado, o termo “superexpressão” se refere a uma expressão que seja mais elevada que a expressão endógena do mesmo gene ou um gene relacionado. Assim, um gene heterólogo é “superexpressado” se sua expressão for mais elevada que a de um gene endógeno comparável.

[0056] Transformação: Conforme aqui usado, o termo “transformação” se refere à transferência e integração de um ácido nucleico ou seu fragmento em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo um ácido nucleico transformador são chamados de organismos “transgênicos”, “recombinantes” ou “transformados”. Métodos de transformação conhecidos incluem, por exemplo: transformação mediada por Agrobac-terium tumefaciens ou A. rhizogenes; transformação com fosfato de cálcio; transformação com polibreno; fusão de protoplastos; eletropo-ração; métodos ultrassônicos (por exemplo, sonoporação); transformação por lipossomos; microinjeção; transformação com DNA nu; transformação com vetores plasmídicos; transformação com vetores virais; transformação biolística (bombardamento com micropartículas); transformação mediada por WHISKERS de carbeto de silício; com feixe de aerossol; e transformação mediada por PEG.

[0057] Introduzido: Conforme aqui usado, o termo “introduzido” (no contexto de introdução de um ácido nucleico em uma célula) inclui a transformação de uma célula, assim como o cruzamento de uma planta compreendendo o ácido nucleico com uma segunda planta, demodo que a segunda planta contenha o ácido nucleico, como pode ser realizado utilizando-se técnicas de criação de plantas convencionais. Essas técnicas de criação são conhecidas na técnica. Para uma discussão de técnicas de criação de plantas, veja Poehlman (1995), Bree-ding Field Crops, 4a Edição, AVI Publication Co., Westport CT.

[0058] Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um ácido nucleico em uma planta. Essa técnica é usada há décadas para introduzir traços em plantas. Um exemplo de uma descrição de retrocruzamento (e outras metodologias de criação de plantas) pode ser encontrado, por exemplo, em Poelman (1995), supra; e Jen-sen (1988), Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY. Em um protocolo de retrocruzamento exemplificativo, uma planta de interesse original (o “ascendente recorrente”) é cruzada com uma segunda planta (o “ascendente não recorrente”) portador de um ácido nucleico a ser introduzido. A descendência resultante desse cruzamento é, então, novamente cruzada com o ascendente recorrente, e o processo é repetido até se obter uma planta convertida, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas do ascendente recorrente sejam recuperadas na planta convertida, além do á-cido nucleico do ascendente não recorrente.

[0059] Plasmídio/vetor: Os termos “plasmídio” e “vetor”, conforme aqui usados, referem-se a um elemento cromossômico extra que possa trazer um ou mais genes que não sejam parte do metabolismo central da célula. Plasmídios e vetores são tipicamente moléculas de DNA de fita dupla circulares. Entretanto, os plasmídios e vetores podem ser ácidos nucleicos lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, e podem ser derivados de qualquer fonte, em que um número de sequências de nucleotídeos tenham sido unidas ou re-combinadas em uma construção única que seja capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA codificadora juntamente com qualquer sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula. Nos exemplos, plasmídios e vetores podem compreender sequências de replicação autônoma, sequências de integração no genoma e/ou fagos ou sequências de nucleotídeos.

[0060] Polipeptídio e “proteína” são usados aqui de maneira inter-cambiável e incluem uma cadeia molecular de dois ou mais aminoáci-dos ligados mediante ligações peptídicas. Os termos não se referem a um comprimento específico do produto. Assim, “peptídios” e “oligopep-tídios” estão incluídos dentro da definição de polipeptídio. Os termos incluem modificações pós-tradução do polipeptídio, por exemplo, gli-cosilações, acetilações, fosforilações e outras. Além disso, fragmentos de proteínas, análogos, proteínas com mutação ou variantes, proteínas de fusão e outras estão incluídas dentro do significado de polipep-tídio. Os termos também incluem moléculas em que um ou mais análogos de aminoácidos ou aminoácidos não canônicos ou não naturais estejam incluídos, conforme possam ser sintetizados ou expressados de maneira recombinante usando técnicas de engenharia de proteínas conhecidas. Além disso, proteínas de fusão da invenção podem ser derivatizadas conforme aqui descrito por técnicas de química orgânica bem conhecidas.

[0061] O termo “proteína de fusão” indica que a proteína inclui componentes polipeptídicos derivados de mais de uma proteína ou polipeptídio de origem. Tipicamente, uma proteína de fusão é expressada por um gene de fusão, em que uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência polipeptídica de uma proteína é anexada em quadro com, e opcionalmente separada por um elo de, uma sequência de nucleotídeos que codifique uma sequência polipeptídica de uma proteínadiferente. O gene de fusão pode ser expressado por uma célula hospedeira recombinante como uma única proteína.

Tecidos e Partes de Soja [0062] Em algumas modalidades, fornece-se um tecido vegetal de soja que compreende um transgene. Algumas modalidades incluem um tecido vegetal de soja compreendendo um rebento ou um material de planta transferido do rebento. Em modalidades adicionais, o tecido vegetal de soja compreende um tecido de núcleo ou manto. Em modalidades adicionais, o tecido vegetal de soja é selecionado do grupo que consiste em um tecido vegetal de soja meristemático, um tecido vegetal de soja dérmico, um tecido vegetal de soja de sustentação e um tecido vegetal de soja vascular.

[0063] Uma célula vegetal, parte de planta e/ou planta pode ser transformada com um transgene para compreender um polipeptídio heterólogo e/ou ácido nucleico heterólogo por qualquer um dos vários métodos de transformação conhecidos na técnica. Em modalidades particulares aqui, um transgene é introduzido em uma célula vegetal, parte de planta e/ou planta por um método selecionado de, por exemplo e sem limitação: transformação e criação seletiva (por exemplo, criação por retrocruzamento).

[0064] As células vegetais formam tecidos vegetais que podem ser classificados como tecido meristemático, tecido dérmico, tecido de sustentação ou tecido vascular. Em uma modalidade, o tecido vegetal de soja que é transformado com um transgene pode compreender um tecido vegetal de soja meristemático, um tecido vegetal dérmico, um tecido vegetal de sustentação ou um tecido vegetal de soja vascular. O uso de um transgene para a transformação de tecidos de núcleo (camadas L2 e L3) que compreendem os tecidos vegetais meristemático e vascular resulta na transformação de um tecido de linhagem germi-nativa da soja. O uso de um transgene para a transformação de tecidos de manto (camada L1) que compreendem os tecidos vegetais de sustentação e dérmico resulta na transformação de um tecido de linhagem não germinativa da soja.

[0065] O tecido meristemático compreende o meristema apical, meristema primário ou meristema lateral. Esses tecidos indiferencia-dos sofrem divisão de novas células, que são usadas para o crescimento ou reparo dos tecidos vegetais, e são caracterizados como zonas de células em divisão ativa. A divisão celular ocorre unicamente nos tecidos meristemáticos. Meristemas apicais, que estão localizados nas pontas do rebento, estão diretamente envolvidos no alongamento do rebento. Meristemas laterais, como o meristema vascular, estão envolvidos no crescimento interno, essas células envolvem o caule estabelecido de uma planta e fazem com que cresça lateralmente.

[0066] O tecido vascular é uma mistura de células diferenciadas consistindo em células de parênquima, células de esclerênquima, células de fibras e outras células envolvidas no transporte (isto é, vasos, traqueídes, xilema ou floema). Esses tipos de células transportam fluidos, como água e nutrientes, internamente na célula vegetal.

[0067] Os tecidos dérmico e de sustentação são tecidos não me-ristemáticos (tecidos que não se dividem) que são compostos por células de parênquima, células de esclerênquima e células de colênquima. Os tecidos dérmicos compreendem as camadas celulares mais externas das folhas, raízes, caules, frutos ou sementes de plantas. Os tecidos de sustentação são tecidos não meristemáticos simples compostos por células de parênquima, células de esclerênquima, clorênquima e células de colênquima. Esses tipos de células geralmente formam a medula e o córtex dos caules.

[0068] Em uma modalidade, a presente exposição descreve um método para a identificação de um transformante de linhagem germi-nativa da soja que compreende um transgene. Em uma modalidade preferida, um tecido vegetal de soja é transformado mediante um método mediado por Agrobacterium de explantas de meia semente modificadas (M. Paz, et al. (2005), Plant Cell Rep., 25: 206-213) ou mediante um método de transformação de nodo cotiledôneo (P. Zeng, et al. (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482). Usando qualquer método, o transgene é distribuído a tecidos vegetais da soja que compreendem tecido de manto externo (camada L1) ou distribuído a tecidos subjacentes localizados mais profundamente na planta, como os tecidos de núcleo (camadas L2 e L3). O tecido de manto (camada L1) se dividirá para formar os tecidos epidérmico e de sustentação que compreendem as células de linhagem não germinativa. Os tecidos de núcleo se dividem para formar os tecidos meristemático e vascular que compreende células de linhagem germinativa. Apenas os eventos transgêni-cos com células de linhagem germinativa transformadas podem passar o transgene para a geração seguinte. A seção vertical mediana de um meristema apical de rebento de soja é ilustrado na FIG. 4 para mostrar a organização das camadas L1, L2 e L3 do rebento de soja.

[0069] Qualquer célula vegetal de soja pode ser geneticamente modificada para compreender um transgene. Em algumas modalidades, a célula vegetal que é assim geneticamente modificada não é capaz de regeneração para produzir uma planta (isto é, transformante de linhagem não germinativa). Em algumas modalidades, plantas que são geneticamente modificadas de acordo com a presente exposição são capazes de regeneração para produzir uma planta transgênica (isto é, transformante de linhagem germinativa).

[0070] Ácidos nucleicos introduzidos em uma célula vegetal de soja podem ser usados para conferir traços agronômicos desejados à soja. Uma ampla variedade de plantas de soja e sistemas de células vegetais podem ser manipulados para as características fisiológicas e agronômicos desejadas aqui descritas usando um ácido nucleico e vários métodos de transformação. As presentes modalidades podem u-sar qualquer um dos muitos métodos para a transformação de plantas (e produção de plantas geneticamente modificadas) que são conhecidos na técnica. Inúmeros métodos para transformação de plantas foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas, assim como plantas monocotiledô-neas (veja, por exemplo, Goto-Fumiyuki et al. (1999), Nat. Biotechnol. 17:282-6; Miki et al. (1993), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (B.R. Glick e J.E. Thompson, Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 67-88). Além disso, vetores e métodos de cultira in vitro para transformação de células e tecidos vegetais e regeneração de plantas são descritos, por exemplo, em Gruber et al. (1993), supra, nas pp. 89-119.

[0071] Metodologias de transformação de plantas disponíveis para introduzir um ácido nucleico em uma célula hospedeira vegetal incluem, por exemplo e sem limitação: transformação com T-DNA desarmado usando Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes como o agente de transformação; transfecção com fosfato de cálcio; transformação com polibreno; fusão de protoplastos; eletroporação (D’Halluin et al. (1992), Plant Cell 4:1495-505); métodos ultrassônicos (por e-xemplo, sonoporação); transformação por lipossomos; microinjeção; contato com DNA nu; contato com vetores plasmídicos; contato com vetores virais; biolística (por exemplo, bombardeamento com partículas de DNA (veja, por exemplo, Klein et al. (1987), Nature 327:70-3) e bombardamento com micropartículas (Sanford et al. (1987), Part. Sei. Technol. 5:27; Sanford (1988), Trends Biotech. 6:299, Sanford (1990), Physiol. Planta 79:206; e Klein et al. (1992), Biotechnology 10:268); transformação mediada por WHISKERS™ de carbeto de silício (Kaep-pler et al. (1990), Plant Cell Rep. 9:415-8); transformação com nano-partículas (veja, por exemplo, a publicação de patente norte-americana n° US2009/0104700A1); com feixe de aerossol; e captação mediada por polietileno glicol (PEG). Em exemplos específicos, um transgene pode ser introduzido diretamente no DNA genômico de uma célula vegetal de soja mediante um dos protocolos de transformação acima descritos.

[0072] Um método amplamente utilizado para a introdução de um cassete de expressão de gene compreendendo um transgene em uma planta se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Horsch et al. (1985), Science 227:1229. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para plantas reconhecidamente úteis para transformar geneticamente células vegetais. Os plasmídios Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, são portadores de genes responsáveis pela transformação genética da planta. Kado (1991), Crit. Rev. Plant. Sei. 10:1. Detalhes referentes a sistemas vetores de Agrobacterium e métodos para a transferência de gene mediada por Agrobacterium também está disponíveis em, por exemplo, Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al. (1989), Plant Cell Reports 8:238, e patentes norte-americanas n° 4.940.838 e 5.464.763.

[0073] Se Agrobacterium for usado para a transformação, o DNA a ser inserido é tipicamente clonado em plasmídios especiais, em um vetor intermediário ou um vetor binário. Vetores intermediários não podem se replicar em Agrobacterium. O vetor intermediário podem ser transferido para A. tumefaciens por meio de um plasmídio auxiliador (conjugação). O sistema Japan Tobacco Superbinary é um exemplo desse sistema (revisado por Komari et al. (2006), Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343; Agrobacterium Protocols, 2a Edição, Vol. 1, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 150-41; e Komori et al. (2007), Plant Physiol. 145:1155-60). Vetores binários podem se replicar tanto em E. coli, quanto em Agrobacterium. Vetores binários compreendem um gene marcador de seleção e um elo ou polielo, que são enquadrados pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Hols-ters, 1978). O Agrobacterium compreende um plasmídio portador de uma região vir. O plasmídio Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula vegetal. T-DNA adicional também pode estar contido.

[0074] As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens dirigirão a inserção de uma fita T contendo o cassete de expressão de gene e marcador adjacente no DNA da célula vegetal quando a célula é infectada pela bactéria usando um vetor de T DNA binário (Bevan (1984), Nuc. Acid Res. 12:8711-21) ou o procedimento de co-cultivo (Horsch et al. (1985), Science 227:1229-31). Generica- mente, a transformação com o sistema de Agrobacterium é usada para manipular plantas dicotiledôneas. Bevan et al. (1982), Ann. Rev. Ge-net. 16:357-84; Rogers et al. (1986), Methods Enzymol. 118:627-41. A transformação com o sistema de Agrobacterium também pode ser u-sada para transformar, assim como transferir ácidos nucleicos para plantas monocotiledôneas e células vegetais. Veja a patente norte-americana n° 5.591.616; Hernalsteen et al. (1984), EMBO J. 3:3039-41; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984), Nature 311:763-4; Grimsley et al. (1987), Nature 325:1677-9; Boulton et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:31-40; e Gould et al. (1991), Plant Physiol. 95:426-34.

[0075] As presentes manipulações genéticas de um hospedeiro recombinante podem ser realizadas usando-se técnicas de DNA re-combinante padronizadas e triagem e podem ser realizadas em qualquer célula hospedeira que seja adequada para manipulação genética. Em algumas modalidades, a célula hospedeira recombinante pode ser qualquer planta ou variedade de soja adequada para modificação genética e/ou expressão de gene recombinante. Em algumas modalidades, o hospedeiro recombinante pode ser uma planta transformante de linhagem germinativa da soja. Técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padronizadas aqui usadas são bem conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo e sem limitação, em: Sambrook et al. (1989), supra; Silhavy et al. (1984), Experiments with Gene Fu-sions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel et al. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, e Wiley-lnterscience, New York, NY.

[0076] Os métodos de transformação resultam em plantas trans-gênicas. A presente exposição pode ser utilizada para identificar plantas transgênicas específicas que compreendam transformantes de linhagem germinativa da soja, particularmente transformantes derivados do tecido de núcleo (L2 e L3). Em particular, os transformantes de li- nhagem germinativa da soja produzidos pelos métodos de transformação apresentados pela invenção podem ser transmitidos para gerações subsequentes.

[0077] Após a introdução de um transgene em uma célula vegetal de soja, a célula vegetal pode ser cultivada e, com a emergência de tecido de diferenciação, como rebentos e raízes, plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas de soja podem ser geradas. Metodologias para a regeneração de plantas são conhecidas por aqueles versados na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil e Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers, e em: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). As plantas de soja geneticamente modificadas aqui descritas podem ser cultivadas em um meio de fermentação ou crescidas em um meio adequado, como o solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superiores pode ser qualquer meio de crescimento para plantas, incluindo, mas não limitados a, solo, areia, qualquer outro meio em partículas que suporte o crescimento de raízes (por exemplo, vermiculita, perlita e outros) ou cultura hidropônica, assim como luz, água e suplementos nutricionais adequados que facilitem o crescimento da planta superior.

[0078] Células vegetais de soja transformadas que sejam produzidas por qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta de soja madura que possua o genótipo transformado e, portanto, o fenótipo desejado. Essas técnicas de regeneração se baseiam na manipulação de certos fitormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente se baseando em um marcador biocida e/ou herbicida que tenha sido introduzido juntamente com as sequências de nucleotídeos desejadas. A regeneração da planta a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans, et al., “Protoplasts Isolation and Culture” em Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calos de plantas, explantas, órgãos, pólens, embriões ou suas partes. Essas técnicas de regeneração são genericamente descritas em Klee et al. (1987), Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.

[0079] Em outras modalidades, as células vegetais de soja que são transformadas não são capazes de regeneração para produzir uma planta de soja madura. Essas células vegetais de soja transformadas são transformantes de soja de linhagem não germinativa.

[0080] Uma célula vegetal de soja transformada, calo, tecido ou planta pode ser identificada e isolada por seleção ou triagem do material de planta manipulado quanto a traços codificados pelos genes marcadores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, a seleção pode ser realizada por crescimento do material de planta manipulado em meios contendo uma quantidade inibitória do antibiótico ou herbicida ao qual o construto de gene de transformação confira resistência. Além disso, plantas e células vegetais transformadas também podem ser identificadas por triagem das atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes de β-glucuronidase, luciferase ou gfp) que possam estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinante. Essas metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.

[0081] Uma planta de soja transgênica contendo aqui uma molécula heteróloga pode ser produzida mediante criação seletiva, por exemplo, por cruzamento sexuado de uma primeira planta ascendente compreendendo a molécula e uma segunda planta ascendente, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de primeiras plantas descendentes. Pode-se selecionar, então, uma primeira planta descendente que seja resistente a um marcador selecionável (por exemplo, glifosato, cuja resistência pode ser conferida à planta descendente pela presente molécula heteróloga). A primeira planta descendente pode ser, então, reproduzida, produzindo, dessa forma, uma pluralidade de segundas plantas descendentes. Então, pode-se selecionar uma segunda planta descendente que seja resistente ao marcador selecionável. Essas etapas também podem incluir o retrocruzamento da primeira planta descendente ou da segunda planta descendente com a segunda planta ascendente ou uma terceira planta ascendente.

[0082] Também se devem entender que duas plantas de soja transgênicas diferentes também podem ser cruzadas para produzir uma descendência que contenha dois genes exógenos adicionados, independentemente segregáveis. A reprodução da descendência a-propriada pode produzir plantas que sejam homozigóticas para ambos os genes exógenos adicionados. O retrocruzamento com uma planta ascendente e o cruzamento com uma planta não transgênica também são considerados, assim como a propagação vegetativa. Outros métodos de criação comumente usados para diferentes traços e colheitas são conhecidos na técnica. A criação por retrocruzamento foi usada para transferir genes de um traço altamente herdável e herdado de maneira simples para um cultivar homozigótico ou linhagem endocru-zada desejável, que o ascendente recorrente. Espera-se que a planta resultante tenha os atributos do ascendente recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido do ascendente doador. Após o cruzamento inicial, indivíduos que possuam o fenótipo do ascendente doador são selecionados e repetidamente cruzado (retrocruzados) com o ascendente recorrente. Espera-se que o ascendente resultante tenha os atributos do ascendente recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido do ascendente doador.

[0083] Um transgene também pode ser introduzido em uma área predeterminada do genoma da planta mediante recombinação homóloga. Métodos para integrar de maneira estável uma sequência polinu-cleotídica em um sítio cromossômico específico de uma célula vegetal mediante recombinação homóloga foram descritos na técnica. Por e-xemplo, a integração específica para sítio conforme descrita na publicação de pedido de patente norte-americana n° 2009/0111188 A1 envolve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência polinucleotídica doadora em um alvo cromossomal. Além disso, o pedido de patente internacional n° WO 2008/021207 descreve recombinação homóloga mediada por dedo de zinco para integrar de maneira estável uma ou mais sequências polinucleotídicas doadoras em localizações específicas do genoma. O uso de recombinases, como FLP/FRT conforme descrito na patente norte-americana n° 6.720.475, ou CRE/LOX conforme descrito na patente norte-americana n° 5.658.772, pode ser utilizado para integrar de maneira estável uma sequência polinucleotídica em um sítio cromossômico específico. Finalmente, o uso de meganucleases que tenham como alvo polinucleotídeos doadores em uma localização cromossômica específica foi descrito em Puchta et al. (1996), PNAS USA 93 pp. 5055-5060).

[0084] Vários outros métodos para integração específica para sítio em células vegetais são genericamente conhecidos e aplicáveis (Ku-mar et al. (2001), Trends in Plant Sei. 6(4) pp. 155-159). Além disso, sistemas de recombinação específicos para sítio que foram identificados em vários organismos procarióticos e eucarióticos inferiores podem ser aplicados para uso em plantas. Exemplos desses sistemas incluem, mas não se limitam a; o sistema recombinase R/RS do plas-mídio pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985), J. Mol. Biol. 182:191-203), e o sistema Gin/gix do fago Mu (Maesere Kahlmann (1991), Mol. Gen. Genet. 230:170-176).

Sequências codificadoras de traço agronômic [0085] Algumas das presentes modalidades apresentam um trans-gene que codifica um polipeptídio compreendendo um cassete de expressão de gene. Esse transgene pode ser útil em qualquer um de uma ampla variedade de aplicações para produzir plantas de soja transgênicas. Exemplos particulares de um transgene compreendendo um cassete de expressão de gene são aqui apresentados para fins ilustrativos e incluem uma expressão de gene compreendendo um gene de traço, um gene de RNAi, ou um gene marcador selecionável.

[0086] Na manipulação de um gene para expressão em plantas de soja, o viés de códon da(s) planta(s) hospedeira(s) esperada(s) pode ser determinado, por exemplo, mediante uso de bases de dados de sequências de DNA publicamente disponíveis para encontrar informação acerca da distribuição de códons dos genomas de plantas ou das regiões codificadoras de proteína de vários genes de plantas.

[0087] No projeto de regiões codificadoras em um ácido nucleico para expressão em plantas, os códons primários (“primeira escolha”) preferidos pela planta devem ser determinados, assim como a segunda, terceira, quarta e outras escolhas de códons preferidos, quando existem múltiplas escolhas. Pode-se, então, projetar uma nova sequência de DNA que codifique a sequência de aminoácidos do mesmo peptídio, mas a nova sequência de DNA difere da sequência de DNA original pela substituição por códons da planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido e outros) para especificar o aminoácido em cada posição dentro da sequência de a-minoácidos.

[0088] A nova sequência pode ser, então, analisada quanto a sítios de enzima de restrição que possam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados podem ser adicionalmente modificados por substituição dos códons com códons preferidos de primeira, se- gunda, terceira ou quarta escolha. Outros sítios na sequência que possam afetar a transcrição ou tradução do gene de interesse são estruturas de haste-laço, junções de éxomíntron (5' ou 3'), sinais de adição de poli A e sinais de término de RNA polimerase; esses sítios podem ser removidos pela substituição por códons de plantas. A sequência pode ser adicionalmente analisada e modificada para reduzir a frequência de dupletos TA ou CG. Além dos dupletos, blocos de sequência de G ou C que tenham mais de cerca de seis resíduos que sejam iguais podem afetar a transcrição ou tradução da sequência. Consequentemente, esses blocos podem ser modificados por substituição dos códons de primeira ou segunda escolha e outros com o có-don de escolha preferido seguinte.

[0089] Uma vez que uma sequência de DNA otimizada (por exemplo, otimizada para plants) tenha sido projetada no papel, ou in silico, moléculas de DNA reais podem ser sintetizadas no laboratório para corresponder em sequência precisamente à sequência projetada. Essas moléculas de ácido nucleico sintéticas podem ser clonadas e de outra forma manipuladas exatamente como se fossem derivadas de fontes naturais ou nativas.

[0090] Um ácido nucleico pode ser aqui clonado em um vetor para transformação em células procarióticas ou eucarióticas para replicação e/ou expressão. Os vetores podem ser vetores procarióticos; por e-xemplo, plasmídios, ou vetores lançadores, vetores de insetos ou vetores eucarióticos. Um ácido nucleico também pode ser aqui clonado em um vetor de expressão, por exemplo, para administração a uma célula vegetal. Em certas aplicações, pode ser preferível ter vetores que sejam funcionais em E. coli (por exemplo, produção de proteína para gerar anticorpos, análise de sequência de DNA, construção de enxertos, obtenção de quantidades de ácidos nucleicos).

[0091] Em uma modalidade, um transgene a ser expressado é a- presentado no presente pedido. O cassete de expressão de gene pode compreender um gene marcador selecionável, um gene de traço ou um gene de RNAi. Exemplos de um gene marcador selecionável, um gene de traço e um gene de RNAi também são apresentados abaixo. Os métodos apresentados no presente pedido são vantajosos pelo fato de apresentar um método para selecionar transformantes de linhagem germinativa que não é dependente da função específica do produto de proteína, ou outra função, do transgene.

Transqenes ou Sequências Codificadoras Que Conferem Resistência a Pragas ou Doença [0092] Genes de Resistência a Doenças de Plantas. As defesas de plantas são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência a doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com um gene de resistência clonado para gerar plantas que sejam resistentes a cepas patogênicas específicas. Exemplos desses genes incluem o gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), o gene Pto do tomate, que codifica uma proteína qui-nase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e o gene RSSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089).

[0093] Uma proteína de Bacillus thuringiensis, seu derivado ou um polipeptídio sintético modelado com base nela, como uma sequência de nucleotídeos de um gene de δ-endotoxina de Bt (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), e um gene vegetativo inseticida (VIP) (veja, por exemplo, Estruch et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5389-94). Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de δ-endotoxina podem ser adquiridas na Coleção Americana de Cultura de Tipo em (Rockvil- le, Md.), sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.

[0094] Uma lectina, como sequências de nucleotídeos de vários genes de lectina de ligação a manose de Clivia miniata (Van Damme etal., 1994 Planta Molec. Biol. 24:825).

[0095] Uma proteína de ligação a vitamina, como avidina e homólogos de avidina que sejam úteis como larvicidas contra pragas de insetos. Veja a patente norte-americana n° 5.659.026.

[0096] Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protea-se ou um inibidor de amilase. Exemplos desses genes incluem um inibidor da cisteína proteinase do arroz (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor da proteinase do tabaco I (Huub et al., 1993 Planta Molec. Biol. 21:985), e um inibidor da α-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).

[0097] Um hormônio ou ferormônio específico para insetos, como um ecdiesteroide e hormônio juvenil, sua variante, um mimético baseado nele ou seu antagonista ou agonista, como a expressão em bacu-lovírus esterase de hormônio juvenil, um inativador do hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).

[0098] Um peptídio ou neuropeptídio específico para insetos que, com a expressão, interrompa a fisiologia da praga afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos desses genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989), e neurotoxinas paralíticas específicas para insetos (parte norte-americana n° 5.266.361).

[0099] Um veneno específico para insetos produzido na natureza por uma cobra, uma vespa e outros, como um peptídio insetotóxico de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165).

[00100] Uma enzima responsável pela hiperacumulação de mono-terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um deri- vado fenilpropanoide ou outra molécula não proteína com atividade inseticida.

[00101] Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-tradução, de uma molécula biologicamente ativa; por e-xemplo, uma enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma estera-se, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, natural ou sintética. Exemplos desses genes incluem um gene callas (pedido publicado PCT WO93/02197), sequências codificadoras de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, na ATCC sob os números de acesso 3999637 e 67152), quitinase de nematódeo do tabaco (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), e gene da ubi4-2 poliubiquitina da salsinha (Kawalleck et al., 1993 Planta Molec. Biol. 21:673).

[00102] Uma molécula que estimule a transdução de sinal. Exemplos dessas moléculas incluem sequências de nucleotídeos para clones de cDNA da calmodulina do feijão-da-china (Botella et al., 1994 Planta Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA da calmodulina do milho (Griess et al., 1994 Plant Phy-siol. 104:1467).

[00103] Um peptídio de momento hidrofóbico. Veja as patentes norte-americanas n° 5.659.026 e 5.607.914; esta última ensina peptídios antimicrobianos sintéticos que conferem resistência a doenças.

[00104] Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, como um análogo peptídico de cecropina-β lítica (Jaynes et al., 1993 Planta Sei. 89:43) que torne plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[00105] Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada dela. Por exemplo, a acumulação de proteínas de revestimento viral em células vegetais transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento da doença efetuada pelo vírus do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, assim como por vírus relacionados. A resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfalfa, vírus do mosaico do pepino, vírus do listrado do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus da escoriação do tabaco, vírus do anel do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Veja, por exemplo, Beachy et al. (1990), Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.

[00106] Um anticorpo específico para insetos ou uma imunotoxina derivada dele. Assim, um anticorpo que tenha como alvo uma função metabólica crítica inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994), Resumo n° 497, Seventh lnt’l. Sym-posium on Molecular Plant-Microbe Interactions, mostra a inativação enzimática em tabaco transgênico mediante produção de fragmentos de anticorpos de cadeia única.

[00107] Um anticorpo específico para vírus. Veja, por exemplo, Ta-vladoraki et al. (1993), Nature 266:469, que mostra que plantas trans-gênicas que expressam genes de anticorpos recombinantes estão protegidas do ataque de vírus.

[00108] Uma proteína de interrupção do desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, endo a-1,4-D po-ligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e a liberação de nutrientes da planta por solubilização da homo-a-1,4-D-galacturonase de parede celular vegetal (Lamb et al. (1992), Bi-o/Technology 10:1436). A clonagem e caracterização de um gene que codifique uma proteína inibidora de endopoligalacturonase de feijão é descrita por Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367).

[00109] Uma proteína de interrupção do desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, como o gene inativador de ribossomo que confere uma resistência aumentada a doença fúngica (Longe- mann etal. (1992), Bio/Technology 10:3305).

[00110] Interferência por RNA, em que uma molécula de RNA é u-sada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é parcial ou completamente de fita dupla, que desencadeia uma resposta de silenciamento, resultando na divagem de ds-RNA em pequenos RNAs de interferência, que são, então, incorporados em um complexo de busca que destroi mRNAs homólogos. Veja, por exemplo, Fire et al., patente norte-americana n° 6.506.559; Gra-ham et al. patente norte-americana n° 6.573.099.

Genes Que Conferem Resistência a um Herbicida [00111] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que iniba o ponto de crescimento ou meristema, como um herbicida de imidazalinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Genes exemplifi-cativos nessa categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee et al., 1988 EMBO J. 7:1241), que também é conhecida como enzima AHAS (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449).

[00112] Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância a glifosato conferida por genes de EPSP sintetase e aroUm mutantes, ou mediante inativação metabólica por genes como GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos fosfono, como glufosinato (genes pat e bar; DSM-2), e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo-hexanodionas (genes que codificam inibidor de ACCase). Veja, por exemplo, a patente norte-americana n° 4.940.835, que apresenta a sequência de nucleotídeos de uma forma de EPSP que pode conferir resistência a glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene de aroA mutante pode ser obtyida sob o número de acesso ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é apresentada na patente norte-americana n° 4.769.061. O pedido de patente europeia n° 0 333 033 e a patente norte-americana n° 4.975.374 apresentam sequências de nucleotídeos de genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene da fos-finotricinaacetil-transferase é apresentada no pedido europeu n° 0 242 246. De Greef et al. (1989), Bio/Technology 7:61, descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam a atividade da fosfinotricina acetil transferase. Exemplos de genes que conferem resistência a ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ci-clo-hexanodionas, como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992), Theor. Appl. Genet. 83:435.

[00113] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que iniba a fotossíntese, como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla et al. (1991), Plant Cell 3:169, descreve o uso de plasmídios que codificam genes psbA mu-tantes para transformar Chlamydomonas. Sequências de nucleotídeos para genes da nitrilase são apresentadas na patente norte-americana n° 4.810.648, e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob os números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de DNA que codifica uma glutationa S-transferase é descrita por Hayes et al. (1992), Biochem. J. 285:173.

[00114] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que que se liga a hidroxifenilpiruvate dioxigenases (HPPD), enzimas que catalisam a reação em que para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogenizado. Esses incluem herbicidas como iso-xazóis (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, patente norte-americana n° 5.424.276), em particular iso-xaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilas (EP496630, EP496631), em particular 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-2,3CI2fenil)propano-1,3-diona, tricetones (EP625505, ΕΡ625508, patente norte-americana n° 5,506,195), em particular sul-cotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz uma superabundância de HPPD em plantas pode conferir tolerância ou resistência a esses herbicidas, incluindo, por exemplo, os genes descritos nas patentes norte-americanas n° 6.268.549 e 6.245.968 e na publicação de patente norte-americana n° 20030066102.

[00115] Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de fenóxi auxina, como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e que também podem conferir resistência ou tolerância a herbicidas de arilo-xifenoxipropionato (AOPP). Exemplos desses genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-1), descrito na patente norte-americana n° 7.838.733.

[00116] Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicidas de fenóxi auxina, como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que também podem conferir resistência ou tolerância a herbicidas de piridi-lóxi auxina, como fluroxipir ou triclopir. Exemplos desses genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetog luta rato (a-ad-12), descrito no WO 2007/053482 A2.

[00117] Genes que codificam resistência ou tolerância a dicamba (veja, por exemplo, publicação de patente norte-americana n° 20030135879).

[00118] Genes que conferem resistência ou tolerância a herbicidas que inibam a protoporfirinogênio oxidase (PPO) (veja a patente norte-americana n° 5.767.373).

[00119] Genes que conferem resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (como atrazina) e herbicidas de derivados de ureia (como diuron) que se ligam a proteínas de núcleo de centros de reação do fotossistema II (PS II) (veja Brussian et al. (1989), EMBO J. 1989, 8(4):1237-1245).

Genes Que Conferem ou Contribuem Para um Traço de Valor Adicio- nado [00120] Metabolismo de ácidos graxos modificado, por exemplo, por transformação de milho ou Brassica com um gene antissentido ou es-tearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon et al. (1992), Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 89:2624).

[00121] Teor de fitato diminuído [00122] A introdução de um gene que codifica fitase, como o gene de fitase do Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87), intensifica a degradação de fitato, acrescentando mais fosfato livre à planta transformada.

[00123] Podería ser introduzido um gene que reduz o teor de fitato. No milho, isso, por exemplo, podería ser realizado por clonagem e, então, reintrodução de DNA associado ao alolo único que é responsável por mutantes de milho caracterizado por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).

[00124] Composição de carboidratos modificada efetuada, por e-xemplo, por transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altere o padrão de ramificação do amido. Exemplos dessas enzimas incluem, o gene da fruetosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza et al. (1988), J. Bacteriol. 170:810), o gene da levan-sucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al. (1985), Mol. Gen. Genel. 200:220), da α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen et al. (1992), Bi-o/Technology 10:292), genes da invertase do tomate (Elliot et al., 1993), o gene da amilase da cevada (Sogaard et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:22480), e da enzima II de ramificação do amido no endos-perma do milho (Fisher et al. (1993), Plant Physiol. 102:10450).

[00125] Para expressar um gene marcador selecionável, um gene de traço, ou um gene de RNAi em uma célula de soja, um ácido nucle-ico que codifica a proteína é tipicamente subclonado em um vetor de expressão que contém um promotor para dirigir a transcrição. Promo- tores bacterianos e eucarióticos adequados são bem conhecidos na técnica e estão descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed. 1989; 3a ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., supra.). Sistemas de expressão bacteriana para expressar um ácido nucleico aqui estão disponíveis em, por exemplo, E. coli, Bacillus sp. e Salmonella (Paiva et al., Gene 22:229-235 (1983)). Kits para esses sistemas de expressão são comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucarióticos para células de mamíferos, levedura e células de insetos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e também são comercialmente disponíveis.

[00126] O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética para a célula é selecionado com relação ao uso desejado (por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos e protozoários). Vetores de expressão bacteriana e em animal padronizados são conhecidos na técnica e estão descritos em detalhes, por exemplo, na publicação de patente norte-americana n° 20050064474A1 e nas publicações de patentes internacionais WO 05/084190, WO 05/014791 e WO 03/080809. Métodos de transfecção padronizados podem ser usados para produzir linhagens de células bacterianas que expressem grandes quantidades de proteína, que pode ser, então, purificada usando técnicas padronizadas.

[00127] A seleção de um promotor usado para dirigir a expressão de um ácido nucleico aqui depende da aplicação particular. Inúmeros promotores que dirigem a expressão de um gene em uma planta podem ser utilizados nas presentes modalidades. Esses promotores podem ser selecionados de promotores constitutivos, quimicamente regulados, induzíveis, específicos para tecido e com preferência para semente. Por exemplo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hospedeira pode ser usado para expressão e purificação das proteínas expressadas. Exemplos não limitativos de promotores de plantas incluem as sequências promotoras derivadas de ubiquitina-10 de A. thaliana (ubi-10) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); manopina sintetase de A. tumefaciens (Amas) (Petolino et al., patente norte-americana n° 6.730.824); e/ou vírus do mosaico da veia de mandioca (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Planta Molecular Bio-logy 31:1129-1139).

[00128] Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor 35S do núcleo do vírus do mosaico da couve-flor (Odell et al. (1985), Nature 313:810-812); promotor da actina do arroz (McElroy et al. (1990), Plant Cell 2:163-171); promotor da ubiquitina do milho (patente norte-americana n° 5.510.474; Christensen et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen et al. (1992), Plant Mol. Biol. 18:675-689); promotor de pEMU (Last et al. (1991), Theor. Appl. Genet. 81:581-588); promotor de ALS (patente norte-americana n° 5,659,026); promotor da histona do milho (Chabouté et al. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)), e outros.

[00129] A gama de promotores compatíveis com plantas disponíveis inclui promotores específicos para tecido e induzíveis. Um elemento regulador induzível é um que seja capaz de ativar direta ou indiretamente a transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator proteico que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa que é, então, direta ou indiretamente converida na forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico, como uma proteína, metabólito, regulador do crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente pelo calor, frio, sal ou elementos tóxi- cos ou indiretamente mediante a ação de um patógeno ou agente de doença, como um vírus. Tipicamente, o fator proteico que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa que é, então, direta ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. Uma célula vegetal contendo um elemento regulador induzível pode ser exposta a um indutor por aplicação externa do indutor à célula ou planta, como por pulverização, aguagem, aquecimento ou métodos similares.

[00130] Qualquer promotor induzível pode ser usados nas presentes modalidades. Veja Ward et al. Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Promotores induzíveis incluem, por exemplo e sem limitação: promotores do receptor de ecdisona (patente norte-americana n° 6.504.082); promotores do sistema ACE1 que respondem ao cobre (Mett et al. PNAS 90:4567-4571 (1993)); genes In2-1 e ln2-2 do milho que respondem a agentes protetores de herbicida de benzenossulfonamida (patente norte-americana n° 5.364.780; Hershey et al., Mol. Gen. Ge-netics 227: 229-237 (1991); e Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237 (1991)); promotores de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcricional é induzida por um hormônio glucocorticos-teroide, Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88:10421 (1991); e McNellis et al. (1998), Plant J. 14(2):247-257; o promotor GST do milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são u-sados como herbicidas de pré-emergência (veja a patente norte-americana n° 5.965.387 e pedido de patente internacional, publicação n° WO 93/001294); e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico (veja S. Ono, M. Kusama, R. Ogura, K. Hiratsuka, “Eva-luation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Repórter System”, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011 Sep 23;75(9): 1796-800). Ou- tros promotores quimicamente regulados de interesse incluem os promotores induzível por tetraciclina e reprimível por tetraciclina (veja, por exemplo, Gatz et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e patentes norte-americanas n° 5.814.618 e 5.789.156).

[00131] Outros promotores reguláveis de interesse incluem um e-lemento regulador sensível ao frio ou um elemento regulador de choque térmico, cuja transcrição pode ser efetuada em resposta à exposição ao frio ou calor, respectivamente (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); o promotor do gene da álcool desidrogenase (Ger-lach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)), induzível por condições anaeróbicas; o promotor induzível pela luz derivado do gene rbcS de ervilha ou gene psaDb de ervilha (Yamamoto et al. (1997), Plant J. 12(2):255-265); um elemento regulador induzível pela luz (Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam e Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90(20):9586-9590; Orozco et al. (1993), Plant Mol. Bio. 23(6): 1129-1138); um elemento regulador induzível por hormônio vegetal (Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990), e outros. Um elemento regulador induzível também pode ser o promotor do gene In2-1 ou ln2-2 do milho, que responde a agentes protetores de herbicidas de benzenossulfonamida (Hershey et al., Mol. Gen. Gene, 227:229-237, 1991; Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), e o repressor Tet do transposon Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991).

[00132] Promotores induzíveis por estresse incluem promotores in-duzíveis por estresse de sal/água, como P5CS (Zang et al. (1997), Plant Sciences 129:81-89); promotores induzíveis por frio, como cor15a (Hajela et al. (1990), Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wi-Ihelm et al. (1993), Plant Mol. Biol. 23:1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998), FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997), Plant Mol. Biol. 33:897-909), e ci21A (Schneider et al. (1997), Plant Physiol. 113:335-45); promotores induzíveis por seca, como Trg-31 (Chaudhary et al. (1996), Plant Mol. Biol. 30:1247-57) e rd29 (Kasuga et al. (1999), Nature Biotechnology 18:287-291); promotores induzíveis por pressão osmótica, como Rab17 (Vilardell et al. (1991), Plant Mol. Biol. 17:985-93) e osmotin (Raghothama et al. (1993), Plant Mol. Biol. 23:1117-28); promotores induzíveis pro calor, como proteínas de choque térmico (Barros et al. (1992), Plant Mol. 19:665-75; Marrs et al. (1993), Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et al. (1996), J. Experimental Bota-ny 47:325-338); e o elemento induzível por choque térmico do promotor da ubiquitina da salsinha (WO 03/102198). Outros promotores induzíveis por estresse incluem rip2 (patente norte-americana n° 5.332.808 e publicação norte-americana n° 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993), Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Certos promotores são induzíveis por feridas, incluindo o promotor pMAS de Agrobacterium (Guevara-Garcia et al. (1993), Plant J. 4(3):495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen et al. (1997), Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343).

[00133] Podem-se utilizar promotores com preferência por tecidos que tenham como alvo uma transcrição e/ou expressão intensificada em um tecido vegetal particular. Exemplos desses tipos de promotores incluem expressão preferencial em semente, como a proporcionada pelo promotor da faseolina (Bustos et al. 1989, The Plant Cell Vol. 1, 839-853), e o gene da globulina-1 do milho, Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972. Para dicotiledôneas, promotores com preferência por sementes incluem, mas não se limitam a, β-faseolina de feijão, na-pina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina e outros. Para monoco-tiledôneas, promotores com preferência por sementes incluem, mas não se limitam a, zeína de 15 kDa, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, γ-zeína, ceroso, encolhido 1, encolhido 2, globulina 1, e outros do milho. Promotores com preferência por sementes também incluem os promotores que dirigem a expressão do gene predominantemente para tecidos específicos na semente como, por exemplo, o promotor com preferência por endosperma de γ-zeína, o promotor críptico do tabaco (Fobert et al. 1994, T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic pro-moter in tobacco, Plant J. 4:567-577), o promotor do gene P de milho (Chopra et al. 1996, Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal repla-cements, Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell, 1997, 1:109), o promotor de globulina-1 do milho (Belenger e Kriz, 1991, Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene, Genetics 129:863-972), e promotores que dirigem a expressão para o revestimento da semente ou casca de grãos de milho, por exemplo, o promotor da glutamina sintetase específico para pericarpo (Muhitch et al., 2002, Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Syntheta-se-1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize, Plant Science 163:865-872).

[00134] Além do promotor, um vetor de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais requeridos para a expressão do ácido nucleico em células hospedeiras, procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típico contém, portanto, um promotor operacionalmente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína, e sinais requeridos, por exemplo, para poliadenila-ção eficiente do transcrito, término da transcricional, sítios de ligação a ribossomos ou término da tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, intensificadores e sinais de fusão heteró-logos.

[00135] Outros componentes do vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso desejado do gene. Os exemplos incluem marcadores selecionáveis, sequências de busca ou reguladoras, sequências de peptídios de trânsito, como a sequência de peptídio de trânsito otimizada (veja a patente norte-americana n° 5.510.471), sequências es-tabilizadoras, como RB7 MAR (veja Thompson e Myatt (1997), Plant Mol. Biol., 34: 687-692 e WO9727207) ou sequências líderes, íntrons e outras. Descrições genéricas e exemplos de vetores de expressão em plantas e genes repórteres podem ser encontrados em Gruber, et al., “Vectors for Plant Transformation” em Methods in Plant Molecular Bio-logy and Biotechnology, Glick et al. eds; CRC Press pp. 89-119 (1993).

[00136] A seleção de um vetor de expressão apropriado dependerá do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão pode incluir, na terminação 3’ de uma sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de término de transcrição e tradução funcional em plantas. A região de término pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de término convenientes estão disponíveis no plasmídio Ti de A. tumefaciens, como as regiões de término de octopina sintetase e nopalina sintetase (nos) (Depicker et al., Mol.eAppI. Genet. 1:561-573 (1982); e Shaw etal. (1984), Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp. 7831-7846(nos)); veja também Guerineau et al., Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon et al., Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen et al., Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe et al., Gene 91:151-158 (1990); Bailas et al., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); e Joshi et al., Nucleic Acids Res. 15:9627-9639 (1987).

[00137] Um cassete de expressão pode conter uma sequência líder 5'. Essas sequências líderes podem agir intensificando a tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de e-xemplo, líderes de picornavírus, líder EMCV (região não codificadora 5’ de encefalomiocardite), Elroy-Stein et al., Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 86:6126-6130 (1989); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (vírus da escoriação do tabaco) Carrington e Freed, Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), líder MDMV (vírus do mosaico anão do milho), Allison et al., Virology 154:9-20 (1986); proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP), Macejak et al., Nature 353:90-94 (1991); líder não traduzido do mRNA de proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfalfa (AMV RNA 4), Jobling et al., Nature 325:622-625 (1987); líder do vírus do mosaico do tabaco (TMV), Gallie et al. (1989), Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; e líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (MCMV) Lommel et al., Virology 81:382-385 (1991). Veja também Della-Cioppa et al., Plant Physi-ology 84:965-968(1987).

[00138] O construto também pode conter sequências que intensifiquem a tradução e/ou estabilidade do mRNA, como íntrons. Um e-xemplo de um desses íntrons é o primeiro íntron do gene II da histona H3.III variante de Arabidopsis thaliana. Chaubet et al., Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).

[00139] Nos casos em que é desejável ter o produto expressado da sequência de nucleotídeos heteróloga dirigido para uma organela particular, particularmente o plastídio, amiloplasto ou o retículo endoplas-mático, ou secretado na superfície da célula ou extracelularmente, o cassete de expressão também pode compreender uma sequência co-dificadora para um peptídio de trânsito. Esses peptídios de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não se limitam a, o peptídio de trânsito para a proteína carreadora de acila, a subunidade pequena de RUBISCO, EPSP sintetase de planta e Helianthus annuus (veja, Lebrun et al., patente norte-americana n° 5.510.417), peptídio de trânsito para cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson et al., Plant Physiol. 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan et al., Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan et al„ Plant (1995) 196(3):477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992), 267(26):18999-9004) e outros. Além disso, peptídios de trânsito para cloroplasto quiméricos são conhecidos na técnica, como o peptídio de trânsito otimizado (veja a patente norte-americana n° 5.510.471). Peptídios de trânsito para cloroplasto adicionais foram anterioremente descritos nas patentes norte-americanas n° 5.717.084; 5.728.925. Aqueles versados na técnica perceberão prontamente as muitas opções disponíveis na expressão de um produto em uma organela particular. Por exemplo, a sequência de alfa amilase da cevada é frequentemente usada para dirigir a expressão para o re-tículo endoplasmático. Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985).

[00140] Deve ser percebido por aqueles versados na técnica que o uso de tecnologias de DNA recombinante pode melhorar o controle da expressão de moléculas de ácido nucleico transfectadas por manipulação, por exemplo, do número de cópias das moléculas de ácido nucleico dentro da célula hospedeira, da eficiência com que essas moléculas de ácido nucleico são transcritas, da eficiência com que os transcritos resultantes são traduzidos e da eficiência de modificações pós-tradução. Além disso, a sequência de promotor podería ser geneticamente manipulada para melhorar o nível de expressão em comparação com o promotor nativo. Técnicas recombinantes utilizáveis para o controle da expressão de moléculas de ácido nucleico incluem, mas não se limitam a, integração estável das moléculas de ácido nucleico em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, adição de sequências de estabilidade do vetor em plasmídios, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modificações de sinas de controle da tradução (por exemplo, sítios de ligação a ribos-somo, sequências de Shine-Dalgarno ou Kozak), modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de códons da célu- Ia hospedeira e deleção de sequências de desestabilizem transcritos.

[00141] Genes repórteres ou marcadores para seleção de células ou tecidos transformados ou partes de plantas ou plantas podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabóli-tos, como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, diidrofolato reduta-se, que confere resistência a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13:143-149, 1994; veja também Herrera Estrella et al., Natu-re 303:209-213, 1983; Meijer etal., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991); neomicina fosfotransferase, que confere resistência às aminoglicosi-das neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 e Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:4803 (1983)); higromicina fosfotransferase, que confere resistência a higro-micina (Marsh, Gene 32:481-485, 1984; veja também Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995); trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:8047, 1988); ma-nose-6-fosfato isomerase, que permite que as células utilizem manose (WO 94/20627); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao inibidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitina (DF-MO; McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Asper-gillus terreus, que confere resistência a Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995).

[00142] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma acetolactato sintetase mutante, que confere resistência a imidazo-linona ou sulfonilureia (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), um psbA mutante, que confere resistência a atrazina (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993), ou uma protoporfirinogênio oxidase mu- tante (veja a patente norte-americana n° 5.767.373), ou outros marcadores que confiram resistência a um herbicida como glufosinato. E-xemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não se limitam a, genes que codificam resistência a cloranfenicol (Her-rera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983); estreptomicina (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996); bleomicina (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); sulfonamida (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); bromoxinila (Stalker et al., Science 242:419-423, 1988); glifosato (Shaw et al., Science 233:478-481, 1986); fosfinotricina (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987), e outros.

[00143] Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA codificador da resistência a glufosinato e, em uma modalidade, pode ser o da fosfinotricina acetil transferase (pat), gene pat ou gene bar otimizado de milho sob o controle do promotor do vírus do mosaico da veia de mandioca. Esses genes conferem resistência a bialafos. Veja Wohlle-ben et al. (1988), Gene 70: 25-37; Gordon-Kamm et al. (1990), Plant Cell 2:603; Uchimiya et al. (1993), BioTechnology 11:835; White et al. (1990), Nucl. Acids Res. 18:1062; Spencer et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 79:625-631; e Anzai et al. (1989), Mol. Gen. Gen. 219:492. Uma versão do gene pat é o gene pat otimizado de milho, descrito na patente norte-americana n° 6.096.947.

[00144] Além disso, podem ser utilizados marcadores que facilitam a identificação de uma célula vegetal contendo o polinucleotídeo que codifica o marcador. São utilizáveis marcadores pontuáveis ou triáveis, quando a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula vegetal. Exemplos incluem um gene de β-glucuronidase, ou uidUm (GUS), que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogêni- cos (por exemplo, patentes norte-americanas n° 5.268.463 e 5.599.670); cloranfenicol acetil transferase (Jefferson et al., The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é beta-caroteno ou pró-vitamina A (Ye et al., Science 287:303-305- (2000)). O gene foi usado para intensificar a nutrição do arroz, mas, neste caso, é utilizado como um marcador triável, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourada conferida. Diferentemente da situação em que o gene é usado por sua contribuição nutricional à planta, basta uma quantidade menor da proteína para fins de marcação. Outros marcadores triáveis incluem os genes de antocianina/flavonoide em geral (veja a discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990) 2:115-127), incluindo, por exemplo, um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., em Chromosome S-tructure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels e Gustaf-son eds., pp. 263-282 (1988)); os genes que controlam a biossíntese de pigmentos flavonoide, como o gene C1 do milho (Kao et al., Plant Cell (1996) 8:1171-1179; Scheffler et al., Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 do milho (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene p1 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sei U.S.A. (1991) 88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); os genes do locus bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11):1039-1049), entre outros.

[00145] Exemplos adicionais de marcadores adequados incluem o gene da proteína ciano fluorescente (CYP) (Boite et al. (2004), J. Cell Science 117: 943-54 e Kato et al. (2002), Plant Physiol. 129:913-42), o gene da proteína fluorescente amarela (PHIYFP™ da Evrogen; veja Boite et al. (2004), J. Cell Science 117:943-54); um gene lux, que codifica uma luciferase, cuja presença pode ser detectada usando, por e-xemplo, filme de raios X, contagem de cintilação, espectrofotometria fluorescente, câmeras de vídeo de baixa luz, câmeras de contagem de fótons ou luminometria de múltiplos poços (Teeri et al. (1989), EMBO J. 8:343); um gene de proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84); e DsRed2, em que células vegetais transformadas com o gene marcador são de cor vermelha e, portanto, visualmente selecionáveis (Dietrich et al. (2002), Biotechniques 2(2):286-293). Exemplos adicionais incluem um gene de β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat’l. Acad. Sei. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Natl Acad. Sei. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de oc-amilase (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241); e um gene de tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, se condensam, formando o composto facilmente detectável melanina. Evidentemente, muitos desses marcadores estão disponíveis e são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Ensaios Para a Detecção de um Transgene ou Produto Expressado de um Transgene [00146] Vários ensaios podem ser utilizados para identificar a localização do transgene transformado dentro das seções de caule de soja. As seguintes técnicas são úteis em várias situações e, em uma modalidade, são úteis na detecção da presença do transgene e/ou do polipeptídio codificado pelo transgene em um caule de planta de soja. Por exemplo, material de planta da seção de caule de soja pode ser transferido para uma membrana e ensaiado quanto à expressão do transgene. Em uma modalidade, o material de planta transferido para a membrana pode ser ensaiado mediante um Western blot para detectar a proteína expressada pelo transgene. Em outra modalidade, o material de planta transferido para a membrana pode ser detectado mediante ensaios enzimáticos. Além disso, um anticorpo que possa detectar a presença do transgene pode ser gerado e usado para ensaiar material de planta da seção de caule de soja que foi transferida para uma membrana e ensaiada quanto à expressão do transgene. Técnicas adicionais, como hibridização in situ, coloração com enzima e i-munocoloração, também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão do transgene nas seções de caule de soja.

[00147] Na análise Western, a seção de caule de soja é cortada transversal mente e transferida diretamente para a membrana. A proteína de interesse que é expressada pelo transgene que foi transformado nas plantas de soja é transferido da seção de caule de soja para a membrana. A proteína é contactada com uma substância marcadora, como um anticorpo. Veja, por exemplo, Hood et al., “Commercial Pro-duction of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification”, Molecular Breeding 3:291-306 (1997); Towbin et al. (1979), “Electro-phoretic transfer of proteins from polyacrylamida gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications”, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76(9):4350-4354; Renart et al. “Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper e detection with antisera: a method for studying antibocy specificity and antigen strueture”, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76(7):3116-3120.

[00148] Conforme aqui usado, o termo “membrana” se refere a uma fase sólida que é um material insolúvel em água poroso ou não poroso incluindo, mas não limitados a, celulose, polissacarídeo como SE- PHADEX™, vidro, poliacriloilmolfolida, sílica, vidro de poro controlado (CPG), poliestireno, poliestireno/látex, polietileno como polietileno de peso molecular ultra alto (UPE), poliamida, fluoreto de polivinilidina (PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE; TEFLON®), TEFLON® modificado com carboxila, náilon, nitrocelulose e metais e ligas, como ouro, platina e paládio. As membranas são carregadas e se ligam a materiais orgânicos como proteínas.

[00149] As membranas melhoram significativamente a transferência por Western blot tornando o processo quantitativo. Ao assegurar que as seções de caule de soja sejam impressas sobre o membro e sejam transferidas para a fase sólida adsorvente, torna-se possível fazer estudos quantitativos para determinar que tecidos da seção de caule de soja compreendem o transgene transformado.

[00150] Outro método para transferir as proteínas é chamado de eletrotransferência e usa uma corrente elétrica para puxar as proteínas da seção de caule para a membrana. Dispositivos para eletrotransferência são comercialmente disponíveis. As proteínas se movem de dentro da seção de caule para membrana enquanto mantêm a organização que tinham dentro do gel. Como resultado desse processo de “transferência”, as proteínas são expostas sobre uma camada de superfície fina para detecção. Tanto as membranas secundárias, quanto absorventes são selecionadas por suas propriedades de ligação a proteínas não específicas (isto é, ligam-se a todas as proteínas igualmente bem). A ligação a proteína se baseia em interações hidrofóbicas, assim como interações de cargas entre a membrana e a proteína.

[00151] A uniformidade e eficácia global da transferência de proteína do gel para a membrana podem ser verificadas por coloração da membrana com corantes Coomassie ou Ponceau S, ou outros corantes. O Coomassie é o mais sensível dos dois, embora a solubilidade em água do Ponceau S torne mais fácil descolorar e sondar subse- quentemente a membrana.

[00152] Como a membrana foi escolhida por sua capacidade de se ligar a proteínas, e tanto anticorpos, quanto o alvo são proteínas, devem-se tomar cuidados para impedir interações entre a membrana e o anticorpo usado para detecção da proteína alvo. O bloqueio da ligação não específica é conseguido colocando-se a membrana em uma solução diluída de proteína, tipicamente albumina sérica bovina (BSA) ou leite em pó desnatado, com uma diminuta porcentagem de detergente como TWEEN® 20. A proteína na solução diluída se fixa à membrana em todos os locais aos quais a proteínas alvo não se fixou. Assim, quando o anticorpo é acrescentado, não há espaço na membrana para se fixar, exceto os sítios de ligação da proteína alvo específica. Isso reduz o “ruído” no produto final do Western blot, levando a resultados mais claros, e elimina uma falsa detecção.

[00153] Conforme aqui usados, os termos “marcador” e “etiqueta” se referem a substâncias que podem conferir um sinal detectável e incluem, mas não se limitam a, enzimas, como fosfatase alcalina, gli-cose-6-fosfato desidrogenase e peroxidase de raiz-forte, ribozima, um substrato para uma replicase, como QB replicase, promotores, corantes, agentes fluorescentes, como fluoresceína, isotiocinato, compostos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluo-rescamina, agentes quimioluminescentes, como isoluminol, sensibili-zadores, coenzimas, substratos de enzimas, radiomarcadores, partículas, como partículas de látex ou carbono, lipossomos, células e outras, que podem ser adicionalmente marcada com um corante, catalisador ou outro grupo detectável.

[00154] Proteínas transferidas para membranas adsorventes podem ser detectadas usando-se várias técnicas convencionais. Uma técnica de detecção preferida usa anticorpos específicos para um polipeptídio particular. O anticorpo primário pode ser detectado usando-se qual- quer uma de várias técnicas. Vários métodos para detectar interações anticorpo-antígeno específicas são conhecidos na técnica e podem ser usados no método, incluindo, mas não limitados a, métodos imunoisto-lógicos padronizados, imunoprecipitação, um imunoensaio de enzima e um radioimunoensaio. Em geral, o anticorpo específico para o poli-peptídio será marcado de maneira detectável, direta ou indiretamente. Marcadores diretos incluem radioisótopos; enzimas cujos produtos sejam detectáveis (por exemplo, luciferase, β-galactosidase e outras); marcadores fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,ficoeritrina e outros); metais emissores de fluorescência, por exemplo, 152Eu, ou outros da série lantanídea, fixados ao anticorpo meiantye grupos quelantes de metal, como EDTA; compostos quimio-luminescentes, por exemplo, luminol, isoluminol, sais de acridínio e outros; compostos bioluminescentes, por exemplo, luciferina, e aequo-rina (proteína fluorescente verde).

[00155] As membranas adsorventes contendo proteínas transferidas podem ser, então, lavadas com tampões adequados, seguido por contato com um anticorpo específico para o polipeptídio marcado de maneira detectável. Métodos de detecção são conhecidos na técnica e serão escolhidos conforme apropriado ao sinal emitido pelo marcador detectável. A detecção é geralmente realizada em comparação com controles adequados e padrões apropriados.

[00156] Em uma modalidade, pode-se utilizar o Western blotting para impressão de tecido das seções de caule de soja para identificar transformantes de soja de linhagem germinativa e de linhagem não germinativa. Transformantes de soja de linhagem germinativa podem ser identificados pelo “padrão de pontos” que é produzido na membrana após a detecção com um anticorpo ou outro marcador. O padrão de pontos aparece na membrana como um círculo preenchido. Comparativamente, os transformantes de soja de linhagem não germinativa po- dem ser identificados pelo “padrão de anel” que é produzido na membrana após a detecção com um anticorpo ou outro marcador. O padrão de anel aparece na membrana como uma linha circular. O centro do padrão de anel está desprovido de sinal de um anticorpo ou outro marcador.

[00157] Portanto, o “padrão de pontos” é indicativo de caules de planta de soja que estejam transformados com um transgene na camada de núcleo (camadas L2 e L3) e que resultarão em transforman-tes de soja de linhagem germinativa. Comparativamente, o “padrão de anel” é indicativo de caules de planta de soja que estejam transformados com um transgene no tecido de manto (camada L1) e que resultarão em transformantes de soja de linhagem não germinativa.

[00158] Modalidades da presente invenção são adicionalmente definidas nos Exemplos a seguir. Deve-se entender que esses Exemplos são dados apenas a título de ilustração. Da discussão acima e desses Exemplos, aqueles versados na técnica podem verificar as características essenciais desta invenção e, sem sair de seu espírito e âmbito, podem fazer várias alterações e modificações das modalidades da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Assim, várias modificações das modalidades da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas, ficarão claras para aqueles versados na técnica pela descrição precedente. Essas modificações também devem ficar dentro do âmbito das reivindicações anexas. A parte a seguir é apresentada a título de ilustração e não se destina a limitar o âmbito da invenção. EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Construto de DNA

[00159] Um único vetor binário chamado de pDAB9381 (FIG. 1) foi construído usando-se procedimentos reconhecidos na técnica. pDAB9381 contém duas Unidades de Transcrição em Plantas (PTUs). A primeira PTU (SEQ ID NO:1) consiste no promotor de ubiquitina-10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbilO; J. Callis, et al. (1990), Ubiquitin extension proteins of Arabidopsis thaliana. Structure, localiza-tion e expression of their promoters in transgenic tobacco. J. Biol. Chem. 265:12486-12493) que aciona a sequência codificadora da proteína de fluorescência amarela (PhiYFP; Shagin, et al. (2004), GFP-like proteins as ubiquitous metazoan superfamily: evolution of functio-nal features and structural complexity, Molecular Biology and Evolution 21(5):841-850) que contém um íntron isolado de Solanum tuberosum, gene LS-1 induzível em tecido específico para luz (íntron ST-LS1; Genbank N° Ac. X04753), e é terminada pela região não traduzida 3’ do quadro de leitura aberto-23 de Agrobacterium tumefaciens (Atu-ORF23 3'UTR; Gelvin SG (1987) TR-based sub-Ti plasmids, patente EP 222493). A segunda PTU (SEQ ID NO:2) foi clonada dentro da sequência codificadora de isopenteniltransferase (ipt CDS; Genbank N° Ac. X00639.1), consistindo no promotor do vírus do mosaico da veia de mandioca (promotor CsVMV; B. Verdaguer, et al. (1996), Isolation and expression in transgenic tobacco and rice plants of the cassava vein mosaic (CVMV) promotor, Plant Mol. Biol. 31:1129-1139) que é usado para acionar a sequência codificadora de fosfinotricina acetil transferase (PAT; W. Wohlleben et al. (1988), Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyl-transferase gene from Streptomyces viri-dochromogenes Tu494 and its expression in Nicotiana tobacum, Gene 70:25-38), terminada pela região não traduzida 3’ do quadro de leitura aberto-1 de A. tumefaciens (AtuORFI 3'UTR; M.L. Huang et al. (1990), A chromosomal Agrobacterium gene required for effective plant signal transduction, J. Bacteriol. 172:1814-1822). O vetor binário resultante continha um gene repórter visual e um gene marcador selecionável com antibiótico e foi subsequentemente usado para a transformação do soja. EXEMPLO 2: Transformação de Soja [00160] Foram utilizados dois métodos para a transformação mediada por Agrobacterium de soja. Esses métodos incluem o método de transformação de nodo cotiledôneo e o método de transformação por semente partida. Ambos os protocolos são descritos em maiores detalhes abaixo.

[00161] Método de Transformação 1: Transformação do nodo cotiledôneo de soja mediada por Agrobacterium tumefaciens.

[00162] Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 (E. Hood, G. Helmer, R. Fraley, M. Chilton (1986), J. Bacteriol. 168:1291-1301) foi eletroporado com o vetor binário pDAB9381. Foram identificadas colônias isoladas que cresceram em meio YEP contendo o antibiótico es-pectinomicina. Colônias únicas foram isoladas, e a presença do vetor binário pDAB9381 foi confirmada mediante digestão com enzima de restrição. A transformação mediada por Agrobacterium de soja (Glyci-ne max c.v., Maverick) foi realizada usando o vetor binário pDAB9381 mediante um procedimento modificado de P. Zeng et al. (2004), Plant Cell Rep. 22(7):478-482. O protocolo foi modificado para incluir o herbicida glufosinato como um agente seletivo. Além disso, outra modificação incluiu a germinação de sementes de soja esterilizadas em meio basal B5 (Gamborg et al. (1968), Exp. Cell Res. Apr 50(1):151-8) solidificado com 3 g/L de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.). A modificação final do protocolo implementou o uso de explantas de nodo cotiledôneo que foram preparadas a partir de mudas de 5 - 6 dias de idade e infectadas com Agrobacterium conforme descrito por Zhang et al. (1999), The use of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediated transformation of soybean, Plant Cell, Tissue, and Organ Culture 56:37-46.

[00163] Conforme descrito em Zeng et al. (2004), o co-cultivo foi realizado durante 5 dias no meio de co-cultivo. Os meios de iniciação de rebento, alongamento de rebento e enraizamento foram suplemen- tados com 50 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de timentina, 50 mg/L de vancomicina e solidificado com 3 g/L de Phytagel. Rebentos selecionados foram, então, transferidos para o meio de enraizamento. Método de Transformação 2: Transformação por semente partida de soja mediada por Agrobacterium tumefaciens [00164] O método de transformação por semente partida descrito abaixo é descrito mais detalhadamente no pedido de patente provisória norte-americana n° 61/739.349, depositado em 19 de dezembro de 2012. Em resumo, Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 (Hood et al., 1986) foi eletroporado com o vetor binário pDAB9381. Foram identificadas colônias isoladas que cresceram em meio YEP contendo o antibiótico espectinomicina. Colônias únicas foram isoladas, e a presença do vetor binário pDAB9381 foi confirmada mediante digestão com enzima de restrição.

[00165] A transformação mediada por Agrobacterium de soja (Gly-cine max c.v. Maverick) foi realizada usando o vetor binário pDAB9381 mediante o procedimento modificado de M. Paz, et al. (2005), Plant Cell Rep. 25:206-213. Resumidamente, sementes de soja maduras foram esterilizadas durante uma noite com gás cloro e embebidas com H20 estéril dezesseis horas no escuro usando uma caixa preta a 24°C antes da transformação da planta mediada por Agrobacterium. As sementes foram cortadas ao meio por um corte longitudinal ao longo do hilo para separar a semente e remover o revestimento da semente. O eixo embrionário foi parcialmente excisado, quaisquer rebentos/brotos axiais foram removidos do nodo cotiledôneo.

[00166] As sementes esterilizadas foram inoculadas durante 30 minutos em um Agrobacterium tumefaciens cepa EHA105 portador do vetor binário pDAB9381. A seguir, as explantas foram deixadas co-cultivando com o Agrobacterium tumefaciens cepa durante 5 dias em meio de co-cultivo coberto com um papel de filtro. Após 5 dias de co- cultivo, as explantas foram lavadas em meio de indução de rebento (SI) líquido contendo 100 mg/L de timentina, 200 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de vancomicina. As explantas foram, então, cultivadas em meio de Indução de Rebento 1 (SI-1) semissólido (produzido por adição de um agente de gelificação ao meio SI), em que o lado plano da semente de soja foi colocado para cima, com a extremidade nodal do cotilédone de soja embebido no meio.

[00167] Após 2 semanas de cultura no meio SI-1 a 24°C com um fotoperíodo de 18 horas (iluminação de 80 - 90 pmoles m'2 s'1), as explantas foram transferidas para o meio de Indução de Rebento 2 (Sl-2), que foi formulado a partir do meio SI-1 por suplementação com 6 mg/L de glufosinato. Após 2 semanas em meio SI-2, os cotilédones foram removidos das explantas, e as explantas com rebentos em desenvolvimento foram excisados fazendo-se um corte na base e transferidos para o meio de Alongamento de Rebento (SE). As culturas foram transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas até que todos os rebentos fossem regenerados. O número de transferência variou de 6-8 transferências, por uma duração de 12 -16 semanas.

[00168] Os protocolos de transformação de soja acima descritos produziram eventos de soja transgênica que eram transformantes de linhagem germinativa ou de linhagem não germinativa. Como na maioria das angiospermas, as células germinativas são formadas a partir de células da camada L2/L3, transformantes de soja de linhagem germinativa resultam quando o transgene é inserido no DNA genômico das células da camada L2/L3 do meristema apical do rebento. Transformantes de linhagem germinativa são capazes de passar um transgene para as plantas descendentes (isto é, T-ι, T2, e outras) e são a-dequados para cultivo comercial convencional. Transformantes de soja de linhagem não germinativa resultam quando o transgene é inserido no DNA genômico apenas das células da camada L1 do meristema apical do rebento, que se pode se divididir anticlinalmente, formando a camada de células epidérmicas da planta. Transformantes de linhagem não germinativa não passam o transgene para as plantas descendentes (isto é, T2, e outras) e são indesejáveis. O conjunto de Exemplos a seguir descreve um novo método de triagem que foi usado para identificar e avançar os transformantes de linhagem germinativa e para detectar e eliminar os transformantes de linhagem não germinativa. EXEMPLO 3: Impressão de Tecido [00169] Rebentos de soja que atingiram um comprimento de 2,5 cm foram selecionados dos meios de alongamento de rebento (SE). Um corte horizontal limpo (seção de caule transversal) foi feito para excisar seções de caule da base dos rebentos. Seções de caule de soja de aproximadamente 0,1 - 0,5 mm de espessura foram excisadas e coletadas dos rebentos. Uma das seções de caule isoladas foi pressionada sobre um pedaço de membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA), formando uma “impressão de tecido” da seção transversal do caule. A seção de caule foi pressionada contra a membrana de nitrocelulose durante 15 segundos usando a pressão suave de um dedo com luva. Esse processo foi repetido para cada seção de caule que foi isolada de um rebento de soja individual. O rebento de soja e a localização das seções de caule correspondentes na membrana de nitrocelulose foram registrados. Além disso, 5 pL de uma solução de estoque a 1 ng/pL de proteína PhiYFP purificada foram salpicados na membrana de nitrocelulose no canto inferior direito da membrana de nitrocelulose como um controle positivo. A seguir, a membrana de nitrocelulose foi deixada secando ao ar à temperatura ambiente durante 10 minutos. Finalmente, a membrana de nitrocelulose foi encharcada em água de-sionizada durante 5 minutos e analisada mediante um procedimento Western blot.

[00170] O Western blotting foi completado por bloqueio da membrana de nitrocelulose durante 30 minutos em Solução de Bloqueio (2% de sólidos de leite em suspensão em salina tamponada com fosfato contendo 0,05% de TWEEN® 20 [PBST]). A seguir, a membrana de nitrocelulose foi lavada duas vezes durante 5 minutos em PBST. A membrana de nitrocelulose foi mergulhada em uma solução de 2% de sólidos de leite em suspensão em PBST, e se adicionou um anticorpo primário (anti-PhiYFP de coelho policlonal a 1 pg/mL (Evrogen, Moscou, Rússia), e a mistura foi incubada com agitação suave à temperatura ambiente durante 60 minutos. A seguir, a membrana de nitrocelulose foi lavada quatro vezes durante 5 minutos em PBST. A membrana de nitrocelulose foi mergulhada em uma solução de 2% de sólidos de leite em suspensão em PBST, e se adicionou um anticorpo secundário (IgG anti-coelho de cabra conjugada a peroxidase de raiz-forte em PBST (Sigma, St. Louis, MO), e a mistura foi incubada com agitação suave for 30 minutos. A seguir, a membrana de nitrocelulose foi lavada quatro vezes durante 5 minutos em PBST. Finalmente, a membrana de nitrocelulose foi lavada três vezes durante 2 minutos em PBS.

[00171] O excesso de umidade foi removido da membrana de nitrocelulose tocando-se levemente o canto da membrana em uma toalha de papel. A ligação de anticorpo foi detectada usando-se reagentes de detecção quimioluminescentes ECL Plus™ (GE Healthcare, Wauke-sha, Wl) segundo as direções do fabricante. A quimioluminescência que emanou dos anticorpos ligados à membrana de nitrocelulose foi visualizada com um sistema de documentação e análise em gel G:Box™ (SynGene, Frederick, MD). Um tempo de exposição de 10 minutos e “nenhuma ligação” foram os parâmetros usados para a documentação e análise G:Box™ da membrana de nitrocelulose. A seleção de “nenhuma ligação” da imagem era necessária para manter a resolução e identificar corretamente o padrão de sinal das impressões de tecido de seção de caule.

[00172] Rebentos de soja que continham uma cópia de expressão funcional do transgene PhiYFP produziram impressões de tecido com dois padrões de imagem distintos. Esses padrões de imagem foram classificados como “anéis” ou “pontos”. A FIG. 2 mostra uma imagem fotográfica dos dois padrões observados. O padrão de anel é caracterizado como um círculo aberto, composto por um contorno circular de sinal quimioluminescente que é desprovido de sinal quimioluminescen-te no centro da impressão de tecido de seção de caule (FIG. 2, Painel a). O padrão de pontos é caracterizado como um círculo cheio, composto por um sinal quimioluminescente por toda a impressão de tecido de seção de caule (FIG. 2, Painel b). Uma imagem da membrana u-sando iluminação com luz epi-branca foi tomada para comparar as posições das impressões de seção de caule de soja com padrões da i-magem de quimioluminescência. Por correlação da imagem de iluminação com luz epi-branca com a imagem de quimioluminescência, o rebento de soja específico que foi usado para gerar a impressão de seção de caule podia ser identificado e classificado como um padrão de imagem de anel ou ponto. (FIG. 2, Painéis c e d.) [00173] Eventos de soja transgênica que eram transformantes de linhagem germinativa produziram impressões de tecido que possuíam um padrão de pontos. Em comparação, eventos de soja transgênica que eram transformantes de linhagem não germinativa produziam impressões de tecido que possuíam um padrão de anel. O padrão de pontos resultou da inserção do transgene no DNA genômico das células das camadas L2 e L3 (que se dividem para formar o córtex, vascu-larização e medula). O padrão de anel resultou da inserção do transgene no DNA genômico das células da camada L1 (que se dividem para formar a camada de células epidérmicas). Este método de detecção pode ser usado para diferenciar transformantes de soja de linha- gem germinativa de transformantes de soja de linhagem não germina-tiva. É desejável um método que permita a identificação de transfor-mantes de linhagem germinativa, pois eventos transgênicos que são capazes de passar um transgene para plantas descendentes são identificados precocemente no processo de transformação, reduzindo, dessa forma, o número total de eventos transgênicos que têm de ser avançados através do processo de transformação. A identificação precoce de transformantes de linhagem germinativa (em que as seções de caule de soja impressas produzem um padrão de “pontos”) resulta em um andamento da transformação de soja mais eficiente. EXEMPLO 4: Microscopia Confocal [00174] Usou-se microscopia confocal para fazer imagens da segunda seção de caule de soja excisada. Essas seções de caule foram montadas em lâminas de vidro e visualizadas com um microscópio confocal Leica SP5 (Wetzlar, Alemanha). As seções de caule foram iluminadas com a linha de 514 nm de um laser de íon argônio. Os dados de emissão da proteína PhiYFP, que era expressada nas amostras de seção de caule de soja, foram coletados entre 530 - 540 nm.

[00175] Em geral, os padrões de fluorescência da expressão de proteína PhiYFP por amostras de caule de soja foram classificados em uma de três classes: a) nenhuma fluorescência; b) fluorescência do tecido derivada da camada L1 do meristema (a camada epidérmica); e c) fluorescência do tecido derivada das camadas L2/L3 do meristema (o córtex, tecidos vasculares e medula). Exemplos de três classes de padrões de fluorescência das amostras de caule de soja são mostrados na FIG. 3. Eventos de soja transgênica que eram transformantes de linhagem germinativa (camadas L2/L3) produziram fluorescência no córtex, tecidos vasculares e medula do caule. A fluorescência resultante da inserção do transgene no DNA genômico das células da camada L2/L3 pode ser identificada por observação da expressão da proteína PhiYFP dentro do córtex tecido vascular, e medula do caule. Em comparação, eventos de soja transgênica que eram transformantes de linhagem não germinativa (camada L1) produziram fluorescência apenas nas células epidérmicas. A fluorescência resultante da inserção do transgene no DNA genômico das células da camada L1 pode ser identificada por observação da expressão da proteína PhiYFP dentro das células epidérmicas do caule. Este método de detecção pode ser usado para identificar transformantes de soja de linhagem germinativa de transformantes de soja de linhagem não germinativa. É desejável a identificação de transformantes de linhagem germinativa, pois eventos transgênicos que são capazes de passar um transgene para plantas descendentes são identificados precocemente no processo de transformação, reduzindo, dessa forma, o número total de eventos transgênicos que têm de ser avançados através do processo de transformação. A identificação precoce de transformantes de linhagem germinativa resulta em um andamento da transformação de soja mais eficiente. EXEMPLO 5: Correlação das Observações de Microscopia Confocal e Resultados de Impressão de Tecidos [00176] Os resultados da impressão de tecidos das seções de caule que produziram os padrões de imagem em pontos demonstraram correlação com as observações de microscopia confocal das seções de caule que expressavam PhiYFP dentro do córtex, tecido vascular e medula do caule. 85% das amostras de rebento de soja (6 de 7) mostrando expressão no córtex em observações de microscopia confocal também exibiram o padrão de imagem de pontos que indicava que o transgene havia sido inserido no DNA genômico das camadas L2/L3. Assim, essas amostras de rebento de soja podiam ser chamadas de transformantes de linhagem germinativa, e avançadas através do processo de transformação de soja. Houve menos que uma correlação (29%) entre as seções de caule que produziram os padrões de ima- gem de anel pela impressão de tecidos em comparação com seções de caule que expressavam PhiYFP dentro da camada de células epidérmicas (transformantes de camada L1), conforme observado por mi-croscopia confocal. Essa porcentagem é menor, pois o método de impressão de tecidos não produziu padrões de imagem de anel para i-números rebentos de soja nos quais os resultados de microscopia confocal indicavam que a proteína PhiYFP era expressada apenas dentro da camada de células epidérmicas (transformantes de camada L1). Entretanto, os resultados da impressão de tecidos só exibiram um resultado falso negativo, em que um padrão de anel observado no procedimento de impressão de tecidos não foi confirmado como expressão epidérmica por microscopia confocal. A correlação entre as seções de caule que produziram os padrões de imagem de anel pela impressão de tecidos em comparação com seções de caule que expressavam PhiYFP dentro das camadas de células epidérmicas conforme observado por microscopia confocal pode ser melhorada por modificação do método de impressão de tecidos para melhorar a sensibilidade da detecção de PhiYFP dentro da camada de células epidérmicas. De maneira importante, entretanto, não houve nenhum caso nesse conjunto de dados de falha na observação de um padrão na análise de impressão de tecidos que fosse posteriormente encontrado por microscopia confocal correlacionando-se a expressão no córtex. Os resultados das análises de impressão de tecidos e das observações de microscopia confocal das seções de caule que expressavam PhiYFP são dados na Tabela 1.

[00177] Tabela 1: Sumário dos resultados das análises de microscopia confocal e impressão de tecidos. Resultados de microscopia confocal chamados de “expressão em tecido interno” eram amostras que produziram fluorescência nas camadas de células de córtex, tecidos vasculares e medula do caule. Amostras marcadas como “expres- são em tecido interno” também podem ter fluorescência na epiderme, além dos tecidos internos. Resultados de microscopia confocal chamados de “expressão epidérmica” eram amostras que produziam fluorescência apenas na camada de células epidérmicas. EXEMPLO 6: Geração de plantas T0 e produção de sementes Ti [00178] Antes de transferir rebentos alongados (3 - 5 cm) para o meio de enraizamento, a extremidade excisada dos internodos do rebento foram mergulhadas em ácido indol 3-butírico a 1 mg/L durante 1 - 3 min para promover o enraizamento (Khan et al. (1994), Agrobacte-rium-Mediated Transformation of Subterranean Clover (Trifolium subterraneum L.), Plant Physiol., May 105(1):81-88). Os rebentos de soja que geraram raízes em tubos de cultura de vidro de 25 χ 100 mm contendo meio de enraizamento foram transferidos para mistura de solo em caixas Magenta abertas e colocados dentro de um Conviron™ para aclimatação das plântulas. Glufosinato, o ingrediente ativo do herbicida Liberty (Bayer Crop Science), foi usado para seleção durante a iniciação e alongamento do rebento. As plântulas enraizadas foram aclimatadas em caixas Magenta abertas durante várias semanas antes de serem molecularmente tríadas e transferidas para a estufa para a-climentação e estabelecimento adicionais. As plantas de soja transgê-nicas resultantes foram c ultivadas na estufa e deixadas se autofertili-zarem para produção de sementes T-|. EXEMPLO 7: Caracterização Molecular de Transformantes Mediante Hidrólise e qPCR: [00179] Confirmou-se a presença dos transgenes dentro do geno-ma de transforma ntes de soja que foram transformados com pDAB9381. Os transforma ntes de soja foram inicialmente triados mediante um ensaio de sonda de hidrólise, análogo ao TAQMAN™, para confirmar a presença dos transgenes pat e yfp. Os transformantes de soja foram triados para confirmar a presença e para estimar o número de cópias dos transgenes dentro do cromossomo da planta.

Ensaio de Sonda de Hidrólise [00180] O número de cópias foi determinado nas plantas T0eTi de Glycine max usando o ensaio de sonda de hidrólise descrito abaixo.

Foram identificadas plantas com números variáveis de transgenes.

[00181] As amostras de tecido foram coletadas usando-se uma punção e colocadas em placas de 96 poços. Uma amostra de tecido de uma folha superior completamente expandida e uma de uma folha inferior completamente expandida de cada planta foram escolhidas para analisar sepadamente e determinar o quimerismo de transformação em plantas T0 de Glycine max. O DNA genômico foi isolado em formato de alta produção usando o Agilent BioCel (Agilent, Santa Clara, CA) e o Qiagen MagAttract DNA Isolation kit™ (Qiagen, German-town, MD). Os ensaios de sonda de hidrólise foram realizados para determinar o número de cópias do transgene de PATv6 e presen-ça/ausência de YFP, com relação a um gene de referência interno, GMS116, por PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCI-CLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

[00182] Para a amplificação de PATv6, preparou-se mistura mestra de sondas LIGHTCICLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a uma concentração f inal de 1X em um volume de 10 pL de reação multiplex contendo 0,4 μΜ de cada primer para PATv6 e 0,4 pM de cada primer para GMS116 e 0,2 pM de cada sonda (Tabela 2). Realizou-se uma reação de amplificação em duas etapas com uma extensão a 60°C durante 60 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram passadas, e os valores de limiar de Ciclo (Ct) foram usados para análise de cada amostra. A análise dos dados de PCR em tempo real foi efetuada com o software LIGHTCICLER® versão 1.5 usando o módulo quant relativo e se baseia no método AACt. Para isso, uma amostra de DNA genômico de 4, 2, 1 e 0,5 verificações de números de cópias conhecidas foram incluídas em cada passagem. Os resultados de número de cópias da triagem de sonda de hidrólise foram determinados para as plantas T0 e T-ι de Glycine max transgênica.

Tabela 2: Informações de primer e sonda para o ensaio de sonda de hidrólise de PATv6 e gene de referência interno (GMS116).

[00183] Para a amplificação de YFP, preparou-se a mistura mestra de sondas LIGHTCICLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) a uma concentração final de 1X em um volume de 10 pL de reação multiplex contendo 0,4 μΜ de cada primer para YFP e 0,4 pM de cada primer para GMS116 e 0,2 pM de cada sonda (Tabela 3). Realizou-se uma reação de amplificação em duas etapas com uma extensão a 60°C durante 60 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram passadas, e os valores de limiar de Ciclo (Ct) foram usados para análise de cada amostra. A análise dos dados de PCR em tempo real foi efetuada com o software LIGHTCICLER® versão 1.5 usando o módulo quant relativo e se baseia no método AACt. Para isso, uma amostra de amostra positiva conhecida, controle positivo de plasmídio, controle negativo de DNA de tipo selvagem e controle de água (nenhuma amplificação) foram usadas em cada passagem. Os resultados de presença/ausência da triagem de sonda de hidrólise foram determinados para as plantas T0 e de Glycine max transgênica. Tabela 3: Informações de primer e sonda para o ensaio de sonda de hidrólise de YFP e gene de referência interno (GMS116). EXEMPLO 8: A Análise Molecular de T-ι se Correlaciona Com Dados de Microscopia Confocal e Impressão de Tecidos de T0 [00184] Os resultados confocais e da impressão de tecidos das seções de rebento T0 podem ser usados para identificar transformantes de linhagem germinativa. Os resultados confocais e da impressão de tecidos das seções de rebento T0 se correlacionavam com os dados moleculares que foram obtidos das plantas de soja descendentes T-|. Um total de 19 eventos transgênicos consistindo nas plantas descendentes T0 e T-ι estão resumidos na Tabela 4. Há uma correlação entre os dados de impressão de tecidos de T0 e os dados moleculares de T^ Dos eventos de soja que foram triados por métodos de microscopia confocal e de impressão de tecidos, 80% (4 de 5) dos eventos de soja demonstraram que a impressão de tecidos (os eventos possuíam um padrão de imagem de pontos) e a microscopia confocal (a fluorescência da proteína foi observada nos tecidos corticais) podem ser usadas precocemente no processo de transformação de plantas para identificar e predizer que eventos eram transformantes de linhagem germina-tiva antes de transferir os rebentos de soja para o meio de enraizamento. Da mesma forma, os métodos de microscopia confocal e de impressão de tecidos podem ser usados para identificar transformantes de linhagem não germinativa. 92% (11 de 12) dos eventos de soja demonstraram que a impressão de tecidos (os eventos possuíam um padrão de anel ou nenhuma imagem) e a microscopia confocal (a fluorescência da proteína foi observada nos tecidos epidérmicos) podem ser usadas precocemente no processo de transformação de plantas para identificar e predizer que eventos eram transformantes de linhagem não germinativa. Em outras palavras, a análise de impressão de tecidos não retornou nenhum resultado falso positivo e só retornou um resultado falso negativo nesse conjunto de dados. A identificação precoce dos transformantes de linhagem não germinativa permite que esses eventos sejam removidos do processo de transformação da soja. Com a remoção desses transformantes de linhagem não germinativa, mais recursos podem ser devotados a transformantes de soja de linhagem germinativa que sejam capazes de passar o transgene inserido para plantas descendentes.

Table 4: Análise de eventos de soja transformados com pDAB9381. Dados de impressão de tecidos e microscopia confocal de plantas T0 em comparação com a análise molecular de plantas descendentes T-|.

[00185] Embora aspectos desta invenção tenham sido descritos em certas modalidades, elas podem ser adicionalmente modificadas dentro do espírito e âmbito desta exposição. Este pedido, portanto, se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações de modalidades da invenção que usem seus princípios gerais. Além disso, este pedido se destina a cobrir afastamentos da presente exposição que estejam dentro da prática conhecida ou comum na técnica à qual essas modalidades se referem e que estejam dentro dos limites das reivindicações anexas.

REIVINDICAÇÕES

Claims (18)

1. Método para a identificação de um transformante de linhagem germinativa da soja, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) transformação de um tecido vegetal de soja com um transgene; (b) regeneração de um rebendo a partir do tecido vegetal de soja transformado compreendendo o transgene; (c) isolamento do rebento regenerado a partir do tecido vegetal de soja transformado compreendendo o transgene; (d) colocação do rebento regenerado isolado em contato com uma membrana, em que um material de planta compreendendo o tecido vegetal de soja transformado que compreende o transgene é transferido do rebento regenerado isolado e fixado à membrana; (e) ensaio do material de planta transferido para determinar uma localização do transgene dentro do material de planta transferido; (f) determinação de uma localização de transgene dentro do rebento regenerado isolado, em que a localização do transgene é selecionada do grupo que consiste em uma camada de tecido L2/L3 e uma camada de tecido L1; e (g) identificação de um rebento regenerado isolado que exiba uma localização de transgene na camada de tecido L2/L3 como um transformante de linhagem germinativa de soja.

2. Método de regeneração de uma planta de soja transgê-nica madura a partir do transformante de linhagem germinativa de soja de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) a seleção do rebento regenerado isolado compreendendo o transformante de linhagem germinativa de soja; e (b) o cultivo do rebento regenerado isolado compreendendo o transformante de linhagem germinativa de soja em uma planta de soja transgênica madura.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a transformação utiliza um método de transformação selecionado do grupo que consiste em transformação com Agrobacte-rium, biolística, transformação com fosfato de cálcio, transformação com polibreno, transformação por fusão de protoplastos, transformação por eletroporação, transformação ultrassônica, transformação por lipossomos, transformação por microinjeção, transformação por DNA nu, transformação com vetor plasmídico, transformação com vetor vi-ral, transformação mediada por carbeto de silício, transformação com feixe de aerossol ou transformação com PEG.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tecido vegetal de soja é selecionado do grupo que consiste em um tecido vegetal de soja meristemático, um tecido vegetal de soja dérmico, um tecido vegetal de soja de sustentação e um tecido vegetal de soja vascular.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tecido vegetal de soja meristemático compreende meristema apical, meristema primário ou meristema lateral.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tecido vegetal de soja dérmico compreende a epi-derme.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tecido vegetal de soja dérmico compreende a peri-derme.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o tecido vegetal de soja vascular é selecionado do grupo que consiste em xilema e floema.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o transgene está contido dentro de pelo menos um cassete de expressão de gene.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de gene compreende um gene marcador selecionável.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de gene compreende um gene de traço.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o cassete de expressão de gene compreende um gene de RNAi.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o isolamento compreende fazer um corte horizontal transversal ao rebento.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a membrana compreende uma membrana de nitroce-lulose membrane, uma membrana de náilon, uma membrana de polite-trafluoroetileno ou uma membrana de fluoreto de polivinilideno.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ensaio compreende um ensaio de detecção de proteína.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o ensaio de detecção de proteína compreende um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína expressada pelo transgene.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a determinação compreende o reconhecimento de um padrão de pontos dentro do material de planta transferido fixado à membrana.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a determinação compreende o reconhecimento de um padrão de anel dentro do material de planta transferido fixado à membrana.