CN110172471A - 大豆转化过程中非种系事件的早期检测和去除 - Google Patents

Abstract

本公开涉及大豆转化过程中非种系事件的早期检测和去除，具体涉及一种从大豆转化子群体中鉴定大豆种系转化子的方法，所述群体包括大豆非种系转化子和大豆种系转化子的组合。大豆非种系转化子在转化过程早期被鉴定并去除。大豆种系转化子被检出并选择用于培养成为成熟的大豆植物。该方法容易应用于在转化过程的早期阶段筛选和获得大豆种系转化子。

Description

大豆转化过程中非种系事件的早期检测和去除

本申请是2014年3月14日提交的申请号为201480027064.9(国际申请号为PCT/US2014/028955)、发明名称为“大豆转化过程中非种系事件的早期检测和去除”的发明专利申请的分案申请。

优先权要求

本申请要求2013年3月15日提交的题为“EARLY DETECTION AND ELIMINATION OFNON GERM-LINE EVENTS IN THE SOYBEAN TRANSFORMATION PROCESS”的美国临时专利申请序列号61/789,379的申请日的权益。

对电子提交的序列表的援引

序列表的正式拷贝作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子提交，文件名“70524SEQUENCES”，于2013年3月11日生成，大小为9千字节，并与本说明书同时提交。在该ASCII格式文件中包含的序列是说明书的一部分，在此整体并入本申请。

技术领域

本公开部分地涉及从由大豆非种系转化子和大豆种系转化子的组合构成的群体中鉴定大豆种系转化子的方法。相应地，大豆非种系转化子在转化过程中被早期检出并去除。大豆种系转化子被检出，并加以选择以培养成为成熟的大豆植物。该方法易于适用于在转化过程的早期阶段筛选并获得大豆种系转化子。

背景

大豆转化方法学在过去三十年中已经得到了发展和改进。大豆转化方法学的这种演进已经导致人们能够成功地将包含农艺性状的转基因导入大豆基因组内。1990年代中期除草剂耐性转基因大豆事件的问世为生产者提供了一种新的、便利的控制广谱杂草的技术革新，这在种植农业方法上是无与伦比的。目前，转基因大豆在全世界都有市售，而且新的转基因大豆产品，例如Enlist^TM大豆，为日益严重的杂草问题提供了改进的解决方案。倘若没有大豆转化方法学的开发和改进，转基因大豆在现代农艺实践中的应用是没有可能的。开发出新的、改进的大豆转化方法学，使之能够用于检测并选择大豆种系，对于应对将新的、复杂的农艺性状渗入大豆基因组内所需的挑战而言是至关重要的。

在转化过程中及早鉴定并选择大豆种系转化子是优选的，因为大豆种系转化子包含稳定整合的转基因，该转基因能够在后续世代中被继承。由于转化过程是相对低效率的，所以需要制备大量转化子，以便从不想要的大豆非种系转化子中鉴定并选择出优选的大豆种系转化子。从转化过程获得的转化子许多是嵌合的或者是大豆非种系转化子。平均而言，所有分离的转化子中大约40至70％是大豆非种系转化子。这些大豆非种系转化子是不想要的，予以剔除。但该剔除过程只有当转化子在整个转化过程中被维持、并且达到成熟之后方可进行。维持不想要的转化子，例如非种系大豆转化子，导致资源的低效利用。在转基因植物的生产中耗费大量成本。这样的成本不仅仅在金钱方面的顾虑，还包括科研人员的时间、器材、和实验室空间的耗费。

开发并改进能够用于在大豆转化的起始阶段筛选并检测大豆种系转化子的方法是非常令人期望的，因为该方法能提高转化过程的效率。

前述的相关技术的实例以及与之相关的限定仅意在说明，并无排他性。本领域技术人员在阅读了本说明书后会容易想到相关技术的其他限定。

公开

在一个优选的实施方案中，本公开涉及一种用于鉴定大豆种系转化子的方法，包括下述步骤：用转基因转化大豆植物组织；从包含该转基因的经转化的大豆植物组织再生芽(shoot)；从经转化的包含该转基因的大豆植物组织分离该再生芽；使分离的再生芽与膜接触，其中含有经转化的包含该转基因的大豆植物组织的植物材料从该分离的再生芽被转移到并固定于该膜；测定该被转移的植物材料以确定所述转基因在该被转移的植物材料内的位置；确定所述分离的再生芽内的转基因位置，其中所述转基因位置选自L2/L3组织层和L1组织层；并鉴定显示L2/L3组织层转基因位置的分离再生芽作为大豆种系转化子。

在该实施方案的一个进一步的方面，提供了一种从鉴定出的大豆种系转化子再生成熟转基因大豆植物的方法，包括：选择包含(comprising)大豆种系转化子的分离的再生芽；并将该包含大豆种系转化子的分离的再生芽培养成为成熟的转基因大豆植物。

在一个进一步的方面，所述的转化采用选自下组的转化方法：土壤杆菌转化、生物射弹(biolistics)、磷酸钙转化、聚凝胺(polybrene)转化、原生质体融合转化、电穿孔转化、超声转化、脂质体转化、显微注射转化、裸DNA转化、质粒载体转化、病毒载体转化、碳化硅介导转化、气溶胶聚束(aerosol beaming)转化、或PEG转化。

在另一个方面，大豆植物组织选自下组：分生性(meristematic)大豆植物组织、皮性(dermal)大豆植物组织、基本(ground)大豆植物组织、和维管大豆植物组织。

在另一个方面，所述分生性大豆植物组织包括顶端分生组织、初生分生组织、或侧生分生组织。

在另一个方面，所述皮性大豆植物组织包括表皮。

在另一个方面，所述皮性大豆植物组织包括周皮。

在另一个方面，所述维管大豆植物组织包括木质部或韧皮部。

在另一个方面，所述转基因包含在至少一个基因表达盒中。

在另一个方面，所述基因表达盒包含可选择标志物基因。

在另一个方面，所述基因表达盒包含性状基因。

在另一个方面，所述基因表达盒包含RNAi基因。

在另一个方面，所述分离包括对所述芽进行横向水平切割。

在另一个方面，所述膜包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚四氟乙烯膜、或聚偏二氟乙烯膜。

在另一个方面，所述测定包括蛋白质检测测定。

在另一个方面，所述蛋白质检测测定包括特异性结合从所述转基因表达的蛋白质的抗体。

在另一个方面，所述确定包括识别固定在所述膜上的被转移的植物材料内的点样式(dot pattern)。

在另一个方面，所述确定包括识别固定在所述膜上的被转移的植物材料内的环样式(ring pattern)。

更具体地，本申请提供下述各项：

1.一种鉴定大豆种系转化子的方法，包括下述步骤：

(a)用转基因转化大豆植物组织；

(b)从经转化的包含转基因的大豆植物组织再生芽；

(c)从该包含转基因的经转化的大豆植物组织分离再生芽；

(d)将分离的再生芽与膜接触，其中植物材料从该分离的再生芽被转移到并固定于该膜，该植物材料包含所述经转化的包含转基因的大豆植物组织；

(e)测定该转移的植物材料以确定所述转基因在该转移的植物材料中的位置；

(f)确定所述分离的再生芽内的转基因位置，其中该转基因位置选自下组：L2/L3组织层，以及L1组织层；和

(g)将显示L2/L3组织层转基因位置的分离的再生芽鉴定为大豆种系转化子。

2.一种从项1的大豆种系转化子再生成熟的转基因大豆植物的方法，包括：

(a)选择包含所述大豆种系转化子的分离的再生芽；和

(b)将该包含所述大豆种系转化子的分离的再生芽培养成为成熟的转基因大豆植物。

3.项1的方法，其中所述转化采用选自下组的转化方法：土壤杆菌转化、生物射弹、磷酸钙转化、聚凝胺转化、原生质体融合转化、电穿孔转化、超声转化、脂质体转化、显微注射转化、裸DNA转化、质粒载体转化、病毒载体转化、碳化硅介导转化、气溶胶聚束转化、或PEG转化。

4.项1的方法，其中所述大豆植物组织选自下组：分生性大豆植物组织、皮性大豆植物组织、基本大豆植物组织、和维管大豆植物组织。

5.项4的方法，其中所述分生性大豆植物组织包括顶端分生组织、初生分生组织、或侧生分生组织。

6.项4的方法，其中所述皮性大豆植物组织包括表皮。

7.项4的方法，其中所述皮性大豆植物组织包括周皮。

8.项4的方法，其中所述维管大豆植物组织选自木质部或韧皮部。

9.项1的方法，其中所述转基因包含在至少一个基因表达盒中。

10.项9的方法，其中所述基因表达盒包含选择标志物基因。

11.项9的方法，其中所述基因表达盒包含性状基因。

12.项9的方法，其中所述基因表达盒包含RNAi基因。

13.项1的方法，其中所述分离包括对所述芽进行横向水平切割。

14.项1的方法，其中所述膜包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚四氟乙烯膜、或聚偏二氟乙烯膜。

15.项1的方法，其中所述测定包括蛋白质检测测定。

16.项15的方法，其中所述蛋白质检测测定包括特异性结合从所述转基因表达的蛋白质的抗体。

17.项1的方法，其中所述确定包括识别固定在所述膜上的转移的植物材料内的点样式。

18.项1的方法，其中所述确定包括识别固定在所述膜上的转移的植物材料内的环样式。

除了上文所述的示例性方面和实施方案之外，通过研究下面的详细说明容易想到其他方面和实施方案。

附图简要说明

图1描绘了pDAB9381的质粒图。

图2,图面a，展示了从大豆茎切片组织印渍(tissue print)观察到的环样式的放大的化学发光图像。图2，图面b，从大豆茎切片组织印渍观察到的点样式的放大的化学发光图像。图2，图面c,用于鉴定大豆茎切片组织印渍(黑点)之位置的经处理的硝酸纤维素膜的落射白光照明图像。图2，图面d，经处理的硝酸纤维素膜的化学发光图像。抗体对PhiYFP的结合导致产生大豆茎切片组织印渍的化学发光信号，该信号被归类为“环”或者“点”图像样式。右下角格外明亮的化学发光信号为点样在膜上作为阳性对照的5ng纯化的PhiYFP蛋白。

图3展示了大豆茎切片的共聚焦荧光显微镜图像，这些切片用特异性检测PhiYFP蛋白的激发/发射参数加以照明。这些图像显示了用于对大豆芽分类的三个类别：图面a，无荧光；图面b，仅表皮细胞层的荧光；和图面c，髓和皮层的荧光。

图4是正在发育的大豆分生组织的示意图。

实施发明的模式

I.概览

本发明公开了一种在植物转化过程的起始阶段筛选并检测大豆种系转化子的方法。本公开的方法是为了快速鉴定并表征大豆种系转化子而设计的。简而言之，通过下述方式完成对包含转基因的经转化大豆植物芽组织的分析：使芽组织与膜接触，并测定该膜以确定所述转基因在所述植物材料内的位置。在大豆芽的核心(L2和L3)层表达转基因者被鉴定为大豆种系转化子。图4显示了发育中的大豆分生组织的示意图。对于鉴定出的大豆种系转化子进行选择并培养成为成熟的大豆植物。其他的大豆非种系转化子在早期从转化过程剔除。这样，可以分析并筛选大豆种系转化子，以鉴定并选择具有插入到种系组织内的供体DNA多核苷酸的特定转化子。

本文公开的方法相对于先前开发的用于鉴定和选择大豆种系转化子的其他已知方法而言是显著的改进。参见，美国专利号5,503,998、美国专利号5,830,728和美国专利号5,989,915。这些先前的方法可以应用于利用对实际的茎的组织化学测定而进行颗粒轰击转化和选择。开发可以用来筛选利用任何已知的转化规程产生的种系转化子，且不需要对经转化的大豆组织进行化学染色的方法是非常令人期望的，因为该方法能提高转化过程的效率。本申请公开了这样的方法。

II术语

除非有其他定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员所普遍理解的相同的意义。在冲突的情况下，以包括定义在内的本申请为准。除非上下文要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。

为了进一步明确本公开，提供下述术语、缩写和定义。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”“含有”，或它们的任何其它变型，都是非排他性的或者说开放式的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、过程、步骤、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、步骤、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非有相反的明确说明，“或”是指包含性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件A或B：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A是为真(或不存在)且B是为真(或存在)，以及A和B都为真(或存在)。

此外，本公开的实施方案的元素或组分之前的不定冠词“一”对实例的数目，即该元素或组分的出现次数没有限制作用。因此“一”应该理解为包括至少一，且元素或组分的单数单词形式也包括复数，除非数目显然应是单数。

如本文中使用的术语“发明”或“本发明”是非限制性的术语，并不意图指代具体发明的任何单一实施方案，而涵盖申请中公开的所有可能的实施方案。

植物：如本文所使用的，术语“植物”包括整个植物及植物的任何后代、细胞、组织、或部分。术语“植物部分”包括植物的任何部分，包括，例如但不限于：种子(包括成熟种子和未成熟种子)；植物插条；植物细胞；植物细胞培养物；植物器官(如花粉、胚、花、果实、芽(shoot)、叶、根、茎、和外植体)。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或者任何其他被组织成一定结构或功能单元的植物细胞群。植物细胞或组织培养物可能能够再生出具有该细胞或组织所来源的植物的生理学和形态学特征的植物，并且可能能够再生出与该植物具有基本上相同的基因型的植物。与之相反，一些植物细胞不能够再生产生植物。植物细胞或组织培养物中的可再生细胞可以是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、须、花、果仁、穗、穗轴、壳、或茎。

植物部分包括可收获的部分和可用于繁殖后代植物的部分。可用于繁殖的植物部分包括，例如但不限于：种子；果实；插条；苗；块茎；和根砧木。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，包括，例如但不限于：花；花粉；苗；块茎；叶；茎；果实；种子；和根。

植物细胞是植物的结构和生理的单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或细胞聚集体的形式(例如，松散型(friable)愈伤组织和培养细胞)，并且可以是更高级有组织单元的一部分(例如，植物组织、植物器官、和植物)。因此，植物细胞可以是原生质体、配子产生细胞、或可以再生成完整植物的细胞或细胞集合。因此，种子，因其包括多个植物细胞并能够再生为完整植物，在本文的实施方案中被认为是一种“植物细胞”。

分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸或多肽)已经与该组分天然存在的生物细胞中的其它生物组分(即，其它染色体或染色体外DNA和RNA，和蛋白)实质上分离、与之分别产生、或从之纯化出来，在分离、产生和纯化的同时实现了该组分的化学或功能变化(例如核酸可以通过断裂连接该核酸与染色体中其余DNA的化学键而从染色体分离)。已经“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子、蛋白和肽。

核酸：术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可以互换使用，并包括单个核酸、多个核酸、核酸片段、变体或其衍生物、和核酸构建体(例如信使RNA(mRNA)和质粒DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全长cDNA序列、或其片段的核苷酸序列，包括非翻译的5’和/或3’序列和编码序列。多核苷酸或核酸可以由任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸构成，其可以包括未修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以包括单链、双链DNA；单链区和双链区混合物DNA；单链和双链RNA；单链区和双链区混合物RNA。包含DNA和RNA的杂交分子可以是单、双链、或单链区和双链区的混合物。前述术语还包括化学、酶学和代谢修饰形式的多核苷酸或核酸。

应当理解，具体的DNA还指其互补物，其序列根据脱氧核糖核苷酸碱基配对的规则确定。

如本文所使用的，术语“基因”是指编码功能产物(RNA或多肽/蛋白)的核酸。基因可以包含位于编码功能产物的序列之前(5’非编码序列)和/或之后(3’非编码序列)的调节序列。

如本文所使用的，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的核酸序列。“调节序列”是指位于编码序列上游(例如，5’非编码序列)、内部或下游(例如，3’非编码序列)的核苷酸序列，其影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括，例如但不限于：启动子；翻译前导序列；内含子；多腺苷酸化识别序列；RNA加工位点；效应物结合位点；和茎环结构。

杂交：包含全部或部分核苷酸序列的核酸可以用作探针，与克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(例如，来自所选生物的基因组或cDNA文库)群体中存在的、与探针序列具有显著量的序列同一性的核苷酸序列选择性“杂交”。杂交探针可以是基因组DNA片段、质粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR扩增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多聚核苷酸，并且探针可以用可检测的基团(例如32P)或任何其他可检测的标记标记。因此，例如但不限于，用于杂交的探针可以通过标记可特异性杂交本文中的核酸(例如与SEQ ID NO:1具有至少大约90％同一性的核酸)的人造寡核苷酸加以制备。用于制备杂交探针和用于构建cDNA和基因组文库的方法是本领域已知的。Sambrook等人.(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY。关于核酸杂交的详尽指导可以参见Sambrook等人(1989)，同上；和Ausubel等人(1997)Short Protocols in Molecular Biology,Third Edition，Wiley，NY，New York，pp.2-40。

如本文所使用的，术语“多肽”包括单个多肽、多个多肽、和其片段。该术语是指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸构成的任何链，且不指示产物的具体长度和大小。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、氨基酸链、和任何其它用于指示有两个或多个氨基酸的链的术语均包含在“多肽”的定义之内，并且前述术语在本文中可以和“多肽”互换使用。多肽可以是从天然生物源分离的或者通过重组技术产生的，但是具体的多肽不一定是从特定的核酸翻译产生的。多肽可以用任何合适的方式产生，包括例如但不限于，通过化学合成。

内源的和异源的：如本文所使用的，术语“天然的”是指在自然界中发现的、并与其自身的调节序列(如果存在的话)在一起的多核苷酸、基因或多肽形式。术语“内源的”是指处于生物或生物基因组中的天然位置处的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。

相反，术语“异源的”是指在参考(宿主)生物的位置处通常不会发现的多核苷酸、基因或多肽。例如，异源核酸可以是通常在参考生物的不同基因组位置处被发现的核酸。作为进一步的实例，异源核酸可以是通常不会在参考生物中被发现的核酸。含有异源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物可以通过将异源多核苷酸、基因或多肽导入到宿主生物内而产生。在特定的实例中，异源多核苷酸包括以不同于相应的天然多核苷酸的形式被重新导入到来源生物内的天然编码序列、或其部分。在特定的实例中，异源基因包括以不同于相应的天然基因的形式被重新导入到来源生物内的天然编码序列或其部分。例如，异源基因可以包括天然编码序列，该天然编码序列是含有非天然调节区的嵌合基因的一部分，该嵌合基因被重新导入到天然宿主内。在特定的实例中，异源多肽是以不同于相应的天然多肽的形式被重新导入到来源生物内的天然多肽。

异源基因或多肽可以是这样的基因或多肽，其包含功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列，该功能性多肽或编码功能性多肽的核酸序列与其它基因或多肽融合从而产生嵌合或融合的多肽或编码它的基因。基因和蛋白的特定实施方案包括具体例举的全长序列和部分、区段、片段(包括与全长分子相比具有内部和/或末端缺失的连续片段)、变体、突变体、嵌合体、以及这些序列的融合。

修饰：如本文所使用的，术语“修饰”可以指特定参考多核苷酸内的改变，其导致由该参考多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消失、或消失。修饰还指参考多肽中的改变，其导致参考多肽的活性减低、基本上消失、或消失。或者，术语“修饰”可以指参考多核苷酸中的改变，其导致该参考多核苷酸编码的多肽的活性增加或提高，以及参考多肽中的改变，其导致参考多肽的活性增加或提高。诸如前述的改变可以通过任何本领域众所周知的方法实现，这样的方法有若干种，包括，例如但不限于：缺失参考分子的一部分；突变参考分子(例如通过自发诱变；通过随机诱变；通过增变基因导致的诱变；和通过转座子诱变)；取代参考分子的一部分；在参考分子内插入元件；下调参考分子的表达；改变参考分子的细胞定位；改变参考分子的状态(例如通过参考多核苷酸的甲基化，和通过参考多肽的磷酸化或泛素化)；除去参考分子的辅助因子；导入靶向参考分子的反义RNA/DNA；导入靶向参考分子的干扰RNA/DNA；参考分子的化学修饰；参考分子的共价修饰；用UV辐射或X射线辐照参考分子；改变参考分子的同源重组；改变参考分子的有丝分裂重组；代替参考分子的启动子；和/或前述的任意组合。

可以通过比较参考多核苷酸或多肽的序列与同源(例如同源酵母或细菌)多核苷酸或多肽的序列，并使高度同源区(保守区)或共有序列中的修饰数目最大化，来找到确定在具体实例中哪些核苷酸或氨基酸残基可以被修饰的指引。

启动子：术语“启动子”指一种能够控制核酸编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。在实例中，受控制的编码序列位于启动子序列的3'。可以从天然基因中整体获得启动子，启动子可以包括来自天然出现的不同启动子的不同元件，或者启动子甚至可以包括人造的DNA片段。本领域的技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境或生理条件表达。所有上述启动子的实例都是已知的，并且在本领域中用于控制异源核酸的表达。指导基因在大多数细胞类型中在大部分时间里表达的启动子通常称为“组成型启动子”。此外，虽然本领域技术人员已经尝试界定调节序列的确切边界(在许多情况下未成功)，但是已经认识到，长度不同的DNA片段可能具有相同的启动子活性。特定核酸的启动子活性可以使用本领域熟知的技术进行测定。

可操作连接：术语“可操作连接”是指单一核酸上的多个核酸序列的关联，其中一个核酸序列的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(例如，编码序列在启动子的转录控制之下)，启动子与编码序列就是可操作连接的。编码序列可以沿着有义和反义方向与调节序列可操作连接。

表达：如本文所使用的，术语“表达”可以指衍生自DNA的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达还指mRNA翻译成多肽。如本文所使用的，术语“过表达”是指高于相同基因或相关基因的内源表达的表达。因此，如果异源基因的表达高于可比较的内源基因的表达，则该异源基因被“过表达”。

转化：如本文所使用的，术语“转化”是指核酸或其片段被转移并整合到宿主生物内，导致基因上稳定的遗传。含有转化核酸的宿主生物被称作“转基因”、“重组”或“转化”生物。已知的转化方法包括，例如但不限于：根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)介导的转化；磷酸钙转化；聚凝胺转化；原生质体融合；电穿孔；超声波方法(例如，超声波穿孔(sonoporation))；脂质体转化；显微注射；用裸DNA转化；用质粒载体转化；用病毒载体转化；基因枪转化(微粒轰击)；碳化硅WHISKERS(晶须)介导的转化；气溶胶聚束(aerosol-beaming)；和PEG介导的转化。

导入的：如本文所使用的，术语“导入的”(在将核酸导入细胞的上下文中)包括细胞的转化，以及包含核酸的植物与第二种植物的杂交，从而使第二种植物含有该核酸，这可以用常规植物育种技术实施。这些育种技术是本领域已知的。关于植物育种技术的讨论，见Poehlman(1995)Breeding Field Crops,第4版,AVI Publication Co.,Westport CT。

回交方法可用于将核酸导入植物。这种技术用于将性状导入植物已有几十年的历史。回交(以及其它的植物育种方法学)的描述实例可以参见，例如，Poelman(1995)，同上；和Jensen(1988)Plant Breeding Methodology,Wiley,New York,NY。在一个示例性回交方案中，将感兴趣的原始植物(以下简称“轮回亲本”)与携带要导入的核酸的第二个植物(“非轮回亲本”)杂交。然后，将此杂交产生的子代再次与轮回亲本杂交，并重复该过程直到获得转化植物，其中除了来自非轮回亲本的核酸之外，转化植物还复原了轮回亲本的几乎全部的期望形态和生理特征。

质粒/载体：如本文所使用的，术语“质粒”和“载体”是指一种染色体外元件，其可携带一个或多个非细胞核心代谢部分的基因。质粒和载体通常是环状双链DNA分子。然而，质粒和载体可以是线性或环状核酸，呈单链或双链DNA或RNA，并可以衍生自任何来源，其中若干核苷酸序列被连接或重组成一个独特的构建体，其能够将启动子片段和编码DNA序列与任何合适的3’非翻译区一起导入到细胞内。在实例中，质粒和载体可以包括自主复制序列、基因组整合序列、和/或噬菌体或核苷酸序列。

“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，并且包括通过肽键共价链接的两个或多个氨基酸的分子链。该术语并非指产物的具体长度。因此，“肽”和“寡肽”包括在多肽的定义内。该术语包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等。此外，蛋白质片段、类似物、突变或变体蛋白、融合蛋白等包括在多肽的含义内。该术语也包括这样的分子，其包括一种或多种氨基酸类似物或非规范或非天然氨基酸的分子，如可使用已知的蛋白质工程技术重组表达。另外，融合蛋白可如本文所述通过熟知的有机化学技术来获得。

术语“融合蛋白”表示蛋白质包括源自多于一种亲本蛋白质或多肽的多肽组分。典型地，融合蛋白是从融合基因表达的，融合基因中编码来自一个蛋白质的多肽序列的核苷酸序列与编码另一种不同的多肽序列的核苷酸序列合框附接，或者任选地通过接头相接。然后可以由重组宿主细胞作为单一蛋白表达融合基因。

III.大豆组织和部分

在某些实施方案中，提供包含转基因的大豆植物组织。一些实施方案包括这样的大豆植物组织，，其包含芽(shoot)或自芽转移的植物材料。在其他实施方案中，大豆植物组织包括核(core)或壳套(mantle)组织。在进一步的实施方案中，大豆植物组织选自分生性大豆植物组织、皮性大豆植物组织、基本大豆植物组织、和维管大豆植物组织。

植物细胞、植物部分和/或植物可通过本领域中已知的若干转化方法中的任何方法用转基因进行转化，从而包含异源多肽和/或异源核酸。在本文中的特定实施方案中，通过例如但不限于选自下组的方法将转基因导入植物细胞、植物部分和/或植物：转化和选择育种(例如回交育种)。

植物细胞形成植物组织，植物组织可分为分生组织、皮组织、基本组织(groundtissue)、或维管组织。在一个实施方案中，用转基因转化的大豆植物组织可包括分生性大豆植物组织、皮性植物组织、基本植物组织、或维管大豆植物组织。用转基因转化包含分生植物组织和维管植物组织的核心组织(L2和L3层)导致大豆种系组织的转化。用转基因转化包含基本植物组织和皮植物组织的壳套组织(L1层)导致大豆非种系组织的转化。

分生组织包括顶端分生组织、初生分生组织、或侧生分生组织。这些非分化组织中发生用于植物组织生长或修复的新细胞的分裂，并被表征为分裂活跃细胞的区域。细胞分裂仅在分生组织中发生。位于芽尖的顶端分生组织直接参与芽延伸。侧生分生组织，例如维管分生组织，参与内部生长，这些细胞处于植物的建成茎周围，使得其侧向生长。

维管组织是由薄壁组织细胞、厚壁组织细胞、纤维细胞、以及其他参与转运的细胞组成的分化细胞组成的混合物(即导管、管胞、木质部、或韧皮部)。这些细胞类型在植物细胞内内部转运液体(例如水)和营养物。

皮性组织和基本组织是非分生性组织(非分裂组织)，由薄壁组织细胞、厚壁组织细胞和厚角组织细胞构成。皮组织包括植物叶、根、茎、果实或的最外细胞层。基本组织是由薄壁组织细胞、厚壁组织细胞、绿色组织、以及厚角组织细胞构成的简单的、非分生性的组织。这些细胞类型通常形成茎的髓和皮层。

在一个实施方案中，本主题公开描述一种鉴定包含转基因的大豆种系转化子的方法。在优选的实施方案中，大豆植物组织通过土壤杆菌介导的修饰的半种子外植体方法来转化(M.Paz,et al.(2005),Plant Cell Rep.,25:206-213)，或者通过子叶节转化方法(P.Zeng,et al.(2004),Plant Cell Rep.,22(7):478 482)来转化。使用上述任一种方法，转基因均被递送到包含外壳套组织(L1层)的大豆植物组织，或被递送到位于植物中更深的下层组织，例如核心组织(L2和L3层)。壳套组织(L1层)将会分裂形成包含非种系细胞的表皮组织和基本组织。核心组织分裂形成包含种系细胞的分生组织和维管组织。只有具备转化的种系细胞的转基因事件才能将转基因传递给下一代。图4图示了一个大豆芽顶端分生组织的中纵断面，显示大豆芽的L1、L2和L3层的组织。

任何大豆植物细胞都可以被遗传修饰从而包含转基因。在一些实施方案中，如此经过遗传修饰的植物细胞不能够再生以产生植物(即非种系转化子)。在一些实施方案中，依照本公开遗传修饰的植物能够再生以产生转基因植物(即种系转化子)。

导入大豆植物细胞的核酸可以用来赋予大豆中期望的农艺性状。利用核酸和各种各样的转化方法，可以对多种多样的大豆植物和植物细胞系统进行改造，以获得本文中描述的期望的生理学和农艺学特征。本文中的实施方案可以使用本领域已知的多种转化植物(以及产生遗传修饰植物)的方法中的任何方法。已经开发了许多植物转化方法，包括用于双子叶植物、以及用于单子叶植物(参见例如Goto-Fumiyuki et al.(1999),Nat.Biotechnol.17:282-6；Miki et al.(1993),Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology(B.R.Glick and J.E.Thompson,Eds.),CRC Press,Inc.,Boca Raton,FL,pp.67-88)的生物学和物理转化规程。此外，用于植物细胞和组织转化以及用于植物再生的载体和体外培养方法在例如Gruber et al.(1993),同上，第89-119页有记载。

可用于将核酸导入植物宿主细胞的植物转化技术包括，例如但不限于：用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌的卸甲T-DNA作为转化剂转化；磷酸钙转染；聚凝胺转化；原生质体融合；电穿孔(D'Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-505)；超声波方法(例如，超声穿孔(sonoporation))；脂质体转化；显微注射；与裸DNA接触；与质粒载体接触；与病毒载体接触；基因枪法(例如，DNA粒子轰击(见，例如Klein et al.(1987)Nature 327:703)和微粒轰击(Sanford et al.(1987)Part.Sci.Technol.5:27；Sanford(1988)Trends Biotech.6:299,Sanford(1990)Physiol.Plant 79:206；and Klein et al.(1992)Biotechnology 10:268)；碳化硅晶须介导的转化(Kaeppler et al.(1990)Plant Cell Rep.9:415-8)；纳米颗粒转化(见，例如，美国专利公开号No.US2009/0104700A1)；气溶胶射线转化；和聚乙二醇(PEG)介导的摄取。在具体的实例中，可直接将异源核酸引入到植物细胞的基因组DNA中。

一种广泛使用的将表达载体引入到植物中的方法是基于土壤杆菌的自然转化系统。Horsch et al.(1985)Science 227:1229。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是已知可用于遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌各自的Ti和Ri质粒携带有负责对植物遗传转化的基因。Kado(1991)Crit.Rev.Plant.Sci.10:1。关于土壤杆菌载体系统和用于土壤杆菌介导的基因转移的方法的详细说明也可以在例如下列文献中获得：Gruber et al.,同上,Miki et al.,同上,Moloney et al.(1989)Plant CellReports 8:238,和美国专利Nos.4,940,838和5,464,763。

如果使用土壤杆菌进行转化，那么通常将待插入的DNA克隆入专门的质粒中，或者是插入中间载体或者是插入二元载体。中间载体不能在土壤杆菌中自我复制。中间载体可以通过利用辅助质粒转移到根癌土壤杆菌内(接合(conjugation))。日本烟草超二元系统是这种系统的一个实例(综述参见，Komari et al.(2006)Methods in Molecular Biology(K.Wang,编辑)No.343；Agrobacterium Protocols,第2版，第1卷,Humana Press Inc.,Totowa,NJ,pp.15-41；和Komori et al.(2007)Plant Physiol.145:1155-60)。二元载体能够在大肠杆菌和土壤杆菌中自我复制。二元载体包含选择标志物基因和由T DNA的左右边界区框定的接头或多接头。它们能够被直接转化到土壤杆菌中(Holsters,1978)。土壤杆菌含有携带vir区域的质粒。Ti或Ri质粒也包含转移T DNA必需的vir区。vir区是将T-DNA转移到植物细胞中必需的。可以包含额外的T-DNA。

当使用二元T-DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711 21)或共培养程序(Horsch et al.(1985)Science 227:1229 31)让细菌感染细胞时，根癌土壤杆菌宿主的毒力功能将会令含有构建体和近邻的标记的T-链插入到植物细胞DNA中。一般地，土壤杆菌转化系统用于对双子叶植物进行工程化。Bevan et al.(1982)Ann.Rev.Genet 16:357-84；Rogers et al.(1986)Methods Enzymol.118:627-41。土壤杆菌转化系统也可用于将核酸转化和转移到单子叶植物和植物细胞中。参见，美国专利No.5,591,616；Hernalsteen etal.(1984)EMBO J 3:3039-41；Hooykass Van Slogteren et al.(1984)Nature 311:763-4；Grimsley et al.(1987)Nature 325:1677-9；Boulton et al.(1989)PlantMol.Biol.12:31 40；和Gould et al.(1991)Plant Physiol.95:426-34。

本文中重组宿主的遗传操作可以使用通用的遗传技术和筛选来进行，并且可以在任何适于遗传操作的宿主细胞中实施。在一些实施方案中，重组宿主细胞可以是任何适合于基因修饰和/或重组基因表达的大豆植物或品种。在一些实施方案中，重组宿主可以是大豆种系转化子植物。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域熟知的并且在下列文献中有描述，例如，但不限于：Sambrook等(1989)，同上；Silhavy等(1984)Experimentswith Gene Fusions，Cold Spring Habor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；和Ausubel等(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssoc.and Wiley Interscience,New York,NY。

转化方法导致产生转基因植物。本公开可以用来鉴定包含大豆种系转化子，尤其是源自核心组织(L2和L3)的转化子的特定转基因植物。具体地，通过本发明提供的转化方法产生的大豆种系转化子可以传递到后续世代。

在将核酸导入到大豆植物细胞中之后，可以使植物细胞生长，且当分化的组织(例如芽和根)出现时，能够产生成熟的植株。在一些实施方案中，可以产生多个大豆植株。用于再生植株的方法是本领域普通技术人员已知的，并可以在如下的文献中找到：Plant Celland Tissue Culture,1994,Vasil and Thorpe Ed.Kluwer Academic Publishers，和Plant Cell Culture Protocols(Methods in Molecular Biology 111,1999 Hall Ed.，Humana Press)。本文所述的遗传修饰大豆植物可以在发酵培养基中培养，或者在合适的培养基例如土壤中生长。在一些实施方案中，用于高等植物的合适生长培养基可以是任何植物生长培养基，包括但不限于，土壤、砂、任何其它可支持根生长的颗粒介质(例如蛭石、珍珠岩等)或水培养基，以及合适的光、水和促进高等植物生长的营养补充剂。

对于通过上述任何一种转化技术产生的转化大豆植物细胞，可以进行培养以再生具有转化基因型、因而具有期望表型的成熟大豆植株。这样的再生技术依赖于对组织培养生长培养基中某些植物激素的操纵，典型地依赖于已经与期望的核苷酸序列一起被引入的杀生物剂和/或除草剂标记。从培养的原生质体再生植株在下列文献中有描述：Evans,etal.,"Protoplasts Isolation and Culture"in Handbook of Plant Cell Culture,124-176页,Macmillian Publishing Company,New York,1983；和Binding,Regeneration ofPlants,Plant Protoplasts,21-73页,CRC Press,Boca Raton,1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得。这样的再生技术在Klee et al.(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467 486中有一般性的描述。

在一些实施方案中，经转化的大豆植物细胞不能够再生以产生成熟的大豆植物。这样的转化的植物细胞是非种系大豆转化子。

可以通过对工程化的植物材料进行选择或筛选，利用转化DNA上存在的标记基因所编码的性状来鉴定和分离转化的大豆植物细胞、愈伤组织、组织、或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体提供对该抗生素或除草剂的耐受性)的培养基上培育工程化的植物材料来实施选择。此外，还可以通过筛选重组核酸构建体上存在的任何可见的标记基因(例如β-葡糖苷酸酶、荧光素酶或gfp基因)的活性，来鉴定转化的植物和植物细胞。这些选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。

含有本文的异源分子的转基因大豆植物可以通过选择性育种来产生，例如，通过含有该分子的第一亲本植物与第二亲本植物有性杂交，由此产生多个第一子代植物。然后选择可以抵抗可选择标志物(例如草甘膦，本文的异源分子可以赋予子代植物对它的抗性)的第一子代植物。然后可以使第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物。然后，可以选择可抵抗选择标志物的第二子代植物。这些步骤可以进一步包括使第一子代植物或第二子代植物与第二亲本植物或第三亲本植物回交。

还应当理解，也可以令两种不同的转基因大豆植物交配以产生含有两个独立分离的、叠加的外源基因的后代。适当后代的自交能够产生对两个叠加外源基因而言均为纯合子的植物。还构想了与亲本植物的回交和与非转化植物的异交(out-crossing)，以及无性繁殖。通常用于不同性状和作物的其他育种方法是本领域已知的。回交育种已经被用于将简单遗传的(simply herited)、高度可遗传的(highly inheritable)性状的基因转移到合意的纯合栽培种或近交系(即为轮回亲本)中。所得的植物预期具有轮回亲本(例如栽培种)的属性以及从供体亲本转移来的期望性状。初始杂交后，选择具有供体亲本表型的个体，并与轮回亲本反复杂交(回交)。所得亲本预期将具有轮回亲本(例如栽培种)的属性和从供体亲本转移来的期望性状。

转基因也可以通过同源重组被引入到植物基因组的预定区域内。通过同源重组将多核苷酸序列稳定整合到植物细胞的特定染色体位点中的方法在本领域中已有描述。例如，在美国专利申请公开号No.2009/0111188 A1中描述的位点特异性整合涉及使用重组酶或整合酶来介导将供体多核苷酸序列引入到染色体靶中。另外，国际专利申请号No.WO2008/021207描述了锌指介导的同源重组，用来一个或多个供体多核苷酸序列稳定地整合到基因组的特定位置内。使用重组酶，例如美国专利No.6,720,475中描述的FLP/FRT，或美国专利No.5,658,772中描述的CRE/LOX，可用于将多核苷酸序列稳定整合到特定的染色体位点。最后，在Puchta et al.,PNAS USA 93(1996)pp.5055-5060)中描述了使用大范围核酸酶(meganuclease)将供体多核苷酸导向到特定的染色体位置。

用于在植物细胞内位点特异性整合的其它不同方法是公知的，并且可以适用(Kumar et al.,Trends in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，在多种原核生物和低等真核生物中业已鉴定的位点特异性重组系统可以在植物中应用。这类系统的实例包括，但不限于：来自鲁氏接合酵母pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki et al.(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)，和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Maeser and Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。

IV.编码农艺性状的序列

本文中的一些实施方案提供包含基因表达盒的编码多肽的转基因。这样的转基因可在多种应用中的任何一种中用来产生转基因大豆植物。本文为了示例说明的目的提供了包含基因表达盒的转基因的具体实例，这些实例包括包括性状基因、RNAi基因或选择标志物基因的基因表达。

在工程化用于在大豆植物中表达的基因时，可以，例如，利用公众可获得的DNA序列数据库寻找关于植物基因组的密码子分布或者多种植物基因的蛋白质编码区的信息，来确定预期的宿主植物的密码子偏好。

在设计用于植物表达的核酸中的编码区时，当存在多种选择时，应当确定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，以及优选密码子的第二、第三、第四选项等。然后，可以设计编码相同肽(例如，DGT-28蛋白质)的氨基酸序列的新DNA序列，但是新DNA序列与原始DNA序列的区别在于用植物(第一优选的、第二优选的、第三优选的、或第四优选的，等等)密码子进行了取代，以规定氨基酸序列中每个位置处的氨基酸。

然后可以对新序列进行分析，寻找可能由这些修饰产生的限制酶位点。对于鉴定出的位点，可以进一步通过用第一、第二、第三或第四选择的优选密码子替换这些密码子来进行修饰。序列中其他可能影响感兴趣的基因转录或翻译的位点是茎-环结构、外显子:内含子接点(5'或3')、多聚腺苷酸添加信号、和RNA聚合酶终止信号；这些位点可通过用植物密码子取代予以去除。可以对序列进行进一步的分析和修饰，以减少TA或CG双联体(doublet)的频率。除了双联体之外，具有超过大约6个相同残基的G或C双联体序列区块(block)会影响序列的转录或翻译。因此，可以通过将密码子的第一或第二选择替换为下一级优选的密码子等方式来对这些区块进行修饰。

一旦在纸上或计算机上设计出了优化的(例如，植物优化的)DNA序列，便可以在实验室里人造出在序列上与设计的序列精确对应的实际DNA分子。可以对这些人造的核酸分子进行克隆和进行其他操作，完全如同它们来自自然或天然的来源一样。

本文中的核酸可以被克隆到载体中，用于转化到原核或真核细胞中进行复制和/或表达。载体可以是原核载体；例如，质粒、或穿梭载体、昆虫载体、或真核载体。本文的核酸也可以被克隆到表达载体中，例如，用于施用到植物细胞中。在某些应用中，可能优选的是具有在大肠杆菌中发挥功能的载体(例如，生产用于产生抗体的蛋白质，DNA序列分析，插入物构建，获得大量核酸)。

在一个实施方案中，在本申请中公开了要表达的转基因。基因表达盒可包含选择标志物基因、性状基因、或RNAi基因。下文中进一步提供了选择标志物基因、性状基因和RNAi基因的实例。本申请公开的方法的优势在于它们提供了一种不依赖转基因的蛋白质产物的具体功能或其他功能来选择种系转化子的方法。

赋予害虫或疾病抗性的基因或编码序列

(A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。这些基因的实例包括：提供黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因(Jones et al.,1994 Science 266:789)；，提供丁香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码一种蛋白激酶(Martin et al.,1993 Science 262:1432)，和提供丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinos et al.,1994 Cell 78:1089)。

(B)苏云金芽孢杆菌蛋白质、其衍生物或以其为模本的人造多肽，例如Btδ-内毒素基因的多核苷酸序列(Geiser et al.,1986 Gene 48:109)和植物杀虫(VIP)基因(见，例如，Estruch et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登录号为40098，67136，31995和31998。

(C)植物凝集素，例如，多种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合性植物凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme et al.,1994 Plant Molec.Biol.24:825)。

(D)维生素结合蛋白质，例如亲和素及亲和素同源物，其可用作针对昆虫类害虫的杀幼虫剂。见美国专利No.5,659,026。

(E)酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这些基因的实例包括水稻半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe et al.,1987 J.Biol.Chem.262:16793)，烟草蛋白酶抑制剂I(Huub et al.,1993 Plant Molec.Biol.21:985)，和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani et al.,1993 Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。

(F)昆虫特异性激素或信息素，例如蜕皮激素和保幼激素或其变体、基于它们的模拟物，或其拮抗剂或激动剂，例如杆状病毒表达的克隆保幼激素酯酶，保幼激素的失活子(Hammock et al.,1990 Nature 344:458)。

(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达时会扰乱受影响的害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt,1989)，和昆虫特异性麻痹神经毒素(美国专利No.5,266,361)。

(H)在自然界中由蛇、马蜂等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎子昆虫毒性肽(Pang,1992 Gene 116:165)。

(I)负责超富集单萜、倍半萜、甾体、异羟肟酸、苯丙烷衍生物或其它具有杀虫活性的非蛋白质分子的酶。

(J)参与生物活性分子修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白质水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然的还是人造的。这些基因的实例包括马蹄莲(callas)基因(PCT公开的申请WO 93/02197)，几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC以登录号3999637和67152获得)，烟草钩虫几丁质酶(Kramer et al.,1993 InsectMolec.Biol.23:691)，和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck et al.,1993 PlantMolec.Biol.21:673)。

(K)刺激信号转导的分子。这些分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella et al.,1994 Plant Molec.Biol.24:757)，和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess et al.,1994 Plant Physiol.104:1467)。

(L)疏水矩肽(hydrophobic moment peptide)。见例如美国专利Nos.5,659,026和5,607,914，后者教导了赋予疾病抗性的人造抗微生物肽。

(M)膜透性酶，通道形成剂或通道阻断剂，例如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes etal.,1993 Plant Sci.89:43)，其使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。

(N)病毒侵袭性蛋白质或由其衍生的复杂毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒以及相关病毒所致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的，针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。参见，例如，Beachy et al.(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。

(O)昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素。因此，靶向昆虫肠道关键代谢功能的抗体可以使受影响的酶失活，杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第七届国际分子植物-微生物相互作用研讨会(Seventh Int'l.Symposium on Molecular Plant MicrobeInteractions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。

(P)病毒特异性抗体。见例如Tavladoraki et al.(1993)Nature 266:469，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。

(Q)由病原体或寄生物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质。因此，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁的均聚-α-1,4-D-半乳糖醛酸而促进真菌定殖和植物营养素释放(Lamb et al.,1992)Bio/Technology 10:1436。Toubart等(1992 Plant J.2:367)描述了豆类内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的编码基因的克隆和表征。

(R)由植物自然产生的发育阻滞(developmental-arrestive)蛋白质，例如大麦核糖体失活基因，其提供了增加的针对真菌疾病的抗性(Longemann et al.,1992).Bio/Technology 10:3305。

(S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到靶向复合体中，靶向复合体破坏同源的mRNA。见例如Fire等人，美国专利6,506,559；Graham等人，6,573,099。

赋予除草剂抗性的基因

(A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂，例如咪唑啉酮类(imidazalinone)、磺酰苯胺类(sulfonanilide)或磺酰脲类除草剂的抗性或耐受性的基因。这类基因的实例编码一种突变的ALS酶(Lee et al.,1988 EMBOJ.7:1241)，其也被称作AHAL酶(Miki et al.,1990 Theor.Appl.Genet.80:449)。

(B)一种或多种额外的编码针对草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过一些基因如GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)和其它膦酰基化合物，如草胺膦(pat和bar基因；DSM-2)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)所致的代谢失活而获得的。见例如美国专利No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得，突变体基因的核苷酸序列在美国专利No.4,769,061中公开。欧洲专利申请No.0 333 033和美国专利No.4,975,374公开了可赋予除草剂如L-草铵膦抗性的谷氨酰胺合酶基因的核苷酸序列。欧洲专利申请No.0 242 246提供了草铵膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef et al.(1989)Bio/Technology 7:61中描述了表达编码草铵膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮如稀禾定和甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是Accl-S1,Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall et al.(1992)Theor.Appl.Genet.83:435所述。

(C)编码针对可抑制光合作用的除草剂例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性的基因。Przibilla et al.(1991)Plant Cell 3:169描述了使用编码突变体psbA基因的质粒转化衣藻。在美国专利No.4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes et al.(1992)Biochem.J.285:173中描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。

(D)编码针对可结合羟基苯基丙酮酸二加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性基因，HPPD是催化对-羟基苯基丙酮酸(HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。这包括例如异噁唑(EP418175,EP470856,EP487352,EP527036,EP560482,EP682659,美国专利No.5,424,276)，特别是异噁唑草酮，其是玉米的选择性除草剂，二酮腈(diketonitrile)(EP496630,EP496631)，特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮类(EP625505，EP625508，美国专利No.5,506,195)，特别是磺草酮、和pyrazolinate等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因能够提供针对这些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利Nos.6,268,549和6,245,968和美国专利申请公开No.20030066102中描述的基因。

(E)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(AOPP)除草剂的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利No.7,838,733所述。

(F)编码针对苯氧基生长素除草剂如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对吡啶基氧基生长素除草剂，如氟草烟或绿草定的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶(aad-12)基因，如WO2007/053482-A2所述。

(G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(见例如美国专利公开No.20030135879)。

(H)编码针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(见美国专利No.5,767,373)。

(I)提供针对可结合光系统II反应中心(PS II)核心蛋白质的三嗪除草剂(例如莠去津)和尿素衍生物(如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因。见Brussian et al.,(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245。

可赋予或贡献增值性状(Value Added Trait)的基因

(A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量(Knultzon et al.,1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:2624。

(B)降低的植酸含量

(1)引入植酸酶编码基因，如黑曲霉植酸酶基因(Van Hartingsveldt et al.,1993 Gene 127:87)，提高植酸降解，向被转化植物添加更多游离磷酸盐。

(2)可引入降低植酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入如下所述的单个等位基因的相关DNA来实现：该单个等位基因导致以植酸水平低为特征的玉米突变体的原因(Raboy et al.,1990 Maydica 35:383)。

(C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza et al.,1988)J.Bacteriol.170:810，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz et al.,1985 Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Pen etal.,1992 Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因(Elliot et al.,1993),大麦淀粉酶基因(Sogaard et al.,1993 J.Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisheret al.,1993 Plant Physiol.102:10450)。

为了在大豆细胞内表达可选择标志物基因、性状基因、或RNA基因，通常将编码蛋白质的核酸亚克隆到含有指导转录的启动子的表达载体中。合适的细菌和真核启动子是本领域公知的，例如在Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版1989；第3版，2001年)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,同上)中所述。本文中用于表达核酸的细菌表达系统可以在，例如，大肠杆菌、芽孢杆菌属和沙门氏菌属中获得(Palva et al.,Gene 22:229 235(1983))。用于这些表达系统的试剂盒可以商购。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统是本领域技术人员公知的，并且也可以商购。

考虑预期用途(例如，在植物、动物、细菌、真菌和原生动物中表达)来选择用于将遗传信息转运到细胞内的具体表达载体。通用的细菌和动物表达载体是本领域已知的，并在例如，美国专利公开20050064474A1和国际专利公开WO 05/084190，WO05/014791和WO03/080809中有详细说明。可以用通用的转染方法产生表达大量蛋白质的细菌细胞系，随后可以使用通用技术加以纯化。

用于指导本文核酸表达的启动子的选择取决于特定的应用。在本文的实施方案中可以使用多种在植物中指导基因表达的启动子。这些启动子可以从组成型、化学调节型、诱导型、组织特异型、和种子优选型启动子中选择。例如，适合于宿主细胞的强组成型启动子可用于表达和纯化表达的蛋白质。植物启动子的非限制性实例包括来自如下来源的启动子序列：拟南芥泛素-10(ubi 10)(Callis,et al.,1990,J.Biol.Chem.,265:12486 12493)；根癌土壤杆菌甘露碱合酶(Δmas)(Petolino et al.,美国专利6,730,824)；和/或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer et al.,1996,Plant Molecular Biology 31:11291139)。

组成型启动子包括，例如，核心花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell et al.(1985)Nature 313:810 812)；水稻肌动蛋白质启动子(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163171)；玉米泛素启动子(美国专利号5,510,474；Christensen et al.(1989)PlantMol.Biol.12:619 632和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675 689)；pEMU启动子(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581 588)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)；玉米组蛋白启动子(Chabouté et al.Plant Molecular Biology,8:179 191(1987))；等。

可用的植物兼容性启动子的范围包括组织特异性和诱导型启动子。诱导型调控元件是能够响应诱导剂而直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因的转录的调控元件。在没有诱导物时，上述DNA序列或基因将不被转录。通常，特异性结合诱导型调控元件从而激活转录的蛋白质因子以无活性的形式存在，随后会被诱导剂直接或间接地转化为活性形式。诱导物可以是化学剂，例如蛋白质、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或由热、冷、盐、或有毒元素所直接施用的生理胁迫，或通过病原体或致病剂如病毒而间接施用的生理胁迫。典型地，特异性结合诱导型调控元件从而激活转录的蛋白质因子以无活性的形式存在，随后会被诱导剂直接或间接地转化为活性形式。可以通过从外部将诱导物施用给细胞或植物，例如通过喷雾、浇水、加热或类似的方法，而将含有诱导型调控元件的植物细胞暴露于诱导物。

在本文的实施方案中可以使用任何诱导型启动子。见Ward et al.PlantMol.Biol.22:361 366(1993)。诱导型启动子包括，例如但不限于：蜕皮激素受体启动子(美国专利号6,504,082)；来自ACE1系统的响应铜的启动子(Mett et al.PNAS 90:4567 4571(1993))；来自玉米的响应苯磺酰胺除草剂安全剂的In2-1和In2-2基因(美国专利号5,364,780；Hershey et al.,Mol.Gen.Genetics 227:229-237(1991)和Gatz et al.,Mol.Gen.Genetics 243:32-38(1994))；来自Tn10的Tet阻遏物(Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.227:229-237(1991)；来自类固醇激素基因的启动子，其转录活性受到糖皮质激素的诱导(Schena et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421(1991)和McNelliset al.,(1998)Plant J.14(2):247-257)；玉米GST启动子，其被用作预应急除草剂的疏水亲电子化合物激活(参见美国专利No.5,965,387和国际专利申请公开No.WO 93/001294)；和烟草PR-1a启动子，其被水杨酸激活(见Ono S,Kusama M,Ogura R,Hiratsuka K.,“Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense GeneExpression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System,”BiosciBiotechnol Biochem.2011Sep 23；75(9):1796-800)。其他受化学调控的感兴趣的启动子包括四环素诱导型和四环素抑制型的启动子(参见，例如，Gatz et al.,(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237,和美国专利号5,814,618和5,789,156)。

其它可调节的感兴趣启动子包括冷应答调控元件或热激调控元件，其转录分别受到冷或热暴露的影响(Takahashi et al.,Plant Physiol.99:383-390,1992)；可被厌氧条件诱导的醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach et al.,PNAS USA 79:2981-2985(1982)；Walker et al.,PNAS 84(19):6624-6628(1987))，来自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光诱导型启动子(Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265)；光诱导型调节元件(Feinbaum et al.,Mol.Gen.Genet.226:449,1991；Lam and Chua,Science 248:471,1990；Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；Orozco etal.(1993)Plant Mol.Bio.23(6):1129-1138)；植物激素诱导型调节元件(YamaguchiShinozaki et al.,Plant Mol.Biol.15:905,1990；Kares et al.,Plant Mol.Biol.15:225,1990)，等等。诱导型调控元件还可以是玉米In2-1或In2-2基因，它们响应苯磺酰胺除草剂安全剂(Hershey et al.,Mol.Gen.Gene.227:229-237,1991；Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.243:32-38,1994)，和转座子Tn10的四环素阻遏物(Gatz et al.,Mol.Gen.Genet.227:229-237,1991)。

胁迫诱导型启动子包括盐/水胁迫诱导型启动子，如P5CS(Zang et al.(1997)Plant Sciences 129:81-89)；冷诱导型启动子，如cor15a(Hajela et al.(1990)PlantPhysiol.93:1246-1252),cor15b(Wilhelm et al.(1993)Plant Mol Biol 23:1073-1077),wsc120(Ouellet et al.(1998)FEBS Lett.423 324-328),ci7(Kirch et al.(1997)Plant Mol Biol.33:897-909),和ci21A(Schneider et al.(1997)PlantPhysiol.113:335-45)；干旱诱导型启动子，如Trg-31(Chaudhary et al.(1996)PlantMol.Biol.30:1247-57)和rd29(Kasuga et al.(1999)Nature Biotechnology 18:287-291)。渗透压诱导型启动子，如Rab17(Vilardell et al.(1991)Plant Mol.Biol.17:985-93)和渗压素(osmotin)(Raghothama et al.(1993)Plant Mol Biol 23:1117-28)。热诱导型启动子，如热激蛋白(Barros et al.(1992)Plant Mol.19:665-75；Marrs et al.(1993)Dev.Genet.14:27-41)、smHSP(Waters et al.(1996)J.Experimental Botany 47:325-338)；和来自欧芹泛素启动子的热激诱导型元件(WO 03/102198)。其它胁迫诱导型启动子包括rip2(美国专利号5,332,808和美国公开号No.2003/0217393)和rd29a(YamaguchiShinozaki et al.(1993)Mol.Gen.Genetics 236:331-340)。某些启动子可以被创伤诱导，包括土壤杆菌属的pMAS启动子(Guevara Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505)和土壤杆菌ORF13启动子(Hansen et al.,(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)。

组织优选的启动子可用于在特定植物组织内靶向增强转录和/或表达。这些类型启动子的实例包括种子优先(seed-preferred)的表达，例如由菜豆蛋白(phaseolin)启动子(Bustos et al.1989.The Plant Cell Vol.1,839-853)，和玉米球蛋白-1基因(Belanger,et al.1991Genetics 129:863-972)提供的种子优先表达。对于双子叶植物，种子优先的启动子包括，但不限于，菜豆的β-菜豆蛋白(β-phaseolin)、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素(soybeanlectin)、十字花科蛋白(cruciferin)，等等。对于单子叶植物，种子优先的启动子包括但不限于：玉米的15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯质蛋白质(waxy)、超甜素(shrunken)1和超甜素2，球蛋白1，等等。种子优先的启动子还包括那些指导基因主要在种子内的特定组织中表达的启动子，例如，γ-玉米醇溶蛋白的胚乳优先的启动子，来自烟草的隐藏(cryptic)启动子(Fobert et al.1994.T DNA tagging of a seedcoat specific cryptic promoter in tobacco.Plant J.4:567-577)，来自玉米的P-基因启动子(Chopra et al.1996.Alleles of the maize P-gene with distinct tissuespecificities encode Myb-homologous proteins with C-terminalreplacements.Plant Cell 7:1149-1158,Erratum in Plant Cell.1997,1:109)，来自玉米的球蛋白-1启动子(Belenger and Kriz.1991.Molecular basis for AllelicPolymorphism of the maize Globulin-1gene.Genetics 129:863-972)，和指导在玉米粒的种皮或果壳上表达的启动子，例如果皮特异性谷氨酰胺合成酶启动子(Muhitch et al.,2002.Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase_1-2 GeneCapable of Conferring Tissue Specific Gene Expression in TransgenicMaize.Plant Science 163:865-872)。

除了启动子之外，表达载体通常还含有转录单元或表达盒，其含有用于在宿主细胞(无论是原核还是真核)内表达核酸所需的全部其它元件。因此，典型的表达盒含有，例如，与编码蛋白质的核酸序列可操作连接的启动子，和信号，例如高效进行转录本多聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点、或翻译终止的信号。表达盒的其它元件包括，例如，增强子和异源剪接信号。

可以包含其它的载体组分，其也取决于基因的预期用途。实例包括选择标志物、靶向序列或调控序列，转运肽序列如优化的转运肽序列(见美国专利号5,510,471)，稳定化序列如RB7MAR(见Thompson and Myatt,(1997)Plant Mol.Biol.,34:687 692和WO9727207)，或前导序列、内含子等。植物表达载体和报告基因的一般描述和实例可以参见Gruber等,“Vectors for Plant Transformation”，录自Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology,Glick等编辑；CRC Press，第89-119页(1993)。

合适的表达载体的选择将取决于宿主和将表达载体导入宿主内的方法。表达盒可以包括在植物中发挥功能的转录和翻译终止区，其位于感兴趣的异源核苷酸序列3’端。终止区可以是感兴趣的DNA序列天然具有的，或者可以来自其他的来源。易用的终止区可以从根癌土壤杆菌的Ti质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶(nos)终止区(Depicker etal.,Mol.and Appl.Genet.1:561-573(1982)和Shaw et al.(1984)Nucleic AcidsResearch vol.12,No.20pp7831-7846(nos))，另见Guerineau et al.Mol.Gen.Genet.262:141-144(1991)；Proudfoot,Cell 64:671-674(1991)；Sanfacon et al.Genes Dev.5:141149(1991)；Mogen et al.Plant Cell 2:1261-1272(1990)；Munroe et al.Gene 91:151-158(1990)；Ballas et al.Nucleic Acids Res.17:7891-7903(1989)；Joshi etal.Nucleic Acid Res.15:9627-9639(1987)。

表达盒可以含有5’前导序列。这些前导序列可以发挥增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并包括例如小核糖核酸病毒(Picornavirus)的前导序列、EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)，Elroy-Stein et al.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:6126-6130(1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)Carrington and FreedJournal of Virology,64:1590-1597(1990)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)，Allisonet al.,Virology 154:9-20(1986)；人免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)，Macejak etal.Nature 353:90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMVRNA 4)，Jobling et al.Nature 325:622-625(1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，Gallie et al.(1989)Molecular Biology of RNA,237-256页；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)Lommel et al.Virology 81:382-385(1991)。另见Della Cioppa et al.PlantPhysiology 84:965-968(1987)。

构建体还包含可增强翻译和/或mRNA稳定性的序列，例如内含子。这种内含子的一个实例是拟南芥组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子。Chaubet et al.Journal ofMolecular Biology,225:569-574(1992)。

在期望将异源核酸序列的表达产物引导到特定的细胞器，特别是质体、造粉体，或到内质网，或者分泌在细胞表面或细胞外的场合，表达盒可以进一步包括转运肽编码序列。这些转运肽是本领域公知的，并且包括但不限于：酰基载体蛋白、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶和向日葵的转运肽(见Lebrun等人的美国专利5,510,417)，玉米Brittle 1叶绿体转运肽(Nelson et al.Plant Physiol 117(4):1235-1252(1998)；Sullivan et al.PlantCell 3(12):1337-48；Sullivan et al.,Planta(1995)196(3):477-84；Sullivan et al.,J.Biol.Chem.(1992)267(26):18999-9004)等。此外，嵌合的叶绿体转运肽是本领域已知的，例如优化的转运肽(参见美国专利号5,510,471)。其它的如叶绿体转运肽先前已经在美国专利号Nos.5,717,084；5,728,925中有描述。本领域的技术人员将很容易意识到，有许多种选项可用于将产物表达到特定的细胞器中。例如，大麦α淀粉酶序列常被用于指导向内质网的表达。Rogers,J.Biol.Chem.260:37313738(1985)。

本领域的技术人员会意识到，使用重组DNA技术能够提高被转染核酸分子的表达控制，例如通过操纵宿主细胞内核酸分子的拷贝数、核酸分子转录的效率、所得的转录本翻译的效率、和翻译后修饰的效率。此外，可以对启动子序列进行基因工程改造，使其与天然启动子相比表达水平提高。可用于控制核酸分子表达的重组技术包括，但不限于，将核酸分子稳定整合到一个或多个宿主细胞染色体中，向质粒添加载体稳定性序列，替换或修饰转录控制信号(例如启动子、操纵基因、增强子)，替换或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno或Kozak序列)，修饰核酸分子使其与宿主细胞的密码子利用率对应、和删除导致转录本不稳定的序列。

转化载体中可以包含用于筛选被转化的细胞或组织或植物部分或植物的报告基因或标志物基因。可选择标志物的实例包括那些赋予针对抗代谢物(例如除草剂或抗生素)的耐受性的标记，例如：二氢叶酸还原酶，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Reiss,PlantPhysiol.(Life Sci.Adv.)13:143-149,1994；另见Herrera Estrella et al.,Nature303:209-213,1983；Meijer et al.,Plant Mol.Biol.16:807-820,1991)；新霉素磷酸转移酶，其赋予对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素和巴龙霉素的抗性(Herrera Estrella,EMBOJ.2:987-995,1983 and Fraley et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:4803(1983))；潮霉素磷酸转移酶，其赋予潮霉素抗性(Marsh,Gene 32:481 485,1984；另见Waldron et al.,Plant Mol.Biol.5:103-108,1985；Zhijian et al.,Plant Science 108:219-227,1995)；trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:8047,1988)；甘露糖6-磷酸异构酶，允许细胞利用甘露糖(WO 94/20627)；鸟氨酸脱羧酶，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸的抗性(DFMO；McConlogue,1987,录自:Current Communications in MolecularBiology,Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；和来自土曲霉的脱氨酶，其赋予对稻瘟菌素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338,1995)。

其它的选择标志物包括，例如，突变体乙酰乳酸合酶，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(Lee et al.,EMBO J.7:1241-1248,1988)，突变体psbA，其赋予阿特拉津(atrazine)抗性(Smeda et al.,Plant Physiol.103:911-917,1993)，或突变体原卟啉原氧化酶(见美国专利No.5,767,373)，其它赋予对除草剂(例如草胺膦)抗性的标志物。合适的可选择标志物基因的实例包括，但不限于，编码氯霉素抗性(Herrera Estrella et al.,EMBO J.2:987-992,1983)；链霉素抗性(Jones et al.,Mol.Gen.Genet.210:86-91,1987)；壮观霉素抗性(Bretagne-Sagnard et al.,Transgenic Res.5:131-137,1996)；博来霉素抗性(Hille etal.,Plant Mol.Biol.7:171-176,1990)；磺酰胺抗性(Guerineau et al.,PlantMol.Biol.15:127-136,1990)；溴苯腈抗性(Stalker et al.,Science 242:419-423,1988)；草甘膦抗性(Shaw et al.,Science 233:478-481,1986)；膦丝菌素(phosphinothricin)抗性(DeBlock et al.,EMBO J.6:2513-2518,1987)，等的基因。

供选择基因使用的一个选项是编码草胺膦抗性的DNA，并且在一个实施方案中，可以是处于木薯叶脉花叶病病毒启动子控制之下的草铵膦乙酰转移酶(pat)、玉米优化的pat基因或bar基因。这些基因赋予对双丙氨膦(bioalaphos)的抗性。见Wohlleben et al.,(1988)Gene 70:25-37)；Gordon Kamm et al.,Plant Cell 2:603；1990；Uchimiya etal.,BioTechnology 11:835,1993；White et al.,Nucl.Acids Res.18:1062,1990；Spencer et al.,Theor.Appl.Genet.79:625-631,1990；和Anzai et al.,Mol.Gen.Gen.219:492,1989。pat基因的一个版本是玉米优化的pat基因，其在美国专利No.6,096,947中有描述。

此外，可以使用这样的标志物，其有助于鉴定含有编码该标志物的多核苷酸的植物细胞。当序列的存在产生可测量的产物，并且能够产生产物而不会破坏植物细胞时，可以使用可评分的(scorable)或可筛选的(screenable)标志物。实例包括β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，其编码一种酶，该酶有多种发色底物是已知的(例如，美国专利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson et al.The EMBO Journal vol.6No.13pp.3901-3907)；和碱性磷酸酶。在一个优选的实施方案中，所用的标志物是β-胡萝卜素或维生素原A(Ye et al.,Science 287:303-305(2000))。该基因已被用于提高稻米的营养，但在这里是使用它作为可筛选标志物，利用所提供的金黄色来检测与感兴趣基因连锁的该基因的存在。与使用该基因为植物贡献营养的情况不同的是，更小量的蛋白质足以实现该目的。其它可筛选标志物包括一般的花青素/类黄酮的基因(见Taylor and Briggs,The Plant Cell(1990)2:115-127中所讨论的)，包括例如，R-座位基因，其编码的产物可以调节植物组织中花青素色素(红色)的产生(Dellaporta et al.,录自ChromosomeStructure and Function,Kluwer Academic Publishers,Appels and Gustafson eds.,pp.263-282(1988))；控制类黄酮色素生物合成的基因，如玉米C1基因(Kao et al.,PlantCell(1996)8:1171 1179；Scheffler et al.,Mol.Gen.Genet.(1994)242:40-48)和玉米C2基因(Wienand et al.,Mol.Gen.Genet.(1986)203:202 207)；B基因(Chandler et al.,Plant Cell(1989)1:1175-1183)，p1基因(Grotewold et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)88:4587-4591；Grotewold et al.,Cell(1994)76:543-553；Sidorenko et al.,Plant Mol.Biol.(1999)39:11-19)；青铜色(bronze)座位基因(Ralston et al.,Genetics(1988)119:185-197；Nash et al.,Plant Cell(1990)2(11):1039-1049)，等等。

合适标志物的其他实例包括青色荧光蛋白质(CYP)基因(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129:913-42)，黄色荧光蛋白质基因(来自Evrogen公司的PHIYFP^TM；见Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54)；lux基因，其编码一种荧光素酶，该荧光素酶的存在可以通过使用，例如，X射线胶片、闪烁计数、荧光光度法、低光度摄像机、光子计数摄像机或多孔发光法等进行检测(Teeri et al.(1989)EMBO J.8:343)；绿色荧光蛋白质(GFP)基因(Sheen et al.,PlantJ.(1995)8(5):777-84)；和DsRed2，用该标志物基因转化的植物细胞呈红色，因此可以通过目测选择(Dietrich et al.(2002)Biotechniques 2(2):286 293)。其它的实例包括β-内酰胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75:3737)，其编码各种发色底物已知的酶(例如PADAC，一种发色头孢菌素)；xylE基因(Zukowsky et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:1101)，其编码邻苯二酚双加氧酶，该酶能够转化发色儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikuta et al.,Biotech.(1990)8:241)；和酪氨酸酶基因(Katz et al.,J.Gen.Microbiol.(1983)129:2703)，其编码的酶能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌，后者进一步缩合形成容易检测的化合物黑色素。显然，许多这样的标志物是本领域技术人员可用并且知晓的。

V.用于检测转基因或转基因的表达产物的测定技术

有多种测定技术可以用来鉴定转化的转基因在大豆茎切片内的位置。下面的技术可以在多种情况下使用，并且在一个实施方案中，可以用来检测大豆植物茎中转基因和/或转基因所编码的多肽的存在。例如，可以将来自大豆茎切片的植物材料印迹到膜上，并测定其对转基因的表达。在一个实施方案中，可以通过Western印迹对转移到膜上的植物材料进行测定以检测从转基因表达的蛋白质。在另一个实施方案中，转移到膜上的植物材料可以通过酶测定来检测。此外，可以生成能够检测转基因存在的抗体，并用该抗体来测定已转移到膜上进行转基因表达测定的来自大豆茎切片的植物材料。其他技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色，也可以用来检测来自大豆茎切片的转基因的存在或表达。

在Western分析中，横向切割大豆茎切片并将其直接印迹到膜上。从已转化到大豆植物中的转基因表达的感兴趣蛋白质从大豆茎切片被转移到膜上。使蛋白质与标记物质，例如抗体接触。参见例如Hood et al.,“Commercial Production of Avidin fromTransgenic Maize；Characterization of Transformants,Production,Processing,Extraction and Purification,”Molecular Breeding 3:291-306(1997)；Towbin et al.(1979),“Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets:procedure and some applications,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76(9):4350-4354；Renart et al.“Transfer of proteinsfrom gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera:a methodfor studying antibody specificity and antigen structure,”Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76(7):3116-3120。

如本文所使用的，术语“膜”是指一种固相，它是多孔性或者非多孔性的不溶于水的材料，包括但不限于，纤维素、多糖例如Sephadex^TM，玻璃，聚丙烯酰吗啉(polyacryloylmolpholide)，二氧化硅，可控孔度玻璃(CPG)，聚苯乙烯，聚苯乙烯/乳胶，聚乙烯如超高分子量聚乙烯(UPE)，聚酰胺，聚偏二氟乙烯(PVDF)，聚四氟乙烯(PTFE；特氟龙)，羧基改性的特氟龙尼龙，硝酸纤维素，以及金属和合金例如金、铂和靶。膜是带电的，并可与有机物质如蛋白质结合。

膜可以显著改善Western印迹转移，因为其可使得该过程定量化。通过确保大豆茎切片被印到膜上并转移到吸附性的固相，就可以进行定量研究来确定大豆茎切片的哪些组织包含被转化的转基因。

另一种转移蛋白质的方法称作电印迹(electroblotting)，其利用电流将蛋白质从茎切片拉到膜上。电印迹用的设备是可商购的。蛋白质从茎切片内部转移到膜上，同时维持它们在凝胶内所具有的组织。作为该“印迹”过程的结果，蛋白质被暴露在表面薄层上供检测。第二膜和吸收膜均选择具有非特异性蛋白结合性质者(其对所有蛋白质的结合同样好)。蛋白质结合是基于疏水相互作用，以及膜和蛋白质之间的电荷相互作用。

蛋白质从凝胶到膜的转移的均一性和总体有效性可以通过用考马斯(Coomassie)或Ponceau S染料，或其他染料对膜染色来检验。在二者中考马斯较为灵敏，但Ponceau S的水溶性使得随后脱色并探测膜较容易。

因为是由于膜能够结合蛋白质而选用膜的，而且抗体和靶物都是蛋白质，所以必须采取步骤来防止膜与用于检测靶蛋白的抗体之间的相互作用。通过将膜放置于含有很小量的去污剂例如20的蛋白质的稀溶液中，通常是牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉的稀溶液中，来封闭非特异性结合。稀溶液中的蛋白质结合到所有未被靶蛋白结合之处。这样，当加入抗体时，膜上除了特定的靶蛋白上的结合位点之外没有其他地方供其结合。这可以降低Western印迹的最终产物中的“噪声”，使得结果更清晰，并消除假检出。

本文所用的术语"标记物"和"标签"是指可发出可检测信号的物质，包括但不仅限于酶如碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及辣根过氧化物酶、核酶、复制酶如QB复制酶的底物、启动子、染料、荧光剂(如荧光素、异硫氰酸盐、罗丹明化合物、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛及荧光胺)、化学发光剂如异鲁米诺、增敏剂、辅酶、酶底物、放射标记物、颗粒如乳胶或碳颗粒、脂质体、细胞等，可进一步用染料、催化剂或其他可检测基团对其进行标记。

转移到吸附膜上的蛋白质可以通过多种常规技术加以检测。一种优选的检测技术利用对特定多肽特异性的抗体。第一抗体可以利用数种方法中的任何一种加以检测。有多种检测特异性抗体-抗原相互作用的方法在本领域中已知并且可以在该方法中应用，包括但不限于标准免疫组织学方法，免疫沉淀，酶免疫测定，和放射免疫测定。一般而言，多肽特异性的抗体会被可检测地标记，或者是直接标记或者是间接标记。直接标记物包括放射性同位素、产生可检测产物的酶(例如荧光素酶、β-半乳糖苷酶等等)；荧光标记物(例如异硫氰酸荧光素；罗丹明；藻红蛋白等等)；发荧光的金属，例如¹⁵²Eu或其他镧系成员，它们介由金属螯合基团例如EDTA附接于抗体；化学发光化合物，例如鲁米诺、异鲁米诺、吖啶盐等等；生物发光化合物，例如萤光素，和水母发光蛋白(绿色荧光蛋白)。

然后可以用合适的缓冲液洗涤含有转移的蛋白质的吸附膜，再将其与可检测地标记的多肽特异性抗体接触。检测方法是本领域已知的，并且将根据可检测标记物发出的信号来合适地选择。检测通常通过与合适的对照以及适宜的标准比较来完成。

在一个实施方案中，Western印迹可以用来进行大豆茎切片的组织印渍(tissueprinting)，以鉴定种系和非种系大豆转化子。种系大豆转化子可以通过在用抗体或其他标记物检测之后在膜上生成的“点样式”(dot pattern)来鉴定。点样式在膜上呈实心的、填满的圆圈(solid，filled circle)。与之相比，非种系大豆转化子可以通过在用抗体或其他标记物检测之后在膜上生成的“环样式”(ring pattern)来鉴定。环样式在膜上呈现圆形的线。环样式的中心没有来自抗体或其他标记物的信号。

相应地，“点样式”指示在核心组织(L2和L3层)中被转基因转化、将会产生种系大豆转化子的大豆植物茎。与之相比，“环样式”指示在壳套组织(L1层)中被转基因转化、将会产生非种系大豆转化子的大豆植物茎。

本发明的实施方案在下面的实施例中进一步限定。但应当理解，这些实施例仅作为举例说明给出。从上面的讨论和这些实施例，本领域的技术人员能够确定本发明的必要特征，并且在不背离本发明精神和范围的前提下，可以对本发明的实施方案进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，本领域技术人员根据前面的描述，容易想到除本文显示并描述的实施方案之外的本发明实施方案的各种修改。这些修改也应落入所附的权利要求书的范围内。以下是作为举例说明提供的，而非意在限制本发明的范围。

实施例

实施例1:DNA构建体

使用本领域公认的程序构建了单一双元载体，标记为pDAB9381(图1)。pDAB9381含有两个植物转录单元(PTUs)。第一个PTU(SEQ ID NO:1)的组成为：拟南芥(Arabidopsisthaliana)泛素-10启动子(AtUbi10启动子；J.Callis,et al.(1990),Ubiquitinextension proteins of Arabidopsis thaliana.Structure,localization andexpression of their promoters in transgenic tobacco.J.Biol.Chem.265:12486-12493)，其驱动黄色荧光蛋白编码序列(PhiYFP；Shagin,et al.(2004),GFP-likeproteins as ubiquitous metazoan superfamily:evolution of functional featuresand structural complexity,Molecular Biology and Evolution 21(5):841-850)，该编码序列含有从马铃薯(Solanum tuberosum)光特异性组织可诱导LS-1基因分离的内含子(ST-LS1intron；Genbank Acc No.X04753)，并以根癌土壤杆菌Agrobacteriumtumefaciens开放阅读框-23 3′非翻译区(AtuORF23 3′UTR；Gelvin SG(1987)TR-basedsub-Ti plasmids,EP专利222493)终止。第二个PTU(SEQ ID NO:2)是从异戊二烯基转移酶编码序列(ipt CDS；Genbank Acc No.X00639.1)克隆的，其组成为：木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV启动子；B.Verdaguer,et al.(1996),Isolation and expression intransgenic tobacco and rice plants of the cassava vein mosaic(CVMV)promoter,Plant Mol.Biol.31:1129-1139)，其用于驱动膦丝菌素乙酰转移酶编码序列(PAT；W.Wohlleben et al.(1988),Nucleotide sequence of the phosphinothricin N-acetyl-transferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494and itsexpression in Nicotiana tobacum,Gene 70:25-38)，以根癌土壤杆菌开放阅读框-1 3’非翻译区终止(AtuORF1 3′UTR；M.L.Huang et al.(1990),A chromosomal Agrobacteriumgene required for effective plant signal transduction,J.Bacteriol.172:1814-1822)。所得的双元载体含有可视的报告基因和抗生素可选择标志物基因，随后将其用于转化大豆。

实施例2:大豆转化

使用了两种土壤杆菌介导的大豆转化方法。这些方法包括子叶节转化方法和分割种子转化方法。这两种方案均在下文进一步详述。

转化方法1:根癌土壤杆菌介导的大豆子叶节转化

根癌土壤杆菌菌株EHA105(E.Hood,G.Helmer,R.Fraley,M.Chilton(1986),J.Bacteriol.168:1291-1301)用双元载体pDAB9381电穿孔。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的分离的菌落。分离单菌落，并通过限制酶消化确认pDAB9381双元载体的存在。通过经修改的P.Zeng et al.(2004),Plant Cell Rep.22(7):478-482的程序，利用pDAB9381双元载体进行土壤杆菌介导的大豆(Glycine max,Maverick栽培种)转化。该方案经过了修改以包含除草剂草铵膦作为选择剂。此外，另一处修改包括在用3g/L Phytagel(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)固化的B5基础培养基(Gamborg et al.(1968),Exp.CellRes.Apr 50(1):151-8)上萌发经灭菌的大豆种子。对规程的最后修改是采用从5-6日龄的幼苗制备、并如下述文献所述用土壤杆菌感染的子叶节外植体：Zhang et al.(1999),Theuse of glufosinate as a selective agent in Agrobacterium-mediatedtransformation of soybean,Plant Cell,Tissue,and Organ Culture 56:37-46。

如Zeng et al.(2004)中所述，在共培养培养基上进行5天的共培养。芽启动培养基、芽伸长培养基和生根培养基均添加50mg/L头孢噻肟、50mg/L特美汀、50mg/L万古霉素，并用3g/L Phytagel固化。然后将选择出的芽转移到生根培养基。

转化方法2:根癌土壤杆菌介导的大豆分割种子转化

下面描述的分割种子转化方法在2012年12月19日提交的美国临时专利申请号61/739,349中有更完整的描述。简而言之，用双元载体pDAB9381电穿孔根癌农杆菌菌株EHA105(Hood et al.,1986)。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的分离的菌落。分离单菌落，并通过限制酶消化确认pDAB9381双元载体的存在。

通过经修改的M.Paz,et al.(2005),Plant Cell Rep.25:206-213.的程序，利用pDAB9381双元载体进行土壤杆菌介导的大豆(Glycine max,Maverick栽培种)转化。简而言之，成熟的大豆种子用氯气灭菌过夜，用黑箱在24℃黑暗中用灭菌H₂O浸泡种子16个小时，然后进行土壤杆菌介导的植物转化。将种子沿着种脐纵向切为两半以分离种子并去除种皮。切去部分胚轴，并从子叶节去除任何主苗(axial shoots/buds)。

经过灭菌的种子用携带pDAB9381双元载体的根癌土壤杆菌EHA105菌株接种30分钟。然后，让外植体在用滤纸覆盖的共培养培养基上与根癌土壤杆菌菌株共培养5天。在5天的共培养之后，用含有100mg/L特美汀、200mg/L头孢噻肟和50mg/L万古霉素的液体芽诱导(SI)培养基洗涤外植体。然后将外植体在半固体芽诱导1(SI-1)培养基(通过向SI培养基中加入胶凝剂而制备)上培养，其中大豆种子的平坦一侧朝上，大豆子叶的节端浸泡在培养基中。

在SI-1培养基上24℃、18小时光周期(80～90μmole m^-2sec^-1光照)培养2周之后，将外植体转移到芽诱导2(SI-2)培养基，该培养基是用SI-1培养基通过补充6mg/L草铵膦而配制的。在SI-2培养基上2周之后，从外植体去除子叶，发出芽的外植体通过在基部切口予以切离，并转移到芽伸长(SE)培养基上。每2周将培养物转移到新鲜的SE培养基，直至所有的芽均再生。转移的次数为6-8次转移不等，持续时间为12-16周。

上文所述的大豆转化程序产生的转基因大豆事件要么是种系转化子，要么是非种系转化子。由于在大多数被子植物中生殖细胞是自L2/L3层细胞形成的，故当转基因插入芽顶端分生组织的L2/L3层细胞基因组DNA中时，产生种系大豆转化子。种系转化子能够将转基因传递给后代植物(即T₁、T₂等)，适合于常规的产业化种植。当转基因仅插入到芽顶端分生组织的L1层细胞的基因组DNA中时，产生非种系大豆转化子；L1层细胞只能垂周地(anticlinally)分裂，形成植物的表皮细胞层。非种系转化子不将转基因传递给后代植物(即T₁、T₂等)，因此是不期望的。下面一组实施例描述了一种新的筛选方法，其被用来鉴定并推进种系转化子，且检测并去除非种系转化子。

实施例3:组织印渍

从芽伸长(SE)培养基选择达到2.5cm长度的大豆芽。做一干净的水平切口(横向茎切片)以从芽的基部切出茎切片。从芽中切出并收集约0.1-0.5mm厚的大豆茎切片。将一片分离的茎切片压到一片硝酸纤维素膜上(Bio-Rad,Hercules,CA)，产生茎横截面的“组织印渍”。用戴手套的手指以轻微压力将该茎切片压向该硝酸纤维素膜。对从单个大豆芽分离的每个切片重复该过程。记录大豆芽和相应的茎切片在硝酸纤维素膜上的位置。此外，将5μL的1ng/μL纯化PhiYFP蛋白储液点样到该硝酸纤维素膜的右下角作为阳性对照。然后，让硝酸纤维素膜在室温风干10分钟。最后，将硝酸纤维素膜在去离子水中浸泡5分钟，并通过Western印迹程序分析。

Western印迹如下完成：将硝酸纤维素膜在封闭溶液(2％乳固形物悬浮于含0.05％20的磷酸盐缓冲盐水[PBST])中封闭30分钟。然后，将硝酸纤维素膜在PBST中洗涤两次，每次5分钟。将硝酸纤维素膜浸没于2％乳固形物悬浮于PBST中的溶液，加入第一抗体(多克隆家兔抗PhiYFP抗体1μg/mL(Evrogen,Moscow,Russia))，将混合物在轻柔搅拌下室温温育60分钟。然后将硝酸纤维素膜在PBST中洗涤4次，每次5分钟。将硝酸纤维素膜浸没于2％乳固形物悬浮于PBST中的溶液，加入第二抗体(辣根过氧化物酶与山羊抗家兔IgG的缀合物，溶于PBST中(Sigma,St.Louis,MO))，将混合物在轻柔搅拌下室温温育30分钟。然后，将硝酸纤维素膜在PBST中洗涤4次，每次5分钟。最后，将硝酸纤维素膜在PBS中洗涤三次，每次2分钟。

在纸巾上轻轻拍打硝酸纤维素膜的角以去除膜上多余的水分。利用ECL Plus^TM化学发光检测试剂(GE Healthcare,Waukesha,WI)按照制造商的指示检测抗体结合。利用G:Box^TM凝胶记录与分析系统(SynGene,Frederick,MD)使自结合于硝酸纤维素膜的抗体放出的化学发光可视化。使用G:Box^TM记录并分析硝酸纤维素膜所用的参数为：曝光时间10分钟，无分选(“no binning”)。选择对图像“无分选”是保持分辨率并正确鉴定来自茎切片组织印渍的信号样式所必需的。

含有功能性表达的PhiYFP转基因拷贝的大豆芽产生了具有两种截然不同的图像样式的组织印渍。这些图像样式被归类为“环”或“点”。图2显示了这两种观察到的样式的摄影图像。环样式的特征是呈空心圆，由一化学发光信号的圆形轮廓组成，在茎切片组织印渍的中心没有化学发光信号(图2，图面a)。点样式的特征是呈实心圆，由遍布整个茎切片组织印渍的化学发光信号构成(图2,图面b)。用一幅利用落射白光照明的该膜的图像来比较大豆茎切片印渍的部分与来自化学发光图像的样式。通过将落射白光照明图像与化学发光图像关联，可以鉴别出被用于产生茎切片印渍的特定大豆芽，并将其归类为环或点图像样式(图2，图面c和d)。

属于种系转化子的转基因大豆事件产生具有了点样式的组织印渍。与之相比，属于非种系转化子的转基因大豆事件产生了具有环样式的组织印渍。点样式是转基因插入L2和L3层的细胞(它们分裂形成皮层、维管组织和髓)的基因组DNA的结果。环样式是转基因插入L1层的细胞(它们分裂形成表皮细胞层)的基因组DNA的结果。该检测方法可以用于将种系大豆转化子与非种系大豆转化子区分开来。容许鉴定种系转化子的方法是理想的，因为在转化过程中更早鉴定出能够将转基因传递到后代植物的转基因事件，从而减少了必须进一步进行转化程序的转基因事件的总数。种系转化子(其中印迹的大豆茎切片产生“点”样式)的早期鉴定导致更高效的大豆转化管道的创建。

实施例4:共聚焦显微术

利用共聚焦显微术来成像第二个切出的大豆茎切片。将这些茎切片加载到玻璃盖玻片上并用Leica SP5共聚焦显微镜(Wetzlar,Germany)观察。用氖离子激光器的514nm线照射茎切片。在530-540nm之间收集大豆茎切片样品中表达的PhiYFP蛋白的发射数据。

一般地，大豆茎样品表达的PhiYFP蛋白的荧光样式被归类为三个类别之一：a)无荧光；b)源自分生组织的L1层(表皮层)的组织的荧光；和c)源自分生组织的L2/L3层(皮层、维管组织，和髓)的组织荧光。图3显示了来自大豆茎样品的三类荧光样式的实例。属于种系(L2/L3层)转化子的转基因大豆事件在茎的皮层、维管组织和髓中产生了荧光。由于转基因插入L2/L3层的细胞的基因组DNA而导致的荧光可以通过观察PhiYFP蛋白在茎的皮层、维管组织和髓中的表达来鉴定。与之相比，属于非种系(L1层)转化子的转基因大豆事件仅在表皮细胞中产生荧光。由于转基因插入L1层的细胞的基因组DNA而导致的荧光可以通过观察PhiYFP蛋白在茎的表皮细胞中的表达来鉴定。该检测方法可以用来鉴别种系大豆转化子和非种系大豆转化子。种系转化子的鉴定是理想的，因为在转化过程中更早鉴定出能够将转基因传递到后代植物的转基因事件，从而减少了必须进一步进行转化程序的转基因事件的总数。种系转化子的早期鉴定导致更高效的大豆转化管道的创建。

实施例5：共聚焦显微术观察所见与组织印渍结果的关联

我们发现，对产生点图像样式的茎切片的组织印渍的结果与对在茎的皮层、维管组织和髓内表达PhiYFP的茎切片的共聚焦显微术观察所见相关。在共聚焦显微术所见中显示皮层表达的大豆芽样品中有85％(6/7)也显示了表明转基因已插入L2/L3层的基因组DNA中的点状图像样式。因此，这些大豆芽样品可以标记为种系转化子，并推进完成大豆转化过程。组织印渍产生环状图像样式的茎切片与通过共聚焦显微术观察到在表皮细胞层内表达PhiYFP的茎切片(L1层转化子)相比，二者之间的相关度较低(29％)。该百分比较低是因为，在通过共聚焦显微术提示PhiYFP蛋白仅在表皮细胞层内表达的大豆芽(L1层转化子)中，有一些在组织印渍方法中并未产生环状图像样式。然而，组织印渍结果仅仅显示了一例假阴性结果，其中在组织印渍程序中观察到的环样式并未被共聚焦显微术确认为表皮表达。通过调整组织印渍方法，提高对表皮细胞层内的PhiYFP检测的灵敏度，可以改善组织印渍产生环状图像样式的茎切片与通过共聚焦显微术观察到在表皮细胞层内表达的PhiYFP的茎切片之间相比的相关性。然而，重要的是，在该数据组中未出现这样的情况：通过后来的共聚焦显微术发现与皮层表达相关的样式，在组织印渍分析中未被观察到。表达PhiYFP的茎切片的组织印渍分析结果和共聚焦显微术观察所见在表1中示出。

表1：共聚焦显微术和组织印渍分析的结果汇总。标示为“内部组织表达”的共聚焦显微术结果是在茎的皮层、维管组织和髓细胞层中产生荧光的样品。标记为“内部组织表达”的样品除了在内部组织中之外，在表皮中也可能具有荧光。标示为“表皮表达”的共聚焦显微术结果是仅在表皮细胞层中产生荧光的样品。

实施例6:T₀植物的生成和T₁种子的产生

在将伸长的芽(3-5cm)转移到生根培养基之前，将芽节间的切开端浸入1mg/L吲哚3-丁酸中1-3min以促进生根(Khan et al.(1994),Agrobacterium-MediatedTransformation of Subterranean Clover(Trifolium subterraneum L.),PlantPhysiol.,May 105(1):81-88)。将在装有生根培养基的25×100mm玻璃培养管中产生了根的大豆芽转移到敞口的Magenta盒中的土壤预混物中，并置入Conviron^TM中以使小植物适应环境。在整个芽启动和伸长过程中使用草铵膦，Liberty除草剂(Bayer Crop Science)的活性成分，进行选择。让生根的小植物在敞口的Magenta盒中适应环境数周，然后对它们进行分子筛选并转移到温室中以进一步适应环境并长壮(establishment)。使由此产生的转基因大豆植物在温室中生长并让其自花授精以产生T₁种子。

实施例7:通过水解和qPCR对转化子的分子表征：

对用pDAB9381转化的大豆转化子的基因组内转基因的存在进行了确证。首先通过一种与TAQMAN^TM相似的水解探针测定来筛选大豆转化子，以确证pat和yfp转基因的存在。对大豆转化子进行筛选以确证植物染色体内转基因的存在并估计其拷贝数。

水解探针测定

利用如下所述的水解探针测定确定了T₀和T₁大豆植物中的拷贝数。鉴定了具有不同数目的转基因的植物。

利用打孔器采集组织样品，并置于96孔平板中。选用来自每株植物的一片完全伸展的顶叶和一片完全伸展的底叶的组织样品分别进行分析，以对付T₀大豆植物中的转化嵌合性问题。利用Agilent BioCel(Agilent,Santa Clara,CA)和Qiagen MagAttract DNAIsolation kit^TM(Qiagen,Germantown,MD)以高通量格式分离基因组DNA。实施水解探针测定以确定PATv6的转基因拷贝数以及YFP的存在/不存在，以内参基因GMS116为比照，通过实时PCR，使用系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)。

为了扩增PATv6，制备1X终浓度的Probes Master预混物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，10μL体积的多重反应，含有PATv6的每种引物各0.4μM，GMS116的每种引物各0.4μM，以及每种探针各0.2μM(表2)。进行了二步扩增反应，在60℃扩增60秒同时捕获荧光。运行了所有样品，并使用循环阈值(Ct)分析每个样品。实时PCR数据的分析使用软件1.5版进行，其中使用相对定量模块，并以ΔΔCt法为基础。为此，每次运行中包括来自已知的4、2、1和0.5拷贝数的标识物的基因组DNA样品。确定了T₀和T₁转基因大豆植物的水解探针筛选的拷贝数结果。

表2:PATv6和内参基因(GMS116)的水解探针测定用的引物和探针信息

为了扩增YFP，制备1X终浓度的Probes Master预混物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，10μL体积的多重反应，含有YFP的每种引物各0.4μM，GMS116的每种引物各0.4μM，以及每种探针各0.2μM(表3)。进行了二步扩增反应，在60℃扩增60秒同时捕获荧光。运行了所有样品，并使用循环阈值(Ct)分析每个样品。实时PCR数据的分析使用软件1.5版进行，其中使用相对定量模块，并以ΔΔCt法为基础。为此，每次运行中包括已知的阳性样品，质粒阳性对照，野生型基因组DNA阴性对照，以及水(无扩增)对照。确定了T₀和T₁转基因大豆植物的水解探针筛选的拷贝数结果。

表3：YFP和内参基因(GMS116)的水解探针测定用的引物和探针信息

实施例8：T₁分子分析与T₀共聚焦显微术和组织印渍数据相关

T₀芽切片的共聚焦和组织印渍结果可以用来鉴定种系转化子。T₀芽切片的共聚焦和组织印渍结果与从T₁后代大豆植物获得的分子数据相关。表4总结了总共19个由T₀和T₁后代植物组成的转基因事件。T₀组织印渍数据和T₁分子数据之间存在相关性。在通过共聚焦显微术和组织印渍方法筛选的大豆事件中，80％(4/5)的大豆事件显示：组织印渍(事件具有点状图像样式)和共聚焦显微术(蛋白质的荧光在皮层组织中观察到)可以用来在植物转化过程的早期，在将大豆芽转移到生根培养基之前，鉴定和预测哪些事件是种系转化子。同样地，共聚焦显微术和组织印渍方法可以用于鉴定非种系转化子。92％(11/12)的大豆事件显示：组织印渍(事件具有环状图像样式或无图像样式)和共聚焦显微术(蛋白质的荧光在表皮组织中观察到)可以用来在植物转化过程的早期鉴定和预测哪些事件是非种系转化子。换言之，在该数据组中，组织印渍分析没有返回假阳性结果，且仅返回了一个假阴性结果。通过及早鉴定非种系转化子，有可能将这些事件从大豆转化过程中去除。通过去除这些非种系转化子，可以将更多的资源投向能够将插入的转基因传递给后代植物的种系大豆转化子。

表4:用pDAB9381转化的大豆事件的分析。T₀植物的组织印渍和共聚焦显微术数据与T₁后代植物的分子分析的比较。

虽然本发明的各方面已经在某些实施方案进行了描述，但是它们在本发明的精神和范围内可以被进一步进行修改。因此，本申请意图涵盖使用其一般原理的本发明实施方案的任何变化、用途或修改。此外，本申请意图涵盖通过这些实施方案所涉及的领域中的已知或习惯做法可以获得、并且落在附加权利要求的范围之内的对本公开的偏离。

序列表

<110> 美国陶氏益农公司(Dow AgroSciences LLC)

J·P·塞缪尔

S·R·契纳雷迪

A·鲍林

J·惠特克

T·明尼克斯

D·帕雷迪

K·Y·姚

K·A·史密斯

<120> 大豆转化开发过程中非种系事件的早期检测和去除

<130> 70524

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2783

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP植物转化单元

<400> 1

gtcgacctgc aggtcaacgg atcaggatat tcttgtttaa gatgttgaac tctatggagg 60

tttgtatgaa ctgatgatct aggaccggat aagttccctt cttcatagcg aacttattca 120

aagaatgttt tgtgtatcat tcttgttaca ttgttattaa tgaaaaaata ttattggtca 180

ttggactgaa cacgagtgtt aaatatggac caggccccaa ataagatcca ttgatatatg 240

aattaaataa caagaataaa tcgagtcacc aaaccacttg ccttttttaa cgagacttgt 300

tcaccaactt gatacaaaag tcattatcct atgcaaatca ataatcatac aaaaatatcc 360

aataacacta aaaaattaaa agaaatggat aatttcacaa tatgttatac gataaagaag 420

ttacttttcc aagaaattca ctgattttat aagcccactt gcattagata aatggcaaaa 480

aaaaacaaaa aggaaaagaa ataaagcacg aagaattcta gaaaatacga aatacgcttc 540

aatgcagtgg gacccacggt tcaattattg ccaattttca gctccaccgt atatttaaaa 600

aataaaacga taatgctaaa aaaatataaa tcgtaacgat cgttaaatct caacggctgg 660

atcttatgac gaccgttaga aattgtggtt gtcgacgagt cagtaataaa cggcgtcaaa 720

gtggttgcag ccggcacaca cgagtcgtgt ttatcaactc aaagcacaaa tacttttcct 780

caacctaaaa ataaggcaat tagccaaaaa caactttgcg tgtaaacaac gctcaataca 840

cgtgtcattt tattattagc tattgcttca ccgccttagc tttctcgtga cctagtcgtc 900

ctcgtctttt cttcttcttc ttctataaaa caatacccaa agcttcttct tcacaattca 960

gatttcaatt tctcaaaatc ttaaaaactt tctctcaatt ctctctaccg tgatcaaggt 1020

aaatttctgt gttccttatt ctctcaaaat cttcgatttt gttttcgttc gatcccaatt 1080

tcgtatatgt tctttggttt agattctgtt aatcttagat cgaagacgat tttctgggtt 1140

tgatcgttag atatcatctt aattctcgat tagggtttca taaatatcat ccgatttgtt 1200

caaataattt gagttttgtc gaataattac tcttcgattt gtgatttcta tctagatctg 1260

gtgttagttt ctagtttgtg cgatcgaatt tgtcgattaa tctgagtttt tctgattaac 1320

agagatctcc atgtcatctg gagcacttct ctttcatggg aagattcctt acgttgtgga 1380

gatggaaggg aatgttgatg gccacacctt tagcatacgt gggaaaggct acggagatgc 1440

ctcagtggga aaggtatgtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcacta 1500

attagtagta atatagtatt tcaagtattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc 1560

tattgctttt ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg 1620

accaaaacat ggtgatgtgc aggttgatgc acaattcatc tgtactaccg gagatgttcc 1680

tgtgccttgg agcacacttg tcaccactct cacctatgga gcacagtgct ttgccaagta 1740

tggtccagag ttgaaggact tctacaagtc ctgtatgcca gatggctatg tgcaagagcg 1800

cacaatcacc tttgaaggag atggcaactt caagactagg gctgaagtca cctttgagaa 1860

tgggtctgtc tacaataggg tcaaactcaa tggtcaaggc ttcaagaaag atggtcacgt 1920

gttgggaaag aacttggagt tcaacttcac tccccactgc ctctacatct ggggagacca 1980

agccaaccac ggtctcaagt cagccttcaa gatatgtcat gagattactg gcagcaaagg 2040

cgacttcata gtggctgacc acacccagat gaacactccc attggtggag gtccagttca 2100

tgttccagag tatcatcata tgtcttacca tgtgaaactt tccaaagatg tgacagacca 2160

cagagacaac atgagcttga aagaaactgt cagagctgtt gactgtcgca agacctacct 2220

ttgagtagtt agcttaatca cctagagctc ggtcaccagc ataattttta ttaatgtact 2280

aaattactgt tttgttaaat gcaattttgc tttctcggga ttttaatatc aaaatctatt 2340

tagaaataca caatattttg ttgcaggctt gctggagaat cgatctgcta tcataaaaat 2400

tacaaaaaaa ttttatttgc ctcaattatt ttaggattgg tattaaggac gcttaaatta 2460

tttgtcgggt cactacgcat cattgtgatt gagaagatca gcgatacgaa atattcgtag 2520

tactatcgat aatttatttg aaaattcata agaaaagcaa acgttacatg aattgatgaa 2580

acaatacaaa gacagataaa gccacgcaca tttaggatat tggccgagat tactgaatat 2640

tgagtaagat cacggaattt ctgacaggag catgtcttca attcagccca aatggcagtt 2700

gaaatactca aaccgcccca tatgcaggag cggatcattc attgtttgtt tggttgcctt 2760

tgccaacatg ggagtccaag gtt 2783

<210> 2

<211> 1828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PAT植物转化单元

<400> 2

ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60

gaagtattat gtaagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120

tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180

gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240

gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300

gtaaggtgga aaatgtaagg gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac 360

tacttatcct tttatatttt tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa 420

ccaagttcgg catttgtgaa aacaagaaaa aatttggtgt aagctatttt ctttgaagta 480

ctgaggatac aacttcagag aaatttgtaa gtttgtaggt accagatctg gatcccaaac 540

catgtctccg gagaggagac cagttgagat taggccagct acagcagctg atatggccgc 600

ggtttgtgat atcgttaacc attacattga gacgtctaca gtgaacttta ggacagagcc 660

acaaacacca caagagtgga ttgatgatct agagaggttg caagatagat acccttggtt 720

ggttgctgag gttgagggtg ttgtggctgg tattgcttac gctgggccct ggaaggctag 780

gaacgcttac gattggacag ttgagagtac tgtttacgtg tcacataggc atcaaaggtt 840

gggcctagga tctacattgt acacacattt gcttaagtct atggaggcgc aaggttttaa 900

gtctgtggtt gctgttatag gccttccaaa cgatccatct gttaggttgc atgaggcttt 960

gggatacaca gcccggggta cattgcgcgc agctggatac aagcatggtg gatggcatga 1020

tgttggtttt tggcaaaggg attttgagtt gccagctcct ccaaggccag ttaggccagt 1080

tacccaaatc tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg atcggcggca atagcttctt 1140

agcgccatcc cgggttgatc ctatctgtgt tgaaatagtt gcggtgggca aggctctctt 1200

tcagaaagac aggcggccaa aggaacccaa ggtgaggtgg gctatggctc tcagttcctt 1260

gtggaagcgc ttggtctaag gtgcagaggt gttagcggga tgaagcaaaa gtgtccgatt 1320

gtaacaagat atgttgatcc tacgtaagga tattaaagta tgtattcatc actaatataa 1380

tcagtgtatt ccaatatgta ctacgatttc caatgtcttt attgtcgccg tatgtaatcg 1440

gcgtcacaaa ataatccccg gtgactttct tttaatccag gatgaaataa tatgttatta 1500

taatttttgc gatttggtcc gttataggaa ttgaagtgtg cttgaggtcg gtcgccacca 1560

ctcccatttc ataattttac atgtatttga aaaataaaaa tttatggtat tcaatttaaa 1620

cacgtatact tgtaaagaat gatatcttga aagaaatata gtttaaatat ttattgataa 1680

aataacaagt caggtattat agtccaagca aaaacataaa tttattgatg caagtttaaa 1740

ttcagaaata tttcaataac tgattatatc agctggtaca ttgccgtaga tgaaagactg 1800

agtgcgatat tatggtgtaa tacatagg 1828

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PATv6 - F引物序列

<400> 3

acaagagtgg attgatgatc tagaga 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PATv6 - R引物序列

<400> 4

ctttgatgcc tatgtgacac gtaaac 26

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PATv6 - FAM探针序列

<400> 5

caaggcgtaa gcaataccag c 21

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMS116 - F引物序列

<400> 6

gtaatatggg ctcagaggaa tggt 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMS116 - R引物序列

<400> 7

atggagaaga acattggaat tgc 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMS116 - FAM探针序列

<400> 8

ccatggcccg gtaccatctg gtc 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP - F引物序列

<400> 9

cgtgttggga aagaacttgg a 21

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP - R引物序列

<400> 10

ccgtggttgg cttggtct 18

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> YFP - FAM探针序列

<400> 11

cactccccac tgcct 15

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMS116 - F引物序列

<400> 12

gtaatatggg ctcagaggaa tggt 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMS116 - R引物序列

<400> 13

atggagaaga acattggaat tgc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMS116 - FAM探针序列

<400> 14

ccatggcccg gtaccatctg gtc 23

Claims (18)

1.一种鉴定大豆种系转化子的方法，包括下述步骤：

(a)用转基因转化大豆植物组织；

(b)从经转化的包含转基因的大豆植物组织再生芽；

(c)从该包含转基因的经转化的大豆植物组织分离再生芽，其中所述分离包括对所述芽进行少于约0.5mm长的横向水平切割；

(d)将分离的再生芽与膜接触，其中植物材料从该分离的再生芽被转移到并固定于该膜，该植物材料包含所述经转化的包含转基因的大豆植物组织；

(e)测定该转移的植物材料以确定所述转基因在该转移的植物材料中的位置，其中所述测定包括使用特异性结合从所述转基因表达的蛋白质的抗体；

(f)确定所述分离的再生芽内的转基因位置，其中该转基因位置选自下组：核心(L2/L3)组织层，以及壳套(L1)组织层；和

(g)将显示L2/L3组织层转基因位置的分离的再生芽鉴定为大豆种系转化子。

2.一种从权利要求1的大豆种系转化子再生成熟的转基因大豆植物的方法，包括：

(a)选择包含所述大豆种系转化子的分离的再生芽；和

(b)将该包含所述大豆种系转化子的分离的再生芽培养成为成熟的转基因大豆植物。

3.权利要求1的方法，其中所述转化采用选自下组的转化方法：土壤杆菌转化、生物射弹、磷酸钙转化、聚凝胺转化、原生质体融合转化、电穿孔转化、超声转化、脂质体转化、显微注射转化、裸DNA转化、质粒载体转化、病毒载体转化、碳化硅介导转化、气溶胶聚束转化、或PEG转化。

4.权利要求1的方法，其中所述大豆植物组织选自下组：分生性大豆植物组织、皮性大豆植物组织、基本大豆植物组织、和维管大豆植物组织。

5.权利要求4的方法，其中所述分生性大豆植物组织包括顶端分生组织、初生分生组织、或侧生分生组织。

6.权利要求4的方法，其中所述皮性大豆植物组织包括表皮。

7.权利要求4的方法，其中所述皮性大豆植物组织包括周皮。

8.权利要求4的方法，其中所述维管大豆植物组织选自木质部或韧皮部。

9.权利要求1的方法，其中所述转基因包含在至少一个基因表达盒中。

10.权利要求9的方法，其中所述基因表达盒包含选择标志物基因。

11.权利要求9的方法，其中所述基因表达盒包含性状基因。

12.权利要求9的方法，其中所述基因表达盒包含RNAi基因。

13.权利要求1的方法，其中所述分离包括对所述芽进行横向水平切割。

14.权利要求1的方法，其中所述膜包括硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚四氟乙烯膜、或聚偏二氟乙烯膜。

15.权利要求1的方法，其中所述测定包括蛋白质检测测定。

16.权利要求15的方法，其中所述蛋白质检测测定包括特异性结合从所述转基因表达的蛋白质的抗体。

17.权利要求1的方法，其中所述确定包括识别固定在所述膜上的转移的植物材料内的点样式。

18.权利要求1的方法，其中所述确定包括识别固定在所述膜上的转移的植物材料内的环样式。