CN114369617B - 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114369617B
CN114369617B CN202210254603.9A CN202210254603A CN114369617B CN 114369617 B CN114369617 B CN 114369617B CN 202210254603 A CN202210254603 A CN 202210254603A CN 114369617 B CN114369617 B CN 114369617B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mosaic virus
vector
seq
yomv
rape
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210254603.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114369617A (zh
Inventor
李正刚
汤亚飞
何自福
佘小漫
于琳
蓝国兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences filed Critical Plant Protection Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202210254603.9A priority Critical patent/CN114369617B/zh
Publication of CN114369617A publication Critical patent/CN114369617A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114369617B publication Critical patent/CN114369617B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01G—HORTICULTURE; CULTIVATION OF VEGETABLES, FLOWERS, RICE, FRUIT, VINES, HOPS OR SEAWEED; FORESTRY; WATERING
    • A01G7/00—Botany in general
    • A01G7/06—Treatment of growing trees or plants, e.g. for preventing decay of wood, for tingeing flowers or wood, for prolonging the life of plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/00052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Forests & Forestry (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。本发明要解决的技术问题是为筛选抗性品种提供一种新选择。本发明的技术方案是一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体，该载体来自于菌株Agrobacterium tumefaciens YoMV‑GD，保藏号为GDMCC No：62229。本发明筛选到一株新的油菜花叶病毒，并构建油菜花叶病毒侵染性克隆载体，将该载体转化农杆菌，即可利用农杆菌注射方法来接种油菜花叶病毒，为筛选油菜花叶病毒抗性材料和品种以及研究油菜花叶病毒基因组结构、致病性以及与寄主之间的互作奠定了基础。

Description

一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用。
背景技术
油菜花叶病毒 (youcai mosaic virus, YoMV) 最早于1958年在中国油菜上发现(魏景超等, 1958)，可以侵染包括十字花科、百合水仙科、菊科、凤仙花科、龙胆科、茄科等多种植物 (Ju et al., 2019)，目前已经在中国、韩国、日本、德国、瑞士、西班牙、英国等多国报道，对十字花科作物和园艺作物生产造成了严重危害 (Zhu et al.，2001；Kwon etal.，2018；刘勇等，2019)。
YoMV属于烟草花叶病毒属，极易通过种子带毒及机械摩擦传播。YoMV编码四个蛋白，分别为125 kDa的复制相关蛋白、182 kDa的复制酶、30 kDa的运动蛋白、17.7 kDa的外壳蛋白。虽然YoMV可以侵染众多十字花科植物，但关于YoMV在萝卜上的发生报道却很少，国内目前暂无报道。YoMV不同株系侵染性差别较大，国内虽然有YoMV株系及其全长序列报道，但是并无侵染性克隆报道，对YoMV的研究还仅仅局限在利用保存的病样进行摩擦接种，比较费时费力，而且还不能保证病样的纯化效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是为筛选抗性品种及对油菜花叶病毒致病机制的研究提供一种新选择。
本发明的技术方案是一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体，该载体来自于菌株Agrobacterium tumefaciens YoMV-GD，保藏号为GDMCC No.62229。
进一步的，所述载体上的表达元件中油菜花叶病毒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
本发明还提供了所述载体在筛选抗油菜花叶病毒的植物中的用途。
进一步的，所述的植物为烟草、油菜、白菜、菜心或萝卜。
本发明还提供了所载体的构建方法，包括如下步骤，以SEQ ID No.7所示核苷酸为模板，设计两对引物扩增出SEQ ID No.7所示核苷酸的前半段和后半段，然后通过同源重组技术，将扩增的前半段和后半段通过同源重组的方法直接连接到pCB301载体上。
进一步的，所述前半段的引物如SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4所示。
具体的，所述后半段的引物如SEQ ID No.5 和SEQ ID No.6所示。
本发明的有益效果：本发明从野外采集到一株新的病毒株系，并将其全长核苷酸序列构建到pCB301载体上，获得油菜花叶病毒侵染性克隆载体，将该载体转化农杆菌，即可利用农杆菌注射方法来接种油菜花叶病毒，为筛选油菜花叶病毒抗性材料和品种以及研究油菜花叶病毒基因组结构、致病性以及与寄主之间的互作奠定了基础。
附图说明
图1、田间采集到的疑似染病样本。
图2、三个疑似样本的PCR产物的电泳结果；M，DNA marker；1～3泳道代表从田间采集的三个不同样品的扩增结果；CK，无症状植株对照。
图3、全序列克隆过程的PCR产物的电泳结果；M，DNA marker；1～3泳道代表前半段序列PCR扩增结果；4～6代表后半段序列扩增结果。
图4、YoMV-GD株系侵染性克隆载体示意图；oriV，复制起始位点；LB T-DNArepeat，农杆菌插入左臂；RB T-DNA repeat，农杆菌插入右臂；NOS terminator，NOS终止子；KanR，卡那霉素抗性基因；trfA，复制激活作用元件；CaMV 35S promoter，来源于CaMV的35S启动子。
图5、农杆菌感染烟草后的图片；Mock，接种包含空载体的农杆菌对照植株；YoMV，接种YoMV-GD的植株。
图6 、农杆菌注射接种萝卜和菜心发病图片。
A：萝卜发病图片。Mock，接种包含空载体的农杆菌对照植株。LB-1，接种YoMV-GD的萝卜品种1。LB-2，YoMV-GD的萝卜品种2。LB-3，YoMV-GD的萝卜品种3。
B：菜心发病图片。Mock，接种包含空载体的农杆菌对照植株。CX-1，YoMV-GD的菜心品种1。CX-2，YoMV-GD的菜心品种2。
C：RT-PCR检测图；M，DNA marker；1泳道代表接种包含空载体的农杆菌对照萝卜样品；2泳道代表阴性对照；3～5泳道代表接种YoMV-GD的萝卜品种1、萝卜品种2和萝卜品种3：6泳道代表接种包含空载体的农杆菌对照菜心样品；7泳道代表阴性对照；8和9泳道代表接种YoMV-GD的菜心品种1和菜心品种2。
具体实施方式
实施例1 病毒的克隆以及载体的构建
从田间采集疑似感染YoMV的三个萝卜病样，症状为黄化、花叶、植株矮小等症状(图1)。
提取总RNA，根据已知病毒序列的保守区域设计引物：F:aatatcagagagcggcattctat（SEQ ID No.1），R:ctgtcggtaaaagtgcaatataact（SEQ IDNo.2），RT-PCR检测，结果发现样品3可以检测到目的条带 (图2)，样品1、2和无症状CK对照则未扩出条带 (图2)，说明样品3感染了YoMV。
以样品3的cDNA为模板，将YoMV全长分为两段，设计引物扩增YoMV全长序列。前半段引物：F1:aagttcatttcatttggagagggttttatttttattgcaacaacaacaa（SEQ ID No.3），R1:tgaacactgtgtcgatctgtaattgctattgggtccccga（SEQ ID No.4）；后半段引物：F2:aacagcgactcccttggagatcatatcaagagcgtcacctcatg（SEQ ID No.5），R2: ggtggagatgccatgccgacccttgggcccctacccggggtta（SEQ ID No.6）。PCR结果显示可以扩出目的条带，前半段3400 bp左右，后半段3100 bp左右 (图3)。将前后半段的PCR产物通过同源重组的方法直接连接到pCB301载体 (姚敏等，农杆菌介导的 CMV 侵染性克隆及 2b 缺失突变体构建，中国农业科学，2011) 上，获得YoMV侵染性克隆并测序得到YoMV全长序列，通过NCBI Blast及DNAMAN软件比对发现获得的YoMV序列与数据库中的YoMV序列均不一致，所以判定从田间采集的毒株为获得的是新的YoMV株系。
SEQ ID No.7 YoMV全长序列：
gttttatttttattgcaacaacaacaacaaattacaataacaacaaaacaaatacaaacaacaacaacatggcacaatttcaacaaacagtaaacatgcaaacattgcaggctgccgcagggcgcaacagcctggtgaatgatttagcctcacgtcgtgtttatgacaatgctgtcgaggagctaaatgcacgctcgagacgccctaaggtccatttctccaaatcagtgtctacggaacagacgctgttagcttcaaacgcttatccggagtttgagatttcctttactcatacccaacatgccgtgcactcccttgcgggcggcctaaggactcttgagttggagtatctcatgatgcaagttccgttcggttctctaacgtacgacatcggtggtaactttgcagcgcaccttttcaaaggacgcgattacgttcactgctgtatgccaaacttggatgtacgcgatatagctcgtcatgaagggcacaaggaagcgatcttcagttacctttctcgcctagataggcagaagcgaccagtccccgaatatcagagagcggcattctataactacgcggagaatcctcatttcgttcactgtgaccgaccatttcagcagtgtgagctaagcaccgttaacggtgcggacacttacgctattgcacttcatagtatatatgatattcctgctgatgagtttggtgcagcgctactcaggaagaatgtgaaaatttgttacgcggctttccatttccacgaaaatatgctccttgactgcgactctgtcacactggaggacattggagccgcatttcaacgcgccggtgacaagttgaatttcttcttccacaacgagagcacactcaattacacccatagttttagtaatataattaagtatgtgtgtaagaccttctttcctgcgagtcagcgttatgtgtatcataaggagtttttagttactagagttaatacgtggtattgtaagtttactagagtcgatacttttactcttttccgtggtgtgtacagaacaagtgtggatagcgaggagttctacaaggctatggatgacgcgtgggaatacaagaagaccttggctatgctaaattccgagaggaccatcttcaaggacagtgctgccatgaatttctggtttccaaaggtcagagatatggtcatcatacctctctttgacgcatctatcacaactggaaggatgtctagaagggaagtgttggtgaacaaggattttgtttacacagtccttaaccacataaaaacctatcaagcaaaggccttaacatatgctaatgtgttatctttcgttgagtctattaggtctagagttatacttaacggtgtcactgccaggtcggaatgggataccgacaaggcaatcttaggtccgttagccatgacatttttccttgtcacaaagttgagtcatgttcaggacgagatcgtccttaagaagttccaaaagtttgacgccactgccaaagaactgatttggtcaagtctctgcgatgccctgaagggggttataccctcggtcaaggagactctcgcgcgcggtggtttcgttaagcttgctgaagagagtttagagatcaaaattccggagttatattgcacttttaccgacaggttagtgcttgaatataagaggacagaggagtttcagtcgtgtgatctgtccaaacctttggaagagtctgagaagtactataatgcgttatccgagctgtctgtgcttgaaaatcttgactcgtttgatctggatgcctttaaggagttgtgtcaaaagaagaacgtcgaccctgatgtcgctgcgaaggtggtggtggcgattatgaatagtgaattgacgttgccgttcaagaaacctacagaagaggaagttgctgaggcgcttagcggagaagtggtgcaggatgaaggattgagtctgagtaacaacgcacccttcccatgtgtgagtaacctcaaggagggtttggttccggcgtgtggattgggtccgaaaggtgcgaacttcgacagagtggatatggacatatctgagttccatctcaagagtgtagatgcagttaaaaaaggggctatgatgtcagcggtgtacacgggaaagatcaaggttcaacagatgaagaactacgtcgattacctaagtgcctcattgtcagctacggtctcaaacctctgtaaagtgcttagggatgttcacggagttgaccctgaatctcaagagaagtcgggtgtgtgggacgtgagaagaggacgctggttactaaaacctaacgcgaagtgtcacgcttggggtgttgcggaagatgctaaccacaagttagttatcgtgttacttaactgggatgaagggaaacctgtctgtgatgagacgtggtttagattggcagtttctagcgactcattggtgtactctgatatgggtaaactcaagacgttaacggcatgttgcagagatggtgagcctccggagcctacggccaaagtggtactcgttgacggtgttccgggctgcggaaaaacaaaggaaatcttggagaaggttaacttttccgaagacttggtgttggttcctggaaaagaagcatcgaaaatgattattcgaagagcaaatcaggcaggtgttacgagagctgataaggacaatgtgaggacggtagattccttcttgatgcaccctccaaaaagggtgttcaaaaggttgtttatcgatgaaggtttaatgttgcacacaggctgtgttaactttttgacgttgctatctcattgtgatgtggcatacgtttacggtgacacacagcagattccctttatctgtagggttgcgaattttccttatccctcgcatttcgcgaagcttgttgttgacgagaaggaagatagaagggtcacgctcaggtgtccggcagacgttacatatttcttgaatacgaggtacgatggatcagtgatgtgtacaagctctgtggagaggtcggttagtgcggaggttgtgagaggaaaaggtgctttaaacccaataactttaccgttagaggggaaaattctcaccttcacgcaagccgataagttcgagttgttggataagggttacaaagatgtgaacacggttcatgaagttcagggcgaaacgtacgaaaagacagcgatcgttcggttaacagcgactcccttggagatcatatcaagagcgtcacctcatgttttggtggcgttgacaaggcacactactcgatgtaaatattacacggttgtgttggacccaatggtgaatgtgatttctgaactggggaaactgtccaactttcttctcgagatgtacaaggtggagtcggggacccaatagcaattacagatcgacacagtgttcaaagggacgaatctgttcgtcccgacgcctaagtcaggagattggcgagacatgcagttctattatgacactcttcttcccggaaacagtactattcttaatgagtttgatgctgtgacgatgaacttgagggatatttccttaaatgtcaaggactgtaggatcgacttctcgaaatctgtgcaagtgccgaaagagcggccggttttcatgaaacctaaattgaggacggcggcagagatgccacgtactgctggtctacttgaaaacctcgtcgcgatgattaaaagaaacatgaacgcaccagatttgacagggacgattgatatagaggacactgcgtcgttagtagttgaaaagttttgggatgcttatgtggtgaaagaattcagcggaacggacggaatggctatgacaagggaaagtttttctagatggctctctaaacaagagtcgtctacagttggtcagttagcggatttcaactttgtggatttgccggcggtggacgagtacaagcatatgatcaagagccaacccaagcagaagttagacttgagcattcaagacgaataccctgcattgcagactatagtctatcattcaaagaagatcaatgcgatttttggtcctatgttttcagagttgacgaggatgctccttgaaagaatagatacttccaagtttctgttttacaccaggaagacaccaacgcagattgaagagtttttctctgatttagattcgtcacaagcgatggagattttggagctcgacatttcaaagtatgacaagtcacaaaacgagttccattgcgctgttgagtacaaaatatgggaaaagcttggaattgacgagtggttagcggaggtgtggagacaaggacacaggaaaacgacgctcaaggactacactgctggcattaagacgtgtttgtggtaccaaaggaaaagcggtgacgtgactacctttattgggaacacaattatcattgcagcgtgtttgagttctatgatcccgatggacaaagtgatcaaggcggctttctgcggtgacgacagtttgatatatattccgaaaggtctagacctaccggatattcaagccggagccaaccttacgtggaactttgaggccaaattgttcaggaaaaagtacgggtatttttgcggtcgttacgttattcaccacgatagaggagctattgtatattatgatccgcttaagttgatatctaaattaggatgtaaacatattagagatgaagttcacttagaagagttgcgtagatctctgtgtgatgtaactagtaatttaaataattgtgcgtatttttcacagttagatgaggccgttgccgaggttcataagaccgcggttggcggagcgtttgtttactgtagtataattaaatatttgtcagataaaaggttgtttaaagatttgttttttgtttgactgagtcgataatgtcttacgagcctaaagttagtgacttccttgctcttacgaaaaaggaggaaattttacccaaggctttgacgagattaaagactgtctctattagtactaaggatgttatatctgttaaggagtctgagtccctgtgtgatattgatttgttagtgaatgtgccattagataagtataggtatgtgggtgttttgggtgttgttttcaccggtgaatggctggtaccggatttcgttaaaggtggggtaacagtgagcgtgattgacaaacggcttgaaaattccagagagtgcataattggtacgtaccgagctgctgcgaaggacagaaggttccagttcaagctggttccaaattacttcggatccactgcggatgccaagcgaaaaccgtggcaggttcatgtgcgaattcaaaatctgaagatcgaagctggatggcaacctctagctctagaggtggtttctgttgccatggttactaataacgtggttgttaaaggtttgagggaaaaggtcatcgcagtgaatgatccgaacgtcgaaggtttcgaaggtgtggttgacgatttcgtcgattcggttgctgcattcaaggcgattgacagtttcagaaagaaaaagaaaaagattggaggaagggatgtgaataataataagtatagatatagaccggagagatacgccggtcctgattcgttacaatataaagaagaaaatggtttacaacatcacgagctcgaatcagtaccagtatttcgcagcgatgtgggcagagcccacagcgatgcttaaccagtgcgtgtctgcgttgtcgcaatcgtatcaaactcaggcggcaagagatactgttagacagcagttctctaaccttctgagtgcgattgtgacaccgaaccagcggtttccagaaacaggataccgggtgtatattaattcagcagttctaaaaccgttgtacgagtctctcatgaagtcctttgatactagaaataggatcattgaaactgaagaagagtcgcgtccatcggcttccgaagtagctaatgcaacacaacgtgttgatgatgcgaccgtggccatcaggagtcaaattcagcttttgctgaacgagctctccaacggacatggtctgatgaacagggcagagttcgaggttttattaccttgggctactgcgccagctacataggcgtggtgcacacgatagtgcatagtgtttttctctccacttaaatcgaagagatatacttacggtgtaattccgcaagggtggcgtaaaccaaattacgcaatgttttaggttccatttaaatcgaaacctgttatttcttggatcacctgttaacgtacgcgtggcgtatattacagtgggaataactaaaagtgagaggttcgaatcctccctaaccccgggtaggggcccaa
实施例2 YoMV侵染性克隆转化农杆菌并进行侵染烟草
取0.5 μg YoMV全序列的侵染性克隆质粒转化GV3101农杆菌，待农杆菌转化子长出后，挑取单菌落进行菌落PCR，挑取阳性克隆摇菌保藏；命名为YoMV-GD（Agrobacteriumtumefaciens），并进行了保藏。保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，邮编510070；保藏日期2022年1月20日，保藏号为GDMCC No.62229。
活化保藏的包含YoMV-GD侵染性克隆载体 (图4) 的农杆菌，28℃培养14～16h，收集菌，用农杆菌悬浮缓冲液悬浮，28℃静置2～4h。用分光光度计测OD600，然后用农杆菌悬浮缓冲液调OD600至1.0，注射5～6叶期本生烟和普通烟以及3-4叶期白萝卜和菜心。
结果显示，注射第五天，本生烟即可出现坏死、花叶等症状，后期整株坏死；第7天普通烟也出现坏死、花叶症状 (图5)；萝卜接种后20天，接种YoMV-GD植株明显矮小，长势弱，叶片黄化（图6A）；菜心接种YoMV-GD后植株也整体偏矮小，叶片有轻微花叶及皱缩（图6B）。RT-PCR结果显示接种YoMV-GD的萝卜和菜心植株都可以检测到YoMV（图6C）。这些结果说明所构建YoMV-GD侵染性克隆具有较强侵染性，可以用于抗病材料品种筛选、及YoMV病毒基因组结构、致病机制解析等研究。
序列表
<110> 广东省农业科学院植物保护研究所
<120> 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatatcagag agcggcattc tat 23
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtcggtaa aagtgcaata taact 25
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagttcattt catttggaga gggttttatt tttattgcaa caacaacaa 49
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgaacactgt gtcgatctgt aattgctatt gggtccccga 40
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aacagcgact cccttggaga tcatatcaag agcgtcacct catg 44
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggagatg ccatgccgac ccttgggccc ctacccgggg tta 43
<210> 7
<211> 6304
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gttttatttt tattgcaaca acaacaacaa attacaataa caacaaaaca aatacaaaca 60
acaacaacat ggcacaattt caacaaacag taaacatgca aacattgcag gctgccgcag 120
ggcgcaacag cctggtgaat gatttagcct cacgtcgtgt ttatgacaat gctgtcgagg 180
agctaaatgc acgctcgaga cgccctaagg tccatttctc caaatcagtg tctacggaac 240
agacgctgtt agcttcaaac gcttatccgg agtttgagat ttcctttact catacccaac 300
atgccgtgca ctcccttgcg ggcggcctaa ggactcttga gttggagtat ctcatgatgc 360
aagttccgtt cggttctcta acgtacgaca tcggtggtaa ctttgcagcg caccttttca 420
aaggacgcga ttacgttcac tgctgtatgc caaacttgga tgtacgcgat atagctcgtc 480
atgaagggca caaggaagcg atcttcagtt acctttctcg cctagatagg cagaagcgac 540
cagtccccga atatcagaga gcggcattct ataactacgc ggagaatcct catttcgttc 600
actgtgaccg accatttcag cagtgtgagc taagcaccgt taacggtgcg gacacttacg 660
ctattgcact tcatagtata tatgatattc ctgctgatga gtttggtgca gcgctactca 720
ggaagaatgt gaaaatttgt tacgcggctt tccatttcca cgaaaatatg ctccttgact 780
gcgactctgt cacactggag gacattggag ccgcatttca acgcgccggt gacaagttga 840
atttcttctt ccacaacgag agcacactca attacaccca tagttttagt aatataatta 900
agtatgtgtg taagaccttc tttcctgcga gtcagcgtta tgtgtatcat aaggagtttt 960
tagttactag agttaatacg tggtattgta agtttactag agtcgatact tttactcttt 1020
tccgtggtgt gtacagaaca agtgtggata gcgaggagtt ctacaaggct atggatgacg 1080
cgtgggaata caagaagacc ttggctatgc taaattccga gaggaccatc ttcaaggaca 1140
gtgctgccat gaatttctgg tttccaaagg tcagagatat ggtcatcata cctctctttg 1200
acgcatctat cacaactgga aggatgtcta gaagggaagt gttggtgaac aaggattttg 1260
tttacacagt ccttaaccac ataaaaacct atcaagcaaa ggccttaaca tatgctaatg 1320
tgttatcttt cgttgagtct attaggtcta gagttatact taacggtgtc actgccaggt 1380
cggaatggga taccgacaag gcaatcttag gtccgttagc catgacattt ttccttgtca 1440
caaagttgag tcatgttcag gacgagatcg tccttaagaa gttccaaaag tttgacgcca 1500
ctgccaaaga actgatttgg tcaagtctct gcgatgccct gaagggggtt ataccctcgg 1560
tcaaggagac tctcgcgcgc ggtggtttcg ttaagcttgc tgaagagagt ttagagatca 1620
aaattccgga gttatattgc acttttaccg acaggttagt gcttgaatat aagaggacag 1680
aggagtttca gtcgtgtgat ctgtccaaac ctttggaaga gtctgagaag tactataatg 1740
cgttatccga gctgtctgtg cttgaaaatc ttgactcgtt tgatctggat gcctttaagg 1800
agttgtgtca aaagaagaac gtcgaccctg atgtcgctgc gaaggtggtg gtggcgatta 1860
tgaatagtga attgacgttg ccgttcaaga aacctacaga agaggaagtt gctgaggcgc 1920
ttagcggaga agtggtgcag gatgaaggat tgagtctgag taacaacgca cccttcccat 1980
gtgtgagtaa cctcaaggag ggtttggttc cggcgtgtgg attgggtccg aaaggtgcga 2040
acttcgacag agtggatatg gacatatctg agttccatct caagagtgta gatgcagtta 2100
aaaaaggggc tatgatgtca gcggtgtaca cgggaaagat caaggttcaa cagatgaaga 2160
actacgtcga ttacctaagt gcctcattgt cagctacggt ctcaaacctc tgtaaagtgc 2220
ttagggatgt tcacggagtt gaccctgaat ctcaagagaa gtcgggtgtg tgggacgtga 2280
gaagaggacg ctggttacta aaacctaacg cgaagtgtca cgcttggggt gttgcggaag 2340
atgctaacca caagttagtt atcgtgttac ttaactggga tgaagggaaa cctgtctgtg 2400
atgagacgtg gtttagattg gcagtttcta gcgactcatt ggtgtactct gatatgggta 2460
aactcaagac gttaacggca tgttgcagag atggtgagcc tccggagcct acggccaaag 2520
tggtactcgt tgacggtgtt ccgggctgcg gaaaaacaaa ggaaatcttg gagaaggtta 2580
acttttccga agacttggtg ttggttcctg gaaaagaagc atcgaaaatg attattcgaa 2640
gagcaaatca ggcaggtgtt acgagagctg ataaggacaa tgtgaggacg gtagattcct 2700
tcttgatgca ccctccaaaa agggtgttca aaaggttgtt tatcgatgaa ggtttaatgt 2760
tgcacacagg ctgtgttaac tttttgacgt tgctatctca ttgtgatgtg gcatacgttt 2820
acggtgacac acagcagatt ccctttatct gtagggttgc gaattttcct tatccctcgc 2880
atttcgcgaa gcttgttgtt gacgagaagg aagatagaag ggtcacgctc aggtgtccgg 2940
cagacgttac atatttcttg aatacgaggt acgatggatc agtgatgtgt acaagctctg 3000
tggagaggtc ggttagtgcg gaggttgtga gaggaaaagg tgctttaaac ccaataactt 3060
taccgttaga ggggaaaatt ctcaccttca cgcaagccga taagttcgag ttgttggata 3120
agggttacaa agatgtgaac acggttcatg aagttcaggg cgaaacgtac gaaaagacag 3180
cgatcgttcg gttaacagcg actcccttgg agatcatatc aagagcgtca cctcatgttt 3240
tggtggcgtt gacaaggcac actactcgat gtaaatatta cacggttgtg ttggacccaa 3300
tggtgaatgt gatttctgaa ctggggaaac tgtccaactt tcttctcgag atgtacaagg 3360
tggagtcggg gacccaatag caattacaga tcgacacagt gttcaaaggg acgaatctgt 3420
tcgtcccgac gcctaagtca ggagattggc gagacatgca gttctattat gacactcttc 3480
ttcccggaaa cagtactatt cttaatgagt ttgatgctgt gacgatgaac ttgagggata 3540
tttccttaaa tgtcaaggac tgtaggatcg acttctcgaa atctgtgcaa gtgccgaaag 3600
agcggccggt tttcatgaaa cctaaattga ggacggcggc agagatgcca cgtactgctg 3660
gtctacttga aaacctcgtc gcgatgatta aaagaaacat gaacgcacca gatttgacag 3720
ggacgattga tatagaggac actgcgtcgt tagtagttga aaagttttgg gatgcttatg 3780
tggtgaaaga attcagcgga acggacggaa tggctatgac aagggaaagt ttttctagat 3840
ggctctctaa acaagagtcg tctacagttg gtcagttagc ggatttcaac tttgtggatt 3900
tgccggcggt ggacgagtac aagcatatga tcaagagcca acccaagcag aagttagact 3960
tgagcattca agacgaatac cctgcattgc agactatagt ctatcattca aagaagatca 4020
atgcgatttt tggtcctatg ttttcagagt tgacgaggat gctccttgaa agaatagata 4080
cttccaagtt tctgttttac accaggaaga caccaacgca gattgaagag tttttctctg 4140
atttagattc gtcacaagcg atggagattt tggagctcga catttcaaag tatgacaagt 4200
cacaaaacga gttccattgc gctgttgagt acaaaatatg ggaaaagctt ggaattgacg 4260
agtggttagc ggaggtgtgg agacaaggac acaggaaaac gacgctcaag gactacactg 4320
ctggcattaa gacgtgtttg tggtaccaaa ggaaaagcgg tgacgtgact acctttattg 4380
ggaacacaat tatcattgca gcgtgtttga gttctatgat cccgatggac aaagtgatca 4440
aggcggcttt ctgcggtgac gacagtttga tatatattcc gaaaggtcta gacctaccgg 4500
atattcaagc cggagccaac cttacgtgga actttgaggc caaattgttc aggaaaaagt 4560
acgggtattt ttgcggtcgt tacgttattc accacgatag aggagctatt gtatattatg 4620
atccgcttaa gttgatatct aaattaggat gtaaacatat tagagatgaa gttcacttag 4680
aagagttgcg tagatctctg tgtgatgtaa ctagtaattt aaataattgt gcgtattttt 4740
cacagttaga tgaggccgtt gccgaggttc ataagaccgc ggttggcgga gcgtttgttt 4800
actgtagtat aattaaatat ttgtcagata aaaggttgtt taaagatttg ttttttgttt 4860
gactgagtcg ataatgtctt acgagcctaa agttagtgac ttccttgctc ttacgaaaaa 4920
ggaggaaatt ttacccaagg ctttgacgag attaaagact gtctctatta gtactaagga 4980
tgttatatct gttaaggagt ctgagtccct gtgtgatatt gatttgttag tgaatgtgcc 5040
attagataag tataggtatg tgggtgtttt gggtgttgtt ttcaccggtg aatggctggt 5100
accggatttc gttaaaggtg gggtaacagt gagcgtgatt gacaaacggc ttgaaaattc 5160
cagagagtgc ataattggta cgtaccgagc tgctgcgaag gacagaaggt tccagttcaa 5220
gctggttcca aattacttcg gatccactgc ggatgccaag cgaaaaccgt ggcaggttca 5280
tgtgcgaatt caaaatctga agatcgaagc tggatggcaa cctctagctc tagaggtggt 5340
ttctgttgcc atggttacta ataacgtggt tgttaaaggt ttgagggaaa aggtcatcgc 5400
agtgaatgat ccgaacgtcg aaggtttcga aggtgtggtt gacgatttcg tcgattcggt 5460
tgctgcattc aaggcgattg acagtttcag aaagaaaaag aaaaagattg gaggaaggga 5520
tgtgaataat aataagtata gatatagacc ggagagatac gccggtcctg attcgttaca 5580
atataaagaa gaaaatggtt tacaacatca cgagctcgaa tcagtaccag tatttcgcag 5640
cgatgtgggc agagcccaca gcgatgctta accagtgcgt gtctgcgttg tcgcaatcgt 5700
atcaaactca ggcggcaaga gatactgtta gacagcagtt ctctaacctt ctgagtgcga 5760
ttgtgacacc gaaccagcgg tttccagaaa caggataccg ggtgtatatt aattcagcag 5820
ttctaaaacc gttgtacgag tctctcatga agtcctttga tactagaaat aggatcattg 5880
aaactgaaga agagtcgcgt ccatcggctt ccgaagtagc taatgcaaca caacgtgttg 5940
atgatgcgac cgtggccatc aggagtcaaa ttcagctttt gctgaacgag ctctccaacg 6000
gacatggtct gatgaacagg gcagagttcg aggttttatt accttgggct actgcgccag 6060
ctacataggc gtggtgcaca cgatagtgca tagtgttttt ctctccactt aaatcgaaga 6120
gatatactta cggtgtaatt ccgcaagggt ggcgtaaacc aaattacgca atgttttagg 6180
ttccatttaa atcgaaacct gttatttctt ggatcacctg ttaacgtacg cgtggcgtat 6240
attacagtgg gaataactaa aagtgagagg ttcgaatcct ccctaacccc gggtaggggc 6300
ccaa 6304

Claims (6)

1.一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体，其特征在于，该载体来自于菌株AgrobacteriumtumefaciensYoMV-GD，保藏号为GDMCC No：62229；所述载体上的表达元件中油菜花叶病毒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
2.权利要求1所述载体在筛选抗油菜花叶病毒的植物中的用途。
3.如权利要求2所述用途，其特征在于，所述的植物为烟草、油菜、白菜、菜心或萝卜。
4.如权利要求1所述载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQ ID No.7所示核苷酸为模板，设计两对引物扩增出SEQ ID No.7所示核苷酸的前半段和后半段，然后通过同源重组技术，将扩增的前半段和后半段通过同源重组的方法直接连接到pCB301载体上。
5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述前半段的引物如SEQ ID No.3 和SEQ IDNo.4所示。
6.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述后半段的引物如SEQ ID No.5 和SEQ IDNo.6所示。
CN202210254603.9A 2022-03-16 2022-03-16 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用 Active CN114369617B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210254603.9A CN114369617B (zh) 2022-03-16 2022-03-16 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210254603.9A CN114369617B (zh) 2022-03-16 2022-03-16 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114369617A CN114369617A (zh) 2022-04-19
CN114369617B true CN114369617B (zh) 2022-06-28

Family

ID=81146273

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210254603.9A Active CN114369617B (zh) 2022-03-16 2022-03-16 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114369617B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063397A2 (en) * 1999-04-20 2000-10-26 Aventis Cropscience N.V. Methods for delivering inhibitory rna to plants and applications thereof
CN106566842A (zh) * 2016-07-18 2017-04-19 湖南农业大学 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2647715A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-09 Nomad Bioscience GmbH Agrobacterium for transient transfection of whole plants
CN105219800A (zh) * 2015-08-03 2016-01-06 浙江省农业科学院 辣椒轻斑驳病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用
CN107058611B (zh) * 2016-12-19 2020-02-04 云南农业大学 一种烟草花叶病毒属病毒通用检测引物及其方法
CN110144364B (zh) * 2018-05-30 2023-05-12 宁波大学 辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063397A2 (en) * 1999-04-20 2000-10-26 Aventis Cropscience N.V. Methods for delivering inhibitory rna to plants and applications thereof
CN106566842A (zh) * 2016-07-18 2017-04-19 湖南农业大学 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank: AY318866.1，"Youcai mosaic virus, complete genome";Ryabov,E.V. 等;《GenBank》;20120403;FEATURES、ORIGIN部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114369617A (zh) 2022-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yin et al. Engineer complete resistance to Cotton Leaf Curl Multan virus by the CRISPR/Cas9 system in Nicotiana benthamiana
CN111424022B (zh) 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
CN110028566B (zh) GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用
CN110055273B (zh) GhMAH1蛋白及其编码基因在调控棉花纤维长度中的应用
CN115820685B (zh) 一种柑橘CsGSTF1基因及其应用
CN114752599B (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS3基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
CN113234729B (zh) 可显著提高棉花黄萎病抗性的基因GauRev2及其应用
CN102712929A (zh) 植物根特异表达启动子的鉴定和应用
CN116694652B (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用
CN116622739B (zh) 番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN114369617B (zh) 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
CN110592100B (zh) 一种木薯camta基因及其抑制表达载体的构建和抗病应用
CN109837297B (zh) 与黄萎病抗性相关的GhAGD13基因及其应用
CN114107327B (zh) 绿色木霉高温胁迫响应关键酶基因TvHSP70、重组表达载体、工程菌及其应用
CN113881700B (zh) 拟南芥AtSR33基因在抑制芜菁花叶病毒侵染中的应用
CN114150003B (zh) 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用
CN115772212A (zh) 紫花苜蓿叶绿体MsSAP22基因及在提高植物抗旱性中的应用
CN113403335A (zh) 桑花叶型矮缩相关病毒MMDaV侵染性克隆载体及其构建方法和应用
CN113603757A (zh) 一种岷江百合Dirigent类似蛋白基因LrDIR1及应用
CN114317595B (zh) 油菜花叶病毒侵染性克隆表达载体及其构建方法
CN116926088B (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS6基因抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
CN117126880B (zh) 本氏烟NbKTI1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN114317460B (zh) 瓜蒌斑驳花叶病毒及其侵染性克隆载体、构建方法和应用
CN114107371B (zh) 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因介导转基因烟草方法
CN114854757B (zh) 响应青枯菌侵染的马铃薯维管束特异表达启动子PStmlp1及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant