CN114150003B

CN114150003B - 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用

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Publication number: CN114150003B
Application number: CN202111482440.1A
Authority: CN
Inventors: 刘丽锋; 周建华; 周厚成; 古勤生; 刘莉铭
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-12-06
Also published as: CN114150003A; CN116837004A

Abstract

本发明公开黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用。针对现有技术未公开对CGMMV基因间隔区域的注释，也没有构思过从间隔区域筛选目的片段用于抗性烟草培育，本发明提供CGMMV基因间隔区域在介导抗性烟草培育中的应用。本发明筛选出三条CGMMV基因间隔区域片段IR1、IR2、IR3，同时构建嵌合结构IMC，均能成功用于植物干涉载体实现抗性烟草培育。本发明还提供利用这些目的片段介导转基因抗性烟草的完整技术方案。

Description

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗性育种，特别是涉及一种由黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV基因介导的抗性烟草培育技术，属于基因工程、遗传育种领域。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)属于烟草花叶病毒属(Tobamovirus spp.)。CGMMV能够以西瓜、甜瓜、南瓜、瓠瓜等较多种葫芦科(Cucurbitaceae)植物作为其自然寄主，且是葫芦科植物最主要病毒之一。由于葫芦科是世界范围内仅次于禾本科、豆科与茄科的重要食用植物科，因而黄瓜绿斑驳花叶病毒容易引发田间连续大面积感染与农业生产的规模性损失，已被世界许多国家与地区都列入检疫对象。CGMMV也可侵染苋色藜(Chenopodium Amaranticolor)、曼陀罗(Datura stramonium)、菟丝子(Cuscuta chinensis)、本氏烟(Nicotiana benthamiana)、珊西烟(Nicotianatabacum var Xanthi nc)等。本氏烟是黄瓜绿斑驳花叶病毒的试验寄主，以本氏烟作为研究对象，通过转基因的手段可以更快的解析该病毒的侵染机制。构建本氏烟草抗性材料在CGMMV研究中意义突出。

CGMMV是正义单链RNA病毒，基因组全长6423nt(图1)，5′端有60nt的非编码区，3′端有175nt的非编码区，中间部分有三个编码区。第一个编码区是与病毒复制相关的129KDa和186KDa蛋白，统称为复制相关蛋白。这两个蛋白具有共同的N端。129KDa复制相关蛋白包含甲基转移酶(Vmethyltransforase)与RNA解旋酶(RNA Helicase)结构域以及两者之间的间隔区域(Internal Region，IR)。186KDa复制相关蛋白通读区域对应依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)结构域。第二编码区是运动蛋白MP(MovementProtein)主要介导病毒细胞间运动。第三编码区是外壳蛋白CP(Coat Protein)主要介导病毒长距离运动。

利用病毒基因介导获得转基因植株抗性材料是植物抗性育种重要手段。在CGMMV的该类现有技术中，用以介导植物抗性的病毒基因目标片段均来自于运动蛋白MP与外壳蛋白CP。分别是：将CGMMV的外壳蛋白CP基因构建到植物表达载体，通过农杆菌转化西瓜砧木“gongdae”，获得具有抗性的转基因砧木材料(Transgenic watermelon rootstockresistant to CGMMV(cucumber green mottle mosaic virus)infection.Plant CellRep(2005)24:350-356)；采用限制性酶切连接的方法将CGMMV的外壳蛋白CP基因构建到载体中，RNA沉默转基因烟草具有抗性(Transgenic Nicotiana benthamiana plantsresistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing.PlantCell Rep(2007)26:1283-1288)；将CGMMV的运动蛋白MP基因正向重复构建到植物表达载体，通过农杆菌转化甜瓜，获得了具有抗性的转基因甜瓜(Molecular analysis oftransgenic melon plants showing virus resistance conferred by direct repeatof movement gene of Cucumber green mottle mosaic virus.Plant Cell Rep(2012)31:1371-1377)。

从已知的CGMMV基因组看，第一编码区相较于第二编码区运动蛋白MP与第三编码区外壳蛋白CP序列更长，能够为筛选具备介导植株抗性功能的目的基因片段提供更丰富的资源库。同时，在第一编码区中，位于含甲基转移酶与RNA解旋酶结构域两者之间的间隔区域(IR)尚未被现有研究注释功能，若能从中有效地筛选出能够介导植株抗性的目的基因片段，则能扩展现有研究对间隔区域功能的认识，表明其并非单纯间隔甲基转移酶与RNA解旋酶，可能有比较重要的功能。

发明内容

本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供CGMMV基因间隔区域基因在抗性烟草培育中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供三个CGMMV基因间隔区域的碱基片段，技术方案如下：

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域片段IR1，其特征在于：是CGMMV基因间隔区域5′端345bp区段，序列如SEQ ID NO.1所示。

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域片段IR2，其特征在于：是CGMMV基因间隔区域中端368bp区段，序列如SEQ ID NO.2所示。

黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域片段IR3，其特征在于：是CGMMV基因间隔区域3′端366bp区段，序列如SEQ ID NO.3所示。

上述三个碱基片段均位于CGMMV基因间隔区域(IR)(如SEQ ID NO.4所示)，经试验证明能够应用于烟草(Nicotiana tabacum L)对CGMMV病毒的抗性基因工程，能够分别介导转基因烟草抗性。因而，本发明同时提供如下技术方案：

包含上述CGMMV基因间隔区域片段IR1或片段IR2或片段IR3的载体。

上述载体包括重组质粒、植物干涉表达载体等。

上述CGMMV基因间隔区域碱基片段IR1、片段IR2、片段IR3在CGMMV基因介导烟草抗性中的应用。

本发明除发现利用独立的CGMMV基因间隔区域能够构建植物干涉表达载体介导抗性烟草以外，还发现利用CGMMV基因间隔区域与CGMMV与CGMMV非间隔区域片段组成嵌合结构所构建的植物干涉表达载体也能介导抗性烟草。其技术方案如下：

嵌合结构片段IMC，其特征在于：由CGMMV基因间隔区域碱基片段IR4(序列如SEQID NO.5所示)、MP基因片段MP1(序列如SEQ ID NO.6所示)、CP基因片段CP1(序列如SEQ IDNO.7所示)构成。

上述嵌合结构IMC是由CGMMV基因间隔区域碱基片段IR4(间隔区域193bp，如SEQID NO.5所示)、MP基因片段MP1(MP 142bp，如SEQ ID NO.6所示)、CP基因片段CP1(CP128bp，如SEQ ID NO.7所示)连接组成，序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明试验证明，嵌合结构片段IMC能够介导转基因烟草抗性。因而，本发明同时提供如下技术方案：

包含上述嵌合结构片段IMC的载体。

上述载体包括重组质粒、植物干涉表达载体等。

上述嵌合结构片段IMC在CGMMV基因介导烟草抗性中的应用。

本发明基于试验数据，提供利用黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组间隔区域片段构建重组质粒培育抗性烟草的技术方案，具体如下：

利用黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组间隔区域片段培育抗性烟草的方法，其特征在于：依如下步骤实施：

首先，根据CGMMV目的片段设计PCR扩增引物对，经PCR扩增后回收纯化得到各PCR产物；

其次，将各PCR产物与干涉载体pHellsgate2进行重组反应，重组产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，筛选序列正确的阳性重组质粒；

再次，各阳性重组质粒转化农杆菌筛选含阳性ihpRNAi的农杆菌；

最后，用含阳性ihpRNAi的农杆菌转化烟草。

综合上述各方案，本发明提供如下技术方案：

黄瓜绿斑驳花叶病毒间隔区域在抗性烟草培育中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)现有技术未公开过CGMMV基因组第一编码区的间隔区域(IR)的功能注释，更未构思过从该区域筛选目的片段建立病毒内源基因介导转基因烟草抗性技术体系，本发明部分地注释了CGMMV基因间隔区域的功能，该功能在于能够应用于CGMMV转基因抗性烟草培育，且其技术效果不低于由MP基因、CP基因参与介导的抗性烟草培育。(2)筛选出三条能够独立用于构建植物干涉载体的CGMMV基因间隔区域片段，实现转基因烟草培育。(3)构建了利用CGMMV基因间隔区域、MP基因、CP基因组成的碱基嵌合结构IMC，能够用于构建植物干涉载体，实现转基因烟草培育。(4)建立了多个利用CGMMV病毒基因间隔区域及其与MP基因、CP基因组合介导转基因抗性烟草的完整技术方案。

附图说明

图1是CGMMV基因组结构图示意图。

图2是IR1、IR2、IR3目的片段PCR扩增结果。

图3是酶切验证结果((a)IR1、(b)IR2、(c)IR3)。

图4是转化农杆菌的PCR验证结果((a)IR1、(b)IR2、(c)IR3)。

图5是实施例三nptII引物检测结果。

图6是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1月，(a)IR1、(b)IR2、(c)IR3)。

图7是IR4、MP1、CP1目的片段PCR扩增结果。

图8是IR-F/CP-R扩增全长(a)的酶切验证结果(b)。

图9是转化农杆菌的PCR验证结果(IMC)。

图10是实施例五nptII引物检测结果。

图11是35S、CP-R引物对检测结果。

图12是实施例五病毒接种攻毒试验结果(示接种后1月叶片症状)

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。

实施例一

克隆构建包含片段IR1、片段IR2、片段IR3的植物干涉表达载体。

选取CGMMV基因间隔区域(如SEQ ID NO.4所示)内5′端345bp(IR1)、中端368bp(IR2)、3′端366bp(IR3)三个不同区段为目的片段，分别利用重组反应构建植物干涉表达载体。

根据三条目的片段序列特征分别设计扩增引物对(见表1)，用PCR分别扩增IR1，IR2，IR3区段。PCR反应体系与程序均相同。

PCR体系：50μL，内含正反向特异引物各1ul，5×TransStart FastPfu Buffer10ul，2.5mM dNTPs 4ul，TransStart Enzyme 1ul，ddH₂O 32ul，模板1ul，Total 50ul。

PCR扩增条件及程序：94℃预变性3min，94℃45sec，58℃45sec，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应结束后，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，回收、纯化并克隆至pMD18-T载体(宝生物工程有限公司)，进行序列测定，分析结果。图2是IR1、IR2、IR3目的片段PCR扩增结果。PCR产物回收纯化。

表1 IR1、IR2、IR3目的片段PCR扩增引物对

目的片段	PCR扩增引物对
		IR1(5′端345bp)	IR-1F(SEQ ID NO.9)、IR-1R(SEQ ID NO.10)
IR2(中端368bp)	IR-2F(SEQ ID NO.11)、IR-2R(SEQ ID NO.12)
		IR3(3′端366bp)	IR-3F(SEQ ID NO.13)、IR-3R(SEQ ID NO.14)

本实施例构建植物干涉表达载体是具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi。选用干涉载体pHellsgate2(华中农业大学番茄组实验室保存)。

所得回收纯化的PCR产物分别与干涉载体pHellsgate2进行BP重组反应。BP重组反应体系均相同，为：BP酶0.6μL，载体0.9μL，目的片段1.5μL。25℃3h。BP反应产物首先转化到大肠杆菌DH5α(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，spec 100mg/L固体平板筛选阳性克隆。对阳性克隆PCR检测，测序验证正确后，提取阳性重组质粒，分别命名为pHe-IR1、pHe-IR2、pHe-IR3。采用冻融法分别将阳性重组质粒pHe-IR1、pHe-IR2、pHe-IR3转入农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司)感受态细胞，菌落PCR检测验证，挑取序列正确的菌落保存用于遗传转化烟草，保存备用。正确的菌落包含所构建的ihpRNAi载体。图3是酶切验证结果((a)IR1、(b)IR2、(c)IR3)，图4是转化农杆菌的PCR验证结果((a)IR1、(b)IR2、(c)IR3)。

实施例二

烟草遗传转化。

本氏烟(Nicotiana benthamiana)种子：中国农业科学院郑州果树研究所保存

MS培养基：北京酷来博科技有限公司

LB培养基(液体)：10g胰蛋白胨/L、5g酵母提取物/L、5g NaCl/L

过夜菌液：用LB液体培养基28℃，220rpm过夜培养实施例一保存备用农杆菌LBA4404制得。

共培养基：MS+BA 2.25mg/L+NAA 0.3mg/L，pH 5.8

筛选培养基：MS+BA 2.25mg/L+NAA 0.3mg/L+Kan 100mg/L+Timitin300mg/L，pH5.8

生根筛选培养基：MS+Kan 100mg/L+Timitin 150mg/L，pH 5.8

本氏烟种子70％酒精消毒30s，84消毒6min，无菌水冲洗6次，然后播种于MS培养基培养(16h光照、8h黑暗、25℃)。4叶期时选取健康叶片作为外植体进行遗传转化。

分别将IR1、IR2、IR3三组试验的烟草幼嫩叶片切下剪取约0.5cm×0.5cm大小作为外植体，于加有100ul新制备过夜菌液的MS液体培养基中侵染10min～30min；取出外植体置于共培养基，黑暗条件下共培养2d～3d。取出外植体转移到筛选培养基进行筛选培养(培养条件同种子MS培养基阶段)；1个月后，从分化的丛生芽中切下单芽，转移到生根筛选培养基进行生根培养(培养条件同种子MS培养基阶段)；当小植株长到3cm左右高时，小心地洗净掉植株根周围的琼脂，将生根植株移栽到基质中炼苗。炼苗期间注意保持基质湿度，2周～3周以后，将成活的小植株转移到花盆中生长。

待遗传转化的烟草结籽，采集T0代种子备用。

实施例三

转基因烟草植株PCR阳性检测。

分别取实施例二IR1、IR2、IR3三组炼苗实验成活的T0代转基因烟草植株的幼嫩叶片为样品，同时取野生型(WT)植株幼嫩叶片为对照。样品与对照材料均提取总DNA(DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司)，利用标记基因nptII进行PCR检测。标记及检测依现有技术操作(参考文献Generation of transgenic watermelon resistance to Cucumbermosaic virus facilitated by an effective Agrobacterium-mediatedtransformation method.Scientia Horticulturae,Volume 205,23June 2016,Pages 32-38)。图5是nptII引物检测结果。

实施例四

病毒接种攻毒试验。

添加抗生素的LB培养基：Kan 100mg/L+Rif 50mg/L、LB培养基

诱导缓冲液：10mmol/LMgCl₂、10mmol/L MES、100μmol/L乙酰丁香酮

转化pHe-IR1、pHe-IR2、pHe-IR3基因的烟草分别获得26、30、30棵阳性植株。经过预试验，各组分别选取两棵抗病性较好的转基因材料，标记为IR1-3、IR1-16，IR2-6、IR2-7，IR3-12、IR3-19，进行病毒接种攻毒试验。

分别将IR1-3、IR1-16、IR2-6、IR2-7、IR3-12、IR3-19的T0代种子与野生型(WT)种子播种到小花盆中。待长到四片叶片时，取转基因烟草DNA检测为阳性的材料进行植株叶片侵染操作：将CGMMV侵染性单克隆载体的农杆菌(中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组保存)在添加抗生素的LB培养基过夜培养16h～24h，6000rpm离心5min，收集下层菌体，用诱导缓冲液悬浮菌体，室温静置2h后，用1mL注射器分别将0.5ml菌体注射接种至IR1、IR2、IR3三种转基因烟草材料及野生型材料(WT)叶片背面。各材料接种后置于温室条件培养(光照16h、28℃，黑暗8h、24℃)，观察记录病毒病发生情况。

WT材料：在接种10d时全部发病，表现为所有的材料心叶和第二片叶均呈花叶、皱缩。接种30d后，花叶和皱缩加重，植株矮化。

转基因材料各株系：接种10d，IR1-3、IR2-6、IR3-12、IR3-19分别有2株发病，IR1-16、IR2-7分别有1株发病；接种20d时，IR2-7、IR3-19株系各增加1株发病，其余株系无染病；接种30d时，各株系发病情况与接种后20d时维持一样，没有增加趋势，表明30d以后发病率保持稳定，转基因阳性转基因材料均表现抗性。整个生长周期内，转基因阳性植株均不发病。

图6是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1月，(a)IR1、(b)IR2、(c)IR3)。图6显示，各组试验的WT与转基因株系第5片叶子的表型中，WT显示花叶皱缩，转基因株系叶片表现为健康状态。

表2 IR1\IR2\IR3转基因植株对CGMMV抗性鉴定

以上实施例一～实施例四结果表明：利用CGMMV基因间隔区域5′端345bp区段(IR1)、中端368bp区段(IR2)、3′端366bp区段(IR3)构建的具有发卡结构的植物表达载体转化烟草，获得的转基因烟草株系都可以对CGMMV产生抗性。CGMMV基因间隔区域碱基片段能够介导转基因烟草抗性，能够应用于CGMMV抗性烟草培育。

实施例五

分别选取CGMMV基因组中IR间隔区域、运动蛋白MP、外壳蛋白CP三个结构域中的各一个区段，组成嵌合结构介导抗性烟草培育。

1、构建包含IR间隔区域片段的嵌合结构的植物干涉表达载体

选取CGMMV病毒中三个区段作为目的片段，包括：IR间隔区域193bp(IR4，如SEQ IDNO.5所示)，MP基因142bp(MP1，如SEQ ID NO.6所示)，CP基因128bp(CP1，如SEQ ID NO.7所示)。根据三条目的片段序列特征分别设计扩增引物对(见表3)，

用IR-F与IR+MP-R，IR+MP-F与MP+CP-R，MP+CP-F与CP-R三对引物PCR分别扩增对应目的片段，最后用IR-F与CP-R扩增重组片段，得到嵌合结构IMC序列(如SEQ ID NO.8所示，463bp)。PCR反应体系、PCR条件及程序、试剂/材料/操作均与实施例一相同。图7是IR4、MP1、CP1目的片段PCR扩增结果。

表3 IR4、MP1、CP1目的片段PCR引物对

目的片段	PCR扩增引物对
		IR4(IR 193bp)	IR-F(SEQ ID NO.15)、IR+MP-R(SEQ ID NO.16)
MP1(MP 142bp)	IR+MP-F(SEQ ID NO.17)、MP+CP-R(SEQ ID NO.18)
		CP1(CP 128bp)	MP+CP-F(SEQ ID NO.19)、CP-R(SEQ ID NO.20)

PCR产物回收纯化后采用与实施例一相同质粒、载体、操作构建包含IMC序列的阳性质粒pHe-IMC、干涉植物表达载体ihpRNAi载体。图8是IR-F/CP-R扩增全长的酶切验证结果，图9是转化农杆菌的PCR验证结果(IMC)。

2、烟草遗传转化。

利用以上步骤所得ihpRNAi载体采用与实施例二相同试剂/材料/操作转化烟草，得转基因烟草植株，并采集T0代种子备用。

3、转基因烟草植株PCR阳性检测

采用与实施例三相同试剂/材料/操作检测以上步骤所得转基因烟草植株。图10是nptII引物检测结果，图11是CP-R引物检测结果(35S)。

4、病毒接种攻毒试验

采用与实施例四相同试剂/材料/操作接种攻毒以上步骤所得转基因烟草植株，并观察记录病毒病发生情况。

WT材料：在接种10d时全部发病，表现为所有的材料心叶和第二片叶均呈花叶、皱缩。

转基因材料：接种10d时，10个株系发病植株少，IMC-11，IMC-13，IMC-5，IMC-17，IMC-18没有发病植株，IMC-5发病1株，IMC-3，IMC-11，IMC-16发病2株，IMC-2发病3株；接种20d时，转基因材料只有IMC-2、IMC-5株系发病增加，达到5株；接种30d时，各株系发病情况与接种后20d时维持一样，没有增加趋势，表明30d统计发病率能够表现T1代材料的分离比例。10个株系发病率不同，说明分离比不同，在T1代转基因植株健康生长，均表现抗性。

图12是病毒接种攻毒试验结果(示接种后1月叶片)。图12显示野生型和转基因株系第5片叶子的表型，WT显示花叶皱缩，转基因株系IMC-13，IMC-17，IMC-18叶片表现为健康状态。

表4 IMC转基因植株对CGMMV病毒抗性鉴定

接种一个月后，用DAS-ELISA检测转基因IMC-13、IMC-15、IMC-18三个株系与WT材料接种CGMMV的情况，WT的ELISA检测指数高于3，平均值高达11.9。三个转基因株系的ELISA检测指数均小于3，说明在转基因株系当中并未检测到CGMMV病毒。

表5 DAS-ELISA分析结果(30dpi)

注：I/H比值≥3.0为阳性材料.阳性对照I/H比值为11.9。

CGMMV侵染烟草后，感染病毒的WT不仅叶片表现花叶、皱缩，而且整个植株比三个转基因株系矮，影响植株生长，造成不可逆的伤害。

表6、接种30d后统计株高结果(30dpi)

以上实施例五结果表明：利用CGMMV病毒IR间隔区域碱基片段能够与病毒CP、MP结构域的片段组成嵌合结构，也能够应用于病毒基因介导抗性烟草培育。

以上实施例一至四记载分别以病毒间隔区域三个独立片段为目的片段介导的抗性烟草培育技术方案，实施例五记载以病毒间隔区域片段与MP片段、CP片段构成的嵌合结构为目的片段介导的抗性烟草培育技术方案，从数据结果可允，两类技术方案所得抗性植株在整个生育期调查均没发病。这表明，CGMMV病毒IR间隔区域能够作为内源基因独立地介导CGMMV抗性烟草，且技术效果不低于传统由病毒MP片段、CP片段为内源基因的介导效果。

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序列表

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 黄瓜绿斑驳花叶病毒基因间隔区域在抗性烟草培育中的应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 21

<211> 345

<212> DNA/RNA

<213> IR1，CGMMV基因间隔区域碱基345bp片段(CGMMV)

<400> 21

gagtggaacg taccggttga tcagctcact gatatctcgt tctcgatatt ccttctcgtg 60

aaggttagga aggtacagat cgagttaatg tctgataaag ttgtaatcga ggcgaggggt 120

ttgcttcgga ggttcgcaga cagtcttaaa tctgccgtag aaggactagg tgattgcgtc 180

tatgatgctc tagttcaaac cggctggttt gacacctcta gcgacgaact gaaagtattg 240

ctacctgaac cgtttatgac cttttcggat tatcttgaag ggatgtacga ggcagatgca 300

aagatcgaga gagagagtgt ctctgagttg ctcgcttccg gtgat 345

<210> 2

<211> 368

<212> DNA/RNA

<213> IR2，CGMMV基因间隔区域碱基368bp片段(CGMMV)

<400> 2

cgcttctgtt gcgttatcca gtacctctgt agatacatgt gaagatatgg atgtaactga 60

agatatggag gatatagtgt tgatggcgga caagagtcat tcttacatgt cccctgaaat 120

ggcgagatgg gctaatgtta aatatggcaa caataaaggg gctctagtcg agtacaaagt 180

cggaacctcg atgactttac ctgccacctg ggcagagaaa ggtaaggctg tcttaccgtt 240

gtcggggatc tgtgtgagga aaccccaatt ttcgaagccg cttgatgagg aagatgactt 300

gaggttatca aacatgaatt tctttaaggt gagcgatcta aagttgaaga agactatcac 360

tccagtcg 368

<210> 3

<211> 366

<212> DNA/RNA

<213> IR3，CGMMV基因间隔区域碱基366bp片段(CGMMV)

<400> 3

ccattcgaga gaggcaaatg aaaaattata ttgattattt atcggcctct cttggttcca 60

cgctgggtaa tctggagaga atcgtgcgga gtgattggaa tggtactgag gagagtatgc 120

aaacgttcgg gttgtatgac tgcgaaaagt gcaagtggtt attgttgcca gccgagaaga 180

agcacgcatg ggccgtggtt ctggcaagtg atgataccac tcgcataatc ttcctttcat 240

atgacgaatc tggttctcct ataattgata agaaaaattg gaagcgattt gctgtctgtt 300

ctgagaccaa agtctatagt gtaattcgta gtttagaggt tctaaataag gaagcgatag 360

tcgacc 366

<210> 4

<211> 1296

<212> DNA/RNA

<213> CGMMV基因间隔区域(CGMMV)

<400> 4

gagtggaacg taccggttga tcagctcact gatatctcgt tctcgatatt ccttctcgtg 60

aaggttagga aggtacagat cgagttaatg tctgataaag ttgtaatcga ggcgaggggt 120

ttgcttcgga ggttcgcaga cagtcttaaa tctgccgtag aaggactagg tgattgcgtc 180

tatgatgctc tagttcaaac cggctggttt gacacctcta gcgacgaact gaaagtattg 240

ctacctgaac cgtttatgac cttttcggat tatcttgaag ggatgtacga ggcagatgca 300

aagatcgaga gagagagtgt ctctgagttg ctcgcttccg gtgatgattt gttcaagaaa 360

atcgatgaga taagaaacaa ttacagtgga gtcgaatttg atgtagagaa attccaagaa 420

ttttgcaagg aactgaatgt taatcctatg ctaattggcc atgttatcga agctattttt 480

tcgcagaagg ctggggtaac agtaacaggt ctgggcacgc tctctcctga gatgggcgct 540

tctgttgcgt tatccagtac ctctgtagat acatgtgaag atatggatgt aactgaagat 600

atggaggata tagtgttgat ggcggacaag agtcattctt acatgtcccc tgaaatggcg 660

agatgggcta atgttaaata tggcaacaat aaaggggctc tagtcgagta caaagtcgga 720

acctcgatga ctttacctgc cacctgggca gagaaaggta aggctgtctt accgttgtcg 780

gggatctgtg tgaggaaacc ccaattttcg aagccgcttg atgaggaaga tgacttgagg 840

ttatcaaaca tgaatttctt taaggtgagc gatctaaagt tgaagaagac tatcactcca 900

gtcgtttaca ctgggaccat tcgagagagg caaatgaaaa attatattga ttatttatcg 960

gcctctcttg gttccacgct gggtaatctg gagagaatcg tgcggagtga ttggaatggt 1020

actgaggaga gtatgcaaac gttcgggttg tatgactgcg aaaagtgcaa gtggttattg 1080

ttgccagccg agaagaagca cgcatgggcc gtggttctgg caagtgatga taccactcgc 1140

ataatcttcc tttcatatga cgaatctggt tctcctataa ttgataagaa aaattggaag 1200

cgatttgctg tctgttctga gaccaaagtc tatagtgtaa ttcgtagttt agaggttcta 1260

aataaggaag cgatagtcga ccccggggtt cacata 1296

<210> 5

<211> 193

<212> DNA/RNA

<213> IR4，CGMMV基因间隔区域碱基193bp片段(CGMMV)

<400> 5

gccacctggg cagagaaagg taaggctgtc ttaccgttgt cggggatctg tgtgaggaaa 60

ccccaatttt cgaagccgct tgatgaggaa gatgacttga ggttatcaaa catgaatttc 120

tttaaggtga gcgatctaaa gttgaagaag actatcactc cagtcgttta cactgggacc 180

attcgagaga ggc 193

<210> 6

<211> 142

<212> DNA/RNA

<213> MP1，CGMMV MP基因142bp片段(CGMMV)

<400> 6

gacaaagttc ctatttcagc ggctgtaatg gcaagagatc ccagttatag gtctaggtcg 60

cagtctgtcg gtggtcgtgg taagcggcat tctaaacctc caaatcggag gttggactct 120

gcttctgaag agtccagttc tg 142

<210> 7

<211> 128

<212> DNA/RNA

<213> CP1，CGMMV CP基因128bp片段(CGMMV)

<400> 7

cgctttcctc aacggtcctg tgttgaggcc tatcttcgtt tcgcttctta gctccacgga 60

tacgcgtaat agggtcattg aggttgtaga tcctagcaat cccacgactg ctgagtcgct 120

taacgctg 128

<210> 8

<211> 463

<212> DNA/RNA

<213> IMC，463bp嵌合结构(CGMMV)

<400> 8

gccacctggg cagagaaagg taaggctgtc ttaccgttgt cggggatctg tgtgaggaaa 60

ccccaatttt cgaagccgct tgatgaggaa gatgacttga ggttatcaaa catgaatttc 120

tttaaggtga gcgatctaaa gttgaagaag actatcactc cagtcgttta cactgggacc 180

attcgagaga ggcgacaaag ttcctatttc agcggctgta atggcaagag atcccagtta 240

taggtctagg tcgcagtctg tcggtggtcg tggtaagcgg cattctaaac ctccaaatcg 300

gaggttggac tctgcttctg aagagtccag ttctgcgctt tcctcaacgg tcctgtgttg 360

aggcctatct tcgtttcgct tcttagctcc acggatacgc gtaatagggt cattgaggtt 420

gtagatccta gcaatcccac gactgctgag tcgcttaacg ctg 463

<210> 9

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-1F(人工合成)

<400> 9

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg agtggaacgt accggttg 48

<210> 10

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-1R(人工合成)

<400> 10

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggta tcaccggaag cgagcaac 48

<210> 11

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-2F(人工合成)

<400> 11

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc gcttctgttg cgttatcca 49

<210> 12

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-2R(人工合成)

<400> 12

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gactggagtg atagtcttc 49

<210> 13

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-3F(人工合成)

<400> 13

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc cattcgagag aggcaaatg 49

<210> 14

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-3R(人工合成)

<400> 14

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg gtcgactatc gcttcctta 49

<210> 15

<211> 48

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR-F(人工合成)

<400> 15

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg ccacctgggc agagaaag 48

<210> 16

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR+MP-R(人工合成)

<400> 16

cgctgaaata ggaactttgt cgcctctctc gaatggtccc 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> 引物IR+MP-F(人工合成)

<400> 17

gggaccattc gagagaggcg acaaagttcc tatttcagcg 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> 引物MP+CP-R(人工合成)

<400> 18

aggaccgttg aggaaagcgc agaactggac tcttcagaag 40

<210> 19

<211> 40

<212> DNA/RNA

<213> 引物MP+CP-F(人工合成)

<400> 19

cttctgaaga gtccagttct gcgctttcct caacggtcct 40

<210> 20

<211> 49

<212> DNA/RNA

<213> 引物CP-R(人工合成)

<400> 20

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agcgttaagc gactcagca 49

Claims

1.黄瓜绿斑驳花叶病毒间隔区域基因片段，其特征在于：是如下方案之一：

方案一：片段IR1，是CGMMV间隔区域5′端345bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；

方案二：片段IR2，是CGMMV间隔区域中端368bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.2所示；

方案三：片段IR3，是CGMMV间隔区域3′端366bp区段，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的基因片段在CGMMV基因介导烟草抗性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述烟草是本氏烟（Nicotiana benthamiana）。

4.烟草干涉表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述任一黄瓜绿斑驳花叶病毒间隔区域基因片段。

5.根据权利要求4所述的烟草干涉表达载体，其特征在于：是具有发夹结构的反向重复序列载体ihpRNAi。

6.根据权利要求5所述的烟草干涉表达载体，其特征在于：回收纯化的所述黄瓜绿斑驳花叶病毒间隔区域基因片段PCR产物与干涉载体pHellsgate2进行BP重组反应构建。

7.重组质粒，其特征在于：包含权利要求1所述任一黄瓜绿斑驳花叶病毒间隔区域基因片段。

8.利用黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组间隔区域片段培育抗性烟草的方法，其特征在于：依如下步骤实施：

首先，根据CGMMV目的片段设计PCR扩增引物对，经PCR扩增后回收纯化得到各PCR产物，所述目的片段是SEQ ID NO.1序列所示片段IR1或SEQ ID NO.2序列所示片段IR2或SEQ IDNO.3序列所示片段IR3；

最后，用含阳性ihpRNAi的农杆菌转化烟草。

9.根据权利要求8所述的培育抗性烟草的方法，其特征在于：所述烟草是本氏烟（Nicotiana benthamiana）。