CN101186950A

CN101186950A - 黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针

Info

Publication number: CN101186950A
Application number: CNA2007101003030A
Authority: CN
Inventors: 赵文军; 陈红运; 白净; 朱水芳; 李明福
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2007-06-07
Filing date: 2007-06-07
Publication date: 2008-05-28
Anticipated expiration: 2027-06-07
Also published as: CN101186950B

Abstract

本发明提供了一种黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针，所述引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1&2所示，所述探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。本发明还进一步提供了检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT－PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。

Description

黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针。

背景技术

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)葫芦科的重要病毒之一，给葫芦科作物的生产造成严重威胁。在黄瓜叶片上引起色斑、水泡及变形，使植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生黑绿色水疱状的坏死斑，产量15％；在前苏联的Georgia地区，发生率达80％～100％，可延缓黄瓜植株的生长发育，甚至导致不孕。早期受侵染的西瓜植株生长缓慢，出现花叶，果实内部严重变色或造成腐烂，果肉纤维化，产量下降30％；1998年在韩国发生面积达463hm²，造成较严重损失；2005年，在我国辽宁盖州地区造成西瓜大面积毁灭，引起农业部、质检总局等相关部门的高度重视。因国内学者对该病毒的研究较少，相关资料及防治经验缺少。

CGMMV分布比较广泛，首次报道于英国，此后在希腊、以色列、法国、印度、日本、韩国、印尼和巴基斯坦等地均有发生。目前已报道的CGMMV分离物多为西瓜株系(CGMMV-W)，CGMMV-W侵染西瓜后可引起典型的斑驳和花叶症状，在成熟期还可导致西瓜果实内部出现果肉变色和腐烂，失去食用和商业价值，造成重大经济损失，该病毒已被列入我国新修订的禁止进境的有害生物名录之中。CGMMV非常稳定，在种子表面可存活数月，从土壤中的植物病残体中仍可分离到具有侵染活性的病毒粒子。近年来，我国进口的葫芦科作物种子的数量逐年增加，而且每年都要从CGMMV发生地日本引进种子，因此该病毒随进境种子传入的风险很高。

本研究选择黄瓜绿斑驳花叶病毒3’端非翻译区基因设计的用于荧光PCR检测的引物和探针序列，通过对反应的退火温度建立了黄瓜绿斑驳花叶病毒的荧光PCR检测方法，反应结束即可根据扩增曲线判定是否有黄瓜绿斑驳花叶病毒。

发明内容

本发明目的在于提供用于黄瓜绿斑驳花叶病毒实时荧光PCR检测的引物及探针序列。

本发明通过分析已报道黄瓜绿斑驳花叶病毒3’端非翻译区序列的基础上，分别设计引物和荧光探针。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1和2所示；所述探针核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示，该探针的一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。可用的报告荧光染料有Fam\hex\tet\joe\vic\fitc\cy3\cy5，可用的淬灭荧光染料有tamra\rox\dabcyl\bhq1\bhq2。

根据TAQMAN技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测。

本发明还进一步给出了应用上述引物和探针的荧光PCR检测方法，其以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

具体地说本发明以样品总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在50μL反应体系中加入20.25μL DEPC处理水，25μL2×Master Mix without UNG，1.25μL 40×MultiScribe and RNaseInhibitor Mix，1μL引物CGMMV-FP(20μmol/L)，1μL引物CGMMV-RP(20μmol/L)，0.5μL探针CGMMV-FAM(20μmol/L)，1.6ng总RNA。TaqMan One-Step RT-PCR Master MixReagents购自Applied Biosystems公司。

其中，上述反应条件可以是：42℃，30min；95℃5min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探针，以适用不同方法的荧光PCR检测。

进一步，还可以将本发明引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明的根据黄瓜绿斑驳花叶病毒3’端非编译区序列设计引物及探针，该引物特异性好，用于荧光PCR检测灵敏性高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有黄瓜绿斑驳花叶病毒，为进出口安全提供了保证。

附图说明

图1是实时荧光RT-PCR技术检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的结果；

图2是本发明检测方法的灵敏度实验。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物及探针的设计和合成

根据猪链球菌2型两种毒力因子MRP(GenBank No.X64450)和EF(GenBank No.A24023)编码基因的公开序列，采用探针设计软件Express 2.0设计引物及探针，引物序列为：

CGMMV-RP(正向)：5’-GCATAGTGCTTTCCCGTTCAC-3’

CGMMV-FP(反向)：5’-TGCAGAATTACTGCCCATAGAAAC-3’

所述探针的序列为：5’-CGGTTTGCTCATTGGTTTGCGGA-3’

该探针的5’端用报告荧光染料FAM标记，3’端用淬灭荧光染料TAMRA标记。

实施例2总RNA的提取

1)取0.1g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；

2)4℃，12000g离心10min以除去不溶的成份，将上清液转入一新的1.5ml离心管中；

3)室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持2-15min后，4℃，12000g离心15min；

4)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温下保持15min；

5)4℃，12000g离心10min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；

6)倒掉上清液，加入75％的乙醇洗涤沉淀，然后4℃，7500g离心5min(如沉淀悬浮起来，则用12000g)，弃去乙醇；

7)沉淀于室温下充分干燥后，溶于30μl dH₂O(DEPC处理)中，-20℃保存备用。

实施例3Real-time RT-PCR扩增方法的建立

1、实时荧光RT-PCR反应体系

以总RNA为模板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在50μL反应体系中加入20.25μL DEPC处理水，25μL 2×Master Mix withoutUNG，1.25μL 40×MultiScribe and RNase Inhibitor Mix，1μL引物CGMMV-FP(20μmol/L)，1μL引物CGMMV-RP(20μmol/L)，0.5μL探针CGMMV-FAM(20μmol/L)，1.6ng总RNA。

2、实时荧光RT-PCR反应条件

将样品管放入ABI公司ABI 7700荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：42℃，30min；95℃5min；95℃15s；60℃1min，共40个循环。每个循环结束后采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4黄瓜绿斑驳花叶病毒Real-time RT-PCR方法的特异性确定

以表现症状的菜豆叶片总RNA为模板，以健康叶片最为对照，通过实时荧光RT-PCR检测荧光强度变化。

试验结果：

以表现症状的菜豆叶片总RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而健康对照的荧光强度没有变化，结果见图1。

实施例5灵敏度实验

用DEPC处理水分别稀释总RNA，进行相对灵敏度检测，在50μL反应体系中，总RNA分别为130ng、13ng、1.3ng、0.13ng、13pg、1.3pg、0.13pg。检测结果如图2所示，最低检测限是0.13pg。

序列表

<110>中国检验检疫科学研究院

<120>黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物及探针

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gcatagtgct ttcccgttca c 21

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tgcagaatta ctgcccatag aaac 24

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cggtttgctc attggtttgc gga 23

Claims

1.一种黄瓜绿斑驳花叶病毒检测用引物，其核苷酸序列为：

CGMMV-RP：5’-GCATAGTGCTTTCCCGTTCAC-3’

CGMMV-FP：5’-TGCAGAATTACTGCCCATAGAAAC-3’。

2.一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为：5’-CGGTTTGCTCATTGGTTTGCGGA-3’，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。

3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，该探针5’端标记有FAM荧光染料，3’标记有TAMRA荧光染料。

4.一种检测黄瓜绿斑驳花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的引物以及权利要求2或3所述的探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，实时荧光RT-PCR的反应过程中的退火温度为60℃。

6.含有权利要求1所述引物的试剂盒。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其还包括权利要求2或3所述的探针。