CN106566842A - 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用 - Google Patents

一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106566842A
CN106566842A CN201610564555.8A CN201610564555A CN106566842A CN 106566842 A CN106566842 A CN 106566842A CN 201610564555 A CN201610564555 A CN 201610564555A CN 106566842 A CN106566842 A CN 106566842A
Authority
CN
China
Prior art keywords
carrier
pmgreen
seq
rdrp
mpd
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610564555.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106566842B (zh
Inventor
潘炜松
吴川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Nuoda Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Hunan Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hunan Agricultural University filed Critical Hunan Agricultural University
Priority to CN201610564555.8A priority Critical patent/CN106566842B/zh
Publication of CN106566842A publication Critical patent/CN106566842A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106566842B publication Critical patent/CN106566842B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用。所述蛋白或多肽的植物表达载体序列如SEQ ID No.14所示，命名为载体pFolia40108。该表达载体基于芜菁脉明病毒(TVCV)的高度感染性和农杆菌对外源基因高效传递的特点，极大地提高了外源基因在烟草中的表达效率。本表达载体将TVCV基因组复制和胞间移动相关的基因克隆于穿梭载体pGreen，同时设计了含有IIs限制性内切酶BsaI的多克隆位点。通过本表达载体可以高效地表达各种抗体、多肽、酶等产品。

Description

一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用。
背景技术
目前，应用植物反应器(植物悬浮细胞或整株植物)生产多肽产品、工业蛋白和医药蛋白，受到世界上很多国家的重视。由于植物体内体外均不含对人体有害的物质及病原菌，所以用植物生产要比用细菌及动物细胞生产安全得多，且生产过程中易于无菌管理，也无需从生产材料中除去有害物质，从而易于达到安全、低成本、大批量生产之目的。在植物中表达外源基因主要有两种途径，一种是用转基因的方法将外源基因整合入植物基因组进行稳定表达；另一种是应用植物病毒载体系统进行瞬时表达。
与转基因植物相比，利用植物病毒载体表达外源基因具有如下优点：首先表达水平很高，伴随病毒的增殖，外源基因可高水平表达，甚至达到每千克病叶数克外源蛋白的水平；其次，植物病毒载体系统增殖速度快，也不需要耗时的植物遗传转化和再生过程，许多载体可通过机械接种感染大面积的植物，通常在接种后1-2周外源基因就可大量表达。与传统的细菌、酵母及动物细胞表达系统相比，植物病毒载体表达外源基因的优点还在于植物种植及管理技术简单，对人及动物安全，不需要昂贵的发酵及细胞培养等特殊设备，且能进行翻译后加工。
DNA病毒最早用于植物病毒载体的构建，但复制过程的复杂性使这类病毒不适于在植物中高水平表达外源蛋白。自然界绝大多数植物病毒基因组由一个及多个正义RNA组成，它们的宿主范围广及病毒的滴度高，且具有在植物细胞内直接被翻译的能力，因此，利用RNA病毒在感染植株中表达重组蛋白日益受到重视。目前，已有多种RNA病毒家族成员用于构建病毒载体。如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)、豇豆花叶病毒(cowpeamosaic virus,CPMV)、番茄丛矮病毒(tomato bushy stunt virus,TBSV)、李痘病毒(plumpox virus,PPV)、马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)、苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaicvirus,ALMV)等。根据植物病毒基因组的结构与功能之特点，已有置换型(Genereplacement)、插入型(Gene insertion)、互补型(Gene complementation)及抗原展示型(Epitope presentation)4种主要的植物病毒载体构建策略。
置换策略最早用于病毒载体的构建，该策略是将外源基因置换病毒基因组中的非必须基因，但基因删除使置换策略存在很大的局限性。另一个有效方法为基因插入即在病毒基因组中插入外源基因。基因互补型载体是指将外源基因插入缺陷型病毒或亚病毒因子中，通过转基因植物或与辅助病毒共侵染而互补缺陷的功能。利用转基因植物互补缺陷型病毒载体失去的功能，从而表达外源基因或用来研究运功蛋白基因等多种病毒基因的功能，以克服置换型载体和插入型载体的不稳定性。抗原展示系统，是将外源基因选择性地插入病毒CP基因中融合表达，使小分子外源肽呈现在病毒粒子表面，通过提纯重组病毒即可获得大量的抗原。这种方法可以大大增强小蛋白多肽的免疫原性，弥补了小分子多肽单独作抗原时免疫原性弱的缺点，且表达的蛋白易于被哺乳动物免疫系统识别。但构建抗原展示型载体需要对病毒的基因组和外壳蛋白结构有充分的了解，因而仅被用于结构较为清楚的几种病毒，应用较多的是TMV、PVX、CPMV和TBSV等。
烟草花叶病毒是一种在病毒学发展史各阶段都有重大影响的模式植物病毒，是螺旋对称型病毒的典型代表。TMV为单链正义RNA病毒，基因组RNA约6395个核苷酸，其RNA5’端有m 7GpppG的帽状结构，3’端无poly(A)。病毒基因组RNA编码3个ORF，至少产生4个蛋白：126kDa，183kDa，30kDa和17kDa，其中17kDa蛋白为病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)，其余3个为非结构蛋白；183kDa和126kDa蛋白为RNA复制酶；30kDa蛋白是TMV的移动蛋白(movement protein,MP)，与病毒在寄主体内的胞间移动有关。TMV最早被用于构建抗原展示载体。将亮氨酸(Leu)-脑啡肽(Enk)编码序列插入CP终止密码子的上游，但病毒核酸在植物细胞间不能移动，也不能形成病毒粒体。为解决这个问题，Hama-moto等进行了改进，他们将一个6bp的通读序列与外源的血管紧张素I转化酶抑制剂(ACEI)编码序列共同插入CP末端，这样能造成CP终止密码子(UAG)的通读，表达天然的CP和CP-ACEI融合蛋白，因而病毒载体能正常组装和系统侵染。利用这一策略流感病毒血凝素和艾滋病毒抗原蛋白(gp120)也成功表达。但研究表明TMV CP仅能融合小于25个氨基酸的小肽，否则其组装会受到影响。
TMV也被用于构建置换载体表达报告基因如gus，gfp，但多数情况下CP置换载体不能或仅能低水平表达外源基因。为了解决这一问题，一般是将额外的病毒CP亚基因组启动子引入该病毒基因组而将外源基因插入此启动子下游，但因为载体中双CP亚基因组启动子序列的高频同源重组，外源基因及易丢失。避免同源重组的方法是采用亲缘关系较近的病毒亚基因组启动子。基于这种思路，利用该病毒载体已表达了几种高价值蛋白分子。例如核糖体灭活蛋白(RIP)，a-天花粉蛋白，单链抗体(SCFV)及单克隆抗体等。并且，已有研究表明烟草花叶病毒载体可合成糖基化蛋白。利用烟草花叶病毒载体也表达了许多免疫性蛋白质包括口蹄疫病(FMDV)VP1蛋白，肿瘤SCFV抗原决定簇，牛疱疹病毒(BHV)gD蛋白及猪传染性腹泻病毒(PEDV)中和表位等。
一些研究结果表明，多种植物病毒载体都存在一些问题：1)稳定性问题。植物病毒载体的一个最大的缺点在于它的稳定性差。快速的基因重组是病毒表达载体不稳定并丢失外源基因的主要原因。因此，在载体构建过程中要尽量避免出现同源序列，以防止发生基因重组。2)外源基因大小限制问题。置换载体插入外源基因的大小受被置换基因大小的限制，而插入载体表达中外源基因如果过大则可能导致表达困难或不能系统侵染。TMV、CPMV等融合抗原展示载体所能表达的外源小肽的大小更是受到严格限制，一般以10～20个氨基酸的多肽为宜，太大就会影响病毒的复制和组装，也为将来的提纯工作带来困难。3)安全性问题。病毒是植物重要的病原物，大部分病毒具有较广的寄主范围，尽管部分病毒载体已被修饰不能引起严重症状或被介体传播，但释放修饰和未修饰的病毒载体仍要严格管理。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述蛋白或多肽的植物表达载体序列如SEQ ID No.14所示，命名为载体pFolia40108。
所述植物表达载体的构建方法为：首先构建载体pmGreen-BsaI；在载体pmGreen-BsaI基础上构建载体pmGreen-MCS；在pmGreen-MCS基础上构建载体pmGreen-RdRP-MP；定点突变载体pmGreen-RdRP-MP后获得载体pmGreen-RdRP-MPd；在载体pmGreen-RdRP-MPd基础上构建载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；构建载体pMD18-T-MNN；最后在载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM和载体pMD18-T-MNN基础上载体pFolia40108；所述载体pmGreen-BsaI序列如SEQ ID No.15所示，所述载体pmGreen-MCS序列如SEQ ID No.16所示，所述载体pmGreen-RdRP-MP序列如SEQ ID No.17所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd序列如SEQ ID No.18所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM序列如SEQ ID No.19所示，所述载体pMD18-T-MNN序列如SEQ ID No.20所示。
具体来说，所述方法包括如下步骤：
(1)以pGreen载体为模板，通过SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物(正向引物和反向引物都带有BamHI和BsaI识别位点)扩增后获得1#DNA片段；1#DNA片段含有pBR322复制元件，卡那霉素抗性基因、pSa复制元件及RB四个元件；所述1#DNA片段序列如SEQ ID No.21所示；
(2)用BamHI酶切1#DNA片段并回收，通过1#DNA片段的自连，环化得到载体pmGreen-BsaI；
(3)合成序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条寡核苷酸链，退火后获得两端不对称的接头；接头内部含有BtgZI、BsaI和BbsI各两个酶切位点，两端含有与载体pmGreen-BsaI在BsaI酶切后匹配的粘性末端；
(4)在同一个试管内加入BsaI内切酶、T4 DNA连接酶、载体pmGreen-BsaI、接头及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pmGreen-MCS；
(5)以TVCV(accession no.U03387.1)为模板，通过SEQ ID No.5所示的正向引物和SEQ ID No.6所示的反向引物(正向引物和反向引物都带有BsaI酶切位点)扩增并回收获得2#DNA片段；2#DNA片段含有RNA聚合酶(RdRP)和移动蛋白(MP)；所述2#DNA片段序列如SEQID No.22所示；
(6)在同一个试管内加入BsaI内切酶、T4 DNA连接酶、载体pmGreen-MCS、2#DNA片段及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pmGreen-RdRP-MP；
(7)通过SEQ ID No.7所示的正向引物和SEQ ID No.8所示的反向引物定点突变pmGreen--RdRP-MP中的外壳蛋白CP的起始密码子，获得载体pmGreen-RdRP-MPd；
(8)以拟南芥基因组DNA为模板，通过SEQ ID No.9所示的正向引物和SEQ IDNo.10所示的反向引物扩增后获得actin基因的启动子序列(3#DNA片段，其序列如SEQ IDNo.23所示)；
(9)在同一个试管内加入BtgZI内切酶、T4 DNA连接酶、载体pmGreen-RdRP-MPd、actin基因启动子片段及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；
(10)将序列如SEQ ID No.11所示的MNN片段克隆至载体pMD18-T上，获得载体pMD18-T-MNN；MNN片段含有多克隆位点、3’非翻译区(NTR)及Nos终止子3个元件；
(11)在同一个试管内加入BbsI内切酶、T4 DNA连接酶、载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM、载体pMD18-T-MNN及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pFolia40108。
上述蛋白或多肽的植物表达载体可用于制备农杆菌介导的植物遗传转化制剂。还可用于制备植物生物反应器。所述植物为烟草，西红柿等茄科植物。
下面对本发明作进一步说明：
本发明要解决的技术问题之一，在于快速高效地将病毒载体转化宿主植株。
本发明是这样解决技术问题之一的：
基于农杆菌介导法的双元载体策略，即将农杆菌Ti质粒中的两个独立的区域放置在不同的质粒上，一种质粒携带有转化所需的Vir基因(在农杆菌中作为辅助质粒)；另一个质粒携带有两个T-DNA的边界重复序列，待转移的外源基因被克隆在两个边界重复序列之间。本发明将TMV基因组复制相关的RNA聚合酶(RdRP)和与病毒在宿主胞间移动有关的MP放置在双元载体pGreen，构建pFolia40108载体。将上述双元载体转化农杆菌C58c1(pSoup)，扩大培养后，通过注射法或真空浸渗法转化本生烟草(Nicotiana benthamiana)。
本发明要解决的技术问题之二，在于传统植物病毒载体所具有的稳定性差的问题。
本发明是这样解决技术问题之二的：
传统植物病毒载体在转染宿主后，产生具有外壳蛋白的完整病毒颗粒，进而系统地感染全植株。全过程涉及病毒的感染，病毒基因组复制/扩增，胞间运动，病毒颗粒的包装，宿主生物合成途径的抑制(或关闭)，宿主介导的基因沉默的抑制等。其中任何一个阶段的限制性因素都可能导致表达系统的低效或不稳定。如病毒的快速进化，插入片段的长度限制，CP启动子的重组等可能影响病毒外壳蛋白的包装，对病毒基因组的某些插入或删除可能影响病毒在全植株系统性的传播。本发明并不表达完整的CP蛋白，通过RNA复制酶对自身基因组的快速高效复制，获得大量的RNA作为外源基因表达的模板。本系统规避了病毒颗粒的产生，一方面降低了病毒颗粒产生过程中的多种限制因素，大大提高表达系统的稳定性；另一方面消除了传统病毒载体系统所具有的安全隐患，没有向环境释放所伴随的生态风险。
本发明所述植物表达载体含有LB、RB、芜菁脉明病毒(TVCV)来源的RNA聚合酶和MP、卡那霉素抗性基因、多克隆位点。本发明载体可以方便快捷插入目的基因，增加了植物病毒载体的稳定性，提高了工作效率。该载体的发明可为植物生物反应器的应用提供有力支持。
总之，本发明针对传统植物病毒的相应缺陷，构建了一种新型蛋白或多肽的植物表达载体。该表达载体基于芜菁脉明病毒(TVCV)的高度感染性和农杆菌对外源基因高效传递的特点，极大地提高了外源基因在烟草中的表达效率。该表达载体将TMV基因组复制和胞间移动相关的基因克隆于穿梭载体pGreen，同时设计了含有IIs限制性内切酶BsaI的多克隆位点。通过该表达载体可以高效地表达各种抗体、多肽、酶等产品。且该表达载体具有安全性好，转染效率高，表达量大等特点。
附图说明
图1为本发明植物表达载体的构建流程图；
图2为本发明中1#片段的PCR结果；
图3为载体pmGreen-BsaI；
图4为载体pmGreen-MCS；
图5为本发明中载体pmGreen-MCS的酶切验证图；
图6为本发明中RdRP-MP片段的PCR结果；
图7为载体pmGreen-RdRP-MP；
图8为本发明中拟南芥actin基因启动子片段的PCR结果；
图9为载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；
图10为载体pMD18-T-MNN；
图11为载体pFolia40108；
图12为本发明中DsRed片段的PCR结果；
图13为载体pFolia40108-DsRed；
图14为DsRed在烟草中的表达结果。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的具体实验方法如无特殊说明，均为常规方法或按照制造厂商说明书建议的条件实施。
实施例中，所述载体pmGreen-BsaI序列如SEQ ID No.15所示，所述载体pmGreen-MCS序列如SEQ ID No.16所示，所述载体pmGreen-RdRP-MP序列如SEQ ID No.17所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd序列如SEQ ID No.18所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM序列如SEQ ID No.19所示，所述载体pMD18-T-MNN序列如SEQ ID No.20所示。所述1#DNA片段序列如SEQ ID No.21所示；所述2#DNA片段序列如SEQ ID No.22所示；所述3#DNA片段序列如SEQ ID No.23所示。
实施例1
pmGreen-BsaI的构建
①以SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物，以pGreen载体为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得1#片段，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
pGreen 1μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 29.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，2min；72℃，10min，30个循环。PCR结果如图2所示。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收2.6kb大小的片段。
②用BamHI-HF酶切，并用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒纯化该片段。酶切反应体系为：
反应条件：37℃，2h。
③用NEB公司T4 DNA Ligase连接酶切回收的1#片段，并转化DH5α大肠杆菌。反应体系：
1#片段 5μL
T4 DNA Ligase Reaction Buffer(10×) 1μL
T4 DNA Ligase 1μL
ddH2O 3μL
反应条件：4℃，16h。转化DH5α大肠杆菌按照说明书转化步骤操作，得到载体pmGreen-BsaI
实施例2
载体pmGreen-MCS的构建
委托公司合成寡核苷酸链Oligo1(SEQ ID No.3)和寡核苷酸链Oligo2(SEQ IDNo.4)，用TE溶液溶解上述两条寡核苷酸链，配制为100μM溶液。取Oligo1和Oligo2各10μL混合，在PCR仪上退火(形成接头)。退火程序：95℃，30sec；72℃，2min；37℃，2min；25℃，2min；4℃，5min。
②将退火形成的双链寡聚脱氧核糖核苷酸(接头)稀释100倍(终浓度0.5μM)
③用NEB公司T4 DNA Ligase和BsaI-HF在同一个试管内进行酶切-连接反应，反应体系：
pmGreen-BsaI(100ng/μL) 1μL
0.5μM接头 1μL
BsaI-HF 0.5μL
T4 DNA Ligase 1μL
ddH2O 6.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取5μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pmGreen-MCS。pmGreen-MCS的BbsI酶切验证结果如图3所示。
实施例3
载体pmGreen-RdRP-MP的构建
以SEQ ID No.5所示的正向引物和SEQ ID No.6所示的反向引物，以TVCV(accessionno.U03387.1)为模板，用Q5DNA聚合酶克隆2#片段，2#片含有RdRP-MP，PCR反应体系为：
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，3min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收5.6kb大小的片段。RdRP-MP片段的PCR结果如图4所示。
②用NEB公司T4 DNA Ligase和BsaI-HF在同一个试管内进行酶切-连接反应，反应体系：
pmGreen-MCS(100ng/μL) 1μL
2#片段(100ng/μL) 1μL
BsaI-HF 0.5μL
T4 DNA Ligase 1μL
ddH2O 6.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取5μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pmGreen-RdRP-MP。
实施例4
定点突变pmGreen-RdRP-MP中CP的起始密码子
①由SEQ ID No.7所示的正向引物和SEQ ID No.8所示的反向引物，以pmGreen-RdRP-MP为模板，用Q5DNA聚合酶进行扩增，PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
pmGreen-RdRP-MP 1μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 29.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，4min；72℃，10min，30个循环。
②PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1μL Dpn I，混匀后37℃孵育1小时。DpnI消化完毕后可以直接用于转化，取5μL反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pmGreen-RdRP-MPd。
实施例5
载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM的构建
①使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根，Cat.No.DP305)提取哥伦比亚野生型拟南芥叶片组织基因组DNA，按照说明书步骤操作。
②以SEQ ID No.9所示的正向引物和SEQ ID No.10所示的反向引物，以拟南芥基因组DNA为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得actin基因的启动子序列(3#DNA片段)。PCR反应体系为：
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
拟南芥基因组DNA 1μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 29.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收840bp大小的片段。PCR结果如图5所示。
②用NEB公司T4 DNA Ligase和BtgZI在同一个试管内进行酶切-连接反应，反应体系：
pmGreen-RdRP-MPd(100ng/μL) 1μL
回收的DNA片段(100ng/μL) 1μL
BtgZI 0.5μL
T4 DNA Ligase 1μL
ddH2O 6.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取5μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM。
实施例6
载体pFolia40108的构建
①委托公司合成SEQ ID No.11所示的DNA片段(MNN)，克隆在载体pMD18-T。
②用NEB公司T4 DNA Ligase和BbsI在同一个试管内进行酶切-连接反应，反应体系：
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取5μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pFolia40108。
实施例7
植物表达载体pFolia40108在烟草中表达DsRed的应用
①以SEQ ID No.12所示的正向引物和SEQ ID No.13所示的反向引物，以质粒pDsRed2为模板，用Q5DNA聚合酶扩增，获得DsRed序列，PCR体系如下。
5×Q5反应缓冲液 10μL
2.5mM dNTPs 4μL
正向引物(10μM) 2.5μL
反向引物(10μM) 2.5μL
质粒pDsRed2 1μL
Q5超保真DNA聚合酶 0.5μL
ddH2O 29.5μL
反应条件：98℃，10sec；55℃，30sec；72℃，1min；72℃，10min，30个循环。按照天根公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书操作，回收700bp大小的片段。PCR结果如图12所示。
②用NEB公司T4 DNA Ligase和BbsI在同一个试管内进行酶切-连接反应，反应体系：
pFolia40108(100ng/μL) 1μL
DsRed片段(100ng/μL) 1μL
BsaI 0.5μL
T4 DNA Ligase 1μL
ddH2O 6.5μL
反应条件：37℃，2min；16℃，5min，25个循环。取5μL酶切-连接反应物转化DH5α大肠杆菌，按照说明书转化步骤操作，得到载体pFolia40108-DsRed。
③将pFolia40108-DsRed采用化学转化法转化农杆菌C58c1(pSoup)，用含有四环素和卡那霉素的LB固体培养基筛选阳性单菌落。
④农杆菌转化烟草采用Orzaez D(Plant Physiology 140(1):3–11)等所提供的方法。将5mL LB培养基(含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL四环素)的过夜培养菌液(28℃，220rpm)，以2000g速度离心10min，收集菌体沉淀。重悬菌体沉淀于MES溶液(10mMMES pH5.6,10mM MgCl2,200μM乙酰丁香酮)并调整其600nm处OD值为0.1。采用去除针尖的1mL注射器将农杆菌注射到5-6周的烟草(N.benthamiana)叶片背面。采用24℃，16h光照/8h黑暗的培养条件继续培养烟草，1周后烟草叶片的DsRed表达状况如图14所示。

Claims (5)

1.一种蛋白或多肽的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体序列如SEQ IDNo.14所示，命名为载体pFolia40108。
2.如权利要求1所述植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述方法为：首先构建载体pmGreen-BsaI；在载体pmGreen-BsaI基础上构建载体pmGreen-MCS；在pmGreen-MCS基础上构建载体pmGreen-RdRP-MP；定点突变载体pmGreen-RdRP-MP后获得载体pmGreen-RdRP-MPd；在载体pmGreen-RdRP-MPd基础上构建载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；构建载体pMD18-T-MNN；最后在载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM和载体pMD18-T-MNN基础上构建载体pFolia40108；所述载体pmGreen-BsaI序列如SEQ ID No.15所示，所述载体pmGreen-MCS序列如SEQ ID No.16所示，所述载体pmGreen-RdRP-MP序列如SEQ ID No.17所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd序列如SEQ ID No.18所示，所述载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM序列如SEQ ID No.19所示，所述载体pMD18-T-MNN序列如SEQ ID No.20所示。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
(1)以pGreen载体为模板，通过SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物扩增后获得1#DNA片段；所述1#DNA片段序列如SEQ ID No.21所示；
(2)用BamHI酶切1#DNA片段并回收，通过1#DNA片段的自连，环化得到载体pmGreen-BsaI；
(3)合成序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的两条寡核苷酸链，退火后获得两端不对称的接头；
(4)在同一个试管内加入BsaI内切酶、T4DNA连接酶、载体pmGreen-BsaI、接头及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pmGreen-MCS；
(5)以TVCV为模板，通过SEQ ID No.5所示的正向引物和SEQ ID No.6所示的反向引物扩增并回收获得2#DNA片段；所述2#DNA片段序列如SEQ ID No.22所示；
(6)在同一个试管内加入BsaI内切酶、T4DNA连接酶、载体pmGreen-MCS、2#DNA片段及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pmGreen-RdRP-MP；
(7)通过SEQ ID No.7所示的正向引物和SEQ ID No.8所示的反向引物定点突变pmGreen--RdRP-MP中的外壳蛋白CP的起始密码子，获得载体pmGreen-RdRP-MPd；
(8)以拟南芥基因组DNA为模板，通过SEQ ID No.9所示的正向引物和SEQ ID No.10所示的反向引物扩增后获得actin基因的启动子序列；
(9)在同一个试管内加入BtgZI内切酶、T4DNA连接酶、载体pmGreen-RdRP-MPd、actin基因启动子片段及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM；
(10)将序列如SEQ ID No.11所示的MNN片段克隆至载体pMD18-T上，获得载体pMD18-T-MNN；
(11)在同一个试管内加入BbsI内切酶、T4DNA连接酶、载体pmGreen-RdRP-MPd-acPROM、载体pMD18-T-MNN及连接缓冲液，进行酶切-连接反应，获得载体pFolia40108。
4.权利要求1所述蛋白或多肽的植物表达载体在制备农杆菌介导的植物遗传转化制剂中的应用。
5.权利要求1所述蛋白或多肽的植物表达载体在制备植物生物反应器中的应用。
CN201610564555.8A 2016-07-18 2016-07-18 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用 Active CN106566842B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610564555.8A CN106566842B (zh) 2016-07-18 2016-07-18 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610564555.8A CN106566842B (zh) 2016-07-18 2016-07-18 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106566842A true CN106566842A (zh) 2017-04-19
CN106566842B CN106566842B (zh) 2019-04-19

Family

ID=58532204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610564555.8A Active CN106566842B (zh) 2016-07-18 2016-07-18 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106566842B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107326043A (zh) * 2017-07-18 2017-11-07 河北省农林科学院粮油作物研究所 一种多功能载体的构建及使用方法
CN114369617A (zh) * 2022-03-16 2022-04-19 广东省农业科学院植物保护研究所 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268192A (zh) * 2005-09-17 2008-09-17 爱康遗传有限公司 包含由植物病毒外壳蛋白、肽接头和重组蛋白组成的多种融合蛋白的植物病毒颗粒及此类植物病毒颗粒用于蛋白质纯化的用途
CN102492716A (zh) * 2011-12-12 2012-06-13 江南大学 一种便于实现蛋白质天然n端表达的毕赤酵母表达载体的构建和使用方法
RU2012153958A (ru) * 2012-12-14 2014-06-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ получения препаративных количеств антигенов флоэмно-ограниченных вирусов

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101268192A (zh) * 2005-09-17 2008-09-17 爱康遗传有限公司 包含由植物病毒外壳蛋白、肽接头和重组蛋白组成的多种融合蛋白的植物病毒颗粒及此类植物病毒颗粒用于蛋白质纯化的用途
CN102492716A (zh) * 2011-12-12 2012-06-13 江南大学 一种便于实现蛋白质天然n端表达的毕赤酵母表达载体的构建和使用方法
RU2012153958A (ru) * 2012-12-14 2014-06-20 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Способ получения препаративных количеств антигенов флоэмно-ограниченных вирусов

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107326043A (zh) * 2017-07-18 2017-11-07 河北省农林科学院粮油作物研究所 一种多功能载体的构建及使用方法
CN107326043B (zh) * 2017-07-18 2019-12-10 河北省农林科学院粮油作物研究所 一种多功能载体的构建及使用方法
CN114369617A (zh) * 2022-03-16 2022-04-19 广东省农业科学院植物保护研究所 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用
CN114369617B (zh) * 2022-03-16 2022-06-28 广东省农业科学院植物保护研究所 一种油菜花叶病毒侵染性克隆载体及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106566842B (zh) 2019-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peyret et al. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants
CA2651907C (en) Bipartite system, method and composition for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants
PT2240589E (pt) Sistemas de expressão de proteínas
JPS60227683A (ja) 単子葉類の植物のゲノム中に異質ｄｎａの組込みの為の方法
Liu et al. A tobamovirus expression vector for agroinfection of legumes and Nicotiana
CN106460005B (zh) 修饰的cpmv增强子元件
WO2020083339A1 (zh) 一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统
CN107828816A (zh) 一种酵母‑农杆菌穿梭载体及构建方法和应用
EP0573767A1 (en) Process for production of exogenous gene or its product in plant cells
CN106566842B (zh) 一种蛋白或多肽的植物表达载体及其应用
CN105980561B (zh) Cpmv增强子元件
CN116286931B (zh) 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用
WO2020168424A9 (en) Rotavirus vp7 fusion proteins and rotavirus-like particles comprising them
WO2014129560A1 (ja) 植物において外来遺伝子を発現させるための核酸分子及び方法
US20220090107A1 (en) Rna viral rna molecule for gene editing
Appaiahgari et al. Plant-based edible vaccines: issues and advantages
CN110144364B (zh) 辣椒轻斑驳病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重组系统及其应用
Ravin et al. Complete sequencing of potato virus X new strain genome and construction of viral vector for production of target proteins in plants
CN109022479A (zh) 一种愈伤组织阶段的筛选方法
CN117286178B (zh) 一种双组份病毒载体的简化构建方法及其相关应用
KR101336507B1 (ko) 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 아그로박테리움 투메파시언스
KR101345890B1 (ko) 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 ｋａｃｃ９５０８３ｐ 아그로박테리움 투메파시언스
KR101345857B1 (ko) 오이 모자이크 바이러스의 감염활성을 식물체에서 재현시킬 수 있는 기탁번호 ｋａｃｃ９５０８２ｐ의 아그로박테리움 투메파시언스
KR102342405B1 (ko) 박과진딧물매개황화바이러스 감염성 클론 및 이의 용도
Baesi et al. CLONING AND TRANSFORMATION OF HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN (HBSAG) GENE TO TOMATO (LYCOPERSICONESCULENTUM MILL.)

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Pan Weisong

Inventor after: Liu Qijun

Inventor after: Wu Chuan

Inventor before: Pan Weisong

Inventor before: Wu Chuan

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220610

Address after: 410221 Room 501, shop 5024, fifth floor, block B, Rome Commercial Plaza, No. 608, Fenglin Third Road, Changsha high tech Development Zone, Changsha, Hunan

Patentee after: Changsha nuohesong biotechnology partnership (L.P.)

Address before: 410128 No. 1, Nongda Road, Furong district, Hunan, Changsha, China. Hunan Agricultural University

Patentee before: Hunan Agricultural University

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221010

Address after: 518116 E1901, Area A2, Galaxy Zhihui, No. 6698, Longgang Avenue (Henggang Section), Bao'an Community, Yuanshan Street, Longgang District, Shenzhen, Guangdong

Patentee after: Shenzhen Nuoda Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 410221 Room 501, shop 5024, fifth floor, block B, Rome Commercial Plaza, No. 608, Fenglin Third Road, Changsha high tech Development Zone, Changsha, Hunan

Patentee before: Changsha nuohesong biotechnology partnership (L.P.)

TR01 Transfer of patent right