CN101268192A - 包含由植物病毒外壳蛋白、肽接头和重组蛋白组成的多种融合蛋白的植物病毒颗粒及此类植物病毒颗粒用于蛋白质纯化的用途 - Google Patents

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Abstract

一种使用包含多个融合蛋白分子的病毒颗粒或病毒样颗粒纯化目的蛋白质的方法，所述融合蛋白包含下述融合蛋白结构域：(i)植物病毒外壳蛋白，(ii)重组蛋白，和(iii)任选地，连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，其中所述病毒颗粒的形成不需要游离的病毒外壳蛋白。

Description

包含由植物病毒外壳蛋白、肽接头和重组蛋白组成的多种融合蛋白的植物病毒颗粒及此类植物病毒颗粒用于蛋白质纯化的用途
发明领域
本发明涉及一种使用包含重组植物病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒的亲和基质亲和纯化目的蛋白质的方法。本发明还涉及亲和基质和重组病毒颗粒，其中，重组病毒颗粒在其表面暴露一种或多种重组蛋白。本发明也涉及作为所述重组病毒颗粒的结构单元的融合蛋白、编码所述融合蛋白的多核苷酸、包含所述多核苷酸的植物、植物组织或植物细胞。本发明还涉及一种产生所述亲和基质的方法和产生所述重组病毒颗粒的方法。本发明也涉及所述融合蛋白用于亲和纯化目的蛋白质的用途。
发明背景
已知在产物产量已经优化的微生物蛋白质表达系统中，高达90％的总生产成本与自宿主纯化目的蛋白质有关，而不是产物本身的费用。为了使蛋白质生产更经济，需要允许快速和价廉的从其它污染组分中分离目的蛋白质或非蛋白质的目的小分子的策略。
(WO02/068927)已经提出使用具有与植物病毒颗粒表面连接的短肽(例如，FLAG-标签)的植物病毒颗粒通过亲和纯化用于纯化目的蛋白质。然而，在现有技术的方法中，待纯化的目的蛋白质必须融合至能将该肽结合至病毒颗粒表面的蛋白质如单链抗体或其它的纯化标签。因此必需在亲和纯化步骤后切割待纯化的蛋白质，这是人们想避免的额外的方法步骤。
抗体和抗体衍生物组成了大约20％的当前开发的生物药品。抗体的纯化占总生产成本的50-80％(综述：Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.，20：639-654)。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的A蛋白广泛用作免疫球蛋白纯化过程中的亲和蛋白质(综述：Jungbauer & Hahn，2004，Curr.Opin.Drug.Disc.& Dev.，7：248-256)。A蛋白主要通过疏水性相互作用(Dowd等人，1998，Nat.Biotechnol.，16：190-195)与免疫球蛋白的Fc结构域可逆地相互作用(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Methods，62：1-13；Gouda等人，1998，Biochemistry，37：129-136)。A蛋白的高稳定性和选择性使其成为免疫球蛋白纯化的优选通用配体。用于市场的A蛋白的主要来源为大肠杆菌(E.coli)中产生的重组A蛋白(Duggleby & Jones，1983，NucleicAcids Res.，11：3065-3076；Engel等人，1992，Protein Expr.Purif.，3：108-113)。在通过用A蛋白亲和纯化来纯化抗体的现有技术方法中，首先必须表达并纯化A蛋白，然后与基质如琼脂糖凝胶连接，然后将其用于抗体的亲和纯化。因此，亲和基质的生产涉及许多步骤，并且是费力的和昂贵的。由于亲和基质的成本较高，亲和基质一般用于几次纯化步骤，导致在相同的亲和基质上纯化的连续的样品之间污染的危险。因此非常需要用于抗体纯化的更廉价和易于产生的亲和基质。此种廉价的亲和基质可以为单次使用的基质，避免污染的危险。
因此本发明的一个目的是提供一种亲和纯化目的蛋白质的方法，其中在亲和纯化步骤之后不需要在目的蛋白质上进行切割步骤。本发明的又一目的是提供一种使用经济的和易于获得的亲和基质纯化如治疗性抗体的免疫球蛋白或其融合蛋白的方法。本发明的另一目的是提供一种纯化治疗性抗体而没有污染人或其它动物病原体的危险的方法。本发明的再一目的是提供一种用于所述纯化方法的亲和基质。
发明总述
这些目的通过纯化目的蛋白质的方法实现，其包括如下步骤：
(a)提供包含融合蛋白的亲和基质，所述融合蛋白包含如下融合蛋白结构域：
(i)植物病毒外壳蛋白、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)任选至少一个连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，
所述融合蛋白的所述重组蛋白对待纯化目的蛋白质具有亲和性，
(b)使所述亲和基质与包含所述目的蛋白质的液体组合物在允许所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下接触，其中所述亲和基质在所述条件下是不溶解的，
(c)在保持所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下，自步骤(b)的混合物中除去没有结合至所述重组蛋白的所述液体组合物中的组分，和
(d)自所述亲和基质分离所述目的蛋白质以获得纯化形式的所述目的蛋白质。
上述目的还通过包含多个融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒而实现，所述融合蛋白包含如下融合蛋白结构域：
(i)植物病毒外壳蛋白结构域、
(ii)重组蛋白结构域，和
(iii)至少一个连接所述植物病毒外壳蛋白质和所述重组蛋白的肽接头，
其中所述重组病毒颗粒的形成不需要游离的病毒外壳蛋白。所述重组结构域或所述外壳蛋白结构域可依次具有一个或多个结构域。
本发明还提供了包含融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒，所述融合蛋白包含如下融合蛋白区段：
(i)植物病毒外壳蛋白、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，所述肽接头包含至少10个氨基酸残基，
其中所述病毒颗粒包含最多20mol-％的游离病毒外壳蛋白。
本发明还提供了包含融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒，所述融合蛋白包含如下融合蛋白区段：
(i)芜菁脉明病毒(turnip vein clearing virus)的植物病毒外壳蛋白或与芜菁脉明病毒的外壳蛋白具有至少40％的同一性的蛋白质、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，所述肽接头包含至少10个氨基酸残基。
本发明还提供了包含融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒，所述融合蛋白包含如下融合蛋白区段：
(i)植物病毒外壳蛋白、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)任选地，连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，所述肽接头包含至少10个氨基酸残基，
其中所述重组蛋白能结合至免疫球蛋白，优选能结合至免疫球蛋白的Fc区。最优选的所述重组蛋白分别为A蛋白或G蛋白或A蛋白或G蛋白的变体，其中所述变体能结合至免疫球蛋白的Fc区。
本发明也提供了纯化目的蛋白质的方法，其包括如下步骤：
(a)提供多个包含如上定义的融合蛋白的所述重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒，所述融合蛋白的所述重组蛋白对所述待纯化的目的蛋白具有亲和性，
(b)在允许所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下，使所述重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒与包含所述目的蛋白质的液体组合物接触，其中在所述条件下所述亲和基质是不溶解的，
(c)在保持所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下，自步骤(b)的混合物中除去没有结合至所述重组蛋白的所述液体组合物中的组分，和
(d)自所述亲和基质分离所述目的蛋白质。
文中所述重组蛋白也称为“亲和蛋白质”。
本发明也提供了本发明的亲和基质或本发明的重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒用于纯化目的蛋白质的用途。本发明还提供了本发明的融合蛋白用于纯化目的蛋白质的用途。
本发明的亲和基质包含本发明的重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒。所述亲和蛋白质对免疫球蛋白或其衍生物具有亲和性，优选所述亲和蛋白质为葡萄球菌A蛋白或链球菌G蛋白或这些蛋白质的衍生物。
本发明还提供了产生根据本发明的重组植物病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒的方法，其包括在细菌、植物、植物组织或植物细胞中表达所述融合蛋白。本发明还提供了编码如上定义的融合蛋白的多核苷酸和包含所述多核苷酸的植物、植物组织或植物细胞。
此外，本发明提供了自如上定义的植物、植物组织或植物细胞能够获得的重组病毒物质。
另外，本发明提供了融合蛋白。特别地，本发明提供了包含如下融合蛋白区段的融合蛋白：植物病毒外壳蛋白、接头肽和葡萄球菌A蛋白或能结合免疫球蛋白的A蛋白衍生物，其中所述融合蛋白能形成病毒颗粒或病毒样颗粒。此外，本发明提供了包含如下融合蛋白区段的融合蛋白：植物病毒外壳蛋白、接头肽和链球菌G蛋白(备选地：链霉抗生物素或其衍生物)或能结合免疫球蛋白的链球菌G蛋白衍生物。
而且，本发明提供了包含植物、植物组织或植物细胞以及如上定义的多核苷酸的组分包(kit-of-parts)。
此外，本发明提供了用途。
本发明也提供了用于目的蛋白质如免疫球蛋白的亲和纯化的亲和基质，所述亲和基质包含重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒，重组病毒颗粒或重组植物病毒样颗粒包含如上所定义的融合蛋白分子，其中相对于在所述亲和基质中存在的游离病毒外壳蛋白和所述融合蛋白的总数，所述重组病毒颗粒包含至多20mol-％的游离病毒外壳蛋白。“游离病毒外壳蛋白”为没有与本发明所述的重组蛋白融合的植物病毒外壳蛋白。
本发明的发明人已经发现使用包含所述重组病毒颗粒或所述重组植物病毒样颗粒的亲和基质可以亲和纯化免疫球蛋白，其中所述重组病毒颗粒或所述重组植物病毒样颗粒具有结合至其表面的亲和蛋白质如A蛋白或G蛋白的。本发明人已经发现可将重组蛋白(如A蛋白、G蛋白等，或其衍生物)与植物病毒外壳蛋白融合而不破坏获得的融合蛋白装配成病毒颗粒的能力。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白在植物细胞中表达而不共表达游离的病毒外壳蛋白。自所述融合蛋白装配的病毒颗粒具有高密度的结合在所述病毒颗粒表面的重组蛋白。
在本发明之前，还没有产生在植物病毒颗粒表面包含重组蛋白作为与植物病毒外壳蛋白的融合物的植物病毒颗粒的技术，其中重组蛋白的大小不限于短肽，且其中除病毒外壳蛋白和重组蛋白的融合蛋白外，病毒颗粒形成不需要提供病毒外壳蛋白。在此，本发明的系统没有现有技术的缺陷：其优选不需要游离病毒外壳蛋白的共表达用于装配其表面展示重组蛋白的病毒颗粒。结果，病毒颗粒表面上重组蛋白的密度远高于包含大量游离病毒外壳蛋白的病毒颗粒的情况。
本发明的融合蛋白是具有N末端和C末端的连续多肽。
在一个实施方案中，融合蛋白包含如下结构域：植物病毒外壳蛋白结构域、重组蛋白结构域和至少一个连接所述植物病毒外壳蛋白结构域和所述重组蛋白结构域的肽接头。在这个实施方案中，所述重组蛋白可以存在于外壳蛋白的氨基酸序列的一级结构中，其中外壳蛋白结构域可由融合蛋白的一级结构的两个外壳蛋白区段形成。在这个实施方案中，所述重组蛋白通过两个肽接头与所述外壳蛋白连接，一个肽接头连接所述重组蛋白的N-末端部分至所述外壳蛋白的N-末端区段，第二个肽接头连接所述重组蛋白的C-末端部分至所述外壳蛋白的C-末端区段。
在另一实施方案中，外壳蛋白结构域、重组蛋白结构域和一个肽接头是所述融合蛋白的一级结构的按序区段。在这个实施方案中，从融合蛋白的N-末端至C-末端，对于融合蛋白区段(或结构域)的顺序有两种可能性：(i)所述植物病毒外壳蛋白位于融合蛋白的N-末端，且接着为所述肽接头，接着为位于融合蛋白C-末端的所述重组蛋白；(ii)所述重组蛋白位于融合蛋白的N-末端，且接着为所述肽接头，接着为位于融合蛋白C-末端的所述外壳蛋白。因此，在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含一个肽接头。
在所有这些实施方案中，融合蛋白在N-末端、在C-末端或在所述融合蛋白中，可还包含氨基酸残基或序列区段。文中“结构域”和“区段”互换使用。
所述植物病毒外壳蛋白可衍生自以下列出的任何植物病毒。在一个实施方案中，所述植物病毒外壳蛋白衍生自形成杆状病毒颗粒的植物病毒。“衍生”表示在本发明的融合蛋白中使用的外壳蛋白不必与植物病毒的天然外壳蛋白相同。取而代之的是，相对于植物病毒的天然外壳蛋白，融合蛋白中使用的外壳蛋白可具有添加、缺失、插入或突变。仅需要外壳蛋白保留其在合适条件下形成病毒或病毒样颗粒的能力。在一个实施方案中，将天然植物病毒外壳蛋白的至多20个氨基酸残基缺失和/或突变。在另一实施方案中，将至多20个氨基酸残基插入到植物病毒的植物病毒外壳蛋白的天然序列中，本发明的外壳蛋白衍生自所述植物病毒的植物病毒外壳蛋白。
所述外壳蛋白可来自正义单链RNA病毒。可在本发明中使用的衍生自植物病毒的外壳蛋白的所述植物病毒的实例包括烟草花叶病毒组(tobamoviruses)如烟草花叶病毒(TMV)、芜菁脉明病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒及其片段或同源物，条件是所述片段或同源物在合适的条件下能形成病毒颗粒或病毒样颗粒。优选地，本发明的外壳蛋白与芜菁脉明病毒、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒或马铃薯Y病毒的外壳蛋白具有至少40％的序列同一性。在另一实施方案中，所述序列同一性为至少50％；在又一实施方案中，所述序列同一性为至少60％。在重要的实施方案中，所述外壳蛋白与烟草花叶病毒的外壳蛋白具有至少80％的序列同一性。
本发明的重组蛋白暴露于所述重组病毒颗粒的表面。对于所述重组蛋白没有限制。所述重组蛋白可以为优选通过一个或多个肽接头融合至植物病毒外壳蛋白的任何蛋白质区段。可以根据本发明的病毒颗粒的应用而选择所述重组蛋白的类型。本发明人已经首次发现可产生这样的重组病毒颗粒，所述重组病毒颗粒具有暴露于所述病毒颗粒表面的重组蛋白而不限于小于40或甚至小于20个氨基酸的小肽。因此，本发明显示其具有至少50个氨基酸残基大小的重组蛋白的完全的潜力。在一个实施方案中，所述重组蛋白具有至少70个氨基酸残基大小；在又一实施方案中，所述重组蛋白具有具有至少90个氨基酸残基大小；在另又一实施方案中，所述重组蛋白具有至少110个氨基酸残基大小。
本发明的重组病毒颗粒或病毒样颗粒为植物病毒颗粒，因为所述融合蛋白的外壳蛋白结构域或区段衍生自植物病毒。本发明的病毒颗粒为重组的，因为它们由为本发明的融合蛋白的一部分的外壳蛋白装配。文中本发明的重组病毒颗粒也称为“所述病毒颗粒”。
例如，当所述病毒颗粒的基质用于亲和纯化目的蛋白质时，所述重组蛋白可作为亲和蛋白质发挥功能。因此，对于本发明的病毒颗粒表面上暴露的蛋白质，文中术语“重组蛋白”和“亲和蛋白质”可互换使用。本发明的重组蛋白是重组的，因为其为本发明的融合蛋白的区段或结构域。
为了允许使用本发明的病毒颗粒亲和纯化化合物或目的蛋白质，所述重组蛋白优选对所述化合物或目的蛋白质具有亲和性。在此，欲使用本发明的亲和基质，或重组病毒颗粒或病毒样颗粒，或融合蛋白纯化的蛋白质称为“目的蛋白质”。待纯化的目的蛋白质为不同于本发明的融合蛋白的蛋白质。在一个实施方案中，所述重组蛋白对免疫球蛋白或其衍生物如治疗性抗体具有亲和性。对免疫球蛋白或其衍生物的亲和性可以为对免疫球蛋白的恒定区的亲和性。在这种情况下，所述重组蛋白可以为对免疫球蛋白具有亲和性的葡萄球菌A蛋白或其结构域或衍生物。在另一实施方案中，所述重组蛋白可以为能结合免疫球蛋白的链球菌G蛋白或其衍生物。在另一实施方案中，所述重组蛋白可以为链霉抗生物素或其衍生物如对StrepTagII具有亲和性的Strepactin。
如果待纯化的化合物为小分子，融合蛋白可以为对所述小分子具有亲和性的任何蛋白质。例如，所述重组蛋白可以为对所述小分子具有亲和性的抗体或抗体的单链片段。
本发明的肽接头在所述融合蛋白的一级结构中连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白。尽管存在可具有至少50个氨基酸残基大小的所述重组蛋白，肽接头也允许装配所述融合蛋白的病毒颗粒。所述肽接头应为柔性的。在一个实施方案中，所述肽接头为了是柔性的，没有二级结构。在另一实施方案中，所述肽接头形成螺旋。优选地，所述肽接头不形成β-折叠。设计具有预定二级结构或没有二级结构的肽属于本领域技术人员的一般知识。例如，脯氨酸残基断开螺旋和β-折叠。因此人们可以将一个或多个脯氨酸残基包括在所述肽接头中。备选地，所述肽接头可以包含大部分的甘氨酸残基，因此可以获得高度柔性的肽接头。
所述肽接头优选具有至少10个氨基酸残基。在另一实施方案中，所述肽接头具有至少15个氨基酸残基；在又一实施方案中，所述肽接头具有至少20个氨基酸残基；在又一实施方案中，所述肽接头具有至少30个氨基酸残基。结合到所述病毒颗粒表面的重组蛋白越大，应将肽接头制备得越长。例如，如果所述重组蛋白具有200个以上的氨基酸残基，肽接头优选具有至少25个氨基酸残基。
在一个实施方案中，所述肽接头的长度在10～70个氨基酸残基之间。在另一实施方案中，所述肽接头的长度在13～50个氨基酸残基之间。在进一步的实施方案中，所述肽接头的长度在16～30个氨基酸之间。
在一个实施方案中，所述重组蛋白和所述肽接头一起具有至少60个氨基酸残基。在另一实施方案中，所述重组蛋白和所述肽接头一起具有至少80个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述重组蛋白和所述肽接头一起具有至少100个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述重组蛋白和所述肽接头一起具有至少130个氨基酸残基。
本发明的病毒颗粒或病毒样颗粒可以通过在细菌或植物宿主中表达编码本发明的所述融合蛋白的多核苷酸而产生。所述植物宿主可以为植物细胞、植物组织或整个植物。除了编码所述融合蛋白外，所述多核苷酸将具有需要用于在选择的宿主中表达所述融合蛋白的调控元件。在表达所述多核苷酸后，本发明的病毒颗粒通常在宿主细胞中装配或可以在合适条件下自宿主细胞分离所述融合蛋白后在体外装配。
本发明的所述病毒颗粒优选不需要存在用于装配的游离病毒外壳蛋白。因此，在一个实施方案中，表达所述融合蛋白而不必共表达游离病毒外壳蛋白。然而，在存在游离外壳蛋白时，本发明的融合蛋白可以装配成所述病毒颗粒。在一个实施方案中，所述病毒颗粒包含至多30mol-％的游离病毒外壳蛋白，优选至多20mol-％，更优选至多10mol-％的游离病毒外壳蛋白。所述病毒颗粒中游离病毒外壳蛋白的含量可以通过将所述病毒颗粒溶解并进行质谱分析如MALDI或ESI质谱分析用于确定所述病毒颗粒的蛋白质组分的分子量和相对丰度。所述病毒颗粒中包含的任何病毒RNA可以在进行质谱分析前去除或当确定所述病毒颗粒的蛋白质组分的相对丰度时可以忽略其信号。
在又一实施方案中，对病毒颗粒进行SDS-PAGE并通过考马斯染色或银染色。如通过商品化凝胶读数器所确定的那样，由游离病毒外壳蛋白引起的条带的强度为由所述融合蛋白引起的条带强度的至多20％，优选至多10％。
为了本发明的目的，将病毒颗粒或病毒样颗粒定义为包含多个病毒外壳蛋白分子、多个本发明的融合蛋白分子、或病毒外壳蛋白分子和本发明的所述融合蛋白分子的混合物的寡聚颗粒。所述颗粒一般具有与所述外壳蛋白来源的野生型病毒的病毒颗粒的大小和形状相似的如电子显微镜中看到的大小和形状。如在Analytical Biochem.，333(2004)230-235中描述的电子显微镜中确定的病毒颗粒或病毒样颗粒的大小优选在最短尺寸上为至少10nm，更优选在在最短尺寸上为至少13nm。
在一个实施方案中，使用植物病毒载体在植物细胞或植物中产生重组病毒颗粒或病毒样颗粒，其中天然植物病毒的外壳蛋白可读框(ORF)由本发明的融合蛋白的ORF代替。由于植物病毒外壳蛋白是在用植物病毒或植物病毒载体感染后在宿主细胞中表达的最丰富的蛋白质，所以使用植物病毒载体具有每个宿主细胞产生大量本发明的融合蛋白的优点。而且，病毒载体的细胞至细胞运动或系统运动可导致病毒载体扩散和大量植物细胞表达所述融合蛋白。使用病毒载体表达蛋白质如本发明的融合蛋白的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，使用农杆菌介导的转化将病毒载体导入植物细胞或作为双元载体部分的植物细胞。
本发明也提供了用于纯化化合物或目的蛋白质的亲和基质。所述亲和基质包含本发明的多个病毒颗粒或病毒样颗粒。在一个实施方案中，所述亲和基质中的所述病毒颗粒或病毒样颗粒不是共价交联的。在另一实施方案中，所述亲和基质中的病毒颗粒或病毒样颗粒可以通过交联剂交联。可用于交联本发明的病毒颗粒的交联剂是本领域已知的。用于此种的交联剂的实例为戊二醛或双琥珀酰亚胺。交联的亲和基质具有改善的机械特性和较高的分子量。而且，共价交联使所述病毒颗粒缺乏感染性，其增加了使用所述亲和基质纯化的产物的安全性。
对于纯化目的蛋白质，可以将本发明的亲和基质填充进用于亲和层析的柱子。然后可根据常规方法进行亲和层析。在另一实施方案中，可以使用所述亲和基质由分批法(比较实施例4)纯化所述目的蛋白质。无论如何，在不溶解所述亲和基质或所述亲和基质的病毒颗粒的溶剂中使用本发明的亲和基质。合适的溶剂为含水溶剂，优选溶剂为水。由于所述亲和基质的高分子量和不溶解性，在待纯化的目的蛋白质的溶液中可以容易地(例如，通过沉淀)将亲和基质与可溶的污染物分离。
根据本发明的待纯化的目的蛋白质一般以溶解形式在还包含可溶或不可溶污染物的水溶液中或分散体中存在。此种溶液的实例为细胞裂解物或细胞上清液。一般首先将不溶物质通过过滤或离心分离用于获得澄清溶液。然后将澄清溶液与本发明的亲和基质接触，其中目的蛋白质结合到所述病毒颗粒的亲和蛋白质。然后，使具有结合的目的蛋白质的亲和基质与最初含有目的蛋白质的溶液分离。清洗具有结合目的蛋白质的亲和基质后，在合适的条件下目的蛋白质可与亲和基质分离，从而获得包含纯化的目的蛋白质的溶液。实施例中给出了使用包含具有结合的A蛋白的病毒颗粒的亲和基质纯化免疫球蛋白的方法。
附图简述
图1左上侧图示了植物病毒颗粒的结构。在右上侧，图示了由本发明的融合蛋白制成的根据本发明的病毒颗粒，在病毒颗粒表面展示A蛋白作为所述重组蛋白。在左下部，显示了根据本发明的病毒颗粒和根据本发明的三种不同的融合蛋白，产生在其表面展示三种不同重组蛋白，即A蛋白、荧光标记物和亲和标签的病毒颗粒。如果右上侧显示的病毒颗粒用于亲和纯化抗体，则病毒颗粒通过A蛋白结合抗体分子。
图2图示了不同双元载体的T-DNA区。
(A)显示pICH20697；
(B)显示包含基于TMV和基于PVX的病毒表达系统的5’前载体(provector)的pICH20701、pICH20723、pICH21684、pICH20710、pICH23407和pICH23411(没有显示内含子位置，但与pICH20697(图2A)的位置相同)。
LB-T-DNA的左边界；RB-T-DNA的右边界；PNOS-农杆菌胭脂氨酸合酶基因的启动子；TNOS-农杆菌胭脂氨酸合酶基因的转录终止区；NPTII-赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因；P35S.-CaMV35S启动子；ACT2-拟南芥(Arabidopsis)肌动蛋白2基因启动子的转录增强子；MP-病毒移动蛋白；CP-病毒外壳蛋白；TVCV聚合酶-芜菁脉明病毒的RNA-依赖性RNA聚合酶；PVX聚合酶-马铃薯X病毒的RNA-依赖性RNA聚合物；25K、12K、8K-三基因块(TGB)区基因；sgp-亚基因组启动子；int-内含子序列的5’部分；AttP-由位点特异性整合酶phiC31识别的重组位点。
(C)-用GeneBee程序(http://www.belozersky.msu.ru)进行来自不同烟草花叶病毒组的CP氨基酸序列的比对(Y.Dorokhov教授惠赠)。比对的上部的标记含义如下：“·”-柱配对交换(column pair exchange)的平均重量小于重量基质平均值；“.”-小于平均值+1个SD；“+”-小于平均值+2SD；“＊”-大于平均值+2SD。导入的用于比对的缺口表示为破折号。自EMBL登录号J02415获得TMV U1(U1：SEQ ID NO：19)、X00052获得TMV普通株(OM：SEQ ID NO：20)、X02144获得番茄花叶病毒(ToMV：SEQ ID NO：21)、AJ243571获得TMV Kazakh毒株(K1：SEQ ID NO：22)、Z92909获得TMV Kazakh株(K2：SEQ ID NO：23)、M34077获得烟草绿斑驳病毒或毒株(U2：SEQ ID NO：24)、AF546184获得TMV flavum毒株(SEQ ID NO：25)、AF321057获得黄瓜果实斑驳花叶病毒(Cucumber fruitmottle mosaic virus)(CFMMV)、D12505获得黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)、E04305获得齿兰环斑病毒(ORSV：SEQ ID NO：26)、AJ308228获得辣椒轻斑驳病毒(PMMV：SEQ ID NO：27)、D63809获得TMV毒株(Rakkyo：SEQ ID NO：28)、J02413获得大麻花叶病毒(sunn-hemp mosaicvirus)(SHMV)、AF254924获得长叶车前花叶病毒(RMV：SEQ ID NO：29)、Z29370获得TMV crucifer毒株(crTMV：SEQ ID NO：30)、U3387获得芜菁脉明病毒(TVCV：SEQ ID NO：31)、U30944获得TMV crucifer毒株(TMV-Cg：SEQ ID NO：32)、AB003936获得TMV Wasabi的crucifer毒株(CTMV-W：SEQ ID NO：34)和Aguilar等人(1996)的油菜花叶病毒(ORMV：SEQ ID NO：33)的数据。
图3A描述双元载体pICH21767、pICH21898、pICH21444、pICH323478、pICH23463、pICH23523、pICH7410、pICH10580和pICH14011的T-DNA区。LB-T-DNA的左边界；RB-T-DNA的右边界；PNOS-农杆菌胭脂合酶基因的启动子；TNOS-农杆菌胭脂合酶基因的转录终止区；NPTII-赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因；NTR-病毒RNA的3’非翻译区；AttB-由位点特异性整合酶phiC31识别的重组位点；编码拟南芥(Arabidopsis)热休克蛋白hsp81.1的基因的pHSP81.1启动子；NLS-核定位信号；GFP-编码合成绿色荧光蛋白的基因；dsRED-红色荧光蛋白；E，D-金黄色葡萄球菌A蛋白免疫球蛋白结合结构域E和D。
图3B显示A蛋白-病毒颗粒融合物的高水平表达。(a)用于本塞姆氏烟草(N.benthamiana)植物转染的构建体。自装配的载体(pICH17501)表达野生型CP。自各通过整合酶催化的位点特异性重组在植物原位(in planta)装配的5’-和3’-构件(pICH10881)表达CP-A蛋白融合物。在pICH20701和pICH24384中的5’-构件中包括短15aa接头(阴影盒)：柔性接头(GGGGS)3，以及pICH20723和pICH24399中的5’-构件中包括短15aa接头(阴影盒)：螺旋接头(EAAAK)3。在pICH20697中不包含任何接头。白盒表示用于优化表达的内含子。RdRp：RNA-依赖性RNA聚合酶；MP：移动蛋白；attP/attB，重组位点；int，用于通过剪接除去重组位点的内含子5’-和3’-部分；N，3’-非翻译区；T，nos终止子。(b)显示自转染野生型病毒的植物的粗提取物、与接头融合的A蛋白N-末端融合物(PA-CP)、没有接头(pICH20697)或有接头(pICH20701/20723)的A蛋白C-末端融合物(CP-PA)、与接头、系统叶片(systemic leaf)的C-末端融合物和非转染对照；Rbc，核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶大亚基的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。
图4表示(A)金黄色葡萄球菌A蛋白的序列(SEQ ID NO：35)和(B)成熟链霉抗生物素片段的序列(氨基酸残基12-139：SEQ ID NO：36)。
编码蛋白质序列的标下划线区的A蛋白基因部分用优化普通烟草(N.tabacum)表达和优化mRNA的结构和稳定性的密码子选择再合成。将其克隆到TMV-3’前载体(pICH21767)。
克隆序列的长度为133aa(结构域E：56aa；结构域D：61aa)。
将成熟链霉抗生物素的序列片段(aa 12-139)克隆到3’-前载体pICH21444以与CP融合；用于增加对Strep TaqII的亲和性的突变残基标下划线(在此位置的天然序列为“ESAV”)。
图5显示重组蛋白与CP的不同融合物的电泳分析。左侧凝胶：磷酸盐缓冲液中的标准提取物(除了7L外)。右侧凝胶：Laemli缓冲液中的提取物(除了GC、RC、CPC外)
1)pICH20697-pICH7410(GFP)；
2)pICH20697-pICH10580(dsRED)；
3)pICH20697-pICH7410(GFP)，系统叶片；
4)20697-pICH10580(dsRED)，系统叶片；
5)pICH20701；
6)pICH20701-pICH7410(GFP)；
7)pICH20701-pICH10580(dsRED)；
8)pICH20710-pICH7410(GFP)；
9)pICH20710-pICH10580(dsRED；
10)pICH20710-pICH7410(GFP)，系统叶片；
11)pICH20710-pICH10580(dsRED)，系统叶片；
12)pICH20723；
13)pICH20723-pICH7410(GFP)；
14)pICH20723-pICH10580(dsRED)；
15)pICH20723-pICH7410(GFP)，系统叶片；
16)pICH20723-pICH10580(dsRED)，系统叶片。
NC-阴性对照；GC-GFP对照；RC-dsRED对照；CPC-CP对照；L-Laemli缓冲液。
图6
(A)-重组病毒颗粒的电子显微镜术。标尺表示100nm。
(B)-自接种的叶组织提取的蛋白质的电泳分离。
1)pICH20701-pICH21767(A蛋白，2个结构域)；
2)pICH20701-pICH21770(A蛋白，1个结构域)；
3)pICH20723-pICH21767(2个结构域)；
4)pICH20723-pICH21770(1个结构域)；
5)野生型病毒。
(C)-自重组病毒颗粒提取的蛋白质的电泳分离。
1)野生型病毒；
2-7)pICH20701-pICH21767(A蛋白，2个结构域)，病毒颗粒的不同制备物；
8)MW蛋白质标志物。
图7.植物病毒衍生的基质表面上展示的A蛋白的抗体结合能力的测定。s-上清液；p-沉淀物；HC-IgG重链；LC-IgG轻链；CP-protA-病毒外壳蛋白-A蛋白融合物；MW-分子量蛋白质标志物(kDa)。
图8.使用其表面上展示A蛋白的病毒颗粒自植物提取物纯化IgG。
1)粗提取物；
2)IgG沉淀后的上清液；
3)IgG沉淀后的重新悬浮的沉淀物；
4)除去颗粒后重新悬浮的沉淀物；
5)IgG的PEG-沉淀后重新悬浮的沉淀物(与其它样品相比2×浓缩)。
HC-IgG重链；LC-IgG轻链；CP-protA-病毒外壳蛋白-A蛋白融合物；MW-分子量蛋白质标志物(kDa)。
发明详述
病毒外壳蛋白是病毒颗粒和病毒样颗粒(VLP)的主要构件。病毒颗粒和VLP是多分子生物聚合物构成的。通过将重组蛋白与病毒外壳蛋白融合，可获得其表面具有外源表位(所述重组蛋白)的病毒颗粒。然而，受到现有技术对重组蛋白与病毒外壳蛋白的翻译融合的限制(Hamamoto等人，1993，BioTechnology，11，930-932；Gopinath等人，2000，Virology，267，159-173；Porta等人，1994，Virology，202：949-955；Porta等人，2003，Virology，310：50-63；JP6169789；US5977438；WO02068927)，因为在现有技术中可以融合至植物病毒外壳蛋白的重组蛋白仅限于20～25个氨基酸残基(Turpen等人，1995 Biotechnology，13：53-57；Sugiyama等人，1995，FEBS Lett.，359：247-250；US 2002/0107387)。如US 2002/0107387的现有技术中推测的较大的重组蛋白可与病毒颗粒融合不能获得实验证实，因此结果是错误的。图3B中显示的实验表明没有根据本发明的特定措施时，不产生由病毒外壳蛋白和A蛋白组成的融合蛋白。因此，US 2002/0107387没有提供具有与病毒外壳蛋白融合的重组蛋白的植物病毒颗粒，其中重组蛋白包含大于50个氨基酸残基。
因此，在现有技术中，已经与融合蛋白共表达了大量(高达95％)游离病毒外壳蛋白用于与融合蛋白共装配，从而获得包括高达95％游离病毒外壳蛋白的病毒颗粒。显然，这限制了表面上展示肽的病毒颗粒的任何应用。
通常，在现有技术中，可以与植物病毒如TMV、豌豆花叶病毒(CPMV)、苜蓿花叶病毒等的CP融合，同时保持装配成功能性毒粒的能力的肽的大小有限，将这些系统限制于表达短免疫原表位和肽激素。另一出版物(Santa-Cruz等人，1996，Proc Natl Acad Sci U S A，93：6286-6290)描述了形成其表面包含表达为与马铃薯X外壳蛋白N-末端融合的绿色荧光蛋白(GFP)的马铃薯X病毒。然而，如对于TMV载体的情况，大量野生型外壳蛋白的表达对病毒颗粒的装配是必须的。后者通过由稳定整合到植物染色体DNA的独立载体表达病毒外壳蛋白实现或通过使用在GFP-CP融合物中可切割接头肽，因此提供用于病毒体形成的CP来源。不存在游离病毒外壳蛋白，不可能获得其表面展示GFP的病毒颗粒。在相似研究中，在包含游离病毒外壳蛋白的马铃薯X病毒颗粒上展示单链抗体(Smolenska等人，FEBS Lett.441(1998)379-382)。另一工作(Bendahmane等人，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：3645-3650)显示了不存在肽接头的GFP与烟草花叶病毒的外壳蛋白的融合物不产生重组病毒颗粒。
本发明的重组病毒颗粒有许多应用如用于亲和层析。例如，当前在研发中组成生物药物制品20％的抗体和抗体衍生物的纯化占总制造成本的50-80％(综述：Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.，20：639-654)。在免疫球蛋白纯化方法中来自金黄色葡萄球菌的A蛋白广泛用作亲和蛋白质(综述：Jungbauer & Hahn，2004，Curr.Opin.Drug.Disc.& Dev.，7：248-256)。A蛋白主要通过疏水相互作用(Dowd等人，1998，Nat.Biotechnol.，16：190-195)可逆地与免疫球蛋白的Fc结构域相互作用(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Methods，62：1-13；Gouda等人，1998，Biochemistry，37：129-136)。A蛋白的高度稳定性和选择性使其成为用于免疫球蛋白纯化的通用亲和蛋白质。用于市场的A蛋白的主要来源为自大肠杆菌产生的重组A蛋白(Duggleby&Jones，1983，Nucleic Acids Res.，11：3065-3076；Engel等人，1992，Protein Expr.Purif.，3：108-113)。在亲和基质如包含病毒颗粒或病毒样颗粒的表面上展示作为亲和蛋白质的A蛋白有可能使具有结合的A蛋白或具有结合的另一免疫吸附剂的亲和基质的价廉来源有机会用于重组单克隆抗体的下游加工。可用于本发明的另一蛋白质为对IgG的Fc结构域也具有强亲和性(Sauer-Eriksson等人，1995，Structure，3：275-278)并且对Fab片段也具有弱亲和性(Derrick & Wigley，1992，Nature，359：752-754)的链球菌G蛋白(Guss等人，1986，EMBO J.，5：1567-1575)。
为了纯化和显现不同宿主中产生的目的蛋白质，本发明利用植物病毒的多种性质(为了本发明的目的是指包括任何生物蛋白质产生宿主或任何非生物蛋白质产生方法)。本发明的一般性原理如图1所示：其表面展示一种或多种重组蛋白的植物病毒颗粒和所述植物病毒颗粒用于纯化目的蛋白质(例如抗体)的用途。而且，本发明利用了病毒外壳蛋白聚合和形成高度有组织的蛋白质结构的能力。本发明的定义“病毒颗粒”覆盖含有了包含根据本发明权利要求的病毒外壳蛋白和重组目的蛋白质的融合蛋白的植物病毒颗粒和植物病毒样颗粒(VLP)。术语“蛋白质基质”或“亲和基质”表示一起形成包含根据本发明的病毒颗粒的基质的多个植物病毒颗粒。图1图示了杆状病毒颗粒。然而，实际上可采用任何充分表征的植物病毒用于实施本发明。属于不同分类群的DNA和RNA病毒适合用于构建包含植物病毒外壳蛋白的融合蛋白。
下文给出了可用于本发明的病毒。引用的分类名(不是斜体字)表示这个分类不具有ICTV国际批准名。常规字体给出了种名(俗名)。标明了没有正式命名属和科的病毒)：
DNA病毒：环状dsDNA病毒：科：花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)，属：杆状DNA病毒属(Badnavirus)，模式种：鸭跖草黄斑驳病毒，属：花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)，模式种：花椰菜花叶病毒，属“SbCMV-样病毒”，模式种：大豆褪绿斑驳病毒属，属“CsVMV-样病毒”，模式种：木薯脉花叶病毒，属：“RTBV-样病毒”，模式种：水稻东格鲁杆状病毒，属：“碧冬茄脉明样病毒(Petunia vein clearing-like viruses)”，模式种：碧冬茄脉明病毒；环状ssDNA病毒：科：双生病毒科(Geminiviridae)，属：玉米线条病毒属(Mastrevirus)(双生病毒第I亚群)，模式种：玉米线条病毒。属：甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)(双生病毒第II亚群)，模式种：甜菜曲顶病毒，属：菜豆金色黄花叶病毒属(Begomovirus)(双生病毒第III亚群)，模式种：菜豆金色花叶病毒；
RNA病毒：
ssRNA病毒：科：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)，属：紫花苜蓿镶嵌病毒属(Alfmovirus)，模式种：苜蓿花叶病毒，属：等轴不稳定环斑病毒(Ilarvirus)，模式种：烟草线条病毒，属：雀麦花叶病毒属(Bromovirus)，模式种：雀麦草花叶病毒，属：黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)，模式种：黄瓜花叶病毒；
科：长线形病毒科(Closteroviridae)，属：黄化丝状病毒属(Closterovirus)，模式种：甜菜黄化病毒，属：毛形病毒属(Crinivirus)，模式种：莴苣传染性黄化病毒，科：豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，属：豇豆花叶病毒属(Comovirus)，模式种：豇豆花叶病毒，属：豆科病毒属(Fabavirus)，模式种：蚕豆枯萎病毒1(broad bean wilt virus 1)，属：蠕传病毒属(Nepovirus)，模式种：烟草环斑病毒；
科：马铃薯 Y 病毒科(Potyviridae)，属：马铃薯 Y 病毒属(Potyvirus)，模式种：马铃薯 Y 病毒，属：黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)，模式种：黑麦草花叶病毒，属：大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)，模式种：大麦黄花叶病毒；
科：伴生病毒科(Sequiviridae)，属：伴生病毒属(Sequivirus)，模式种：欧防风黄点病毒，属：矮化病毒属(Waikavirus)，模式种：水稻东格鲁球状病毒；科：番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，属：香石竹斑驳病毒(Carmovirus)，模式种：香石竹斑驳病毒，属：香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)，模式种：香石竹环斑病毒，属：玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，模式种：玉米褪绿斑驳病毒，属：烟草坏死病毒属(Necrovirus)，模式种：烟草坏死病毒，属：番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)，模式种：番茄丛矮病毒，ssRNA病毒未确定的属，属：毛状病毒组(Capillovirus)，模式种：苹果茎沟病毒；
属：香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，模式种：香石竹潜隐病毒；属：耳突花叶病毒属(Enamovirus)，模式种：豌豆耳突花叶病毒，
属：真菌传杆状病毒属(Furovirus)，模式种：土传小麦花叶病毒，属：大麦病毒属(Hordeivirus)，模式种：大麦条纹花叶病毒，属：悬钩子病毒属(Idaeovirus)，模式种：悬钩子丛矮病毒；
属：黄症病毒属(Luteovirus)，模式种：大麦黄矮病毒；属：玉米细线病毒属(Marafivirus)，模式种：玉米褪绿矮缩病毒；属：马铃薯 X 病毒属(Potexvirus)，模式种：马铃薯 X 病毒；属：南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，模式种：南方菜豆花叶病毒，属：纤细病毒属(Tenuivirus)，模式种：水稻条纹病毒，
属：烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，模式种：烟草花叶病毒，
属：烟草脆裂病毒属(Tobravirus)，模式种：烟草脆裂病毒，
属：发样病毒属(Trichovirus)，模式种：苹果褪绿叶斑病毒；属：芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)，模式种：芜菁黄花叶病毒；属：伞形病毒属(Umbravirus)，模式种：胡萝卜斑驳病毒；
负链ssRNA病毒：目：单负链病毒目，科：弹状病毒科(Bunyaviridae)，属：胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)，模试种：莴苣坏死黄化病毒，属：胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，模式种：马铃薯黄矮病毒；
负链ssRNA病毒：科：弹状病毒科(Bunyaviridae)，属：番茄斑萎病毒属(Tospovirus)，模式种番茄斑萎病毒；
dsRNA病毒：科：双组分RNA病毒科(Partitiviridae)，属：α潜隐病毒属(Alphacryptovirus)，模式种：白三叶草潜隐病毒1，属：β潜隐病毒属(Betacryptovirus)，模式种：白三叶草潜隐病毒2，科：呼肠孤病毒科(Reoviridae)，属：斐济病毒属(Fijivirus)，模式种：斐济病病毒，属：植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)，模式种：伤瘤病毒，属：水稻病毒属(Oryzavirus)，模式种：水稻齿叶矮缩病毒；
未确定病毒：
基因组：ssRNA，种：大蒜A、B、C、D病毒(Garlic viruses A，B，C，D)，种葡萄斑点病毒(grapevine fleck virus)，种：玉米白线花叶病毒(maizewhite line mosaic virus)，种油橄榄潜伏病毒2(olive latent virus 2)，种：欧尔密甜瓜病毒(ourmia melon virus)，种天竺葵带状斑点病毒(Pelargonium zonate spot virus)。
选择的病毒的大小和形状如下：
杆状病毒-TMV：毒粒具有≈300nm长度及≈18nm直径；PVX(丝状；通常弯曲；具有清楚的形态长度)：长515nm及直径13nm；雀麦花叶病毒：直径26nm。
对称/形状-二十面体
苜蓿花叶病毒(核壳杆状或准轴对称的伸长的)：长35nm(Tb)或长30nm；Ta为杆状(Ta-b)或椭圆形(Ta-t)形状)无清楚的形态长度：长56nm(B)；长43nm(M)；直径18nm。
优选的病毒为具有单链正义RNA基因组的植物病毒。其它优选的病毒为具有杆状病毒颗粒的植物病毒。
主要选择实施例中使用的病毒(烟草花叶病毒和马铃薯X病毒)，因为易于获得所述病毒的包括最近研发的用于表达异型寡聚蛋白质的系统(EP申请号05 001 819.1；WO 2006/079546)的已经很好建立的表达系统(Donson等人，1991，Proc Natl Acad Sci U S A，88：7204-7208；Shivprasad等人，1999，Virology，255：312-323；Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci U S A，101：6852-6857；Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723；Chapman，Kavanagh & Baulcombe，1992，Plant J.，2：549-557；Baulcombe，Chapman  &  Santa Cruz，1995，Plant J.，7：1045-1053；Angell & Baulcombe，1997，EMBO J.，16：3675-3684)。包括DNA病毒在内的其它植物病毒也可用于实施本发明(综述请参见：Mullineaux等人，1992，Genetic Engineeringin Plant Viruses，CRC Press Inc.，第187-215页；Timmermans等人，1994，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，45：79-112；Porta & Lomonossoff，2002，Biotechnol.Genet.Engineering Rev.，19：245-291)。
我们惊奇地发现(a)柔性肽接头(不能形成二级结构或能形成螺旋状二级结构)允许克服在产生重组蛋白与植物病毒外壳蛋白的翻译融合物中的大小限制。推测所述肽接头去除或显著降低了融合配偶体对彼此功能性的不利影响。本发明中使用的肽接头可以为柔性肽接头如(GGGGS)n或形成螺旋的肽接头如(EAAAK)n，其中n可以为2～5。肽接头为所述融合蛋白的区段。已描述了不同蛋白质的融合蛋白中这种肽接头的使用及其对融合蛋白功能的影响(Arai等人，2001，Protein Eng.，14：529-532；Arai等人，2004，Proteins，57：829-838)。在实施例1中，我们描述了含有n＝3的接头肽的构建体的设计(也参见图1)。然而，也制备了n＝2的相似的构建体(未显示)。我们发现较长的肽接头(n＝3)对融合配偶体：病毒CP(形成病毒颗粒)和重组蛋白(例如，结合免疫球蛋白的A蛋白)的功能具有显著的正面影响。较长的接头(比15个氨基酸残基长)可进一步使融合配偶体的功能之间的干扰最小化。然而，适合用于实施本发明的肽接头的长度可显著长于上述提及的长度(例如高达25个氨基酸残基)并且可取决于与病毒外壳蛋白融合的重组蛋白。用于实施本发明的肽接头的选择不限于上述接头。本发明中可以使用许多其它类型的接头。一般地，在多结构域或多重复蛋白质中的接头很少有二级结构，但是有其它类型的形成螺旋结构的接头(Ortiz等人，2005，J.Mol.Biol.l349：638-647)。同样，在噬菌体展示技术中有关于接头设计的信息(Maruyama等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：8273-8277；Turner等人，1997，J.Immunol.Methods，205：43-54；Castillo等人，2001，J.Immunol.Methods，257：117-122；Weiss等人，2000，ProteinSci.，9：647-654；Mikawa等人，1996，J.Mol.Biol.，262：21-30)。尽管在噬菌体和基于植物病毒的系统之间的结构和生物学有显著差异，本发明人发现用于选择肽接头的通用原则可用于植物病毒颗粒。看来通过所述肽接头使重组蛋白与病毒外壳蛋白之间出现距离降低了融合蛋白上外壳蛋白和重组蛋白之间的相互作用，结果保留了它们的功能。用多种预测蛋白质二级结构的程序(例如NNPREDICT  ，链接http://www.cmpharm.ucsf.edu/～nomi/nnpredict.html)(Kneller等人，1990，J.Mol.Biol.214：171-182)可检测在本应用中选择的用于实施本发明的肽接头的适合性。对于预测二级结构，由于二级结构上侧翼序列(本发明的外壳蛋白和重组蛋白)的可能的影响，所以应将接头肽作为融合蛋白的整合部分进行分析。用于这个目的的备选程序为德国的Heidelberg大学的PredictProtein(http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)。
通过表达本发明的所述融合蛋白可以产生重组植物病毒颗粒或植物病毒样颗粒。在一个实施方案中，使用植物病毒载体在植物细胞或植物中表达所述融合蛋白。在此类植物病毒载体中，可以用编码本发明所述融合蛋白的多核苷酸替代病毒载体的来源病毒的外壳蛋白。
植物病毒载体是用于在植物中瞬时高产量表达重组蛋白如本发明的融合蛋白的有效工具(综述参见：Porta & Lomonossoff，1996，Mol.Biotechnol.，5，209-221；Yusibov等人，1999，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，240，81-94；Gleba等人，2004，Curr Opin Plant Biol.7：182-188；Gleba等人，2005，Vaccine，23：2042-2048)。与植物核转基因相比，基于病毒载体的表达系统提供了显著较高产量的转基因产物(如本发明的融合蛋白)。例如，当由病毒载体表达时，重组蛋白的水平可以高达总细胞植物蛋白含量的5～50％(Kumagai等人，2000，Gene，245，169-174；Shivprasad等人，1999，Virology，255，312-323；Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci U S A，101：6852-6857；Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723)。有几个描述适合用于在植物中系统表达本发明的融合蛋白的病毒载体的公开专利(US5316931；US5589367；US5866785)。通常，这些载体可以自额外的亚基因组启动子(US5466788；US5670353；US5866785)或使用用于独立蛋白质翻译的IRES元件自多顺反子病毒RNA(WO0229068)将外源基因表达为与病毒蛋白的翻译融合物(US5491076；US5977438)。其它系统(WO2005049839)依赖于农杆菌，用于系统送递病毒复制子并且相对于系统病毒载体而言对于外源基因的大小具有显著较高的接受力。
在实施例2中，我们描述了在其表面上展示不同大小的不同重组蛋白的病毒颗粒的产生和分析。图5显示了在病毒载体帮助下表达的不同病毒CP-重组蛋白融合物的电泳分析。自所述分析结果显而易见地是大部分检测的融合物在浸润的叶中显示高表达水平并且在一些情况下，重组病毒载体可系统性移动。然而，系统性移动可导致回复为野生型载体。因此，在本发明的一个实施方案中，使用农杆菌介导的送递病毒载体或前载体，在接种叶中表达CP-重组蛋白融合物(Marillonnet等人，2004，Proc Natl AcadSci U S A，101：6852-6857；Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723)。在表达为与CP的融合物的根据本发明的七种不同重组蛋白中，六种重组蛋白成功表达并以蛋白质基质的形式自植物组织分离。在所述病毒颗粒的表面上展示的重组蛋白的活性通过实验证实。显然没有接头肽，在接种的或系统叶片中均观察不到直接与CP融合的重组蛋白的表达(图5的泳道1、2、3、4)。通过根据本发明的肽接头与CP融合的同一的重组蛋白实现了在接种叶中的高水平表达(图5的泳道7L、13、14)。
本发明的另一实施方案阐明了病毒颗粒表面上展示的重组蛋白在生物工程应用中的功能性。我们选择通过15个氨基酸肽接头连接的包含A蛋白的结构域E和D(133个氨基酸残基，参见图4-A)与病毒CP的融合蛋白。A蛋白是广泛用于层析纯化免疫球蛋白优选IgG和其功能性衍生物的有效亲和标签(Fuglistaller，P.，1989，J.Immunol.Methods，124-171-177；Fahmer等人，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.，30：121-128；Jungbauer & Hahn，2004，Curr.Opin.Drug Discov.Dev.，7：248-256)。随着临床试验中单克隆抗体的数量稳步增长和商品化生产抗体，日益需要重组A蛋白用于重组免疫球蛋白的纯化，并且将需要大量的重组A蛋白。而且，对于药物蛋白质的纯化，单次使用的试剂是优选的选择。当前，大部分重组A蛋白在大肠杆菌中生产(Hammond等人，1990，Ann.NYAcad.Sci.，613：863-867；Engel等人，1992，Protein Expr.Purif.，3：108-113；Cai等人，1992，Chin.J.Biotechnol.，8：93-98)。我们的发明允许生产大量的A蛋白、链球菌G蛋白(Bond等人，1993，J.Immunol.Methods，166：27-33；Du等人，2005，Biopolymers，79：9-17；Honda等人，1999，Biochemistry，38：1203-1213；大量的其活性片段、衍生物和类似物，所述重组蛋白已经与亲和(或层析)基质即植物病毒衍生的病毒颗粒的蛋白质基质偶联。由图6显然地是，CP-A蛋白融合物是重组病毒颗粒的一部分，其中所述重组病毒颗粒在考马斯染色的SDS-PAGE检出限度内专门地包含融合蛋白(图6B)并且没有可检测到的作为病毒颗粒结构单元的野生型CP。
展示A蛋白的病毒颗粒的表面可作为适合用于免疫球蛋白纯化的高亲和配体。病毒颗粒的相对高分子量允许将其作为亲和基质并用于研发简单的步骤来纯化可结合至本发明的重组病毒颗粒(或其它目的蛋白质)的免疫球蛋白。
而且，重组病毒颗粒可通过交联进一步聚合，产生例如在蛋白质纯化方法中适合用于作为亲和基质的甚至更高分子量的结构(Smith，Petrenko& Matthew，1998，J.Immunol.Methods，215：151-161)。交联病毒颗粒的另一方法可以通过在不同病毒颗粒的经修饰的(加入半胱氨酸)外壳蛋白之间形成二硫桥(Wang等人，2002，Chem.Biol.，9：813-819)。该方法也允许灭活病毒颗粒，防止病毒载体的复制。而且，多种交联剂可用于灭活病毒颗粒，例如但不限于甲醛(Barteling & Cassim，2004，Dev.Biol.，119：449-455)、吖丙啶、N-乙酰吖丙啶(Burrage等人，2000，Vaccine，18：2454-2461)、UV辐射(Freitas等人，2003，J Virol Methods.，108：205-11)和其它方法。
无论是天然存在的野生型病毒或突变病毒，还是遗传工程化的病毒载体均是自主复制的，因此是非常廉价的。植物病毒颗粒也比纯化步骤需要的大多数蛋白质或小分子大很多。通过使目的蛋白质与根据本发明的病毒颗粒结合，可有效地利用分子量或物理化学性质的巨大差异自如组织匀浆中的混合物中分离目的蛋白质或非蛋白质化合物，然后自剩余的混合物中分离获得的复合体。随后可以本领域技术人员已知的多种方法解除病毒颗粒和目的分子之间的结合。在本发明的一个实施方案中，我们证实了使用其表面展示IgG-结合结构域的重组病毒颗粒自植物提取物分离IgG。如实施例2描述地产生和分离展示A蛋白的IgG结合结构域的病毒颗粒。在评价了其结合能力后(实施例3，图7)，所述颗粒用于纯化用非竞争病毒载体农杆菌浸润(agroinfiltrated)的本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)植物中产生的单克隆抗体(IgG类)(实施例4，图8)。从图8显而易见，使用所述颗粒的一步纯化产生大约95％纯度的IgG样品。表1中概述了使用所述展示A蛋白的颗粒作为与病毒外壳蛋白的融合物纯化IgG的方法。
本发明也允许产生和利用其表面具有多种(两种或更多种)类型重组蛋白，从而在植物病毒颗粒表面上产生复合结构的重组病毒颗粒。这可例如通过最近研发的允许以高产量表达多种CP和目的重组蛋白的融合物的基于植物病毒的表达系统而实现(EP申请号05001819.1；WO 2006/079546)。例如，用本发明可以在病毒颗粒中表达和装配大致等摩尔量的两种重组融合蛋白。备选地，如果以不是等摩尔的摩尔比值需要不同的融合蛋白，可用标准(例如，由35S启动子驱动)表达盒瞬时表达，或由稳定整合到植物染色体DNA中的载体表达所述融合蛋白之一，同时可以由病毒载体表达其它融合蛋白。在又一方法中，以需要的比例混合不同重组病毒颗粒可以体外重新构建病毒颗粒，通过改变溶液的pH和/或离子强度解开构建体，然后将其从新装配，从而产生其表面具有不同重组蛋白的不同类型的病毒颗粒。图1的左下侧图示了展示多于一种重组蛋白的植物病毒颗粒。除了具有CP-A蛋白融合物外，此种病毒颗粒也可展示在纯化步骤中帮助分离所述病毒颗粒或其亲和基质的荧光标记(例如，GFP或dsRed)。另外，作为根据本发明的融合蛋白的一部分的蛋白酶抑制剂可保护待分离的目的蛋白质(例如IgG)免于蛋白水解降解。
优选地，由于植物实际上无人和动物病原体，本发明的病毒颗粒在植物种产生(表达)，因此降低了使用分离自病毒或细菌来源的病毒颗粒感染的危险。与由动物或细菌来源产生的病毒颗粒相比，在植物、植物组织或植物细胞种产生病毒颗粒的成本降低。然而，原则上，使用包括植物(包括其细胞和组织培养)、包括非人动物有机体的动物、动物和人细胞培养、真菌、细菌和酵母的多种宿主表达系统可以实施本方法。
取决于几种因素，如相对于宿主待纯化的目的蛋白质的性质和宿主中产生蛋白质的方式以及病毒颗粒和蛋白质之间亲和性的性质，可以许多不同的方式实施本纯化目的蛋白质的方法。在待纯化的目的蛋白质或小分子化合物由宿主内源性(天然)产生的实施方案中，可以将宿主培养和裂解。可以将包含目的蛋白质的其裂解液或精制溶液与包含本发明的重组病毒颗粒的亲和基质接触。不能由宿主内源性产生的蛋白质的纯化一般需要遗传操作以向宿主提供这样的结构，即至少一个编码待纯化的目的蛋白质的转基因。在这些实施方案中，可以将转基因作为病毒表达/复制载体的部分，或通过单独的转化事件导入到宿主中。亲和基质的表面上展示的重组蛋白对由宿主产生的目的蛋白质的亲和性可以为直接的或间接的，因为转基因可编码目的蛋白质为具有被病毒颗粒的亲和蛋白质识别和结合的结合肽的融合形式。因此，目的蛋白质本身可为融合蛋白。
在一个实施方案中，在植物宿主(例如，植物细胞、组织、组织匀浆或整个植物)中表达目的外源(例如，异源)蛋白质。这个实施方案需要提供展示重组蛋白作为亲和蛋白质的所述病毒颗粒，其中所述重组蛋白对待纯化的目的蛋白质具有亲和性。
备选地，所述病毒颗粒展示对待纯化的小分子化合物具有亲和性的重组蛋白。治疗剂和除草剂为此种小分子化合物的实例。通常，根据本发明可以分离或检测任何由宿主如植物、动物、细菌或酵母细胞产生的，并且由植物病毒颗粒表面上展示的重组蛋白识别(例如，具有亲和性)的非肽有机分子。使用的用于自蛋白质(或小分子)解离下植物病毒颗粒的条件取决于相互作用的特定形式并且可以通过改变物理化学参数，例如，pH；温度；离子、螯合剂浓度等而产生。选择适当的条件在蛋白质纯化领域技术人员的水平内。超滤是自所述病毒颗粒的亲和基质分离蛋白质的一种方式。
本发明同样适合用于纯化天然存在的或作为在大量宿主中转基因表达结果的转基因目的蛋白质和内源性目的蛋白质以及非蛋白质分子，其中所述大量宿主包括但不限于植物、动物和细菌界的成员。此类蛋白质的实例可以为但不限于药学和工业上重要的蛋白质，例如免疫反应蛋白质、酶，其中所述酶包括DNA修饰酶；淀粉、细胞壁修饰酶、蛋白酶、脂酶等。
在对宿主为外源性的蛋白质或小分子的情况下，根据标准技术，将编码目的蛋白质(本身或结合至病毒颗粒上的重组蛋白的肽的融合物的形式)的导致产生的小分子的其表达的转基因导入非人宿主。通常，这些技术可包括稳定或瞬时转化或病毒送递(例如通过病毒表达载体感染细胞)。在文献中很好描述了产生具有稳定整合的外源基因的转基因生物体的方法。例如，通过农杆菌介导的送递将DNA转化到植物细胞中。参见美国专利号：5,591,616；4,940,838；和5,464,763。其它方法包括颗粒或微粒轰击(美国专利号5,100,792；欧洲专利(EP)444,882 B1；EP 434,616 B1)、显微注射(WO09209696；WO 09400583 A1；EP 175,966 B1)和电穿孔(EP 564,595 B1；EP 290,395 B1；WO 08706614 A1)。很好建立了将转基因送递到动物、细菌和酵母细胞的方法。将转基因送递到动物细胞中的受欢迎的方法为逆转录病毒介导(Robbins & Givizzani，1998；Reynolds等人，1999)。其它用合成(非病毒)载体的方法也是合适的(综述参见：Bown等人，2001)。在许多手册例如，Yeast Protocol Handbook(2000)和Sambrook等人，(1989)中很好描述了用于酵母和细菌细胞的转化方法。
因为本发明可适应如组织匀浆、离心和超滤的技术，所以其很好地适于工业应用和按比例放大。其可用于在任何原核或真核系统中产生蛋白质和小分子。因此，本发明是由任何种类的原核或真核系统中纯化任何目的蛋白质的通用、廉价和扩大的方法。
本发明的重组病毒颗粒可以应用在许多不同领域-不仅仅在生物技术，也在纳米技术和分子电子学中应用是令人感兴趣的。由于植物病毒容易产生和分离以及提供高产量(每千克鲜烟草叶高达10g病毒颗粒)，所以其对此种目的是非常适合的。而且，使用简单的‘低技术(low-tech)’方法(Creager等人，1999，Plant Cell，11：301-308)可以工业纯化病毒颗粒(毒粒)。
实施例
下述实施例进一步举例说明本发明而不限制本发明的范围。
实施例1
用于CP-融合蛋白表达的基于TVCV和PVX的前载体的构建
通常在两个最近的出版物中(Marillonnet等人，2004，Proc Natl AcadSci U S A，101：6852-6857；Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723)描述了下述实施例中使用的载体。马铃薯X病毒(PVX)的cDNA通过RT-PCR自DSMZ保藏中心(http://www.dsmz.de)接受的PVX分离株PV-0014产生并用于产生PVX前载体。许多出版物描述了基于PVX的表达系统(Chapman，Kavanagh & Baulcombe，1992，Plant J.，2：549-557；Baulcombe，Chapman & Santa Cruz，1995，Plant J.，7：1045-1053；Angell &Baulcombe，1997，EMBO J.，16：3675-3684)。
a)烟草花叶病毒组TVCV(芜菁脉明病毒)的5’-前载体
使用引物cptv1和cpfus4或cpfus5通过PCR扩增TVCV外壳蛋白的3’-部分，从而将(GGGGS)3-接头或(EAAAK)3-接头导入到CP的C末端。用NcoI和BsaI切割PCR产物并连接入含有野生型CP而没有肽接头的5’-前载体pICH20697(图2A)，产生构建体pICH20701和pICH20723(图2B)。载体pICH20697的内含子结构与以前描述的(pICH18722)(Marillonnet等人，2005，Nature Biotechnol.，23：718-723)的内含子结构相似。
b)PVX(马铃薯X病毒)的5’-前载体
使用pICH20701或pICH20723作为模板，用引物pv5cptv和pv5p5r2通过PCR扩增具有接头的CP。将PCR产物作为NheI-SacI片段克隆进PVX 5’-前载体中获得构建体pICH23407和pICH23411(图2)。
c)将目的基因克隆入3’-前载体
A蛋白
来自金黄色葡萄球菌的A蛋白包含5个免疫球蛋白(IgG)结合结构域(图4-A)。由GENEART(Regensburg，德国)合成这些结构域中的最初两个(结构域E和D)和两侧的一些额外的氨基酸(总共133aa，图4，下划线标出)。在普通烟草(Nicotiana tabacum)中优化表达该序列。将该序列作为BsaI-HindIII片段克隆到pICH10990载体(Marillonnet等人，2004，ProcNatl Acad Sci U S A，101：6852-6857)获得构建体pICH21767(图3A)。自该构建体，将A蛋白序列作为HindIII-NdeI片段转移到PVX的3’-前载体pICH21799中获得pICH23523(图3A)。构建体pICH21770(未显示)与pICH21767相似，但仅包含A蛋白的一个IgG结合结构域(结构域E)。
Streptactin
Streptactin是对StrepTag II具有增加的亲和性的链霉抗生物素的突变形式(Voss S.& Skerra A.1997.Prot Engin 10，975-982)。使用引物strepprl和streppr2或streppr3和streppr4在来自阿维丁链霉菌(Streptomycesavidinii)作为模板的基因组DNA上通过PCR分别扩增Streptactin的5’-和3’-部分。图4-B中显示的编码蛋白片段的PCR产物用BsaI-BpiI(streppr1和streppr2)和BpiI-BamHI(streppr3和streppr4)切割并连接到用BsaI-BamHI切割的3-前载体pICH10990(Marillonnet等人，2004，ProcNatlAcadSci U S A，101：6852-6857)，获得构建体pICH21444(图3A)。
将认为是单体形式的Streptactin突变形式(V55T，T76R，L109T，V125R)(Wu SC & Wong SL.，2005，J Biol Chem 280：23225-31)通过用寡核苷酸streppr5-streppr12定点突变工程化获得构建体pICH23478(图3A)。
StrepTag II
将这个标签导入用XbaI、BsaI切割的用寡聚体streptag5和streptag6的接头连接的3’-前载体pICH21595中，获得的构建体命名为pICH23463(图3A)。
其它基因
将许多其它基因(GFP、DsRed、抗原、细胞因子)以相似的方式克隆进3’-前载体(Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci U S A，101：6852-6857)获得构建体pICH7410(GFP)，pICH10580(DsRED)(图3A)。
实施例2
植物中CP-融合蛋白的表达
农杆菌浸润
将所有构建体电穿孔进根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101中。基本上如Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci U S A，101：6852-6857所述，将本塞姆氏烟草植物进行农杆菌浸润。将三个包含编码CP的5’前载体、编码重组蛋白的3’前载体和位点特异性重组酶的来源(pICH14011，图3A)的三个农杆菌菌株混合并用于浸润，所述CP的5’前载体、编码重组蛋白的3’前载体和位点特异性重组酶的来源通过位点特异性重组将病毒前载体植株原位装配成能扩增和表达重组目的蛋白质的病毒载体。用注射器进行小规模浸润；使用真空装置进行大规模浸润(Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723).
本塞姆氏烟草叶中表达的CP融合物的分析
在浸润6～11天后，自浸润的本塞姆氏烟草叶中提取所有重组蛋白融合物并如以前描述(Marillonnet等人，2004，Proc Natl Acad Sci U S A，101：6852-6857；Marillonnet等人，2005，Nat Biotechnol.，23：718-723)在聚丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离进行分析。图5(A，B)显示了不同CP-重组蛋白融合物的电泳分析结果。值得注意的是CP与重组目的蛋白质的直接融合物(无接头肽)不产生可检测的表达。
特别地，使用pICH20697 5’-前载体(图3B)和适当的3’前载体(pICH21767，图3B)的联合不产生任何可检测的表达。而且，与使用具有接头肽的5’前载体的情况不同，如下述进行的电子显微镜分析没有在样品中检测到任何病毒样结构。
病毒颗粒的提取和纯化
使用叶汁压榨机或研钵和研棒在0.1M磷酸钾缓冲液，pH 7.0(2-3ml缓冲液/g FW)将浸润的叶匀浆。通过Miracloth过滤除去不溶物质。使用标准方法(Turpen & Reinl，1998，Methods in Biotechnol.，3：89-101，C.Cunningham & A.J.R.Porter编著，Humana出版社，Totowa，NJ)用一体积的氯仿处理叶汁一次并用聚乙二醇(PEG-6000)沉淀病毒颗粒。将颗粒在磷酸钾缓冲液中重新悬浮并进一步通过蔗糖密度离心纯化。将包含与A蛋白片段融合的CP的病毒颗粒样品通过SDS-电泳和通过电子显微镜分析。如Negrouk及其同事(2004，Analytical Biochem.，333：230-235)的描述制备用于电子显微镜的样品。图6显示了分析结果。
实施例3
结合至植物病毒颗粒表面的A蛋白的抗体结合能力
具有结合的重组A蛋白的纯化病毒颗粒的等分试样(0.5mg)与不同量的人IgG(Sigma I4506)混合，冰上孵育1小时并通过离心(10分钟，12.000g)沉淀。通过SDS-PAGE分析沉淀物和上清液(图7)。证实1mg病毒颗粒可结合高达2mg的IgG。结合能力大约为2mg IgG/mg病毒颗粒(即1分子IgG(150kDa)结合重组病毒颗粒表面上的每3～5个分子的CP-A蛋白融合物(34kDa)。
实施例4
使用其表面展示A蛋白的重组病毒颗粒在植物中纯化表达的抗体
使用ICONs病毒表达系统植株原位表达抗体，用于在植物中产生异型寡聚(hetero-oligomeric)蛋白质(EP申请号05 001 819.1；WO2006/079546)。将包含IgG类的单克隆抗体的叶材料在液氮中研磨并且每克新鲜叶重量(FW)用3ml PBS提取(Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，CSH，NY)。通过两轮离心(10分钟，16000g)除去不溶物质。每1ml植物提取物加入100毫克展示A蛋白的病毒颗粒，并将样品冰上孵育至少1小时。通过离心(15分钟，12000g)沉淀结合至病毒颗粒的抗体并在0.25体积的0.1M甘氨酸pH 2.5中重新悬浮。为了除去病毒颗粒，将样品调整至1％NaCl，4％PEG，冰上孵育30分钟并以10.000g离心15分钟。将包含抗体的上清液转移到新试管中，用1/10体积的1M Tris/HCl pH 9.0中和并通过加入适当体积的PBS缓冲液中的25％PEG溶液调整至14％PEG。将样品冰上保持至少1小时并通过离心(15分钟，16000g)沉淀抗体。表1中显示了纯化步骤的总结。抗体在适当体积的PBS中溶解并通过凝胶电泳分析。图8中显示了来自纯化步骤的蛋白质的电泳分析。
表1：使用其表面上展示A蛋白的重组病毒颗粒纯化IgG的方法总结
1.用3体积的PBS提取浸润叶。通过2×离心澄清提取物。
2.加入病毒颗粒(大约100mg/ml)并于冰上孵育15～30分钟。
3.12000g(台式离心机中11300转/分)，4℃离心10分钟。
4.弃去上清液，在1体积的0.1M甘氨酸，pH 2.5中重新悬浮沉淀物。
5.加入1/10体积的12％NaCl和1/5体积的25％PEG-6000(在0.1M甘氨酸中，pH 2.5)。冰上孵育30分钟。
6.10000g(台式离心机中10300转/分)，4℃离心15分钟。
7.将上清液转移到新试管中；用1/10体积的1M Tris/HCl pH 9.0中和；加入1体积的25％PEG-6000(PBS中)并于冰上孵育30分钟。
8.16000g(台式离心机中13000转/分)，4℃离心15分钟。
9.弃去上清液，再离心5分钟。
10.仔细除去所有痕量上清液；在适当体积的PBS中重新悬浮沉淀物。
附录1
引物序列：
cptv1：5’-cggagctcttaatttaaaagaagaaaatgtcttacaac-3’(SEQ ID NO：1)
cpfus4：5’-tttggtctcatacctgagccaccgcctcctgatccaccgcctccacttcctccgcctc
ctgtagcaggcgcagtagtcc-3’(SEQ ID NO：2)
pv5cptv：5’-cagctagcaacaaacaagaaatgtcttacaacattacaaacccg-3’(SEQ IDNO：3)
pv5p5r2：5’-gagctctctcgagcatgctacgcccccaactgagag-3’(SEQ ID NO：4)
streppr1：5’-gaagacaaaggtgctgctgaggctggaattacaggcacctgg-3’(SEQ ID NO：5)
streppr2：5’-gaagacaatgtaacataagttcctgtaagtgcaccatcggcgcc-3’(SEQ ID NO：6)
streppr3：5’-gaagacaatacagctagaggtaatgcagaaagacgttacgtcctg-3’(SEQ IDNO：7)
streppr4：5’-ggatccaaggtctcaacctgctgctgatggtttcaccttggtgaag-3’(SEQ IDNO：8)
streppr5：5’-tttggtctcagagtgtaacgtctttctgcattacc-3’(SEQ ID NO：9)
streppr6： 5’-tttggtctcaactcttaccggtcgttacgacagc-3’(SEQ ID NO：10)
streppr7： 5’-tttggtctcaccctccaaccgagggcggtgcc-3’(SEQ ID NO：11)
streppr8： 5’-tttggtctcaagggtggcctggaagaataact-3’(SEQ ID NO：12)
streppr9： 5’-tttggtctcagtgtccactgggtgttgatcctcg-3’(SEQ ID NO：13)
streppr10  5’-tttggtctcaacactgacttccggcaccaccgagg-3’(SEQ ID NO：14)
streppr11：5’-tttggtctcatctaagtgtggacttccaggcgttggc-3’(SEQ ID NO：15)
streppr12：5’-tttgaagactatagaggacacgacaccttcaccaag-3’(SEQ ID NO：16)
streptag5：5’-ctagcttggagtcatccacagttcgagaaataa-3’(SEQ ID NO：17)
streptag6  5’-aagcttatttctcgaactgtggatgactccaag-3’(SEQ ID NO：18)

Claims (37)

1.一种纯化目的蛋白质的方法，其包括步骤：
(a)提供包含融合蛋白的亲和基质，所述融合蛋白包含如下融合蛋白结构域：
(i)植物病毒外壳蛋白、和
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，所述融合蛋白的所述重组蛋白对所述待纯化目的蛋白质具有亲和性，
(b)使所述亲和基质与包含所述目的蛋白质的液体组合物在允许所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下接触，其中所述亲和基质在所述条件下是不溶解的，
(c)在保留所述目的蛋白质结合至所述亲和基质的所述重组蛋白的条件下自步骤(b)的混合物中除去没有结合至所述重组蛋白的所述液体组合物的组分，和
(d)自所述亲和基质分离所述目的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组蛋白对免疫球蛋白或其衍生物具有亲和性，优选地所述重组蛋白为葡萄球菌A蛋白或其衍生物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述目的蛋白质为免疫球蛋白。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的方法，其中所述融合蛋白还包含：
(iii)至少一个连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一个肽接头包含至少10个氨基酸残基。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，所述亲和基质相对于在所述亲和基质中存在的游离病毒外壳蛋白和所述融合蛋白的总数而言，包含至多20mol-％的游离病毒外壳蛋白。
7.包含多个融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒，所述融合蛋白包含如下融合蛋白结构域：
(i)植物病毒外壳蛋白、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)任选地，连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，
其中所述重组蛋白能结合免疫球蛋白，优选地通过免疫球蛋白的Fc区结合免疫球蛋白。
8.包含融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒，所述融合蛋白包含如下融合蛋白区段：
(i)植物病毒外壳蛋白、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，所述肽接头包含至少10个氨基酸残基，
其中所述病毒颗粒包含至多20mol-％的游离病毒外壳蛋白。
9.根据权利要求7至8中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述病毒颗粒为杆状。
10.根据权利要求7至8中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述病毒外壳蛋白为芜菁脉明病毒的外壳蛋白或与芜菁脉明病毒外壳蛋白具有至少40％同一性的蛋白质。
11.根据权利要求7至9中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述植物病毒外壳蛋白与芜菁脉明病毒外壳蛋白具有至少60％的同一性。
12.根据权利要求7至9中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述植物病毒外壳蛋白为烟草花叶病毒外壳蛋白或与烟草花叶病毒外壳蛋白具有至少80％同一性的蛋白质。
13.根据权利要求7至12中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白通过所述肽接头连接至所述植物病毒外壳蛋白的N-末端。
14.根据权利要求7至12中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白通过所述肽接头连接至所述植物病毒外壳蛋白的C-末端。
15.根据权利要求7至12中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白为所述植物病毒外壳蛋白的内部融合物并且通过两个肽接头连接至所述植物病毒外壳蛋白。
16.根据权利要求7至15中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述肽接头没有确定的二级结构或形成螺旋。
17.根据权利要求7至16中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述病毒颗粒在其表面上展示两种或多种不同的重组蛋白。
18.根据权利要求7至17中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白对免疫球蛋白或其衍生物具有亲和性，优选地，所述重组蛋白对免疫球蛋白的Fc区具有亲和性。
19.根据权利要求18所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白为葡萄球菌A蛋白或能结合免疫球蛋白的其衍生物。
20.根据权利要求18所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白为链球菌G蛋白或能结合免疫球蛋白的其衍生物。
21.根据权利要求7至17中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中所述重组蛋白为链霉抗生物素或其衍生物。
22.根据权利要求7至21中任意一项所述的病毒颗粒或病毒样颗粒，其中病毒颗粒包含至多20mol-％，优选地至多10mol-％的游离病毒外壳蛋白。
23.包含融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒，所述融合蛋白包含如下融合蛋白结构域：
(i)芜菁脉明病毒的植物病毒外壳蛋白或与芜菁脉明病毒外壳蛋白具有至少40％同一性的蛋白质、
(ii)包含至少50个氨基酸残基的重组蛋白，和
(iii)任选地，连接所述植物病毒外壳蛋白和所述重组蛋白的肽接头，所述肽接头包含至少10个氨基酸残基。
24.产生如权利要求7至23中任意一项所述的重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒的方法，其包括在细菌、植物、植物组织或植物细胞表达所述融合蛋白。
25.根据权利要求24所述的方法，其包括通过农杆菌介导的送递将编码所述融合蛋白的植物病毒载体导入植物细胞中，然后自所述植物细胞中分离所述病毒颗粒。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其还包括使用化学灭活使所述病毒颗粒缺乏感染性。
27.产生重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒的方法，其包括在包含权利要求7至23中任意一项所述的融合蛋白和为外壳蛋白或包含外壳蛋白的第二种蛋白质的混合物中，在允许装配包含所述融合蛋白和所述第二种蛋白质的病毒颗粒的条件下，装配重组病毒颗粒。
28.一种融合蛋白，其包含下述融合蛋白区段：植物病毒外壳蛋白、接头肽和能结合免疫球蛋白的重组蛋白，优选地所述重组蛋白能结合免疫球蛋白的恒定区，其中所述融合蛋白优选地能形成重组病毒颗粒或病毒样颗粒。
29.一种融合蛋白，其包含下述融合蛋白区段：
(i)植物病毒外壳蛋白、
(ii)A蛋白或G蛋白，或能结合至免疫球蛋白的Fc区的A蛋白或G蛋白的变体，和
(iii)连接第(i)条和第(ii)条的区段的接头肽。
30.一种多核苷酸，其编码如权利要求7至23、28或29中任意一项所述的融合蛋白。
31.一种植物、植物组织或植物细胞，其包含权利要求30的多核苷酸。
32.病毒物质，其自权利要求31的植物、植物组织或植物细胞获得或可获得的。
33.组分包，其包含植物、植物组织或植物细胞以及如权利要求30所述的多核苷酸。
34.用于亲和纯化目的蛋白的蛋白质基质，所述蛋白质基质包含如权利要求7至23中任意一项所述的含有融合蛋白分子的重组病毒颗粒或重组病毒样颗粒，其中相对于所述亲和基质中存在的游离病毒外壳蛋白和所述融合蛋白的总数而言，所述病毒颗粒包含至多20mol-％的游离病毒外壳蛋白。
35.根据权利要求34所述的蛋白质基质，所述蛋白质基质包含化学交联的所述病毒颗粒或病毒样颗粒。
36.根据权利要求1至6中任意一项所述的方法，其中所述融合蛋白如权利要求7至23中任意一项所定义。
37.如权利要求1至23、28或29中任意一项所述的融合蛋白；或如权利要求7至23中任意一项所述的重组病毒颗粒或病毒样颗粒；或如权利要求34或35中任意一项所述的基质的用途，用于纯化目的蛋白质。
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