JP2880024B2 - 植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法 - Google Patents
植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法Info
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- JP2880024B2 JP2880024B2 JP4188744A JP18874492A JP2880024B2 JP 2880024 B2 JP2880024 B2 JP 2880024B2 JP 4188744 A JP4188744 A JP 4188744A JP 18874492 A JP18874492 A JP 18874492A JP 2880024 B2 JP2880024 B2 JP 2880024B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、植物ウィルスベクター
による、外来遺伝子の植物体への導入と、植物の性質の
改良，及び植物体全身における有用タンパク質の製造方
法に関する。
による、外来遺伝子の植物体への導入と、植物の性質の
改良，及び植物体全身における有用タンパク質の製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】トバモウィルス等に代表されるある種の
植物ウィルスは、植物に感染すると、その植物内で増殖
し、外被タンパク質と呼ばれるタンパク質を大量に作り
ながら、植物体内で急速に拡がって行くことが知られて
いる。
植物ウィルスは、植物に感染すると、その植物内で増殖
し、外被タンパク質と呼ばれるタンパク質を大量に作り
ながら、植物体内で急速に拡がって行くことが知られて
いる。
【０００３】すでに、これらの植物ウィルスを用いた遺
伝子操作系が幾つか構築されており、この系を用いて外
来遺伝子を植物体内へ導入する試みがなされている。例
えば外被タンパク質遺伝子と外来遺伝子を置換する方法
（特開昭６３−１４６９３号公報），或いは外被タンパ
ク質遺伝子と外来遺伝子を直結して融合タンパク質を作
らせる方法（特開平２−４９５９１号公報）等である。
伝子操作系が幾つか構築されており、この系を用いて外
来遺伝子を植物体内へ導入する試みがなされている。例
えば外被タンパク質遺伝子と外来遺伝子を置換する方法
（特開昭６３−１４６９３号公報），或いは外被タンパ
ク質遺伝子と外来遺伝子を直結して融合タンパク質を作
らせる方法（特開平２−４９５９１号公報）等である。
【０００４】しかし、これら公知の方法で用いられてい
る植物ウィルスベクターはいずれも、植物個体全体に拡
がる能力（全身感染性）を持たないという、大きな欠点
を有しており、植物個体全体に有用な性質を導入した
り、植物個体全体で有用タンパク質を生産することは、
不可能であった。
る植物ウィルスベクターはいずれも、植物個体全体に拡
がる能力（全身感染性）を持たないという、大きな欠点
を有しており、植物個体全体に有用な性質を導入した
り、植物個体全体で有用タンパク質を生産することは、
不可能であった。
【０００５】植物ウィルスが全身感染性を示す為には、
外被タンパク質による粒子形成が必要である（T.Saito
et al. : Virology Vol.176,329,1990）。既存の植物ウ
ィルスベクターは、外被タンパク質が産生されなかった
り（置換型ベクター）、外被タンパク質が融合タンパク
質となっており、その性質が大きく変化してしまったり
（直結型ベクター）する為、粒子形成をすることができ
ず、全身感染性を示さなかったものと考えられる。
外被タンパク質による粒子形成が必要である（T.Saito
et al. : Virology Vol.176,329,1990）。既存の植物ウ
ィルスベクターは、外被タンパク質が産生されなかった
り（置換型ベクター）、外被タンパク質が融合タンパク
質となっており、その性質が大きく変化してしまったり
（直結型ベクター）する為、粒子形成をすることができ
ず、全身感染性を示さなかったものと考えられる。
【０００６】従って本発明の目的とするところは、植物
個体全体への感染性（全身感染性）を有する植物ウィル
スベクター、及び該植物ウィルスベクターを双子葉植物
個体に直接接種することによって外来遺伝子を双子葉植
物中で発現させる方法を提供するにある。
個体全体への感染性（全身感染性）を有する植物ウィル
スベクター、及び該植物ウィルスベクターを双子葉植物
個体に直接接種することによって外来遺伝子を双子葉植
物中で発現させる方法を提供するにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上述の目的は、植物ウィ
ルスの外被タンパク質遺伝子の下流に、リードスルーを
誘起する塩基配列を介して外来遺伝子が接続されている
ことを特徴とする、植物ウィルスベクター、及び該植物
ウィルスベクターを転写産物とするプラスミド、並びに
該植物ウィルスベクターを双子葉植物個体に直接接種す
ることを特徴とする、外来遺伝子を植物中で発現させる
方法によって達成される。
ルスの外被タンパク質遺伝子の下流に、リードスルーを
誘起する塩基配列を介して外来遺伝子が接続されている
ことを特徴とする、植物ウィルスベクター、及び該植物
ウィルスベクターを転写産物とするプラスミド、並びに
該植物ウィルスベクターを双子葉植物個体に直接接種す
ることを特徴とする、外来遺伝子を植物中で発現させる
方法によって達成される。
【０００８】以下、本発明について詳細に説明するが、
それに先立って、本明細書中で用いた用語について説明
する。
それに先立って、本明細書中で用いた用語について説明
する。
【０００９】植物ウィルスベクター；植物ウィルスの持
つＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に、外来遺伝子を導入するこ
とによって得られる複製可能な組換え体。
つＤＮＡ或いはＲＮＡ配列に、外来遺伝子を導入するこ
とによって得られる複製可能な組換え体。
【００１０】リードスルー；ＲＮＡからタンパク質への
翻訳において、終止コドンで翻訳がストップせず、時と
して次の終止コドンまで翻訳されてしまう現象。リード
スルーされる終止コドンの近傍の塩基配列によって起き
る。
翻訳において、終止コドンで翻訳がストップせず、時と
して次の終止コドンまで翻訳されてしまう現象。リード
スルーされる終止コドンの近傍の塩基配列によって起き
る。
【００１１】本発明に用いられる植物ウィルスとして
は、カリモウィルス，ジェミニウィルス等のＤＮＡウィ
ルス，タバコモザイクウィルス等のトバモウィルスグル
ープに属するウィルスやブロモウィルス等のＲＮＡウィ
ルス等が挙げられ、植物ウィルスであればその種類は問
わない。
は、カリモウィルス，ジェミニウィルス等のＤＮＡウィ
ルス，タバコモザイクウィルス等のトバモウィルスグル
ープに属するウィルスやブロモウィルス等のＲＮＡウィ
ルス等が挙げられ、植物ウィルスであればその種類は問
わない。
【００１２】本発明に用いられる外来遺伝子としては、
薬理，生理活性を有するペプチド遺伝子や、植物にスト
レス耐性，病害虫耐性を与えるタンパク質遺伝子，植物
の形態や花色を変化させるタンパク質遺伝子等があり、
具体的には、エンケファリン，カルシトニン，グルタチ
オン，コルチコトロピン，ヒト上皮細胞成長因子（ＥＧ
Ｆ）や、下記に示したような、血圧低下作用を持つ、ア
ンジオテンシン転換酵素阻害（ＡＣＥＩ）ペプチド，イ
ンフルエンザウィルス由来ペプチド，エイズウィルスｇ
ｐ１２０由来ペプチド等をコードする遺伝子等が挙げら
れる。
薬理，生理活性を有するペプチド遺伝子や、植物にスト
レス耐性，病害虫耐性を与えるタンパク質遺伝子，植物
の形態や花色を変化させるタンパク質遺伝子等があり、
具体的には、エンケファリン，カルシトニン，グルタチ
オン，コルチコトロピン，ヒト上皮細胞成長因子（ＥＧ
Ｆ）や、下記に示したような、血圧低下作用を持つ、ア
ンジオテンシン転換酵素阻害（ＡＣＥＩ）ペプチド，イ
ンフルエンザウィルス由来ペプチド，エイズウィルスｇ
ｐ１２０由来ペプチド等をコードする遺伝子等が挙げら
れる。
【００１３】
【表１】
【００１４】これらの遺伝子は、生物のゲノムＤＮＡや
ｃＤＮＡ，或いはプラスミドＤＮＡ等から得ることがで
きるが、ＤＮＡ合成機等を用いて合成することもでき
る。
ｃＤＮＡ，或いはプラスミドＤＮＡ等から得ることがで
きるが、ＤＮＡ合成機等を用いて合成することもでき
る。
【００１５】本発明に用いられるリードスルーを誘起す
る塩基配列とは、リードスルー現象を引き起こす塩基配
列ならばその種類は問わないが、例えばタバコモザイク
ウィルスの１３０／１８０Ｋと呼ばれるタンパク質遺伝
子中に存在する塩基配列等のような天然に存在する塩基
配列の他、それらの塩基配列の一部を置換したものであ
っても良い。
る塩基配列とは、リードスルー現象を引き起こす塩基配
列ならばその種類は問わないが、例えばタバコモザイク
ウィルスの１３０／１８０Ｋと呼ばれるタンパク質遺伝
子中に存在する塩基配列等のような天然に存在する塩基
配列の他、それらの塩基配列の一部を置換したものであ
っても良い。
【００１６】具体的には、タバコモザイクウィルスの１
３０／１８０Ｋタンパク質遺伝子中に存在するＵＡＧＣ
ＡＡＵＵＡ，又はそのＤＮＡ型に相当するＴＡＧＣＡＡ
ＴＴＡ（下線部は終止コドンである。），あるいは終止
コドンを他の終止コドンに置き換えたＵＡＡＣＡＡＵＵ
Ａ（ＴＡＡＣＡＡＴＴＡ），ＵＧＡＣＡＡＵＵＡ（ＴＧ
ＡＣＡＡＴＴＡ），もしくは終止コドン以外の塩基配列
を置換したＵＡＧＣＡＲＹＹＡ（ＴＡＧＣＡＲＹＹＡ）
（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＵあるいはＴを表す。）等
が挙げられるが、中でもＵＡＧＣＡＡＵＵＡ（ＴＡＧＣ
ＡＡＴＴＡ）が、リードスルー効率が良いという点で好
ましい。
３０／１８０Ｋタンパク質遺伝子中に存在するＵＡＧＣ
ＡＡＵＵＡ，又はそのＤＮＡ型に相当するＴＡＧＣＡＡ
ＴＴＡ（下線部は終止コドンである。），あるいは終止
コドンを他の終止コドンに置き換えたＵＡＡＣＡＡＵＵ
Ａ（ＴＡＡＣＡＡＴＴＡ），ＵＧＡＣＡＡＵＵＡ（ＴＧ
ＡＣＡＡＴＴＡ），もしくは終止コドン以外の塩基配列
を置換したＵＡＧＣＡＲＹＹＡ（ＴＡＧＣＡＲＹＹＡ）
（ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＵあるいはＴを表す。）等
が挙げられるが、中でもＵＡＧＣＡＡＵＵＡ（ＴＡＧＣ
ＡＡＴＴＡ）が、リードスルー効率が良いという点で好
ましい。
【００１７】本発明に用いられる植物ウィルスの外被タ
ンパク質遺伝子としては、天然に存在する遺伝子の他、
その一部の塩基配列を欠失させたもの，又は一部の塩基
配列を置換した遺伝子でも良いが、特にリードスルーを
誘起する塩基配列の直前の塩基がＡである外被タンパク
質遺伝子が、リードスルー効率の点で好ましい。
ンパク質遺伝子としては、天然に存在する遺伝子の他、
その一部の塩基配列を欠失させたもの，又は一部の塩基
配列を置換した遺伝子でも良いが、特にリードスルーを
誘起する塩基配列の直前の塩基がＡである外被タンパク
質遺伝子が、リードスルー効率の点で好ましい。
【００１８】塩基配列の置換を具体的に示すと、タバコ
モザイクウィルスの場合、外被タンパク質遺伝子の３’
末端のＵ（Ｔ）のＡへの置換あるいは３’末端のＵＣＵ
（ＴＣＴ）のＣＡＡへの置換等が挙げられ、これらの置
換はリードスルー効率が著しく向上するという点で好ま
しい。
モザイクウィルスの場合、外被タンパク質遺伝子の３’
末端のＵ（Ｔ）のＡへの置換あるいは３’末端のＵＣＵ
（ＴＣＴ）のＣＡＡへの置換等が挙げられ、これらの置
換はリードスルー効率が著しく向上するという点で好ま
しい。
【００１９】本発明において用いられるプラスミドとし
ては、植物ウィルスがＲＮＡウィルスの場合は、例えば
試験管内転写用のプロモーターとしてＰＭプロモーター
を持つｐＬＦＷ３（Meshi et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,Vol.83,5043,1986），Ｔ７プロモーターを持つｐＴ
ＬＷ３（渡辺ら，平成４年３月１１日，国立遺伝研究所
研究集会「ウィルス増殖に関連した宿主因子とその機
能」）等が挙げられるが、植物ウィルスがＤＮＡウィル
スの場合は、試験管内転写用のプロモーターを持たない
プラスミドでよい。
ては、植物ウィルスがＲＮＡウィルスの場合は、例えば
試験管内転写用のプロモーターとしてＰＭプロモーター
を持つｐＬＦＷ３（Meshi et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.
USA,Vol.83,5043,1986），Ｔ７プロモーターを持つｐＴ
ＬＷ３（渡辺ら，平成４年３月１１日，国立遺伝研究所
研究集会「ウィルス増殖に関連した宿主因子とその機
能」）等が挙げられるが、植物ウィルスがＤＮＡウィル
スの場合は、試験管内転写用のプロモーターを持たない
プラスミドでよい。
【００２０】本発明の植物ウィルスベクターは、ウィル
スがＲＮＡの場合は例えば次のようにして作成すること
ができる。
スがＲＮＡの場合は例えば次のようにして作成すること
ができる。
【００２１】まず、植物ＲＮＡウィルスのｃＤＮＡを、
試験管内転写用プロモーターを有するプラスミドのプロ
モーター下流に組み込む。次に、遺伝子操作において通
常用いられる手法に従い、植物ウィルス由来の外被タン
パク質遺伝子の下流に、リードスルーを誘起する塩基配
列を介して目的とする外来遺伝子を組み込む。
試験管内転写用プロモーターを有するプラスミドのプロ
モーター下流に組み込む。次に、遺伝子操作において通
常用いられる手法に従い、植物ウィルス由来の外被タン
パク質遺伝子の下流に、リードスルーを誘起する塩基配
列を介して目的とする外来遺伝子を組み込む。
【００２２】この時、外来遺伝子に起因するタンパク質
（又はペプチド）を単離し易いように、リードスルーを
誘起する塩基配列と外来遺伝子との間に、タンパク質分
解酵素等が認識するアミノ酸をコードする塩基配列を挿
入しておくのが好ましい。タンパク質分解酵素が認識す
るアミノ酸としては、例えばアルギニンが挙げられる。
（又はペプチド）を単離し易いように、リードスルーを
誘起する塩基配列と外来遺伝子との間に、タンパク質分
解酵素等が認識するアミノ酸をコードする塩基配列を挿
入しておくのが好ましい。タンパク質分解酵素が認識す
るアミノ酸としては、例えばアルギニンが挙げられる。
【００２３】次に、構築した上記のプラスミドから、試
験管内転写反応によって、ＲＮＡを作成し、植物ウィル
スベクターとする。又、本発明の植物ウィルスベクター
は、更に試験管内で野性型ウィルスの外被タンパク質と
粒子形成させたもの（植物ウィルスベクター粒子）であ
ってもよい。
験管内転写反応によって、ＲＮＡを作成し、植物ウィル
スベクターとする。又、本発明の植物ウィルスベクター
は、更に試験管内で野性型ウィルスの外被タンパク質と
粒子形成させたもの（植物ウィルスベクター粒子）であ
ってもよい。
【００２４】ウィルスがＤＮＡの場合は、ＤＮＡウィル
スを直接プラスミドに組み込み、遺伝子操作を行う。遺
伝子操作を行ったプラスミドからＤＮＡウィルス部分を
切り出す方法等によって、植物ウィルスベクターを作成
することができる。
スを直接プラスミドに組み込み、遺伝子操作を行う。遺
伝子操作を行ったプラスミドからＤＮＡウィルス部分を
切り出す方法等によって、植物ウィルスベクターを作成
することができる。
【００２５】上述のようにして得られた植物ウィルスベ
クターは、ＲＮＡ又はＤＮＡの形で，或いはＲＮＡの場
合は好ましくは粒子形成させた形で、例えばカーボラン
ダムとともに葉に摺り込んだり、カーボランダムととも
に植物体に噴霧する方法等で、簡単に植物に感染させる
ことができる。
クターは、ＲＮＡ又はＤＮＡの形で，或いはＲＮＡの場
合は好ましくは粒子形成させた形で、例えばカーボラン
ダムとともに葉に摺り込んだり、カーボランダムととも
に植物体に噴霧する方法等で、簡単に植物に感染させる
ことができる。
【００２６】
【作用】本発明の植物ウィルスベクターは、リードスル
ーを誘起する塩基配列を有している為、外被タンパク質
と融合タンパク質（外来遺伝子由来の有用タンパク質又
はペプチドと外被タンパク質との融合タンパク質）を、
同時に産生する。その為、ウィルス粒子形成が正常に行
われ、全身感染性を示すと供に、植物体全体において外
来遺伝子を発現できるものと思われる。
ーを誘起する塩基配列を有している為、外被タンパク質
と融合タンパク質（外来遺伝子由来の有用タンパク質又
はペプチドと外被タンパク質との融合タンパク質）を、
同時に産生する。その為、ウィルス粒子形成が正常に行
われ、全身感染性を示すと供に、植物体全体において外
来遺伝子を発現できるものと思われる。
【００２７】
【実施例】以下実施例によって本発明を更に詳細に説明
する。尚、実施例で用いたプラスミドｐＴＬＷ３を図１
に示す。
する。尚、実施例で用いたプラスミドｐＴＬＷ３を図１
に示す。
【００２８】 実施例１〜３，比較例１ １）ＡＣＥＩ配列を組み込んだ転写用プラスミドの作成
【００２９】 ＡＣＥＩ配列を有する合成ＤＮＡの作成 ＡＢＩ社３８０Ａ型合成ＤＮＡ機を用いて、０．２μｍ
ｏｌスケールで、図２に示す８本の合成ＤＮＡを作成し
た。Ａ及びＡ’は従来の直結型ベクター（比較例１），
Ｂ及びＢ’はリードスルー型ベクター（実施例１），Ｃ
及びＣ’は外被タンパク質遺伝子の３’末端の１塩基を
置換したリードスルー型ベクター（実施例２），Ｄ及び
Ｄ’は外被タンパク質遺伝子の３’末端の３塩基を置換
したリードスルー型ベクター（実施例３）に用いるもの
である。いずれのベクターも、発現した融合タンパク質
から、トリプシン消化によってＡＣＥＩペプチドが単離
できるように、ＡＣＥＩ配列の５’側にアルギニンをコ
ードする配列を付してある。合成したＤＮＡは、ＡＢＩ
社ＯＰＣカートリッジによって精製した。
ｏｌスケールで、図２に示す８本の合成ＤＮＡを作成し
た。Ａ及びＡ’は従来の直結型ベクター（比較例１），
Ｂ及びＢ’はリードスルー型ベクター（実施例１），Ｃ
及びＣ’は外被タンパク質遺伝子の３’末端の１塩基を
置換したリードスルー型ベクター（実施例２），Ｄ及び
Ｄ’は外被タンパク質遺伝子の３’末端の３塩基を置換
したリードスルー型ベクター（実施例３）に用いるもの
である。いずれのベクターも、発現した融合タンパク質
から、トリプシン消化によってＡＣＥＩペプチドが単離
できるように、ＡＣＥＩ配列の５’側にアルギニンをコ
ードする配列を付してある。合成したＤＮＡは、ＡＢＩ
社ＯＰＣカートリッジによって精製した。
【００３０】 合成ＤＮＡのリン酸化とアニール で合成したＤＮＡを０．１μｇ／μｌの濃度に調製
し、０．２ｍＭのＡＴＰによってリン酸化し、フェノー
ル処理とエーテル洗浄によって精製した。精製したＤＮ
Ａを０．０２μｇ／μｌに調製し、ＡとＡ’，Ｂと
Ｂ’，ＣとＣ’，ＤとＤ’を各々混合して、６５℃で５
分間処理した。処理後、室温となるまでゆっくりと冷却
することによってアニールした。
し、０．２ｍＭのＡＴＰによってリン酸化し、フェノー
ル処理とエーテル洗浄によって精製した。精製したＤＮ
Ａを０．０２μｇ／μｌに調製し、ＡとＡ’，Ｂと
Ｂ’，ＣとＣ’，ＤとＤ’を各々混合して、６５℃で５
分間処理した。処理後、室温となるまでゆっくりと冷却
することによってアニールした。
【００３１】 プラスミド構築の為の断片調製 図１で表される公知のプラスミドｐＴＬＷ３を、表２に
示す制限酵素の組合せにて消化し、各大きさの断片を調
製した。尚、ｐＴＬＷ３中での各断片の位置関係を、図
３に示す。
示す制限酵素の組合せにて消化し、各大きさの断片を調
製した。尚、ｐＴＬＷ３中での各断片の位置関係を、図
３に示す。
【００３２】
【表２】
【００３３】各断片の調製は、アガロース電気泳動によ
る分離の後、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮキット（ＢＩＯ １
０１社製）を用い、添付説明書に従って行った。
る分離の後、ＧＥＮＥ ＣＬＥＡＮキット（ＢＩＯ １
０１社製）を用い、添付説明書に従って行った。
【００３４】上記断片のうち、ＫｐｎＩとＭｌｕＩの
７．１ｋｂｐ断片については、アルカリホスファターゼ
処理を行い、末端のリン酸を除いて、以下の反応に用い
た。
７．１ｋｂｐ断片については、アルカリホスファターゼ
処理を行い、末端のリン酸を除いて、以下の反応に用い
た。
【００３５】プラスミドの構築と調製で作成した、
アニールした４種の合成ＤＮＡ溶液各々を、で作成し
たｐＴＬＷ３に由来する４つのＤＮＡ断片溶液ととも
に、以下の組成にて、１５℃で１５時間反応させること
によって各々結合させ、４種のプラスミドを作成した。
得られたプラスミドのうち、２種を図４に示す（ａ；比
較例１，ｂ；実施例１）。
アニールした４種の合成ＤＮＡ溶液各々を、で作成し
たｐＴＬＷ３に由来する４つのＤＮＡ断片溶液ととも
に、以下の組成にて、１５℃で１５時間反応させること
によって各々結合させ、４種のプラスミドを作成した。
得られたプラスミドのうち、２種を図４に示す（ａ；比
較例１，ｂ；実施例１）。
【００３６】
【表３】 ┌──────────────────────────┬──────┐ │アニールした合成ＤＮＡ溶液（０．０２μｇ／μｌ） │１．０ μｌ│ │ＫｐｎＩ／ＭｌｕＩ断片 （０．００１μｇ／μｌ） │９．０ μｌ│ │ＫｐｎＩ／ＳｔｕＩ断片 （０．０１μｇ／μｌ） │１．５ μｌ│ │ＳｔｕＩ／ＡｖａII断片 （０．０１５μｇ／μｌ） │０．５ μｌ│ │ＮｓｉＩ／ＭｌｕＩ断片 （０．００５μｇ／μｌ） │０．５ μｌ│ │×１０結合反応用バッファー │１．５ μｌ│ │Ｔ４リガーゼ〔宝酒造（株）３５０Units ／μｌ〕 │１．０ μｌ│ ├──────────────────────────┼──────┤ │ 計 │１５．０μｌ│ └──────────────────────────┴──────┘
【００３７】尚、×１０結合反応用バッファーの組成
を、表４に示す。
を、表４に示す。
【００３８】
【表４】
【００３９】反応液をそのまま用いてＥ．Ｃｏｌｉ・Ｈ
Ｂ１０１コンピテントセル〔宝酒造（株）製〕を形質転
換し、カルベニシリン耐性のコロニーを選抜した。選抜
したコロニーの大腸菌から、目的とするプラスミドを抽
出・精製した。
Ｂ１０１コンピテントセル〔宝酒造（株）製〕を形質転
換し、カルベニシリン耐性のコロニーを選抜した。選抜
したコロニーの大腸菌から、目的とするプラスミドを抽
出・精製した。
【００４０】 ２）試験管内転写反応による植物ウィルスベクターの作
成 １）で作成した４種のプラスミド（従来型ベクターの配
列を持つものと、本発明のベクター配列を持つもの）
を、制限酵素で消化した後、フェノール処理とエタノー
ル沈澱で精製し、鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡを
用い、以下に示す反応系で、３７℃，２時間、試験管内
転写反応を行い、４種の植物ウィルスベクター（ＲＮ
Ａ）を作成した。作成した植物ウィルスベクター（ＲＮ
Ａ）は、フェノール処理とエタノール沈澱により精製し
た。
成 １）で作成した４種のプラスミド（従来型ベクターの配
列を持つものと、本発明のベクター配列を持つもの）
を、制限酵素で消化した後、フェノール処理とエタノー
ル沈澱で精製し、鋳型ＤＮＡとした。この鋳型ＤＮＡを
用い、以下に示す反応系で、３７℃，２時間、試験管内
転写反応を行い、４種の植物ウィルスベクター（ＲＮ
Ａ）を作成した。作成した植物ウィルスベクター（ＲＮ
Ａ）は、フェノール処理とエタノール沈澱により精製し
た。
【００４１】
【表５】 ┌────────────────────────────────┐ │１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０） ４μｌ│ │１Ｍ ＭｇＣｌ2 ２μｌ│ │１Ｍ ＤＴＴ １μｌ│ │１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ １μｌ│ │１００ｍＭ ＡＴＰ １μｌ│ │１００ｍＭ ＵＴＰ １μｌ│ │１００ｍＭ ＣＴＰ １μｌ│ │１０ｍＭ ＧＴＰ ２μｌ│ │１０ｍＭ ＣＡＰ ２０μｌ│ │鋳型ＤＮＡ（０．５ｍｇ／ｍｌ） １０μｌ│ │Ｔ７ポリメラーゼ 〔宝酒造（株）５０Units ／μｌ〕 １μｌ│ │ＲＮａｓｅインヒビター 〔宝酒造（株）５０Units ／μｌ〕 １μｌ│ │Ｈ2 Ｏ ５５μｌ│ ├────────────────────────────────┤ │ 計 １００μｌ│ └────────────────────────────────┘
【００４２】作成した植物ウィルスベクター（ＲＮＡ）
と、公知の方法（Frankel-Conrat.H,Virology,Vol.４,1
〜4,1957）により精製した野性型タバコモザイクウィル
スの外被タンパク質とを、下記の組成にて、２０℃で１
５時間反応させることによって、試験管内で人為的に粒
子形成を行った。反応溶液は、そのまま植物ウィルスベ
クター粒子溶液として使用した。
と、公知の方法（Frankel-Conrat.H,Virology,Vol.４,1
〜4,1957）により精製した野性型タバコモザイクウィル
スの外被タンパク質とを、下記の組成にて、２０℃で１
５時間反応させることによって、試験管内で人為的に粒
子形成を行った。反応溶液は、そのまま植物ウィルスベ
クター粒子溶液として使用した。
【００４３】
【表６】 ┌─────────────────────────┬────┐ │植物ウィルスベクター（ＲＮＡ）（０．３μｇ／μｌ）│ ８μｌ│ │ウィルス外被タンパク質 （１０μｇ／μｌ）│１０μｌ│ │０．２Ｍリン酸バッファー （ｐＨ＝７．０）│１８μｌ│ └─────────────────────────┴────┘
【００４４】 ３）植物ウィルスベクター粒子の接種による植物個体内
への外来遺伝子の導入 ２）で作成した植物ウィルスベクター粒子溶液を１０ｍ
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）によって１００倍
に希釈し、カーボランダムを用いて、播種後６週令のサ
ムソン種タバコ（Nicotiana tabacum cv. Samsun）の葉
に、１００μｌずつ塗擦接種した。
への外来遺伝子の導入 ２）で作成した植物ウィルスベクター粒子溶液を１０ｍ
Ｍリン酸バッファー（ｐＨ＝７．０）によって１００倍
に希釈し、カーボランダムを用いて、播種後６週令のサ
ムソン種タバコ（Nicotiana tabacum cv. Samsun）の葉
に、１００μｌずつ塗擦接種した。
【００４５】 ４）植物個体内における植物ウィルスベクターの複製と
上葉への移行の確認サンプルの調製 植物ウィルスベクター粒子を感染させてから１５日後
に、同一個体内の感染葉及び非感染葉各々から１０ｍｇ
の切片を切り取った。表７に示す組成のＳＤＳサンプリ
ングバッファー５０μｌを加え、ホモジナイズした後、
１００℃で３分間処理した。冷却した後、１２，０００
ｒｐｍで５分間、遠心分離を行い、上清をＳＤＳ化タン
パク質サンプルとした。
上葉への移行の確認サンプルの調製 植物ウィルスベクター粒子を感染させてから１５日後
に、同一個体内の感染葉及び非感染葉各々から１０ｍｇ
の切片を切り取った。表７に示す組成のＳＤＳサンプリ
ングバッファー５０μｌを加え、ホモジナイズした後、
１００℃で３分間処理した。冷却した後、１２，０００
ｒｐｍで５分間、遠心分離を行い、上清をＳＤＳ化タン
パク質サンプルとした。
【００４６】
【表７】 ┌────────────────────────┐ │ ＳＤＳサンプリングバッファー組成 │ ├────────────────┬───────┤ │Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝６．８）│ １２０ｍＭ │ │ＳＤＳ │ ４％ │ │２−メルカプトエタノール │ １０％ │ │グリセロール │ ２０％ │ │ＢＰＢ │０．００２％ │ └────────────────┴───────┘
【００４７】 各サンプル中の植物ウィルスベクターの検出 植物ウィルスベクターの存否は、ウィルス外被タンパク
質及び融合タンパク質の有無によって判断した。で調
製したＳＤＳ化タンパク質サンプル１μｌを、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミド）にかけ、タ
ンパク質を分離した。分離したタンパク質をゲルから電
気式ブロッティングによりＰＶＤＦ膜へと転写した。次
に、抗タバコモザイクウィルスウサギ血清をＴＢＳ緩衝
液〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．６）２０ｍＭ及びＮ
ａＣｌ，１３７ｍＭ〕で６４，０００倍希釈したものを
一次抗体染色液とし、ウサギ抗体用ブロッティング検出
キット（アマシャム社製）を用いて、添付説明書に従
い、抗体染色を行った。結果を図５に示す。
質及び融合タンパク質の有無によって判断した。で調
製したＳＤＳ化タンパク質サンプル１μｌを、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ（１２．５％ポリアクリルアミド）にかけ、タ
ンパク質を分離した。分離したタンパク質をゲルから電
気式ブロッティングによりＰＶＤＦ膜へと転写した。次
に、抗タバコモザイクウィルスウサギ血清をＴＢＳ緩衝
液〔Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．６）２０ｍＭ及びＮ
ａＣｌ，１３７ｍＭ〕で６４，０００倍希釈したものを
一次抗体染色液とし、ウサギ抗体用ブロッティング検出
キット（アマシャム社製）を用いて、添付説明書に従
い、抗体染色を行った。結果を図５に示す。
【００４８】融合タンパク質のみを産生する従来型植物
ウィルスベクター（比較例１）は、感染葉中では検出さ
れたが、非感染葉への移行は認められなかった（図５の
１，２）。
ウィルスベクター（比較例１）は、感染葉中では検出さ
れたが、非感染葉への移行は認められなかった（図５の
１，２）。
【００４９】一方、外被タンパク質と融合タンパク質と
を同時に産生するようにリードスルー配列を導入した本
発明の植物ウィルスベクター（実施例１〜３）は、感染
葉と非感染葉の両方において検出され、葉から葉へと移
行している（全身感染性を持つ）ことが確認された（図
５の３〜８）。
を同時に産生するようにリードスルー配列を導入した本
発明の植物ウィルスベクター（実施例１〜３）は、感染
葉と非感染葉の両方において検出され、葉から葉へと移
行している（全身感染性を持つ）ことが確認された（図
５の３〜８）。
【００５０】 ５）植物個体内におけるＡＣＥＩの産生の確認 ４）と同じサンプルを用いて、同様に電気泳動，膜への
転写を行い、抗ＡＣＥＩウサギ血清をＴＢＳ緩衝液で１
２８，０００倍希釈したものを一次抗体染色液とし、
４）と同様に抗体染色を行った。結果を図６に示す。
転写を行い、抗ＡＣＥＩウサギ血清をＴＢＳ緩衝液で１
２８，０００倍希釈したものを一次抗体染色液とし、
４）と同様に抗体染色を行った。結果を図６に示す。
【００５１】従来型植物ウィルスベクターは感染葉のみ
に、本発明の植物ウィルスベクターは感染葉及び非感染
葉の両方において、融合タンパク質の形でＡＣＥＩを産
生していることが確認された。
に、本発明の植物ウィルスベクターは感染葉及び非感染
葉の両方において、融合タンパク質の形でＡＣＥＩを産
生していることが確認された。
【００５２】 ６）植物ウィルスベクターの融合タンパク質生産能の比
較 サンプルの調製及びサンプル中の植物ウィルスベクター
の検出は、４）の，と同様に行い、実施例１〜３の
植物ウィルスベクターの融合タンパク質生産能を比較し
た。
較 サンプルの調製及びサンプル中の植物ウィルスベクター
の検出は、４）の，と同様に行い、実施例１〜３の
植物ウィルスベクターの融合タンパク質生産能を比較し
た。
【００５３】その際、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけるサンプ
ルは、感染葉から抽出し、生葉０．２ｍｇ相当量として
揃えた。また、同時にタバコモザイクウィルス外被タン
パク質スタンダード１００，７５，５０，２５，１０，
５ｎｇもＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。検出は４）のと
同様、抗タバコモザイクウィルスウサギ血清による抗体
染色によって行った。その結果を図７に示す。
ルは、感染葉から抽出し、生葉０．２ｍｇ相当量として
揃えた。また、同時にタバコモザイクウィルス外被タン
パク質スタンダード１００，７５，５０，２５，１０，
５ｎｇもＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。検出は４）のと
同様、抗タバコモザイクウィルスウサギ血清による抗体
染色によって行った。その結果を図７に示す。
【００５４】図７におけるバンドの濃さを比較し、それ
ぞれのベクターの融合タンパク質生産量を算出したとこ
ろ、タバコの葉１ｇあたり実施例１のベクターは０．０
２５ｍｇ，実施例２のベクター及び実施例３のベクター
は０．２５ｍｇの融合タンパク質を生産していた。この
ことから、外被タンパク質遺伝子の３’末端の塩基配列
をＵからＡ，あるいはＵＣＵからＣＡＡに置換すること
によって、リードスルー効率が向上し、融合タンパク質
生産能が１０倍に増大していることが判った。
ぞれのベクターの融合タンパク質生産量を算出したとこ
ろ、タバコの葉１ｇあたり実施例１のベクターは０．０
２５ｍｇ，実施例２のベクター及び実施例３のベクター
は０．２５ｍｇの融合タンパク質を生産していた。この
ことから、外被タンパク質遺伝子の３’末端の塩基配列
をＵからＡ，あるいはＵＣＵからＣＡＡに置換すること
によって、リードスルー効率が向上し、融合タンパク質
生産能が１０倍に増大していることが判った。
【００５５】 実施例４ 実施例１で作成したＡＣＥＩ配列を持つ本発明の植物ウ
ィルスベクター粒子溶液を、播種後約６ヵ月のミニトマ
トの〔シュガーランプ種，サカタのタネ（株）から購
入〕葉に感染させた。感染は、実施例１と同様に行っ
た。１４日後にトマトの実を収穫し、トマトの実から抽
出したタンパク質サンプル中のＡＣＥＩを、実施例１と
同様にして、抗ＡＣＥＩ抗体を用いて検出した。結果を
図８に示す。
ィルスベクター粒子溶液を、播種後約６ヵ月のミニトマ
トの〔シュガーランプ種，サカタのタネ（株）から購
入〕葉に感染させた。感染は、実施例１と同様に行っ
た。１４日後にトマトの実を収穫し、トマトの実から抽
出したタンパク質サンプル中のＡＣＥＩを、実施例１と
同様にして、抗ＡＣＥＩ抗体を用いて検出した。結果を
図８に示す。
【００５６】図８から明らかなように、トマト実中でＡ
ＣＥＩが産生されていることが確認された。
ＣＥＩが産生されていることが確認された。
【００５７】作成されたトマトの実は、経口摂取による
血圧低下作用を有するＡＣＥＩを多量に含有しているも
のと期待される。
血圧低下作用を有するＡＣＥＩを多量に含有しているも
のと期待される。
【００５８】 実施例５〜７ 実施例２と同様にして、インフルエンザウィルスｈｅｍ
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ由来のペプチド２種（ＴＬＨＡ
１，ＴＬＨＡ２と略記する。），及びエイズウィルスｇ
ｐ１２０由来のペプチド１種（ＴＬＨＩＶと略記す
る。）をコードする遺伝子を用いて１塩基置換リードス
ルー型ベクターを作成し、タバコの葉に感染させた。用
いた合成ＤＮＡを図９に示す。
ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ由来のペプチド２種（ＴＬＨＡ
１，ＴＬＨＡ２と略記する。），及びエイズウィルスｇ
ｐ１２０由来のペプチド１種（ＴＬＨＩＶと略記す
る。）をコードする遺伝子を用いて１塩基置換リードス
ルー型ベクターを作成し、タバコの葉に感染させた。用
いた合成ＤＮＡを図９に示す。
【００５９】その結果実施例１〜３と同様、外被タンパ
ク質と融合タンパク質とを同時に産生するようにリード
スルー配列を導入した本発明の植物ウィルスベクター
（実施例４〜６）は、感染葉と非感染葉の両方において
検出され、葉から葉へと移行している（全身感染性を持
つ）ことが確認された（図１０）。
ク質と融合タンパク質とを同時に産生するようにリード
スルー配列を導入した本発明の植物ウィルスベクター
（実施例４〜６）は、感染葉と非感染葉の両方において
検出され、葉から葉へと移行している（全身感染性を持
つ）ことが確認された（図１０）。
【００６０】また、感染葉及び非感染葉の両方におい
て、融合タンパク質の形でペプチドを産生していること
が確認された（図１１）。
て、融合タンパク質の形でペプチドを産生していること
が確認された（図１１）。
【００６１】
【発明の効果】以上の様に、本発明の植物ウィルスベク
ターは、植物個体での全身感染性という大きな利点を有
しているため、植物個体への有用な性質の導入及び植物
体全体での有用タンパク質の生産が可能となる。
ターは、植物個体での全身感染性という大きな利点を有
しているため、植物個体への有用な性質の導入及び植物
体全体での有用タンパク質の生産が可能となる。
【図１】プラスミドｐＴＬＷ３を表す図である。
【図２】実施例〜３及び比較例１において、植物ウィル
スベクターを作成する際に使用した合成ＤＮＡの、塩基
配列を表す図である（Ａ及びＡ’は比較例１，Ｂ及び
Ｂ’は実施例１，Ｃ及びＣ’は実施例２，Ｄ及びＤ’は
実施例３）。
スベクターを作成する際に使用した合成ＤＮＡの、塩基
配列を表す図である（Ａ及びＡ’は比較例１，Ｂ及び
Ｂ’は実施例１，Ｃ及びＣ’は実施例２，Ｄ及びＤ’は
実施例３）。
【図３】実施例及び比較例においてプラスミド構築に用
いたＤＮＡ断片の、プラスミドｐＴＬＷ３中における位
置関係を示す図である。
いたＤＮＡ断片の、プラスミドｐＴＬＷ３中における位
置関係を示す図である。
【図４】（ａ）は比較例１，（ｂ）は実施例１において
作成したプラスミドを表す図である。
作成したプラスミドを表す図である。
【図５】比較例１及び実施例１〜３で行った植物個体へ
の感染実験において、感染葉及び非感染葉中のベクター
ウィルスの有無を調べた図である。
の感染実験において、感染葉及び非感染葉中のベクター
ウィルスの有無を調べた図である。
【図６】比較例１及び実施例１〜３で行った植物個体へ
の感染実験において、感染葉及び非感染葉中のＡＣＥＩ
の有無を調べた図である。
の感染実験において、感染葉及び非感染葉中のＡＣＥＩ
の有無を調べた図である。
【図７】本発明のリードスルー型ベクター（実施例１〜
３）の、融合タンパク質生産能を調べた図である。
３）の、融合タンパク質生産能を調べた図である。
【図８】実施例４で行ったミニトマトへの感染実験にお
いて、トマト実中のＡＣＥＩの有無を調べた図である。
いて、トマト実中のＡＣＥＩの有無を調べた図である。
【図９】実施例５〜７において、植物ウィルスベクター
を作成する際に使用した合成ＤＮＡの、塩基配列を表す
図である（Ｅ及びＥ’は実施例５，Ｆ及びＦ’は実施例
６，Ｇ及びＧ’は実施例７）。
を作成する際に使用した合成ＤＮＡの、塩基配列を表す
図である（Ｅ及びＥ’は実施例５，Ｆ及びＦ’は実施例
６，Ｇ及びＧ’は実施例７）。
【図１０】実施例５〜７で行った植物個体への感染実験
において、感染葉及び非感染葉中のベクターウィルスの
有無を調べた図である。
において、感染葉及び非感染葉中のベクターウィルスの
有無を調べた図である。
【図１１】実施例５〜７で行った植物個体への感染実験
において、感染葉及び非感染葉中のペプチドの有無を調
べた図である。
において、感染葉及び非感染葉中のペプチドの有無を調
べた図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松永 祐士 神奈川県南足柄市岩原171番地 (72)発明者 岡田 吉美 千葉県松戸市常盤平２丁目６番14号 審査官 内田 俊生
Claims (6)
- 【請求項１】 植物ウィルスの外被タンパク質遺伝子の
下流に、リードスルーを誘起する塩基配列を介して外来
遺伝子が接続されていることを特徴とする、植物ウィル
スベクター。 - 【請求項２】 外被タンパク質遺伝子が、一部の塩基配
列を欠損又は置換した外被タンパク質遺伝子である請求
項１記載の植物ウィルスベクター。 - 【請求項３】 植物ウィルスが植物ＲＮＡウィルスであ
る請求項１又は２記載の植物ウィルスベクター。 - 【請求項４】 外被タンパク質遺伝子が、トバモウィル
スの遺伝子である請求項１又は２記載の植物ウィルスベ
クター。 - 【請求項５】 請求項３乃至４記載の植物ウィルスベク
ターを転写産物とするプラスミド。 - 【請求項６】 請求項１乃至３記載の植物ウィルスベク
ターを双子葉植物個体に直接接種することを特徴とす
る、外来遺伝子を双子葉植物中で発現させる方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4188744A JP2880024B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-06-22 | 植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法 |
| EP93906862A EP0672754B1 (en) | 1992-03-31 | 1993-03-31 | Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product |
| US08/313,127 US5618699A (en) | 1992-03-31 | 1993-03-31 | Plant virus vector, plasmid, process for expression of foreign gene and process for obtaining foreign gene product |
| EP01118243A EP1162267A3 (en) | 1992-03-31 | 1993-03-31 | Plant virus vector, plasmid, process for expression of foreign gene and process for obtaining foreign gene product |
| DE69333529T DE69333529T2 (de) | 1992-03-31 | 1993-03-31 | Pflanzenvirus-vektor, plasmid, methode der expression fremder gene und methode zur gewinnung obiger genprodukte |
| PCT/JP1993/000408 WO1993020217A1 (en) | 1992-03-31 | 1993-03-31 | Plant virus vector, plasmid, method of expressing foreign gene, and method of acquiring foreign gene product |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10862892 | 1992-03-31 | ||
| JP4-108628 | 1992-03-31 | ||
| JP4188744A JP2880024B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-06-22 | 植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328977A JPH05328977A (ja) | 1993-12-14 |
| JP2880024B2 true JP2880024B2 (ja) | 1999-04-05 |
Family
ID=14489619
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4188744A Expired - Fee Related JP2880024B2 (ja) | 1992-03-31 | 1992-06-22 | 植物ウィルスベクター及びプラスミド並びに外来遺伝子を植物中で発現させる方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2880024B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1764414A1 (en) * | 2005-09-17 | 2007-03-21 | Icon Genetics AG | Plant viral particles comprising a plurality of fusion proteins consisting of a plant viral coat protein, a peptide linker and a recombinant protein and use of such plant viral particles for protein purification |
-
1992
- 1992-06-22 JP JP4188744A patent/JP2880024B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05328977A (ja) | 1993-12-14 |
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