CN103392003A - 基于长线形病毒的核酸分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在植物细胞中产生靶多肽的新型核酸分子。更具体地，所述新型核酸分子包含来源于长线形病毒科病毒的微型复制子和编码靶多肽的异源多核苷酸。还提供了包含靶多肽的组合物及其用途。

Description

基于长线形病毒的核酸分子及其用途
交叉参考相关申请
本申请要求2010年10月8日提交的美国临时申请号61/391,333的权益，为了所有目的将其内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明总地来说涉及用于在植物细胞中产生靶多肽的新型核酸分子。更具体地，所述核酸分子包括来源于长线形病毒科(Closteroviridae)病毒的微型复制子(minireplicon)及编码靶多肽的多核苷酸。
发明背景
使用植物病毒载体产生重组蛋白(包括单克隆抗体(mAb)、疫苗抗原、酶、双效疫苗(dual vaccine)、融合分子及病毒样颗粒(VLP))是对常规的基于哺乳动物细胞的表达系统的有吸引力的替代方式。由于病毒复制速度很快，因此植物病毒载体具有快速产生大量外源蛋白的潜力。
基于烟草花叶病毒(TMV)的载体是最广泛地用于瞬时表达植物产生的亚基疫苗和治疗性蛋白质的载体(Streatfield；Yusibov等人；Gleba等人；Rybicki)。然而，使用TMV载体表达高分子量蛋白质或共表达多个多肽链或蛋白质是存在挑战的。仍然需要用于在植物中产生单个大的靶蛋白以及同时产生多个靶蛋白的改进的植物病毒载体。
发明概述
本发明的公开的主题涉及用于在植物细胞中产生靶多肽的新型核酸分子。
根据本发明的一个方面，提供了用于在植物细胞中产生一种或多种靶多肽的分离的核酸分子。核酸分子包括来源于长线形病毒科病毒的微型复制子和一种或多种异源多核苷酸。核酸分子能够在植物细胞中复制。一种或多种异源多核苷酸编码一种或多种靶多肽。核酸分子还可包括编码一种或多种来源于长线形病毒科病毒的移动蛋白(movement proteins)的多核苷酸。长线形病毒科病毒可以是甜菜黄化病毒(Beet yellows virus)。
植物细胞可存在于植物、植物部分或细胞培养基中。植物可以是完整的正在生长的植物。植物部分可选自叶、茎、根、花组织、种子和叶柄。
在一个实施方案中，一种或多种靶多肽包含蛋白质的一个或多个亚基，并且能够在植物细胞中形成所述蛋白质。蛋白质可以是酶。
在另一个实施方案中，一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且第一多肽能够在植物细胞中修饰第二多肽。
在另一个实施方案中，一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且第一多肽能够影响第二多肽在植物细胞中的表达。第一多肽可以是沉默抑制子(silencing suppressor)。
在其它实施方案中，一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且第一多肽能够增加第二多肽在植物细胞中的产生。
在其它实施方案中，一种或多种靶多肽包括抗体的重链和轻链，并且能够在植物细胞中形成所述抗体。
一种或多种靶多肽可包括免疫原性多肽。一种或多种靶多肽包括至少100kD的多肽。
对于本发明的每一种核酸分子，提供了包含所述核酸分子的载体。
根据本发明的另一个方面，提供了用于在植物细胞中产生一种或多种靶多肽的方法。方法包括(a)将核酸分子引入植物细胞；和(b)在允许一种或多种靶多肽在植物细胞中产生的条件下维持植物细胞。核酸分子包括来源于长线形病毒科病毒的微小扩增子和一种或多种异源多核苷酸。核酸分子能够在植物细胞中复制。一种或多种异源多核苷酸编码一种或多种靶多肽。一种或多种靶多肽包括至少100kD的多肽。所述方法还可包括从植物细胞纯化一种或多种靶多肽的至少一种。核酸分子还可包括编码一种或多种来源于长线形病毒科病毒的移动蛋白的多核苷酸。长线形病毒科病毒可以是甜菜黄化病毒。
在本发明的产生方法中，植物细胞可存在于植物、植物部分或细胞培养基中。植物可以是完整的正在生长的植物。植物部分可选自叶、茎、根、叶组织、种子和叶柄。
提供了包含至少一种通过本发明的方法产生的一种或多种靶多肽的组合物。还提供了治疗需要至少一种由此产生的一种或多种靶多肽的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含一种或多种靶多肽的至少一种的药物组合物。
在一个实施方案中，一种或多种靶多肽包括蛋白质的一个或多个亚基。在产生方法中，维持条件还允许在植物细胞中产生蛋白质。提供了包含由此产生的蛋白质的组合物。还提供了治疗需要所述蛋白质的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含蛋白质的药物组合物。蛋白质可以是酶。
在另一个实施方案中，一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽。在产生方法中，维持条件还允许第一多肽在植物细胞中修饰第二多肽、影响第二多肽的表达和/或增加第二多肽的产生。提供了包含第二多肽的组合物。还提供了治疗需要第二多肽的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含第二多肽的药物组合物。第一多肽可以是沉默抑制子。
在另一个实施方案中，一种或多种靶多肽包括抗体的重链和轻链。在产生方法中，维持条件还允许在植物细胞中产生抗体。提供了包含抗体的组合物。还提供了治疗需要抗体的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含抗体的药物组合物。
在其它实施方案中，一种或多种靶多肽包括免疫原性多肽。提供了包含由此产生的免疫原性多肽的组合物。还提供了用于在受试者中诱导免疫应答的方法。诱导方法包括给受试者施用有效量的包含免疫原性多肽的药物组合物。还提供了用于在受试者中诱导抗病原体的保护性免疫应答的方法。保护性诱导方法包括给受试者施用有效量的包含免疫原性多肽的药物组合物。免疫原性多肽来源于病原体。
附图概述
图1为举例说明BYV基因组的组织的图解。L-Pro–木瓜蛋白酶样前导蛋白水解酶；Met、Hel和Pol–分别是复制酶的甲基转移酶、RNA解螺旋酶和RNA-依赖性RNA聚合酶结构域；p6–6kD蛋白质；Hsp70h–Hsp70同源物；p64–64kD蛋白质；CPm和CP–分别是次要和主要衣壳蛋白；p20和p21–分别是20和21kD的蛋白质。
图2是举例说明编码抗-PA抗体的Hc和Lc的基于BYV的launch载体(launch vector)的T-DNA区域的图解。35S–花椰菜花叶病毒35S启动子；NOS–胭脂碱合酶终止子；LB和RB–分别是T-DNA的左和右边界。
图3A显示利用编码抗-PA抗体的Hc和Lc的基于BYV的launch载体系统性感染的本氏烟草(N.benthamiana)叶子。图3B显示在渗透(infiltration)后(dpi)30、32、34、36和39天系统性感染的本氏烟草叶子的Hc、Lc以及总的抗-PA IgG表达的Western印迹分析。在第34天观察到总的抗-PA IgG的最大表达，新鲜叶重量为53mg/kg。*标准物，总的人IgG的ng数。
图4是举例说明用于表达抗-PA抗体的Hc和Lc的基于T-DNA的BYV微型复制子载体的T-DNA区域的图解。Hc和Lc基因分别处于BYV CP启动子和GLRaV2CP启动子的控制之下。
图5是举例说明用于表达抗-PA抗体的Hc和Lc的基于T-DNA的BYV微型复制子载体的T-DNA区域的图解。Hc和Lc基因分别处于BYV CP启动子和BYSV CP启动子的控制之下。
图6A-B显示分别在5和7dpi通过修饰的miniBYV载体系统性感染的本氏烟草叶子中的Hc和Lc表达的Western印迹分析。图6C显示在5、7和9dpi系统性感染的本氏烟草叶子中的Lc和Hc的表达的计算的量。泳道：100、50和25(ng)的人mAb标准物。Q3,#1,Q3,#2,Q3,#3,Q4,#1,Q4,#2,Q4,#3–具有抗-PA mAb的Hc和Lc的miniBYV复制子的不同克隆。
图7是举例说明处于BYV启动子控制之下的用于表达炭疽保护性抗原83(PA83)的miniBYV复制子载体的T-DNA区域的图解。
图8A显示在5、7和9dpi系统性感染的本氏烟草叶子中的PA83表达的Western印迹分析。图8B显示在5、7和9dpi系统性感染的本氏烟草叶子中的总蛋白质(TP)和总可溶性蛋白质(TSP)表达的量。泳道1-9：1，PA标准物，50ng；2，PA标准物，25ng；3，PA标准物，10ng；4，pCB-miniBYV-PA83，TP；5，pCB-miniBYV-PA83，TSP；6，pGR-D4-PA83，TP*；7，pGR-D4-PA83，TSP*；8，pClean238-PA83，TP；9，pClean238-PA83，TSP。*无沉默抑制子P1HcPro。
图9是举例说明用于共表达靶蛋白Pfs48与能够修饰靶蛋白的酶的miniBYV复制子载体的T-DNA区域的图解。
图10显示靶蛋白Pfs48与能够使靶蛋白Pfs48去糖基化的酶PNGaseF的共表达。分别使用抗-His抗体(A)和抗-FLAG抗体(B)进行检测。
图11是举例说明使用强和弱长线形病毒启动子(即，BYV CP启动子、GLRaV2CP启动子和BYSV CP启动子)的组合表达3个不同靶的3个开放阅读框(ORF)的miniBYV复制子载体的T-DNA区域的图解。
图12A-H显示了根据公开的主题的一些实施方案的BYV launch载体的T-DNA区域的核酸序列(SEQ ID NO：1)。在T-DNA序列的左边界(LB)与右边界(RB)(下划线)之间引入了具有多克隆位点(粗体)和35S启动子(小写字体)及NOS终止子(斜体小写字体)的BYV序列(大写字体)。多克隆位点(粗体)包括PacI(14,254-14,261bp)、AscI(14,262-14,269)、BsrGI(14,270-14,275)、NheI(14,276-14,281)和FseI(14,285-14,292)。
图13A-E显示根据公开的主题的一些实施方案的miniBYVlaunch载体的T-DNA区域的核酸序列(SEQ ID NO：2)。在T-DNA序列的左边界(LB)与右边界(RB)(下划线)之间引入了具有多克隆位点(粗体)和具有双重增强子的35S启动子(小写字体)及NOS终止子(斜体小写字体)的miniBYV序列(大写字体)。多克隆位点(粗体)包括BamHI(10,278-10,285)、PacI(10,286-10,293)、AscI(10,294-10,301)、BsrGI(10,302-10,307)、NheI(10,308-10,313)和FseI(10,317-10,324)。
图14显示(A)BYV CP启动子(SEQ ID NO：3)、(B)BYSV CP启动子(SEQ ID NO：4)和(C)GLRaV2CP启动子(SEQ ID NO：5)的核酸序列。
图15显示(A)在N-末端具有来自烟草(Nicotiana tabacum)的PR1a信号肽(下划线)的抗-PA抗体的Lc的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)，和(B)具有TGA终止密码子(下划线)的相应核酸序列(SEQ ID NO：7)。
图16显示(A)在N-末端具有来自烟草的PR1a信号肽(下划线)的抗-PA抗体的Hc的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)，和(B)具有TGA终止密码子(下划线)的相应核酸序列(SEQ ID NO：9)。
图17显示(A)在N-末端具有来自烟草的PR1a信号肽(下划线)以及在C-末端具有用于纯化的6His(粗体)和作为ER滞留信号的KDEL(斜体)的PA83的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)，和(B)具有TGA终止密码子(下划线)的相应核酸序列(SEQ ID NO：11)。
图18显示(A)在N-末端具有来自烟草的PR1a信号肽(下划线)以及在C-末端具有用于纯化的6His(粗体)和作为ER滞留信号的KDEL(斜体)的Pfs48的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，和(B)具有TGA终止密码子(下划线)的相应核酸序列(SEQ ID NO：13)。
图19显示(A)在N-末端具有来自烟草的PR1a信号肽(下划线)以及在C-末端具有用于检测的FLAG标签(粗体)和作为ER滞留信号的KDEL(斜体)的PNGaseF的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)，和(B)具有TGA终止密码子(下划线)的相应核酸序列(SEQ ID NO：15)。
发明详述
本发明基于下列发现：包含甜菜黄化病毒(BYV)微型复制子的新型核酸分子可用于在植物细胞中产生单一或多种异源靶多肽。BYV微型复制子可用于产生具有治疗活性的蛋白质、亚基疫苗、蛋白质佐剂、酶、单克隆抗体(mAb)和病毒样颗粒(VLP)。
BYV为属于长线形病毒科线形病毒属(Closterovirus)的正链RNA病毒的甲病毒超组(alphavirus supergroup)的成员。BYV的15.5kb单分体基因组(monopartite genome)编码8个开放阅读框(ORF)(图1)。3组蛋白质在BYV基因组得到认识。第一组蛋白质负责病毒复制，包括甲基转移酶(Met)、解螺旋酶(Hel)和RNA聚合酶(Pol)(ORF1A和1B)。第二组蛋白质负责病毒的细胞间移动(ORF2-6)，包括P6、HSP70h、CP、CPm和p64。此类蛋白质的任一个被敲除导致病毒的细胞间移动的阻止。第三组蛋白质包括病毒结构组分例如Hsp70H、CP、CPm、p64和p20(ORF3-7)。p20也称为病毒长距离转运因子。p21-BYV沉默抑制子(ORF8)。
BYV包含覆盖50%以上的BYV基因组并且包括BYV复制所必需的基因的复制基因块(gene block)。BYV复制基因块由病毒复制酶(Hel)的木瓜蛋白酶样前导蛋白水解酶(L-Pro)的结构域、甲基转移酶(Met)、解螺旋酶样结构域区域以及RNA依赖性RNA聚合酶(Pol)形成。RNA依赖性RNA聚合酶从+1移框表达。由于移框频率低，因此包含甲基转移酶、解螺旋酶和聚合酶的更大的复制蛋白相较于甲基转移酶-解螺旋酶多蛋白而言以较少的量产生(图1)。弯曲的BYV病毒体长度为～1300nm，直径为～12nm，并且包含5种结构蛋白。主要衣壳蛋白(CP)包裹了病毒体的～95%。BYV的细胞间移动和系统性移动所必需的短的病毒体尾包含：次要CP(CPm)；Hsp70h，细胞热激蛋白的同源物；p64，功能未知的64kD蛋白质；和p20，长距离转运因子。BYV的其它蛋白质为p6，BYV的细胞间移动所需的小的跨膜蛋白并且位于宿主细胞的内质网中；和p21，参与短干扰RNA的结合的BYV沉默抑制子。
本文中使用的术语“蛋白质”是指包含氨基酸残基的生物分子。蛋白质可包含一个或多个多肽。每一个多肽可以是蛋白质的亚基。例如，蛋白质可以是由两个Hc和两个Lc组成的抗体。蛋白质可以以天然或修饰的形式存在，并且当其多肽正确折叠或装配时可显示生物功能。
本文中使用的术语“多肽”是指对于聚合物的最小长度没有限制的氨基酸残基的聚合物。优选，多肽具有至少20个氨基酸。多肽可以是全长蛋白质或其片段或变体。
本文中使用的术语蛋白质的“片段”是指具有与蛋白质的氨基酸序列的部分但非全部相同的氨基酸序列的多肽。优选，蛋白质的片段保留与蛋白质相同的功能。
本文中使用的术语蛋白质的“变体”是指这样的多肽，所述多肽除具有至少一个修饰例如糖基化、磷酸化、缺失、添加或置换外具有与蛋白质的氨基酸序列相同的氨基酸。变体可具有与蛋白质的氨基酸序列具有至少约80%、90%、95%或99%，优选至少约90%，更优选至少约95%的同一性的氨基酸。优选，蛋白质的变体保留与蛋白质相同的功能。
本文中使用的术语“来源于”是指起源或来源，可包括天然存在的、重组的、未纯化的或纯化的分子。
根据本发明的一个方面，提供了用于在植物细胞中产生一种或多种靶多肽的核酸分子。核酸分子包括来源于长线形病毒科病毒的微型复制子以及一种或多种异源多核苷酸，并且能够在植物细胞中复制。所述一种或多种异源多核苷酸编码一种或多种靶多肽。
长线形病毒科病毒可以是长线形病毒科中的任何病毒。例如，长线形病毒科病毒可以是甜菜黄化病毒、葡萄卷叶伴随病毒(Grapevineleafroll-associated virus)2(GLRaV2)、甜菜黄矮病毒(Beet yellows stuntvirus)(BYSV)、柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus)(CTV)、胡萝卜黄叶病毒(Carrot yellow leaf virus)(CYLV)或莴苣传染性枯黄病毒(Lettuceinfectious yellows virus)(LIYV)。优选，长线形病毒为甜菜黄化病毒。
植物细胞可以是任何植物、植物部分(例如，叶、茎、根、花组织、种子和叶柄)或细胞培养基中的细胞。植物可以是完整的正在生长的植物。细胞培养基可以是适用于生长植物细胞(优选以悬浮形式)的任何培养基。植物细胞优选易被长线形病毒科病毒感染。更优选，植物细胞对BYV感染易感。植物细胞优选适合于靶多肽的表达。例如，植物细胞可以是本氏烟草叶子的细胞。其它适当的植物包括克里夫兰烟草(Nicotiana clevelandii)、甜菜、菠菜、油菜、莴苣、豌豆、烟草、长叶车前(Plantago lanceolata)、番杏(Tetragonia tetragonioides)、冬马齿苋(Montia perfoliata)、甜菜、菠菜、鹅肠菜(Stellaria media)、油菜、莴苣、豌豆、烟草、长叶车前、冬马齿苋、番杏、球花藜(Chenopodiumfoliosum)和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)。
来源于长线形病毒科病毒的微型复制子为多核苷酸，其包含仅编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质的每一种相应于长线形病毒科病毒的病毒复制所需的天然病毒复制蛋白。每一种编码的蛋白质显示与其相应的天然病毒复制蛋白相同的功能，并且可具有与其相应的天然病毒复制蛋白的氨基酸序列具有至少约80%、85%、90%、95%或99%，优选至少约95%，更优选至少约99%，最优选100%的同一性的氨基酸序列。微型复制子可通过缺失病毒复制非必需的核酸序列(包括基因)来从长线形病毒科病毒的基因组产生。例如，BYV微型复制子可以是由L-Pro结构域、甲基转移酶(Met)、解螺旋酶(Hel)和RNA依赖性RNA聚合酶(Pol)形成的复制基因块(如图1中显示的)。
对于本发明的每一种核酸分子，提供了包含所述核酸的载体。载体可在每一个末端包括细菌转移DNA的边界序列，并且位于细菌转移DNA中，以允许将本发明的核酸递送入植物细胞。具体地，载体可包括来源于二元载体(binary vector)的Ti质粒的一个或多个核酸序列(例如，图2中的右边界(RB)和左边界(LB))。这样的包括Ti质粒和病毒载体的元件的载体也称为launch载体。该载体也可用于共表达目标靶多核苷酸和蛋白质，例如沉默抑制子或修饰酶例如PNGaseF，以修饰靶多肽，影响靶多肽的表达和/或增加靶多肽的产生。所述蛋白质可促进靶多肽的成熟或积累。
异源多核苷酸是对于长线形病毒科病毒和靶细胞来说是外来的，非天然的多核苷酸。其可包含编码靶多肽的核酸序列，所述靶多肽可在植物细胞中表达。
在本发明的核酸分子中，每一个异源多核苷酸编码靶多肽，并且可以可操作地连接于来源于长线形病毒科的任何病毒的病毒启动子。适当的病毒启动子的实例包括BYV启动子、葡萄卷叶伴随病毒2(GLRaV2)启动子和/或甜菜黄矮病毒(BYSV)启动子。优选，同一核酸分子中的多核苷酸可操作地连接于不同的病毒启动子。示例性病毒启动子包括BYV CP启动子(SEQ ID NO：3；图14)、BYSV CP启动子(SEQ ID NO：4；图14)和GLRaV2CP启动子(SEQ ID NO：5；图14)。
本发明的核酸分子还可包括编码来源于长线形病毒科病毒的一种或多种移动蛋白的多核苷酸。移动蛋白的实例包括BYV的p6、Hsp70h、p64、CPm、CP和p20。移动蛋白可增强核酸分子从一个植物细胞至另一个植物细胞的移动并且导致核酸分子的系统性扩散，从而使由异源多核苷酸编码的靶多肽的植物产生水平升高例如至少约1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、200%、500%或1000%。
本发明的核酸分子可包含1(例如，图7)、2(例如，图2、4、5和9)、3(例如，图11)或更多种异源多核苷酸，所述多核苷酸的每一种编码靶多肽。优选，核酸分子包括编码两种或更多种靶多肽的两种或更多种异源多核苷酸，并且靶多肽从植物细胞内的核酸分子的相同微型复制子表达。靶多肽可构成蛋白质的亚基。靶多肽能够形成蛋白质例如酶或抗体。例如，核酸分子可包括编码抗体的Hc(图16)和Lc(图15)的两种异源多核苷酸。在一些实施方案中，核酸可编码两种靶多肽，其中第一靶多肽能够在植物细胞中修饰第二靶多肽，影响其表达和/或增加其产生。第一靶多肽可促进第二多肽的成熟，所述第二多肽变得具有生物活性。第一靶多肽还可促进第二多肽的积累。
靶多肽可以是能够形成或成为功能性蛋白质(例如，酶或抗体)或疫苗候选者的任何多肽。靶多肽可具有任何大小。其可具有至少约6、10、50、100、200、300、400、500、750或1000个氨基酸，优选至少约100个氨基酸，更优选至少约500个氨基酸，最优选至少750个氨基酸。其还可以为至少约10、20、50、75、100、125、150或200kD，优选至少约100kD，更优选至少约125kD，最优选至少约150kD。
靶多肽可以是免疫原性的。其可包含一个或多个能够刺激受试者的免疫系统以产生体液和/或细胞的抗原特异性免疫应答的表位(线性的和/或构象的)。体液免疫应答是指由B淋巴细胞或B细胞产生的抗体介导的免疫应答，而细胞免疫应答是指由T淋巴细胞或T细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。一般而言，B细胞表位包含至少约5个氨基酸，但可以为3-4个氨基酸，而T细胞表位包括至少约7-9个氨基酸，辅助T细胞表位包括至少12-20个氨基酸。靶多肽可来源于病原性生物或病原体的蛋白质(例如，表面蛋白或毒素亚基)。
“受试者”可以是动物。例如，动物可以是农业动物(例如，马、牛和鸡)或宠物(例如，狗和猫)。优选，受试者是哺乳动物。最优选，受试者是人。受试者可以是雄性或雌性。受试者也可以是新生儿、儿童或成人。受试者可患有疾病或医学病况。
对于本发明的核酸分子的每一种，提供了用于在植物细胞中产生1、2、3或更多种靶多肽的方法。方法包括(a)将核酸分子引入植物细胞；和(b)在允许靶多肽在植物细胞中产生的条件下维持植物细胞。核酸分子包括来源于长线形病毒科病毒的微型复制子，并且能够在植物细胞中复制。核酸分子还包括1、2、3或更多种异源多核苷酸，其每一种编码靶多肽。植物细胞可以是植物、植物部分(例如，叶、茎、根、花组织、种子或叶柄)或细胞培养基中的细胞。植物可以是完整的正在生长的植物。优选，植物细胞存在于植物叶子中。
可使用本领域已知的技术将本发明的核酸分子引入植物细胞。例如，可通过渗透、微粒轰击或人工接种来将核酸分子递送进入植物细胞。核酸分子可用作通过例如化学品、光或热激激活的诱导系统的部分。优选，通过渗透将核酸分子引入植物细胞。
为了通过利用本发明的载体感染的植物或植物细胞产生靶多肽，在允许产生的条件下维持感染的植物或植物细胞。此类条件包括适当的温度、湿度、压力、时限和照明。如下文实施例2和4-6中所描述的，本发明的核酸分子已被引入植物细胞，将所述植物细胞维持在允许一种或两种多肽产生的条件下，并且观察这样的产生。产生方法还可包括从植物纯化靶多肽的至少一种。还可使用本领域已知的技术从植物纯化靶多肽。例如，可使用能够结合靶多肽的抗体或受体从植物纯化靶多肽。纯化方法可包括使用提取缓冲液从本氏烟草提取靶。在低速离心后，可通过过滤澄清上清液，将其用于层析。纯化的产物可具有至少约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%，优选至少约50%，更优选至少约75%，最优选至少约95%的纯度。靶多肽可用于粗制植物提取物中。例如，根据本发明的植物组织中表达的工业酶和包含所述酶的粗制提取物可用于工业过程。
在根据本发明的产生方法中，长线形病毒科病毒可以是长线形病毒科中的任何病毒。长线形病毒科病毒的实例包括BYV、葡萄卷叶伴随病毒2(GLRaV2)和甜菜黄矮病毒(BYSV)。优选，长线形病毒科病毒为BYV。载体还可包括编码来源于长线形病毒科病毒的一种或多种移动蛋白的多核苷酸。移动蛋白可增强异源多核苷酸从一个植物细胞至另一个植物细胞的移动，从而使由异源多核苷酸编码的靶多肽的植物产生水平升高例如至少约1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、200%、500%或1000%。
对于本发明的每一种产生方法，提供了包含由此产生的1、2、3或更多种靶多肽的组合物。还提供了治疗需要1、2、3或更多种靶多肽的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含靶多肽的药物组合物。药物组合物还可包含药学上可接受的载体或稀释剂。适当的载体或稀释剂在本领域是已知的，包括但不限于盐水、缓冲盐溶液、甘露醇、L-组氨酸、聚山梨酯80、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物组合物可任选地包含佐剂。药物组合物可具有约4.0-10.0，优选5.6-7.0的pH。
术语“有效量”是指包含实现所述目标(例如，治疗需要靶多肽的受试者，或在受试者中诱导免疫应答)所需的靶多肽的药物组合物的量。取决于所述目标、受试者的体格特征、靶多肽的性质或需要的严重度、相关或不相关医学病况的存在、靶多肽的性质、包含靶多肽的组合物、给受试者施用组合物的方法以及施用途径，包含靶多肽的药物组合物的有效量可变化。用于给定的受试者的具体剂量通常可通过医生的判断来设定。可将药物组合物以一剂或多剂给受试者施用。
可将靶多肽配制于本发明的药物组合物中。可配制通过各种途径例如口服、舌下、鼻内、眼内、经直肠、经皮肤、粘膜、表面或胃肠外施用给受试者施用的药物组合物。
在根据本发明的产生方法中，1、2、3或更多种靶多肽可以是蛋白质的一个或多个亚基，并且维持条件可还允许在植物细胞中产生所述蛋白质。提供了包含由此产生的蛋白质的组合物。还提供了治疗需要所述蛋白质的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含所述蛋白质的药物组合物。所述蛋白质可以是酶。
在根据本发明的产生方法中，第一靶多肽可能够在植物细胞中修饰第二靶多肽，影响其表达和/或增加其产生，维持条件可还允许第一靶多肽在植物细胞中修饰第二靶多肽，影响其表达和/或增加其产生。提供了包含由此产生的第二靶多肽的组合物。还提供了治疗需要修饰的靶多肽的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含多肽的药物组合物。
在根据本发明的产生方法中，靶多肽可以是抗体的Hc和Lc，并且维持条件可还允许在植物细胞中产生抗体。提供了包含由此产生的抗体的组合物。还提供了用于治疗需要抗体的受试者的方法。治疗方法包括给受试者施用有效量的包含抗体的药物组合物。
在根据本发明的产生方法中，靶多肽可以是免疫原性的。提供了包含免疫原性靶多肽的组合物。还提供了用于在受试者中诱导免疫应答的方法。免疫原性方法包括给受试者施用有效量的包含免疫原性靶多肽的药物组合物。当免疫原性靶多肽来源于病原体时，免疫原性方法可用于通过给受试者施用有效量的包含免疫原性靶多肽的药物组合物而在受试者中诱导抗所述病原体的保护性免疫应答。病原体可以是细胞内或细胞外病原体。
如本文中所用，术语“约”，当指可测量的值例如量、百分数等时，意指包括与指定的值相差±20%或±10%，更优选±5%，更优选±1%以及更优选±0.1%的变化，当此类变化适当时。
本文中引述的全部文件、书籍、手册、论文、专利、公布的专利申请、指导、摘要及其它参考资料通过引用整体并入本文。通过考虑本文中公开的本发明的说明书和实施，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。说明书和实施例意在仅举例说明，本发明的范围和精神由下列权利要求指定。
实施例1.用于单克隆抗体表达的基于BYV的launch载体的构建
构建了用于在同一宿主细胞中同时表达两种靶多肽的基于BYV的launch载体(图2)。BYV launch载体用作表达两个ORF，抗炭疽的PA的mAb的Hc和Lc，的载体。为了克隆两个外源基因(抗-PA mAb的Lc和Hc)，将多克隆位点(MCS)引入BYV基因组中的CPm与CP编码序列之间(SEQ ID NO：1，图12)。除了本身的BamHI限制位点外，MCS还包含5个限制位点PacI/AscI/BsrGI/NheI/FseI。在插入MCS后，将两个异源长线形病毒CP启动子引入BYV基因组：GLRaV2CP启动子和BYSV CP启动子(图2)。从而，抗-PA mAb的Hc(SEQ IDNO：9；图16)和Lc(SEQ ID NO：7；图15)的序列被克隆为分别在BYV CP和GLRaV2CP启动子的控制下。同时，BYSV CP启动子驱动BYV CP(图2)。将所得的构建体pCB-BYV-PA-HcLc转化进入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101。
实施例2.抗-PA mAb在系统性BYV感染的叶中的表达
为了确认病毒的稳定性以及抗-PA mAb的表达和装配，通过过夜培养(在28℃)具有编码抗-PA mAb的Hc和Lc的BYV载体的农杆菌和具有编码来自日本萝卜花叶病毒(Turnip mosaic virus)的沉默抑制子P1HcPro的二元载体的农杆菌的培养物，以1.0:0.2OD600的比率人工地共渗透5周龄的本氏烟草叶(Kasschau等人,2003)。在30dpi后，观察到BYV感染的系统性症状(图3A)。具体地，感染的叶显示作为系统性症状的明脉症(clearing vein)。在30、32、34、36和39dpi从系统性感染的叶采集样品。
为了显示抗-PA mAb的Lc和Hc的表达，使用Western印迹分析(图3B)。为了估量Hc和Lc的表达水平，分别以1:5000和1:2000的稀释度使用缀合有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗-人Hc和Lc抗体(Bethyl Laboratories Inc.)。将纯化的抗-PA mAb用作阳性对照。使用Synoptics Ltd的GeneGnome5凝胶成像和分析系统计算表达水平。通过在非还原条件下使用相同的技术来计算装配的抗-PA mAb的表达水平。在34dpi，最大表达水平被测定为53mg/kg的鲜叶重。
实施例3.基于T-DNA的BYV微型复制子的构建
为了减少生产时间和提高抗体表达水平，通过从实施例1中描述的基于BYV的launch载体除去所有病毒复制非必需的基因来工程化基于T-DNA的BYV微型复制子(miniBYV)(图1、2和4)。使用本身的BamHI限制位点，将与插入实施例1的基于全长BYV的载体的MCS相同的MCS引入miniBYV复制子(SEQ ID NO：2；图13)(图2和4)。该策略允许使用异源长线形病毒的亚基组启动子从单个miniBYV复制子表达两个外源基因。此外，引入两个长线形病毒的启动子BYV CP启动子和GLRaV2CP启动子以分别驱动抗-PA mAb的Hc(SEQ ID NO：9；图16)和Lc(SEQ ID NO：7；图15)。
为了阻止剪接和增强病毒侵袭力的效率，从病毒复制酶序列除去经典剪接位点。为了升高miniBYV RNA的转录水平，将具有双重增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子插入miniBYV序列的5′末端的上游(图4)。
为了增加合成的初始转录物的量，将具有双重增强子的35S启动子引入miniBYV序列的上游以产生修饰的miniBYV载体(图5)。利用强BYSV CP启动子替换弱GLRaV2CP启动子。使用Center forBioinformatics and Biological Statistics,Iowa State University的SplicePredictor软件，就经典剪接位点的存在分析BYV复制酶。将拟南芥用作剪接位点模型。为了避免潜在剪接，通过将核苷酸2219(GenBank登录号AF190581)从A置换成C(这通过测序来确认)来突变BYV复制酶内的高评分经典受体剪接位点。这也允许敲除位置3606中的供体位点。具有miniBYV及mAb的Hc和Lc的T-DNA插入物的最终大小为13,746bp(图5)。
实施例4.抗-PA mAb在利用修饰的miniBYV载体(pCB-BYV-Hc-Lc)系统性感染的叶中的表达
为了检查mAb的Hc和Lc从修饰的miniBYV载体的表达水平，使用两个克隆(Q3和Q4，通过测序确认的)，如实施例2中所述渗透5周龄本氏烟草植物，对于每一个克隆收集3个农杆菌菌落。为了确认Hc和Lc都表达，在5、7和9dpi采集叶圆片，利用Western印迹进行分析，如上所述进行计算。结果显示使用具有两个强启动子的修饰的miniBYV launch载体的抗-PA mAb的Hc和Lc的表达水平增加3倍(图6)，这表明miniBYV载体可用于抗体生产。
实施例5.使用miniBYV载体表达大蛋白质(PA83)
为了研究使用miniBYV载体表达大蛋白质的可能性，使用来自炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的具有83kD的分子量的炭疽保护性抗原83(PA83,GenBank登录号M22589)。由GENEART Inc.(Germany)对具有添加的来自烟草的PR-1a信号肽、6x组氨酸亲和纯化标签和内质网(ER)滞留信号(KDEL)的PA83的序列(SEQ ID NO：11；图17)进行植物优化，使用PacI/NheI限制位点将其克隆进入miniBYV载体(图7)。通过测序确认终产物。将具有miniBYV-PA83载体的二元载体转化进入农杆菌的GV3101株。将来自miniBYV的PA83的表达水平与其它载体例如基于TMV的launch载体pGR-D4-PA83和具有双重35S启动子及TEV前导序列的常规二元载体pClean283-PA83相比较。如上所述人工渗透5月龄的本氏烟草的叶子。
分析5、7和9dpi的总蛋白质(TP)和总可溶性蛋白质(TSP)的表达水平(图8A)。对于7dpi，重复渗透和分析3次以确认计算的数目。如图8B中所示，在7dpi对于使用miniBYV载体的PA83观察到最高表达水平(268±22mg/kg)，其具有83%的溶解度。miniBYV复制子的表达水平为常规二元载体(pClean)的至少2倍并且相较于基于TMV的载体(D4)高出超过60%(图8)。
使用固定的金属离子吸附层析(IMAC)柱，纯化从miniBYV复制子表达的PA83蛋白。纯化过程为：以3:1v/w比率利用提取缓冲液(50mM磷酸钠pH8.0,500mM NaCl,20mM咪唑和1mM二乙基氨基甲酸[DIECA])从本氏烟草的叶组织提取靶。澄清后，通过利用Chelating Sepharose Big Beads树脂，使用Ni-IMAC捕获PA83。利用包含300mM咪唑的缓冲液(通过将60%的缓冲液B[50mM磷酸钠pH7.5,500mM NaCl,500mM咪唑]与40%的缓冲液A[50mM磷酸钠pH7.5,500mM NaCl]混合而获得)洗脱靶。Western印迹分析显示在IMAC纯化后从miniBYV载体表达的PA83的最终回收为约72%。
实施例6.使用miniBYV载体共表达靶蛋白和酶
为了研究使用miniBYV载体共表达靶蛋白和修饰酶的可能性，使用了疟疾疫苗候选蛋白Pfs48(来自原生动物寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，登录号AAL74351)和来自脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)的内切糖苷酶F(PNGaseF,登录号AAA24932)。再次地使用在蛋白质的N末端具有PR-1a肽并且在C末端具有6xHis-标签和KDEL的Pfs48的植物GENEART-优化序列(SEQ ID NO：13；图18)。对于PNGaseF，使用了在蛋白质N末端的PR-1a肽以及在C末端的FLAG标签和KDEL ER滞留信号(SEQID NO：15；图19)。将两个序列都克隆入图9中显示的miniBYV载体。将弱GLRaV2CP启动子用于控制PNGaseF，因为当以较高水平表达时所述酶对植物组织具有毒性。
以1:2000的稀释度使用小鼠抗-组氨酸mAb(抗-4xHis,QiagenInc.)估量Pfs48的表达水平。图10A显示糖基化的Pfs48(对照，其表达无PNGaseF)的电泳迁移率与和PNGaseF共表达的Pfs48的非糖基化形式相比较是不同的(更小的迁移率)。使用兔抗-FLAG第一mAb(Sigma)和山羊抗-兔第二Ab(Biorad)通过Western印迹确认PNGaseF的表达(图10B)。这些结果验证了靶(Pfs48)与酶(PNGaseF)的相同区室化(compartmentalization)，这可能在病毒复制复合体的内部。结果还验证了PNGaseF作用于Pfs48。
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Claims (42)

1.用于在植物细胞中产生一种或多种靶多肽的分离的核酸分子，其包含来源于长线形病毒科病毒的微型复制子和一种或多种异源多核苷酸，其中所述核酸分子能够在所述植物细胞中复制，并且其中所述一种或多种异源多核苷酸编码所述一种或多种靶多肽。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述长线形病毒科病毒为甜菜黄化病毒。
3.权利要求1或2的核酸分子，其中所述植物细胞存在于植物、植物部分或细胞培养基中。
4.权利要求1-3的任一项的核酸分子，其中所述植物部分选自叶、茎、根、花组织、种子和叶柄。
5.权利要求1-4的任一项的核酸分子，其还包括编码来源于长线形病毒科病毒的一种或多种移动蛋白的多核苷酸。
6.权利要求1-5的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括蛋白质的一个或多个亚基，并且其中所述一种或多种靶多肽能够在所述植物细胞中形成所述蛋白质。
7.权利要求6的核酸分子，其中所述蛋白质为酶。
8.权利要求1-5的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且其中所述第一多肽能够在所述植物细胞中修饰所述第二多肽。
9.权利要求1-5的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且其中所述第一多肽能够影响所述第二多肽在所述植物细胞中的表达。
10.权利要求9的核酸分子，其中所述第一多肽是沉默抑制子。
11.权利要求1-5的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且其中所述第一多肽能够增加所述第二多肽在所述植物细胞中的产生。
12.权利要求1-5的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括抗体的重链和轻链，并且其中所述一种或多种靶多肽能够在所述植物细胞中形成所述抗体。
13.权利要求1-12的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括免疫原性多肽。
14.权利要求1-13的任一项的核酸分子，其中所述一种或多种靶多肽包括至少100kD的多肽。
15.包含权利要求1-14的任一项的核酸分子的载体。
16.用于在植物细胞中产生一种或多种靶多肽的方法，包括
(a)将核酸分子引入植物细胞，其中所述核酸分子包括来源于长线形病毒科病毒的微型复制子和一种或多种异源多核苷酸，其中所述核酸分子能够在所述植物细胞中复制，并且其中所述一种或多种异源多核苷酸编码一种或多种靶多肽；和
(b)在允许在所述植物细胞中产生所述一种或多种靶多肽的条件下维持所述植物细胞。
17.权利要求16的方法，其还包括从所述植物细胞纯化至少一种所述一种或多种靶多肽。
18.权利要求16或17的方法，其中所述长线形病毒科病毒为甜菜黄化病毒。
19.权利要求16-18的任一项的方法，其中所述植物细胞存在于植物、植物部分或细胞培养基中。
20.权利要求19的方法，其中所述植物部分选自叶、茎、根、花组织、种子和叶柄。
21.权利要求16-20的任一项的方法，其中所述核酸分子还包括编码一种或多种来源于长线形病毒科病毒的移动蛋白的多核苷酸。
22.包含至少一种由权利要求16-21的任一项的方法产生的一种或多种靶多肽的组合物。
23.治疗需要至少一种由权利要求16-21的任一项的方法产生的一种或多种靶多肽的受试者的方法，包括给所述受试者施用有效量的包含至少一种所述一种或多种靶多肽的药物组合物。
24.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括蛋白质的一个或多个亚基，并且其中所述维持条件还允许在所述植物细胞中产生所述蛋白质。
25.权利要求24的方法，其中所述蛋白质为酶。
26.包含由权利要求24的方法产生的蛋白质的组合物。
27.权利要求26的组合物，其中所述蛋白质为酶。
28.治疗需要由权利要求24的方法产生的蛋白质的受试者的方法，包括给所述受试者施用有效量的包含所述蛋白质的药物组合物。
29.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括第一和第二多肽，并且其中所述维持条件还允许所述第一多肽在所述植物细胞中修饰所述第二多肽。
30.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且其中所述维持条件还允许所述第一多肽影响所述第二多肽在所述植物细胞中的表达。
31.权利要求30的方法，其中所述第一多肽是沉默抑制子。
32.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括第一多肽和第二多肽，并且其中所述维持条件还允许所述第一多肽增加所述第二多肽在所述植物细胞中的产生。
33.组合物，其包含由权利要求29-32的任一项的方法产生的第二多肽。
34.治疗需要由权利要求29-32的任一项的方法产生的第二多肽的受试者的方法，包括给所述受试者施用有效量的包含所述第二多肽的药物组合物。
35.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括抗体的重链和轻链，并且其中所述维持条件还允许在所述植物细胞中产生所述抗体。
36.包含由权利要求35的方法产生的抗体的组合物。
37.治疗需要由权利要求35的方法产生的抗体的受试者的方法，包括给所述受试者施用有效量的包含所述抗体的药物组合物。
38.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括免疫原性多肽。
39.包含由权利要求38的方法产生的免疫原性多肽的组合物。
40.用于在受试者中诱导免疫应答的方法，包括给所述受试者施用有效量的包含由权利要求38的方法产生的免疫原性多肽的药物组合物。
41.用于在受试者中诱导抗病原体的保护性免疫应答的方法，包括给所述受试者施用有效量的包含由权利要求38的方法产生的免疫原性多肽的药物组合物，其中所述免疫原性多肽来源于所述病原体。
42.权利要求16-21的任一项的方法，其中所述一种或多种靶多肽包括至少100kD的多肽。
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