CN101115842A - 使用正义单链病毒rna载体在植物中生产抗体 - Google Patents

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Abstract

在植物、植物组织或植物细胞中产生包含至少第一和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括通过以下方式在植物中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基：i)向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的正义单链RNA病毒载体或ii)向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供第一和第二正义单链RNA病毒载体，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中至少所述第一病毒载体和所述第二病毒载体是非竞争的病毒载体。

Description

使用正义单链病毒RNA载体在植物中生产抗体
技术领域
本发明涉及使用正义单链RNA病毒载体在植物、植物部分或植物细胞培养物中产生异源寡聚蛋白质。本发明所述的方法和载体为植物细胞提供产量提高的功能性异源寡聚重组蛋白，例如全长的抗体或其异源寡聚合成衍生物(包括与其它蛋白质或其片段的融合)。
背景技术
基于植物的分子农业是产生设计用于人类和动物健康领域的重组蛋白的良机，由于其潜在的低生产成本以及生物制药工业为从制造方法中消除动物衍生蛋白质的尝试(因为这些产品可能受到人抗原，例如牛海绵状脑炎(BSE)或克雅病(CJD，vCJD)污染)而成为优选。然而，使用基于强组成型或组织特异性启动子的标准表达系统不能解决在植物细胞中高产量生产异源寡聚蛋白质的问题，原因如下：首先，大部分这样的重组蛋白对植物生长和发育具有不利的影响，因此严重影响产量；其次，使用组织特异性启动子(例如种子特异性)需要将编码药物蛋白质的基因稳定掺入可食用作物植物(例如稻、玉米、小麦)的基因组，这在开放领域栽培情况下可能产生转基因流控制的问题。此外，如果出于产物的低产量而在封闭(温室)环境中使用，这些系统是不可商购的。
基于植物病毒的瞬时表达系统(见综述：Porta和Lomonossoff，1996，Mol.Biotechnol.，5，209-221；Yusibov等人，1999，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，240.81-94；Gleba等人，2004，Curr.Opin.Plant Biol.，7，182-188)能够在植物叶组织中提供高表达水平并且在一定程度上能够处理重组蛋白质的毒性及其对植物发育的有害影响的问题，因为该技术能够使生长和生产期分离。最佳已建立的和可商购的系统是基于正义单链RNA病毒载体，优选基于烟草花叶病毒(TMV)衍生的载体(Kumagai等人，1994，Proc.Natl.Acad.ScL USA，90，427-430；Mallory等人，2002，Nature Biotechnol.20，622-625；US5316931；US5589367；US5866785；US5977438；WO02088369；WO02097080；WO0229068；US5491076)。然而，这些系统受到严重的局限，限制其用于产生简单、相对小的蛋白质。这部分是由于病毒载体的不稳定及其高频率的回复成为野生型(如果其带有大于1kb的异源序列)而引起。该技术的另一严重的局限是缺乏能够表达代表最有价值的重组蛋白类的复合异源寡聚蛋白质(例如治疗的单克隆抗体及其衍生物)的病毒载体系统。
仅有一份公开提出使用植物病毒载体在植物中表达全长的单克隆抗体(Verch等人，1998，J.Immunol.Meth.，220，69-75)。该文献描述了使用两个系统的基于TMV的病毒载体在体系的叶中表达单克隆抗体的重链和轻链，通过使用所述载体的体外合成的转录本共转染本氏烟草(N.benthamiana)植物，从不同载体表达不同的链。然而，重组蛋白在所述系统中的产量很低，以至于必须使用高度灵敏的测试，例如Western印迹和ELISA确定装配的单克隆抗体的存在。由于重组抗体的微不足道的产量，该系统不适于实际应用并且不具有商业价值。因为两个或多个基于TMV的病毒载体通常不存在于被转染植物的相同植物组织中(见实施例1)，检测的抗原结合活性可能归因于在分离操作中来自不同细胞或组织中表达的抗体重链和轻链的体外装配。先前已表明功能性的抗体可以由变性和还原的抗体组分体外装配(Petersen和Dorrington，1974，J.Biol.Chem.，17，5633-5641；Maeda等人，1996，Protein Engineering，9，95-100)。然而，在缺乏这样装配的适宜条件下，这样的装配的效率极低。
因此，对于重组的异源寡聚蛋白质，在植物中没有其产量和效率足以与其它大规模表达系统(例如真菌或昆虫细胞表达系统)市场竞争的大规模表达系统。这样的植物表达必须尽可能好地满足下列标准：
(i)高产量，包括在尽可能多的植物组织中和所述组织的尽可能多的细胞中表达目标异源寡聚蛋白质；
(ii)为了避免重组蛋白表达对植物生长的有害影响，蛋白质或目标产物的表达应该为瞬时(或可转换的)从而能够在期望的植物发育阶段开始表达；
(iii)提供在植物细胞中编码异源寡聚蛋白质不同亚基的多蛋白的最佳比率，从而在由所述亚基组装的所述重组蛋白水平上支持重组蛋白的高产量。
因此，本发明的目标是提供在植物、植物部分或植物细胞培养物中产生异源寡聚蛋白质的有效方法。另一目标是提供能够表达异源寡聚蛋白质的高产量的植物表达系统。本发明的另一目标是提供在相同植物细胞中共表达超过一种目的多肽的有效方法。此外，本发明的目标是为在植物、植物部分或植物细胞培养物中表达抗体提供快速和高产量的方法。
发明概述
本发明提供在植物、植物组织或植物细胞中产生包括至少第一和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括通过以下方式在植物中表达至少所述第一和第二蛋白质亚基：
(i)向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供第一和第二正义单链RNA病毒载体，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中，至少所述第一病毒载体和所述第二病毒载体是非竞争的病毒载体；或
(ii)向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的正义单链RNA病毒载体。
在一个实施方案中，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体由于是不同的病毒载体因而是非竞争性的。在另一实施方案中，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体由于并非衍生自相同的RNA病毒因而是非竞争性的。在另一实施方案中，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体由于在除了编码所述第一和第二蛋白质亚基的序列部分之外的序列部分不同因而是非竞争性的。在另一实施方案中，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体由于衍生自属于不同病毒种的RNA病毒因而是非竞争性的。在另一实施方案中，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体由于衍生自属于不同病毒属的RNA病毒因而是非竞争性的。
本发明的另一实施方案是在植物、植物组织或植物细胞中产生包含至少第一和第二蛋白质亚基(例如抗体的重链和轻链)的抗体，所述方法包括在植物细胞中通过以下方法表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基：
(i)通过农杆菌介导的转染向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供第一正义单链RNA病毒载体的DNA前体和第二正义单链RNA病毒载体的DNA前体，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中，至少所述第一病毒载体或所述第二病毒载体缺少编码所述第一或所述第二病毒载体在所述植物中系统转移所需的功能性蛋白质的开放阅读框；或
(ii)通过农杆菌介导的转染向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的正义单链RNA病毒载体的DNA前体，其中，所述病毒载体缺少编码系统移动所需的功能性蛋白质的ORF。
本发明还提供在植物、植物组织或植物细胞中产生包含至少第一和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括在植物细胞中表达来自一个或多个正义单链RNA病毒载体的至少所述第一和所述第二蛋白质亚基。
在权利要求和下述对本发明的另一实施方案进行描述。
本发明的发明人已经令人惊奇的建立了使用植物病毒载体在植物中产生高产量的异源寡聚蛋白质的方法。在植物中有效产生异源寡聚蛋白质需要在相同植物细胞中高产量的产生异源寡聚蛋白质的不同蛋白质亚基。这样，可以利用所述细胞的天然蛋白组装能力，例如其内质网(ER)，在具有表达的所述至少两种蛋白质亚基的细胞中有效组装异源寡聚蛋白质。因此无需在体外低效率地组装所述异源寡聚蛋白质。本发明通过以上步骤(i)或通过以上步骤(ii)或通过以上步骤(i)和(ii)的组合，首次在相同细胞中获得两个或多个蛋白质的有效共表达。
所述第一蛋白质亚基在RNA病毒载体中由第一异源(核酸)序列编码。所述第二蛋白质亚基在RNA病毒载体中由第二异源(核酸)序列编码。因此，这些异源序列是所述病毒载体的RNA序列并且通常包含或编码表达所述蛋白质亚基所需的调节序列。这类调节序列的实例为亚基因组启动子、IRES元件和3’-非翻译序列。这里，如果序列并非天然存在于其衍生自的病毒中，则该序列为异源序列。
根据本发明，可生产的异源寡聚蛋白质具有至少第一和第二亚基，其中，所述第一和所述第二亚基具有不同的多肽序列。因此，所述第一和所述第二亚基通常必须由不同的异源核酸序列表达。寡聚蛋白质的亚基组装形成寡聚蛋白质的四级结构。亚基的组装通常涉及亚基之间的非共价键。此外，可以在所述蛋白质亚基之间形成共价键，例如二硫键。
在一个实施方案中，所述异源寡聚蛋白质为异源二聚体蛋白质，即具有两个不同蛋白质亚基的蛋白质。在另一实施方案中，所述异源寡聚蛋白质可能具有超过两个不同亚基，例如3或4个不同亚基(分别为异源三聚体或异源四聚体蛋白质)。在另一实施方案中，所述异源寡聚蛋白质可以具有两个不同的亚基，其中，在所述异源寡聚蛋白质中所述亚基的一个或两个可以存在超过一次。所述异源寡聚蛋白质的亚基组成的实例是AaBb、AaBbCc和AaBbCcDd，其中A代表第一蛋白质亚基，B代表第二蛋白质亚基，C和D代表其它的蛋白质亚基。每个大写字母A、B、C和D代表与其它蛋白质亚基不同的蛋白质亚基，且小写字母代表至少为1的整数，其表示在所述异源寡聚蛋白质中各个蛋白质亚基的拷贝数。一个实例是IgG抗体，其具有亚基组成A2B2，其中A代表第一蛋白质亚基(例如重链)且B代表第二蛋白质亚基(例如轻链)。优选地，根据本发明产生的异源寡聚蛋白质具有两个或三个不同的蛋白质亚基，更优选具有两个不同的蛋白质亚基。
在本发明的方法中，通过所述步骤(i)或/和所述步骤(ii)在所述植物、所述植物组织或所述植物细胞的细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基。每种所述步骤(i)和(ii)使能够在相同细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基，从而可以在所述细胞中有效产生所述异源寡聚蛋白质。步骤(i)和(ii)可以相似，特别是对于产生具有三个、四个或更多个不同蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质(见实施例7)。
本发明的所述正义单链RNA病毒载体在这里也被简称为“病毒载体”。通常所述正义单链RNA病毒载体衍生自正义单链植物RNA病毒。
在步骤(ii)中，向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的正义单链RNA病毒载体。编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的所述病毒载体含有作为插入片段的编码所述第一蛋白质亚基的第一异源序列，该蛋白质亚基的表达可能在第一亚基因组启动子的控制之下。此外，所述病毒载体含有作为插入片段的编码所述第二蛋白质亚基的第二异源序列，该蛋白质亚基的表达可能在第二亚基因组启动子的控制之下。如果所述第一和所述第二蛋白质亚基都在亚基因组启动子的控制下表达，这些亚基因组启动子优选在序列上不同，以避免在所述病毒载体中的自身同源(self-homology)，其将在植物细胞中导致不期望的重组事件。可以从植物病毒的不同菌株或种采集这样的不同亚基因组启动子，例如一个亚基因组启动子可以是(或可以衍生自)烟草花叶病毒(TMV)U1的包被蛋白(CP)亚基因组启动子和其它的亚基因组启动子可以是(或可以衍生自)烟草花叶病毒(TMV)U5的CP亚基因组启动子或来自感染十字花科植物的烟草花叶病毒(cr-TMV)。
代替所述第一或所述第二亚基因组启动子，可以在IRES(内部核糖体进入位点)元件控制下翻译所述第一或所述第二蛋白质亚基。尽管所述第一或所述第二蛋白质亚基两者的翻译可以在IRES元件控制下进行，优选使用亚基因组启动子表达所述蛋白质亚基的至少一种。在本发明中使用的IRES元件可以从例如cr-TMV植物病毒或其它植物病毒获得(Proc NatlAcad Sci USA 2002，99，5301-6；Virology 1999，263，139-54；WO03020927；WO0229068)。
步骤(ii)的所述病毒载体优选不能在所述植物或所述植物组织中系统移动。这可以例如通过省略病毒颗粒组装的功能起点而获得。例如在烟草花叶病毒中，病毒颗粒组装的起点位于MP ORF。因此可以通过从所述病毒载体缺失全部或部分的MP ORF省略病毒颗粒组装的起点。因此所述病毒载体优选缺少功能性移动蛋白(MP)ORF。更优选地，所述病毒载体缺少系统移动所述病毒载体所需的功能性蛋白质。在这一实施方案中，所述病毒载体可以缺少功能性包被蛋白质ORF，且大部分优选的所述病毒载体同时缺少功能性移动蛋白ORF和功能性包被蛋白质ORF。从病毒载体省略MP ORF和/或CP ORF为在所述病毒载体中编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基而不损害病毒载体的稳定性提供了更多的空间。在这一实施方案中，优选向所述植物或所述植物组织的多数细胞提供所述病毒载体以获得大量细胞的感染。这可以使用农杆菌通过将所述RNA病毒载体的DNA前体作为T-DNA提供而获得(见以下)。
步骤(ii)的所述病毒载体可以衍生自任何正义单链植物RNA病毒，例如在“发明详述”部分所列。优选的病毒组为烟草花叶病毒、马铃薯X病毒(potexvirus)和马铃薯Y病毒(potyvirus)。最优选的病毒是TMV和PVX。所述病毒载体至少含有来自病毒的ORF，其衍生自所述病毒载体复制所需蛋白质的编码序列。所述病毒载体通常还包含病毒复制的调节元件和至少一个亚基因组启动子。
在步骤(i)中，向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供第一和第二正义单链RNA病毒载体。所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基。
步骤(i)使能够产生具有两个不同的蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质。步骤(i)还使能够产生具有超过两个不同亚基的异源寡聚蛋白质，例如三个或四个不同的蛋白质亚基。在这种情况下，可以向所述植物、植物组织或植物细胞提供第一、第二和第三病毒载体(且任选地提供更多的病毒载体)，每个载体编码所述不同蛋白质亚基之一。如果在步骤(i)必须表达三个或四个不同的蛋白质亚基，优选该三个或四个病毒载体彼此分别都是非竞争性病毒载体。在三个病毒载体的情况，第一病毒载体可以衍生自烟草花叶病毒，第二病毒载体可以衍生自马铃薯Y病毒，第三病毒载体可以衍生自马铃薯X病毒。
如果两个病毒载体能够在相同的植物细胞中有效表达其编码的蛋白质亚基(共表达)，则这两个病毒载体是非竞争性的。共表达需要至少两个不同的病毒载体在大量表达其编码的异源序列之前的复制期间不彼此战胜。在所述至少两个病毒载体的RNA水平上序列差异越高，其在相同植物细胞中越为非竞争性。由于所述第一病毒载体和所述第二病毒载体是不同的病毒载体，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体是非竞争性病毒载体。
为了是非竞争性的病毒载体，在一个通常的实施方案中，所述第一和所述第二病毒载体(所述两个非竞争性病毒载体)除了在编码所述蛋白质亚基的所述异源序列上不同，还至少在序列部分有差异。优选地，除了所述异源序列，序列部分中的这类差异衍生自植物RNA病毒，例如涉及病毒功能的序列部分，例如病毒在植物细胞中的复制(例如编码复制酶的序列)、病毒蛋白质的翻译(例如亚基因组启动子)或病毒的细胞-至-细胞或长距离的运动。
为了是非竞争性的病毒载体，在另一个通常的实施方案中，所述第一和所述第二病毒载体(所述两个非竞争性病毒载体)来自不同的植物病毒。在这一实施方案的一个实例中，所述至少两个非竞争性病毒载体并非衍生自相同病毒菌株的病毒。在另一实例中，所述至少两个非竞争性病毒载体并非衍生自相同病毒种的病毒。在更多的实例中，所述至少两个非竞争性病毒载体并非衍生自相同病毒属的病毒。因此，所述第一病毒载体和所述第二病毒载体优选衍生自不同菌株的病毒，更优选来自不同种的病毒，最优选来自不同属的病毒。
所述第一病毒载体可以衍生自属于马铃薯X病毒属的病毒，且所述第二病毒载体可以衍生自属于马铃薯Y病毒属的病毒。具体的，所述第一病毒载体可以衍生自马铃薯病毒X，且所述第二病毒载体可以衍生自马铃薯病毒Y。
在马铃薯Y病毒载体(potyviral vector)的情况下，所述蛋白质亚基能够作为与病毒多蛋白的融合而表达，其中，可以通过马铃薯Y病毒蛋白酶识别位点从所述多蛋白分离本发明的蛋白质亚基。
在另一实施方案中，所述第一病毒载体可以衍生自属于马铃薯X病毒属的病毒，且所述第二病毒载体可以衍生自属于烟草花叶病毒属的病毒。具体的，所述第一病毒载体可以衍生自马铃薯病毒X，且所述第二病毒载体可以衍生自烟草花叶病毒。
“从病毒衍生”意指病毒载体含有其衍生自的病毒的遗传元件或序列部分。在一个实施方案中，所述病毒载体含有从RNA病毒获得的复制酶ORF(开放阅读框)。在另一实施方案中，病毒载体含有来自RNA病毒的运动蛋白ORF以及任选的还有复制酶ORF。如果需要，可以突变从RNA病毒获得的病毒遗传元件，例如从而引入病毒载体克隆所需要的限制位点。
其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体都是基于烟草花叶病毒载体TMV 30 B的一个实施方案被排除在本发明方法的步骤(i)之外，因为在这种情况下所述第一病毒载体和所述第二病毒载体并非不同的病毒载体而是相同的病毒载体(参见Verch等人，J.Immunological Methods 220(1998)69-75)。
所述第一和所述第二病毒载体(所述非竞争性病毒载体)优选具有至多90％，更优选至多80％，甚至更优选至多70％和最优选至多60％的RNA水平上的序列同源性。更具体的，所述第一病毒载体的任何序列段的100个碱基与所述第二病毒载体的任何序列段的100个碱基具有至多90％，优选至多80％，更优选至多70％和最优选至多60％的序列同源性。
在一个实施方案中，所述第一病毒载体的复制酶ORF(或者，如果该复制酶由超过一个ORF编码，则为多个ORF)和所述第二病毒载体的复制酶ORF(或者，如果该复制酶由超过一个ORF编码，则为多个ORF)具有至多90％，更优选至多80％，甚至更优选至多70％和最优选至多60％的序列同源性。在另一实施方案中，所述第一病毒载体的复制酶ORF和所述第二病毒载体的复制酶ORF具有至多85％，更优选至多75％，甚至更优选至多65％和最优选至多55％的同一性。
在步骤(i)中，所述第一病毒载体优选含有编码所述第一蛋白质亚基的第一异源序列，该蛋白质亚基的表达可能在第一亚基因组启动子的控制下。所述第二病毒载体优选含有编码所述第二蛋白质亚基的第二异源序列，该蛋白质亚基的表达可能在第二亚基因组启动子的控制下。可以以IRES元件代替所述亚基因组启动子的一个或两个。对于步骤(ii)与上述相似，如果所述第一和所述第二蛋白质亚基都在亚基因组启动子的控制下表达，这些亚基因组启动子优选在序列上不同以避免在所述第一和所述第二病毒载体(以及任何更多的病毒载体)之间的同源性，该同源性将在植物细胞中导致不希望的重组事件。可以从不同的菌株或植物病毒种获得这类不同的亚基因组启动子，例如一个亚基因组启动子可以是烟草花叶病毒(TMV)U1的包被蛋白(CP)亚基因组启动子，和另一亚基因组启动子可以是TMV U5或十字花科感染的烟草花叶病毒(cr-TMV)的CP亚基因组启动子。
由于在构建本发明的病毒载体时可以省略细胞-至-细胞或长距离移动所需要的植物病毒的ORF，可以通过比较所述病毒载体的复制酶ORF确定所述非竞争性病毒载体的相关性。
可以将分别编码所述第一和所述第二蛋白质亚基的所述第一和所述第二异源序列作为附加序列加入所述病毒载体。优选加入所述异源序列使能够获得高水平的表达。为此目的，将所述异源序列加在病毒的3’末端，因为在许多病毒中，3’ORF通常是表达水平最高的ORF。然而，优选用所述异源序列代替所述病毒的天然序列，例如所述病毒的天然3’ORF，其在许多病毒例如烟草花叶病毒中为CP ORF。因此，所述第一和/或所述第二病毒载体优选缺少所述病毒载体系统移动的ORF。所述病毒载体还可以缺少细胞-至-细胞移动的ORF，例如在烟草花叶病毒中的MP ORF。
在本发明中，可以将步骤(i)和步骤(ii)组合，特别是对于表达具有三个或更多不同亚基的异源寡聚蛋白质。如果要生产的异源寡聚蛋白质具有四个不同蛋白质亚基，可以根据步骤(i)表达两个蛋白质亚基，根据步骤(ii)在植物或植物组织的细胞中生产另外的两个蛋白质亚基。然而，优选的，可以从第一病毒载体表达两个蛋白质亚基，从对第一病毒载体非竞争性的第二病毒载体表达两个蛋白质亚基。如果要生产具有三个不同蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质，可以根据步骤(i)通过从第一病毒载体表达两个蛋白质(与步骤(ii)所述相似)，并且从非竞争性病毒载体表达第三个蛋白质亚基来表达所述三个蛋白质亚基。
通常在DNA水平改造本发明的病毒载体。如果将所述病毒载体作为RNA病毒载体提供给植物细胞或植物组织细胞，可以例如使用噬菌体聚合酶，例如T7聚合酶以及合适的启动子将所述DNA体外转录为所述RNA病毒载体。优选将两个不同的病毒载体作为混合物用于所述植物以保证向所述植物细胞同时提供两个病毒载体。然而，优选使用所述RNA病毒载体的DNA前体转化所述植物或所述植物组织来向植物细胞或植物组织的细胞提供本发明的病毒载体。所述DNA前体在所述植物的细胞中具有转录启动子活性，通过所述DNA前体的转录形成所述病毒载体。最优选的所述DNA前体是农杆菌Ti质粒中的T-DNA。接着通过用两个或多个农杆菌菌株的混合物(如悬液)处理所述植物，向所述植物或所述植物组织提供两个或多个病毒载体，其中，每个菌株含有编码特定病毒载体的T-DNA。使用这样的农杆菌悬液处理植物的主要部分可以代替天然植物病毒的系统移动功能和/或细胞-至-细胞移动功能。
在本发明中最优选通过农杆菌使用所述病毒载体的DNA前体瞬时转染所述植物、植物组织或植物细胞。然而，可以将所述病毒载体的所述DNA前体稳定掺入植物染色体DNA。可以通过可诱导的启动子控制所述病毒载体从染色体DNA的释放。
如果通过DNA前体向所述植物提供所述病毒载体，优选采取措施以提高所述病毒载体从细胞核(载体在其中被转录)至细胞质(所述病毒载体在其中复制)的转移效率。这可以通过在所述DNA前体中包含内含子而实现，特别是如在国际专利申请PCT/EP05/000492，公布为WO2005/71090中详细描述的病毒载体的复制酶ORF中，其在这里被引入作为参考。
可以将本发明的方法用于其中存在或在今后可以作出植物病毒表达系统的任何植物。所述植物可以是单子叶或双子叶。在双子叶中，优选茄科、十字花科、藜科和豆科。在茄科中，优选烟草属，如普通烟草(N.tabacum)或本氏烟草。其它优选的植物是紫苜蓿(Medicago sativa)和甜菜种，如甜菜(Beta vulgaris)。
使用本发明的方法在植物系统中产生异源寡聚蛋白质。优选的异源寡聚蛋白质是免疫球蛋白，如以下类型的免疫球蛋白：免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白D和免疫球蛋白E。这些免疫球蛋白可以包含至少抗原结合的结构域部分。如情况所需，如果根据本发明产生的这些免疫球蛋白包含至少两个不同的蛋白质亚基，其可以相对于天然动物的免疫球蛋白被修饰。该免疫球蛋白可以包含与免疫球蛋白重链相连的保护蛋白质，其中该保护蛋白质包含多聚免疫球蛋白受体部分。另一优选的异源寡聚蛋白质是胰岛素。
按照情况需要，可以以多种不同的方式，相对于天然蛋白质修饰本发明的异源寡聚蛋白质。在异源寡聚蛋白质中，可以用植物特异性的信号肽代替天然异源寡聚蛋白质的一个或多个蛋白质亚基的形成分泌信号的前导序列。所述植物特异性信号肽可以衍生自烟草钙网蛋白和/或稻α淀粉酶。所述异源寡聚蛋白质的至少一个或至少两个或多个亚基可以含有内质网滞留信号KDEL以提高植物细胞中所述异源寡聚蛋白质从所述亚基的组装。此外，可以突变编码所述蛋白质亚基的所述异源序列以从所述异源寡聚蛋白质中部分或全部地除去糖基化位点。而且，可以例如通过改造植物糖基化机制的组分，例如一个或多个糖基转移酶，改变要表达的异源寡聚蛋白质的糖基化方式。
可以在表达之后根据公知的操作从植物、植物组织或植物细胞分离本发明的异源寡聚蛋白质。接着可以纯化所述异源寡聚蛋白质至基本同质，该状态可以被定义为，所述异源寡聚蛋白质在考马斯染色的SDS-PAGE上的条带占据由常规凝胶读取器测定的染色条带的至少70％，优选至少80％和最优选至少90％。
附图说明
图1(A)显示在浸润的本氏烟草叶中来自两个不同的基于TMV的载体GFP和DsRed的表达分布。左图：左侧上部的亮点是用plCH17272浸润区域的GFP荧光。下面的弱的亮点是用载体plCH18505浸润区域的红色荧光。在左图右侧底部的亮点是用plCH17272+plCH18505浸润的区域。右侧图显示从叶区域分离的原生质体，用两个不同的载体共浸润(上部：在GFP荧光检测条件下的原生质体；下栏：在DsRed荧光检测条件下的相同原生质体)。(B)plCH17272和plCH18505的T-DNA区的示意图。P-转录启动子；T-转录终止区；RdRP-病毒RNA依赖的RNA聚合酶；MP-病毒移动蛋白；3’NTR-病毒3’非翻译区；Cr-sgp-crTMV菌株的CP亚基因组启动子区；GOI-目的基因。(C)是plCH17272和plCH18505的T-DNA区限制图谱的示意图。
图2描述了病毒载体T-DNA区的示意图，该病毒载体设计由不同的亚基因组启动子共表达两个不同的转基因(GOI-1和GOI-2)。P-转录启动子；T-转录终止区；RdRP-病毒RNA依赖的RNA聚合酶；MP-病毒移动蛋白；3’NTR-病毒3’非翻译区；Cr-sgp-crTMV菌株的CP亚基因组启动子区；3PK-三重假结区；U5sgp-TMV-U5菌株的CP亚基因组启动子；GOI-目的基因。
图3(A)描述了plCH17388、plCH17123、plCH15933、plCH7410、plCH10580、plCH10881和plCH10745构建体的T-DNA区的示意图。RS-由PhiC31整合酶识别的重组位点。灰色竖条表示内含子。(B)描述了plCH17388、plCH17123、plCH15933的T-DNA区的限制图谱。(C)描述了pICH7410、plCH10580、plCH10881和plCH10745的T-DNA区的限制图谱。
图4在(A)中显示在对DNA前体plCH17388和plCH15933与重组酶来源一起进行农杆菌传递之后6天，本氏烟草叶区域的荧光显微照相。RS-由PhiC31整合酶识别的重组位点。
图5描述了不同载体系统的T-DNA区示意图，该载体系统用于表达抗体的重链和轻链。RS-由PhiC31整合酶识别的重组位点。
图6显示使用病毒前载体系统(provector system)在本氏烟草叶中IgG表达的Western印迹。
在非还原条件下的12％凝胶上进行TSP的电泳分离。使用来自兔的缀合HRP(Sigma)的抗人IgG片段(稀释6×103倍)检测表达的蛋白质。
1道-未感染的叶组织；2道-细胞质中表达的IgG重链(plCH17388)；3道-IgG重链和轻链，用35S启动子构建体(plC0123+plCH19846)共表达；4道-与3道相同的IgG重链和轻链，用P19(plCH6692)表达；5道-用35S启动子构建体和P19(plCH5290+plCH6692)表达的GFP；6道-IgG重链和轻链，用双顺反子构建体plCH19860共表达；7道-IgG重链和轻链，用双顺反子构建体plCH19860(MP缺陷的5′前载体plCH17123，反式MP plCH 10745)共表达；8道-在细胞质中共表达GFP和dsRED，提供反式MP(pICH17123+plCH19919+plCH10745)。
图7描述了编码非竞争性病毒载体的T-DNA区示意图，该载体设计用于在相同植物细胞中共表达不同的目的蛋白质亚基。P-转录启动子；T-转录终止区；TMV RdRP-烟草花叶病毒的依赖病毒RNA的RNA聚合酶；PVX RdRP-马铃薯病毒X的依赖病毒RNA的RNA聚合酶；MP-病毒移动蛋白；3’NTR-病毒3’非翻译区；Cr-sgp-crTMV菌株的CP亚基因组启动子区；GOI-编码目的蛋白质亚基的目的基因。
图8描述了双元载体plC0130的T-DNA区示意图。
图9显示使用TMV(plCH17388+plCH10580)和基于PVX(plC0130)载体在植物细胞中对GFP和dsRED的共表达：从农杆菌接种的本氏烟草叶中分离的原生质体的GFP和dsRED观测。
图10(A)描述了双元载体plCH17620、plCH20431、plCH21240、plCH20421和plCH21370的T-DNA区示意图。
(B)为双元载体plCH11599、plCH21910和plCH21920的T-DNA区示意图。
(C)为双元载体plCH21282、plCH10990、plCH22250和plCH22240的T-DNA区示意图。Lv和Lc-轻链的可变区和保守区；Hv和Hc-重链的可变区和保守区。
(D)为PVX衍生的前载体plCH21380的克隆方案示意图。
图11(a)显示使用PVX和crTMV载体确定IgG轻链和重链共表达水平的ELISA检测结果。左边的组织培养板的孔数对应于柱状图中柱的数目。柱状图显示这些孔在405nm的OD值。
1，2-未感染的植物组织；
3，4，5-在PVX中的钙网蛋白SP-重链(分别为plCH21240-1、plCH21240-5和plCH21370-14克隆)
6，7，8-在PVX中的钙网蛋白SP-IgG轻链(LC)(分别为plCH21370-18、plCH21370-19、plCH21370-31，在N端缺失)；
9，10，11-在PVX中的钙网蛋白SP-IgG轻链(分别为plCH21370-40、plCH21370-44、plCH21370-45)；
12-空白对照(没有使用植物蛋白质提取物)；
13，14，15-在PVX中的钙网蛋白SP-IgG重链(HC)(分别为plCH21240-1、plCH21240-5和plCH21240-14克隆)与crTMV中的钙网蛋白SP-IgG轻链(plCH 17620+plCH10881+plCH20431)共表达；
16，17，18-在PVX中的钙网蛋白-IgG的LC(分别为plCH21370-18、plCH21370-19、plCH21370-31，在N端缺失)与crTMV中的钙网蛋白-HC(plCH17620+plCH10881+plCH20421)共表达；
19，20，21-在PVX中的钙网蛋白-IgG的LC(分别为plCH21370-40、plCH21370-44、plCH21370-45)与基于crTMV的载体中的钙网蛋白SP-重链(plCH 17620+plCH10881+plCH20421)共表达；
22-用PVX表达的GFP(plC0130)；
23-用PVX表达的GFP(plCH20799)；
24-由crTMV单独表达的钙网蛋白SP-IgG轻链(plCH17620+plCH10881+plCH20431)；
25-由基于crTMV的载体表达的钙网蛋白SP-IgG重链(plCH17620+plCH10881+plCH20421)；
26-在PTGS阻抑基因P19存在下在强35S启动子控制下共表达的IgG的轻链和重链；
27-由基于crTMV的载体共表达的IgG的轻链和重链(plCH17388+plCH10881＝plCH20241)；
28-由基于crTMV的载体共表达的轻链和重链(plCH17388+plCH10881＝plCH20241)，MP(plCH10745)以反式提供；
＊-OD405值远超过可测量值。
图11(b)显示在本氏烟草叶中表达的抗癌抗体的电泳和Western印迹分析。
(A)在用TMV和PVX前载体共转染的本氏烟草叶中的抗癌抗体的重链和轻链的聚积。轻链由PVX表达，重链由TMV表达。在还原条件下以12％聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。上栏显示考马斯染色；中间栏显示使用HRP缀合的山羊抗人IgG(γ链特异性)抗体(Sigma)的Western印迹；下栏显示使用HRP缀合的兔抗人IgG(λ链特异性)抗体(Sigma)的Western印迹。Uninf，未感染组织；2-11，接种后的天数；S，标准抗癌mab(单克隆抗体)；LC，用TMV前载体单独表达的轻链(感染后6天)；HC，用TMV前载体单独表达的重链(感染后6天)。
(B)使用A蛋白磁珠(NEB)纯化抗癌mab。在考马斯染色凝胶上在非还原条件下12％聚丙烯酰胺凝胶中迁移的植物衍生的(1道)和标准的(2道)mab。
(C)用表达HC的TMV前载体和表达LC的PVX前载体共感染的本氏烟草叶中组装的抗癌mab的积聚。在非还原条件下以10％聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。用山羊抗人IgG(γ链特异性)抗体进行探针的Western印迹。Uninf，未感染组织；2-11，接种后的天数；S，标准抗癌mab；LC，用TMV前载体单独表达的轻链(感染后6天)；HC，用TMV前载体单独表达的重链(感染后6天)；H2L2：含有两条重链和两条轻链的IgG异源四聚体，H2L-含有两条重链和一条轻链的异源三聚体，H2-重链同源二聚体，L2-轻链同源二聚体。
图12显示双元载体plCH17620、pICH-FSHA和pICH-FSHB的T-DNA区示意图。
图13描述了双元载体plCH17388、plCH-MLCJ和plCH-MHC的T-DNA区示意图。
发明详述
本发明所述病毒载体是其中单个载体编码形成所述异源寡聚蛋白质所需全部蛋白质亚基的病毒载体，或是至少两个不同的非竞争性病毒载体，其中，所述至少两个病毒载体的每一个编码形成所述异源寡聚蛋白质所需的不同蛋白质亚基。每一个所述非竞争性病毒载体可以表达编码重组异源寡聚蛋白质的多个亚基的多条异源核酸序列。可以将所述RNA病毒载体瞬时传递进入植物细胞，或作为DNA前体稳定掺入植物染色体DNA。
本发明提供在植物细胞中高产量生产异源寡聚蛋白质的方法。这一方法克服了现存的基于病毒载体表达系统的局限性(例如对要表达异源序列大小的局限)、所述载体的高度不稳定性以及在同一植物细胞中共表达不同异源核酸的不稳定性。此外，由于从系统除去病毒包被蛋白，阻止感染性病毒颗粒的形成和回复为野生型病毒，所述方法提供更好的生物安全特性。通过本发明的操作，为目的异源寡聚蛋白质而设计的高产量表达系统对于实际上任何植物RNA病毒衍生的复制子是可能的，所述复制子适于表达目的异源序列，通过修饰所述复制子能够表达编码目的异源寡聚蛋白质不同亚基的至少两个目的异源序列。或者，可以发现另一非竞争性病毒载体能够与所述病毒载体在同一植物细胞中共复制。
属于不同分类群的正义单链RNA病毒(这里也简称为“RNA病毒”)适用于构建本发明的正义单链RNA病毒载体(这里也称简为“病毒载体”)。本文中，病毒载体是能够在植物细胞中复制的RNA载体，即使用RNA病毒载体为模板通过依赖RNA的RNA聚合作用形成更多的RNA载体分子。优选的，本发明的病毒载体含有至少一个具有RNA病毒功能的病毒序列元件，例如复制酶、亚基因组启动子、病毒颗粒组装起点、包被蛋白ORF、或移动蛋白ORF。此外，病毒载体可以有RNA病毒IRES元件。
可以，例如通过向病毒中引入限制位点，从其衍生自的病毒构建病毒载体，所述限制位点代表适用于引入本发明的异源序列的克隆位点。本领域技术人员应该理解的是对RNA病毒或载体的核酸改造通常分别使用所述RNA病毒或载体的DNA拷贝在DNA水平上完成。因此，更精确的说，可以通过向RNA病毒的DNA拷贝引入限制位点，从其衍生自的RNA病毒的DNA拷贝构建RNA病毒载体的DNA拷贝，所述限制位点代表适于在DNA水平引入本发明异源序列的DNA拷贝的克隆位点。这些问题对于本领域技术人员是显而易见的并且在本文中通常不再强调。
如果RNA病毒的DNA拷贝天然地具有适于克隆的限制位点，该病毒本身可以是病毒载体。本文中，术语“病毒载体”指其中在所述载体中不存在所述异源序列的情况，或者指其中在载体中不存在本发明的蛋白质亚基的编码序列的情况。通过清楚说明存在这类插入片段从而鉴定其中编码本发明的蛋白质亚基的所述异源序列或序列插入所述病毒载体的情况。
本文中，在引入编码本发明蛋白质亚基的所述异源序列或序列之前，如果两个病毒载体序列不同，则称两个病毒载体为不同的。在引入编码本发明蛋白质亚基的所述异源序列或序列之前，如果两个病毒载体具有相同的序列，则称两个病毒载体为相同的。因此，当确定两个病毒载体是不同或相同时，不考虑编码本发明蛋白质亚基的所述异源序列或序列。
本文中，术语“复制子”或“病毒复制子”具有与“病毒载体”相同的含义。
以下列出可用于改造本发明的病毒载体的RNA病毒表。引用的分类名(并非斜体字体)表示该分类不具有ICTV国际认可的名称。种名(俗名)以常规字体给出。不具有正式指定的属或科的病毒被指出：
RNA病毒：
ssRNA病毒：
科：雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)，
属：苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)，代表种：苜蓿花叶病毒，
属：等轴不稳环斑病毒属(Ilarvirus)，代表种：烟草条(斑)纹病毒，
属：雀麦镶嵌病毒属(Bromovirus)，代表种：雀麦镶嵌病毒，
属：黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)，代表种：黄瓜花叶病毒；
科：长线形病毒科(Closteroviridae)，
属：黄化丝状病毒属(Closterovirus)，代表种：甜菜黄化病毒，
属：长线状病毒属(Crinivirus)，代表种：莴苣传染性枯黄病毒，
科：豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，
属：豇豆花叶病毒属(Comovirus)，代表种：豇豆花叶病毒，
属：蚕豆萎蔫病毒属(Fabavirus)，代表种：蚕豆萎蔫病毒1，
属：线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，代表种：烟草环斑病毒；
科：马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，
属：马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，代表种：马铃薯Y病毒、李痘病毒、烟草蚀纹病毒、三叶草黄脉病毒、烟草脉斑驳病毒；
属：黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)，代表种：黑麦草镶嵌病毒，
属：大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)，代表种：大麦黄色镶嵌病毒；
科：欧防风黄点病毒科(Sequiviridae)，
属：伴生病毒属(Sequivirus)，代表种：欧防风黄点病毒，
属：矮化病毒属(Waikavirus)，代表种：稻东格鲁球状病毒；
科：番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，
属：香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)，代表种：香石竹斑驳病毒，
属：香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)，代表种：香石竹环斑病毒，
属：玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，代表种：玉米褪绿斑驳病毒，
属：坏死病毒属(Necrovirus)，代表种：烟草坏死病毒属，
属：番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)，代表种：番茄丛矮病毒，
未指定属的ssRNA病毒，
属：线形病毒属(Capillovirus)，代表种：苹果茎沟病毒；
属：香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，代表种：香石竹潜隐病毒；
属：耳突花叶病毒属(Enamovirus)，代表种：豌豆耳突花叶病毒，
属：真菌传杆状病毒属(Furovirus)，代表种：土传小麦花叶病毒，
属：大麦病毒属(Hordeivirus)，代表种：大麦条纹花叶病毒，
属：悬钩子病毒属(Idaeovirus)，代表种：覆盆子丛矮病毒；
属：黄症病毒属(Luteovirus)，代表种：大麦黄矮病毒；
属：玉米细线病毒属(Marafivirus)，代表种：玉米雷亚多非纳病毒；
属：马铃薯X病毒属(Potexvirus)，代表种：马铃薯X病毒；
属：南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，代表种：南方菜豆花叶病毒，
属：纤细病毒属(Tenuivirus)，代表种：稻条纹病毒，
属：烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，代表种：烟草花叶病毒，
属：烟草脆裂病毒属(Tobravirus)，代表种：烟草脆裂病毒，
属：发状病毒属(Trichovirus)，代表种：苹果褪绿叶斑病毒；
属：芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)，代表种：芜菁黄花叶病毒；
属：幽影病毒属(Umbravirus)，代表种：胡萝卜斑驳病毒；
负链ssRNA病毒：目：单股负链RNA病毒目(Mononegavirales)，科：弹状病毒科(Rhabdoviridae)，属：胞质弹状病毒属(Cytorhabdovirus)，代表种：莴苣坏死黄化病毒，
属：胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，代表种：马铃薯黄矮病毒。
RNA病毒载体能够为在植物细胞中表达目的基因提供极高的异源RNA拷贝数。然而，如果异源核酸序列的大小增加至某些限制之上，通常在1kb以上，已知这样的载体会变得极不稳定。由于这样的限制，迄今为止，对这类载体系统的应用限制于相对简单的小蛋白质至中型蛋白质的表达。表达大或复杂的异源寡聚蛋白质的努力尚无成功结果。我们已惊奇地发现可以成功地采用病毒载体高产量的表达复合异源寡聚蛋白质，这在先前是不可能的。由于在相同细胞中共表达目的蛋白所使用的病毒载体的不相容性，对表达全长单克隆抗体的早期努力(Verch等人，1998，J.Immunol.Meth.，220，69-75)并未提供满意的结果。在实施例1中，我们在单个细胞水平证明从相同植物RNA病毒(TMV)衍生的病毒复制子有效共表达两个不同基因(GFP和DsRed)是不可能的。在图1(A-右栏)，我们不能检测到显示出表达两种报告基因DsRed和GFP的原生质体。在右下栏一些原生质体中，DsRed的弱表达方式与强的GFP表达(右上栏)相一致，并且由于用于DsRed检测的过滤片漏光而呈现假阳性结果。这一漏光产生含有高浓度GFP的原生质体的明显的弱DsRed荧光。因此即使当RNA复制子带有编码不同重组蛋白的不同异源核酸序列时，相同或共有广泛同源区的RNA复制子不能在一个植物细胞中共存。这一现象的原因目前尚未知。可能的解释为一个病毒复制子拷贝数的指数增加导致迅速胜过另一病毒复制子。因此在选择的细胞中第二个开始复制的复制子不能赶上第一个，其中，这些事件确定“第一”复制子具有统计特征的显著性。
在我们解决此问题的研究中，我们改造了病毒复制子使在所述复制子中存在两个不同的异源核酸序列，其在两个不同的亚基因组启动子控制下编码不同的蛋白质。在图2中显示编码这样的RNA复制子的T-DNA区概图。我们使用先前专利申请(WO02088369；又见Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，6852-6857)所述的前载体方法作为设计和优化这样载体的便宜方法。该方法使能够经由位点特异性重组在植物中从预制的构件组装最终的载体，因此显著的加速了载体设计和载体优化。在实施例2中描述了该构建体的设计并且在图3中显示了示意图。
我们惊奇的发现尽管在最终复制子中插入大的片段且由存在两个强亚基因组启动子导致的载体的复杂结构，获得的RNA复制子在植物中显示出高稳定性和在相同植物细胞中提供两种不同重组蛋白(GFP和DsRed)共表达的能力。如图4所示，在感染区域内，共表达的频率可以达到几乎所有细胞的100％。例如在这样的构建体中用IgG的轻链和重链代替报告基因(GFP和DsRed)(图5)在浸润的本氏烟草叶中进一步的表达，产生令人惊奇的结果。如在实施例3中所述，Western印迹分析显示了令人印象深刻的高浓度的组装的单克隆抗体(6和7道；图6)。由我们的系统提供的组装的单克隆抗体的产量远远高于由现有技术系统产生的产量(图6，4道)。据我们所知，这是使用基于植物病毒载体的表达系统表达复合异源寡聚蛋白质(例如抗体)的第一次证明。所有先前的公开局限于表达单克隆抗体的简单的人工衍生物，例如使用TMV病毒载体(McCormick等人，1999，ProcNatl Acad Sci USA，96，703-708；McCormick等人，2003，J.Immunol.Methods，278，95-104)和基于PVX的载体(Smolenska等人，1998，FEBSLett.，441，379-382；Franconi等人，1999，Immunotechnology，4，189-201；Hendy等人，1999，J.Immunol.Methods，231，137-146；Roggero等人，2001，Protein Expr.Purif.，22，70-74)表达单链抗体(scFv)。
在本发明中，我们优选不使用系统病毒载体。代替系统病毒载体，我们优选通过农杆菌介导将病毒载体前体传递进入植物系统来代替病毒载体的系统移动能力。这使我们可以用要表达的异源序列代替病毒的包被蛋白。这一方法有助于增加病毒载体对异源序列的可能的容量。同时，该方法消除了病毒载体由于自发的缺失异源序列而转化为野生型病毒的可能性，所述转化可能损害系统的产量。
尽管我们基于病毒复制子系统产生的单克隆抗体产量显著优于现有技术系统，我们检测了通过减少病毒复制子的大小进一步增加产量的可能性。考虑到减少表达分泌型抗体双链的病毒复制子大小的有限的可能性，我们尝试从两个不同的病毒复制子表达抗体的重链和轻链。考虑到基于相同病毒的复制子不能在相同植物细胞中共表达两条不同的异源序列(见以上实施例1)，我们检测了通过将DsRed和GFP基因分别克隆进入由非同源的植物病毒烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯病毒X(PVX)衍生的病毒载体从而在相同植物细胞中共表达两种不同基因的可能性(见实施例4)。在图7和8显示了含有所述病毒载体的cDNA的T-DNA区示意图(仅PVX)。在实施例4中，出于方便，我们使用基于TMV的病毒载体，所述载体在植物中经由位点特异性重组从载体构件组装。我们令人惊奇的发现从共浸润的植物叶区分离的原生质体显示出几乎100％的DsRed和GFP报告基因的共表达频率(图9)。
近来，由Dietrich和Maiss提出关于不同标记病毒的空间分离的研究(2003，J.Gen.Virology，84，2871-2876)。在这一研究中，作为报告基因表达荧光蛋白。未提到产生异源寡聚蛋白质。此外，没有在分离的原生质体水平上对共表达的研究。由于报告基因产物能够经由胞间连丝扩散至相邻细胞，不能获得所选择的病毒对究竟在相同或是相邻细胞中表达报告基因的信息。更早的公布涉及在感染植物时野生型病毒彼此之间的协同作用，但不涉及异源寡聚蛋白质在植物细胞中的表达(Rochow和Ross，1955，Virology，1，10-27；Goodman和Ross，1974，Virology，58，16-24；Goodman和Ross，1974，Virology，59，314-318；Goodman和Ross，1974，Virology，58，263-271)。关于病毒在共感染植物中的协同相互作用的这些早期研究(Vance等人，1995，Virology，206，583-590；Pruss等人，1997，Plant Cell，9，859-868)随后发展导致发现转录后基因沉默(PTGS)的阻抑基因。重组蛋白表达系统的进一步发展定向于研究这类PTGS阻抑基因以增加重组蛋白的产量。在现有技术中对蛋白质表达没有使用基于协同病毒的病毒表达系统的暗示。
本发明证明非竞争性病毒载体为在植物细胞或植物中生产异源寡聚蛋白质提供有效工具。如果两个或多个病毒载体能够在相同植物细胞中复制并且在所述复制和其它细胞的转染中不彼此稀释，所述病毒载体是彼此非竞争性的。没有稀释意指至少10％，优选50％，更优选90％和最优选100％的转染的植物细胞是共转染的，例如含有所述两个或多个不同的病毒载体。优选所述病毒载体能够复制和表达异源核酸序列。更优选所述异源核酸序列编码不同蛋白质。甚至更优选所述不同的蛋白质为异源寡聚蛋白质的亚基。为了确定病毒载体究竟是竞争性或非竞争性的，可以测量植物细胞的共转染频率。这可以通过以下方案完成：用两种不同的报告基因，例如DsRed和GFP标记两种病毒载体。将所述不同标记的载体共传递(例如经由农杆菌浸润)进入植物叶组织，并且在3-6天之后对从感染区域分离的原生质体计数以确定共表达两种报告基因的原生质体相对于仅表达一种报告基因的原生质体数的比率。在实施例2和4中描述了证明这样的测量的实验(也见图1A和9)。通常，非竞争性病毒载体可以衍生自协同的病毒，例如能够成功的共转染相同植物宿主的病毒。这样的协同的RNA病毒对的实例包括：
马铃薯病毒X(PVX)/烟草花叶病毒(TMV)；
PVX/烟草脉斑驳病毒(TVMV)；
PVX/烟草蚀纹病毒(TEV)；
PVX/三叶草黄脉病毒(CIYVV)；
PVX/李痘病毒(PPV)；
PVX/马铃薯病毒Y(PVY)。
病毒载体的竞争或非竞争性机制的原因未知。一个可能的解释是由协同的病毒载体衍生的病毒复制子在不同的亚细胞区形成病毒复制复合物(VRC)(Kawakami等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，6291-6296)，因此它们不彼此竞争形成VRC所需的空间。如实验所确定，非竞争的病毒载体可以衍生自在其核酸序列水平上显著不同的不同病毒种。所述非竞争性病毒载体可以衍生自能够成功共感染相同植物宿主的协同性植物病毒。协同性病毒通常属于不同的属。例如PVX属于马铃薯X病毒属，而与其协同的病毒例如TVMV、TEV、PPV和CIEVV属于马铃薯Y病毒属。与PVX病毒协同的其它病毒(非竞争性)例如TMV、TVCV和crTMV属于烟草花叶病毒属。显然，在不同属的代表之间基因组同源性相当低，通常在RNA水平上低于50％同一性。
在实施例5中描述了将单克隆抗体的重链和轻链克隆进不同病毒载体(例如基于PVX和TMV的病毒载体)，接着在共感染的植物组织中进一步共表达所述链。在图10中显示了载体的示意图。在该载体帮助下产生的单克隆抗体产量与其它表达系统相比较的ELISA测量表明基于两个非竞争性病毒载体的所述系统的最佳执行(图11)。现有技术中在病毒载体帮助下在植物细胞中有效表达重组异源寡聚蛋白质尚未知。
根据我们的数据，病毒载体的病毒衍生的序列应该不呈现使所述病毒与其它病毒之间的显著需要考虑的同源性。这样病毒的实例是病毒对TMV和PVX以及基于其的病毒载体。这些病毒载体并未呈现这样的同源性。选择可接受的病毒对的另一要求可以是在共感染植物宿主期间原始野生型病毒的协同性。
使用瞬时表达系统基于农杆菌介导将DNA前体传递进入植物细胞来完成以上讨论的实验。然而，本发明备选的应用是用于以所述RNA复制子的DNA前体稳定掺入植物核染色体的转基因植物。这使能够克服基于植物病毒载体系统的许多局限，例如对病毒载体可容忍的异源序列最大尺寸的限制。由于DNA前体将存在于转基因植物的每个细胞中，RNA复制子的系统移动或细胞至细胞的移动(复制子扩散)不是必需的。这可以由高效率的形成本发明的RNA复制子和转运其进入胞质而得到补偿。然而，由于RNA复制子的形成并非总是发生在全部细胞中，载体的细胞-至-细胞移动的能力可以有额外的价值。
可以使用不同方法向植物、植物组织或植物细胞提供异源DNA。可以通过由农杆菌携带的Ti-质粒载体(US 5,591,616；US 4,940,838；US5,464,763)或颗粒或微粒轰击(US 05100792；EP 00444882B1；EP00434616B1)将所述载体转化进入植物细胞。还可以使用其它植物转化方法，例如显微注射(WO 09209696；WO 09400583A1；EP 175966B1)、电穿孔(EP00564595B1；EP00290395B1；WO 08706614A1)或PEG介导的原生质体转化等。可以由要转化的植物物种决定选择载体传递的方法。例如，通常优选微粒轰击用于单子叶转化，而对于双子叶，通常农杆菌介导的转化效果较好。
在本发明的实例中，我们使用瞬时农杆菌介导的传递使载体(所述异源DNA)进入烟草细胞。然而，可以根据适于目的植物物种的稳定转化或瞬时转化的任何标准技术将所述载体稳定的导入植物。双子叶的转化技术是本领域众所周知的，且包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌技术涉及由原生质体或细胞直接摄取外源遗传物质。这些技术包括PEG或电穿孔介导的摄取、颗粒轰击介导的传递和显微注射。这些技术的实例描述在Paszkowski等人，EMBO J3，2717-2722(1984)，Potrykus等人，MoI.Gen，Genet.199，169-177(1985)，Reich等人，Biotechnology4：1001-1004(1986)，和Klein等人，Nature 327，70-73(1987)。在各个情况下使用标准技术将转化的细胞再生为整个植物。
因为农杆菌介导的转化技术具有高转化效率且广泛的适用于多种不同物种，优选用该技术转化双子叶植物。可以通过农杆菌常规转化多种作物物种，包括烟草、番茄、向日葵、棉、油菜、马铃薯、大豆、苜蓿和杨树(EP 0 317 511(棉)、EP 0 249 432(番茄)、WO 87/07299(白菜)、美国专利4,795,855(杨树))。
在本发明的实例中，使用农杆菌介导的T-DNA传递用于目的基因的瞬时表达。这一方法不仅对于小规模至中规模的重组蛋白生产系统，而且对于大规模表达都是非常有用的工具。
使用可诱导的或任何其它受调节的(例如发育调节的)启动子可以达到对稳定掺入植物染色体DNA的病毒复制子前体的释放。根据其诱导条件，可以将可诱导的启动子分为两类：由非生物因子(温度、光、化学物质)诱导的那些和由生物因子，例如病原体或害虫侵袭诱导的那些。第一类的实例为热诱导(US 05187287)和冷诱导(US05847102)的启动子、铜诱导系统(Mett等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，4567-4571)、类固醇诱导系统(Aoyama和Chua，1997，Plant J.，11，605-612；McNellis等人，1998，Plant J.，14，247-257；US06063985)、乙醇诱导系统(Caddick等人，1997，NatureBiotech.，16，177-180；WO09321334)和四环素诱导系统(Weinmann等人，1994，Plant J.，5，559-569)。在植物的化学诱导系统领域，最近的发展之一是嵌合启动子，其可以由糖皮质激素地赛米松开启并且由四环素关闭(Bohner等人，1999，Plant J.，19，87-95)。关于化学诱导系统的综述见：Zuo和Chua，(2000，Current Opin.Biotechnol.，11，146-151)和Padidam，M(2003，Curr.Opin.Plant Biol.，6，169-177)。可诱导启动子的其它实例是控制植物中的致病相关(PR)基因表达的启动子。可以通过用水杨酸(其为植物信号通路中应答病原体攻击的重要组分)或能够引起PR基因表达的其它化合物(1，2，3-苯并噻二唑或异烟酸)(US05942662)处理植物来诱导这些启动子。
本发明不限于在实施例中所述基于TMV和基于PVX的载体，而是可以应用于衍生自其它植物RNA病毒的复制子，使建立由所述病毒复制子衍生的表达系统。已知对于病毒对PVX/PVY在共感染植物中的协同性研究得最好(Rochow和Ross，1955，Virology，1，10-27；Goodman和Ross，1974，Virology，58，16-24)。很可能那些病毒许多可以在相同植物细胞中共复制。Dietrich和Maiss(2003，J.Gen.Virol.，84，2871-2876)已表明不同标记的病毒对，例如李痘病毒(PPV)和马铃薯病毒X(PVX)、烟草脉斑驳病毒(TVMV)和PVX、三叶草黄脉病毒(CIYVV)和PVX可以在植物组织的相同感染区共表达不同的报告基因。可以使用本发明所述策略发展重组异源寡聚蛋白质表达系统，用于能够在相同植物细胞中共复制的几乎任何植物正义单链RNA病毒衍生的复制子对。例如，在本发明中可以使用基于苜蓿花叶病毒属的苜蓿花叶病毒(AMV)的病毒载体。
可以使用本发明在植物或植物细胞中表达编码复合(异源寡聚)蛋白的目的基因、其片段(功能性或非功能性)及其人工衍生物和融合。使用本发明可以产生并纯化多种有商业价值的异源寡聚蛋白质类群。那些类群包括但不限于工业和研究的蛋白质以及应用于人类或动物健康领域的蛋白质。然而，最优选免疫应答蛋白类群，特别是选自不同类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA和IgD)的单克隆抗体和它们的合成衍生物(如突变体类型以及与其它蛋白质或其部分的不同类型的融合)。
具体实施方式
提出下列实施例以说明本发明。可以做出修改和变化而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
由相同植物RNA病毒衍生的两个基于TMV的RNA病毒载体没有GFP和DsRed的共表达
用由相同植物RNA病毒衍生的但是含有两个不同目的基因的两个基于TMV的RNA病毒载体感染叶组织(图1)。我们使用克隆在基于TMV病毒载体中的可视标记基因GFP和DsRed来测试这一方法。第一构建体，plCH17272(见Marillonnet等人，2005，Nat.Biotechnol.，23，718-723的图1)，含有GFP，并且除了在载体的RdRP编码序列含有9个而非14个植物内含子之外，与plCH18711(见国际专利申请PCT/EP03/12530，作为WO2005049839公布；Marillonnet等人，2005，Nat.Biotechnol.，23，718-723)相似。plCH18722(Marillonnet等人，2005，Nat.Biotechnol.，23，718-723)构建在两个密切相关的菌株TMV、Cr-TMV(Dorokhov等人，1994，FEBS Lett.350，5-8)和TVCV(Lartey等人，1994，Arch.Virol.138，287-298)的骨架上，并且含有在植物启动子控制之下的病毒基因组，由异源序列代替包被蛋白序列。在RdRP和MP中存在的11个内含子增加了在农杆菌介导载体传递进入叶组织之后病毒复制的起始效率，并且因此增加了两个载体在相同细胞中的共表达的概率。plCH18505与plCH17272相似，除了其GFP编码序列已经由使用Xho1-Not1限制位点的DsRed的编码序列代替(图1)。在图1C中显示plCH18505和plCH17272的T-DNA区详细的限制图谱。在农杆菌菌株GV3101中转化plCH17272和plCH18505，并且如先前所述(Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.ScL USA，101，6852-6857)浸润本氏烟草叶组织。从浸润后7天(dpi)的浸润区制备原生质体并且在显微镜的蓝光或红光下观察。即使对于从数天之后的浸润区制备的原生质体，很少有原生质体同时表达GFP和DsRed(图1A)。这说明一旦细胞被基于TMV的第一病毒载体感染，它不能被基于TMV的第二载体再次感染。
实施例2
来自单个病毒复制子的GFP和DsRed的共表达
由RNA病毒载体表达的两个目的基因在两个分别的亚基因组启动子控制下(图2)。两个亚基因组启动子可以是相同的，但是为了避免在病毒复制期间构建体中重复序列之间缺失的风险，优选使用来自相关TMV菌株的亚基因组启动子；在这一情况下，第二亚基因组启动子和3’非翻译区来自TMGMV菌株U5(Shivprasad等人，1999，Virology，255，312-323；Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，6852-6857)。而且，为了克隆方便，在病毒前载体(如在WO02/088369所述和由Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，6852-6857所述)而非完整组装的载体中克隆GFP和DsRed。通过在植物中前载体构件之间的位点特异性重组，将两个前载体plCH17388和plCH15933(图3)转化为完整功能的基于TMV的病毒载体。除了在病毒序列中存在11个内含子(如在plCH17272)，plCH17388与plCHNOP(Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，6852-6857)相似。除了TMGMV U5的编码序列由DsRed的编码序列代替，plCH15933与plCHGFPSYS(Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101，6852-6857)相同。
在农杆菌菌株GV3101中转化plCH15933并且与plCH17388和pICH10881(图3)一起浸润本氏烟草叶。浸润5天之后，所有表达GFP的焦点也表达DsRed，显示出两个基因在相同植物细胞中极好的共表达(图4)。
实施例3
来自单个病毒复制子的抗体表达
在plCH15933中，GFP和DsRed的编码序列分别由IgG抗体的轻链和重链代替，产生构建体plCH20241(图5)。作为对照，将轻链和重链克隆在基于TMV的前载体代替plCH1740的编码序列，产生构建体plCH20421和plCH20431(图5)。将plCH20241与plCH17388和plCH10881(图3)一起共浸润本氏烟草叶。
将辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG兔抗体(Sigma)以1∶6000稀释用于对从浸润叶提取的可溶总蛋白质执行Western印迹分析。在图6A中显示该分析的结果。显然，使用单个病毒载体获得的抗体表达水平(6和7道，图6)显著高于使用强组成型启动子甚至在PTGS阻抑基因P19的存在下获得的抗体水平(3-4道，图6)。
实施例4
使用基于TMV和PVX病毒载体的GFP和DsRed的共表达
共表达两个基因的其它策略是使用构建在不同病毒上的分开的病毒载体，所述不同病毒可以共感染相同细胞并在其中复制。作为实例，基于马铃薯病毒X(PVX)的病毒载体可以与TMV在相同细胞中共存。在图7中显示两个这样的非竞争性病毒载体的示意图。
从德国微生物和细胞培养物保藏所(DSMZ)获得作为感染的干叶物质的PVX接种物(菌株PV0014)，并且用于接种本氏烟草植物。使用呈现病毒症状的接种植物的体系叶制备总RNA。使用引物pvxpr2、pvxpr4和pvxpr6制备第一链cDNA。使用Pfu-Taq聚合酶混合物，通过PCR从PVXcDNA扩增三个cDNA片段：
使用下列引物扩增片段1：
Pvxpr1：ttt ggtctc a tgaa gaaaactaaaccatacaccaccaacacaac(SEQ IDNO：1)
Pvxpr2：ctttttccagcccggagaccatttctgtgatgg(SEQ ID NO：2)
用Bsal消化片段1。
使用下列引物扩增片段2：
Pvxpr3：ttt cgtctc a gggctggaaaaagaggacttccctgaagg(SEQ ID NO：3)
Pvxpr4：gagtcgtctcctgcataaacttgagcag(SEQ ID NO：4)
用Esp3l消化片段2。
使用下列引物扩增片段3：
Pvx5：ttt gaagac aa tgcaggagacgactccgcactgg(SEQ ID NO：5)
Pvx6：            cg         gacgtc              ttttttttttttttttttttttttatttatattattcatacaatcaaaccagaaaatac(SEQ ID NO：6)
用Bpil Aatll消化片段3。
片段4含有拟南芥肌动蛋白2基因启动子(An等人，1996，Plant J.，10，107-121)，使用以下引物从拟南芥基因组DNA扩增：
Act2pr1：ttt acgcgt ttcgacaaaatttagaacgaacttaattatg(SEQ ID NO：7)
Act2pr2：ttt ggtctc a ttca ttcaaagcggagaggaaaatatatg(SEQ ID NO：8)
用Mlu1和Bsa1消化片段4。
作为拟南芥肌动蛋白2启动子的备选，也使用CaMV 35启动子驱动基于PVX的病毒载体的转录(见图10D，plCH20788；plCH21380)。使用的制备基于PVX载体的通用策略如Baulcombe及其同事所述(1995，PlantJournal，7：1045-1053)。
将全部四个片段一起克隆在使用Mlu1和Aatll消化的双元载体中。在农杆菌菌株GV3101中转化产生的构建体的20个克隆，并且使用每个克隆浸润本氏烟草植物的一个叶片。一周之后，由表型筛选具有病毒感染症状的本氏烟草，并且保留阳性的质粒克隆(plCHPVX)。
从这一完整的功能性cDNA制备克隆载体用于在CP亚基因组启动子的下游克隆目的基因。克隆GFP基因作为实例。将在CP亚基因组启动子区的ATG突变为AGG(在Genbank登录号M95516位置5651)。将GFP基因克隆在Nhel位点的3’(相当于5662至5667)。PVX的3’末端(相当于5618至6435)克隆在GFP序列的下游，并且接着该序列的是12至24个A的一段序列。通过农杆菌浸润使此构建体(plCH0130，图8)进入本氏烟草叶。浸润二至三天之后在浸润区出现GFP荧光。几天之后出现GFP的系统移动。
将plC0130与提供DsRed表达的载体plCH17388、plCH10580和plCH10881(图3)一起共浸润进入本氏烟草叶。共浸润6天之后，从浸润区制备原生质体并且在显微镜的蓝光下观察。几乎全部的原生质体同时表达GFP和DsRed，表现出极佳的共表达水平(图9)。
实施例5
使用基于TMV和PVX的载体表达单克隆抗体
将IgG的重链和轻链克隆在PVX载体中，代替在plC0130中的GFP编码序列，产生两个构建体，plCH21240和plCH21370，其分别含有重链或轻链(图10A)。还构建了含有抗体轻链或重链的TMV前载体部分的克隆(plCH20431和plCH20421，图10A)。使用于从基于PVX和TMV的载体表达两个不同链的农杆菌混合物浸润本氏烟草叶并且在接种10天后通过ELISA测量抗体的表达水平。结果(图11)显示在基于PVX和TMV的载体共表达重链和轻链的情况下组装的功能性抗体的极高水平。其水平显著高于从同时表达两个链的TMV载体所获得的(实施例3)。
另外，将属于IgG1亚类的另一人肿瘤特异性单克隆抗体，抗癌mab亚克隆在基于TMV和PVX的载体中，步骤如下：将含有抗癌mab轻链编码序列的730 Ncol-Notl片段在Notl位点平端化并且连接在基于TMV的3’构件克隆载体plCH11599(图10B)(该载体用Ncol-Xbal切开并且在Xbal位点平端化)，连接后产生plCH21910(图10B)。使用相同的策略将1421 bp的Ncol-Notl片段与抗癌mab重链编码序列亚克隆进入plCH11599(图10B)产生plCH21920(图10B)构建体。在基于TMV的3’构件克隆载体plCH10990(图10C)的基础上产生表达GFP的基于PVX 3’构件的plCH21282(图10C)。通过将GFP编码序列插入plCH10990(图10C)和接着用PVX的3’非翻译区代替TMV的3’非翻译区完成几个克隆步骤。类似的，通过使用PVX的3’非翻译区代替TMV的3’非翻译区将基于TMV的3’前载体构件plCH21920(图10B)转化进入基于PVX的3’前载体构件plCH22250(图10C)。将在Hindlll位点平端化的plCH21282(图10C)的575bp Hindlll-Nd-el片段与Sal1位点平端化的plCH21920的Sal1-Ndel片段连接。将含有抗癌mab轻链编码序列的723 bp Ncol-EcoRI片段亚克隆在使用Ncol-EcoRI消化的plCH22250(图10C)中，产生plCH22240(图10C)。
5’前载体plCH21380(图10D)按照以下方法制备：使用构建体plCH17388(图3B)作为模板，在引物pv5p5F(SEQ ID NO：9)(5′cagctagcaa caaacaagaa aggtaagttt c-3′)和pv5p5R(SEQ ID NO：10)(5′-tctgagctct gcatgctacg cccccaactg agag-3′)帮助下PCR扩增该片段，用Nhe1和Sac1限制内切酶消化，并与plCH20788的大的Nhe1-Sac1片段连接，用内含子的5’端和AttP重组位点代替PVX载体的3’部分。在图10D中显示克隆的示意图。使用5’前载体和3’前载体的策略在植物中经由位点特异性重组组装病毒载体在先前已有描述(Marillonnet等人，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101：6852-6857)。
农杆菌浸润操作
使用标准电穿孔方案将所有产生的构建体在农杆菌菌株GV3101中转化并且进一步用于本氏烟草叶的农杆菌浸润。将过夜生长的农杆菌培养物(OD600范围从1.8至2.5)等量混合并且在6000g离心3分钟获得沉淀。将沉淀重悬浮于含有10mM MES(pH 5.5)和10mM MgSO4的溶液中，产生对于每种单独的培养物的10-1稀释。通过使用无针头的注射器使温室生长的本氏烟草植物的6-8周龄叶受到浸润。在使用前载体用于农杆菌浸润的情况下，农杆菌混合物通常带有5种不同的农杆菌菌株，每种提供下列组分之一：重组酶(整合酶)来源(plCH10881)；5′PVX前载体(plCH21380)；提供IgG链之一的一个3′PVX前载体(由TMV前载体提供的互补链决定，或者提供重链的plCH22250或者提供轻链的plCH22240)；5′TMV前载体(plCH17388)；一个3′TMV前载体(编码轻链的plCH21910或编码重链的plCH21920)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹
将以农杆菌浸润的100mg本氏烟草叶样品在液氮中研磨，使用300μl蛋白质提取缓冲液(0.1M Tris、150mM NaCl和0.1％吐温20，pH8.0)。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液系统将叶的粗提物在10％(非还原条件)或12％(还原条件)的聚丙烯酰胺凝胶中分离，接着通过考马斯亮兰染色。对于Western印迹分析，使用印迹缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、20％甲醇，pH8.3)将来自SDS-聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质电转移至Hybond P膜(Amersham Biosciences，英国)。在TBST(50mM Tris、100mM NaCl、0.05％吐温20，pH7.4)中用5％脱脂牛奶封闭膜，并且用山羊抗人λ轻链HRP缀合抗体(Sigma，英国)或山羊抗人IgGγ链特异性HRP缀合抗体(Sigma，英国)作为探针检测，所述抗体在2.5％脱脂牛奶/TBS中以1∶10000和1∶5000分别稀释。使用ECL检测试剂(Amersham Biosciences，英国)检测结合的抗体。在图11B中显示电泳分离和Western印迹分析的结果。与标准IgG的比较表明在植物组织中单克隆抗体的产量达到每克新鲜叶生物量0.2-0.35mg。
植物衍生的重组Mab的分离
使用含有100mM磷酸钠、150mM NaCl和0.05％吐温20(pH8.0)的缓冲液从接种农杆菌的本氏烟草叶区提取总可溶蛋白质。根据操作说明书，使用A蛋白磁珠(New England Biolabs，美国)对蛋白粗提物进行一步亲和纯化，小规模分离抗癌mab。在图11B(B栏)显示了带有纯化的植物衍生Mab的考马斯染色凝胶。
实施例6
使用基于TMV和PVX的载体表达促卵泡激素(FSH)
合成编码牛FSH的α多肽(对应于GenBank登录号No.NM_173901的101-463编码序列的核苷酸)和β多肽(对应于GenBank登录号No.NM_174060的70-459编码序列的核苷酸)的基因(cDNA)，所述基因侧翼带有限制位点(对于FSH-α和FSH-β亚基为5’Nco1-3’EcoR1)，并将所述基因代替IgG的重链和轻链编码序列克隆在TMV前载体(由plCH11599衍生的plCH20431，图10B)和PVX载体(plCH21240)产生分别含有α亚基和β亚基编码序列的两个构建体，plCH-FSHA和plCH-FSHB(图12)。制备从基于PVX和基于TMV的载体表达两种不同亚基的农杆菌混合物并如上所述浸润本氏烟草叶，接种10天之后使用可商购的FSH二聚体特异性(FSH 117)抗体通过ELISA测量异二聚体FSH的表达水平并且使用Tropix化学发光系统(Tropix，Bedford，MA)检测。
实施例7
使用基于TMV和PVX的载体表达IgM
使用编码IgM轻链和J链的序列分别代替plCH 15933中GFP和DsRed的编码序列，产生plCH-MLCJ构建体(图13)。将编码IgM重链的基因克隆在PVX载体(plCH21240)代替IgG重链的编码序列并且产生plCH-MHC构建体(图13)。使用从基于PVX和TMV的载体表达IgM的三个不同链的农杆菌混合物浸润本氏烟草叶，接种10天之后使用可商购的IgM特异性抗体通过ELISA测量异二聚体复合物的表达水平。
本发明要求其优先权的欧洲专利申请No.05 001 819.1和美国专利申请No.60/593,606的内容在此被完整引入作为参考。

Claims (42)

1.在植物、植物组织或植物细胞中产生包含至少第一和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括在植物细胞中通过以下方式表达至少所述第一和第二蛋白质亚基：
(i)向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供第一和第二正义单链RNA病毒载体，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体是不同的病毒载体；或
(ii)向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的正义单链RNA病毒载体。
2.根据权利要求1的方法，接着从所述植物、所述植物组织或所述植物细胞分离所述异源寡聚蛋白质。
3.根据权利要求1或2的方法，其中编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的所述RNA病毒载体含有编码所述第一蛋白质亚基的第一异源序列和编码所述第二蛋白质亚基的第二异源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白质亚基的表达在亚基因组启动子的控制下。
4.根据权利要求1或2的方法，其中编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的所述RNA病毒载体含有编码所述第一蛋白质亚基的第一异源序列和编码所述第二蛋白质亚基的第二异源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白质亚基的表达在IRES元件的控制下。
5.根据权利要求1至4的任一项的方法，其中编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的所述RNA病毒载体缺少编码所述病毒载体系统移动功能性蛋白质的ORF。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述第一病毒载体含有编码所述第一蛋白质亚基的第一异源序列，而所述第二病毒载体含有编码所述第二蛋白质亚基的第二异源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白质亚基的表达在亚基因组启动子的控制下。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述第一病毒载体含有编码所述第一蛋白质亚基的第一异源序列，而所述第二病毒载体含有编码所述第二蛋白质亚基的第二异源序列，其中所述第一和/或所述第二蛋白质亚基的表达在IRES元件的控制下。
8.根据权利要求1至7的任一项的方法，其中编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的所述病毒载体、所述第一病毒载体和/或所述第二病毒载体缺少功能性包被蛋白ORF、功能性移动蛋白ORF和/或组装病毒颗粒的功能性起点。
9.根据权利要求1至8的任一项的方法，其中所述第一病毒载体衍生自属于马铃薯X病毒属的病毒，而所述第二病毒载体衍生自属于马铃薯Y病毒属的病毒。
10.根据权利要求9的方法，其中所述第一病毒载体衍生自马铃薯病毒X，而所述第二病毒载体衍生自马铃薯病毒Y。
11.根据权利要求1至8的任一项的方法，其中所述第一病毒载体衍生自属于马铃薯X病毒属的病毒，而所述第二病毒载体衍生自属于烟草花叶病毒属的病毒。
12.根据权利要求11的方法，其中所述第一病毒载体衍生自马铃薯病毒X，而所述第二病毒载体衍生自烟草花叶病毒。
13.根据权利要求1至12的任一项的方法，其中所述第一和所述第二病毒载体具有至多60％的序列同源性。
14.根据权利要求1至13的任一项的方法，其中所述异源寡聚蛋白质是抗体。
15.根据权利要求1至14的任一项的方法，其中向所述植物、植物组织或植物细胞瞬时提供所述病毒载体。
16.根据权利要求15的方法，其中通过农杆菌转染向所述植物、植物组织或植物细胞瞬时提供所述病毒载体。
17.根据权利要求1至14的任一项的方法，其中将所述RNA病毒载体作为所述RNA病毒载体的DNA前体稳定掺入植物染色体DNA。
18.根据权利要求17的方法，其中通过可诱导的启动子提供来自所述DNA前体的所述RNA病毒载体的受控释放。
19.根据权利要求1至18的任一项的方法，其中至少所述第一或所述第二蛋白质亚基具有植物特异性信号肽作为ER靶向信号。
20.根据权利要求19的方法，其中所述植物特异性信号肽衍生自烟草钙网蛋白和/或稻α淀粉酶。
21.根据权利要求14的方法，其中所述抗体是包含至少部分的抗原结合结构域的免疫球蛋白。
22.根据权利要求14或21的方法，其中所述抗体包含与免疫球蛋白重链缔合的保护蛋白质，其中该保护蛋白质包含多聚免疫球蛋白受体的部分。
23.根据权利要求14、21或22的任一项的方法，其中所述抗体或其衍生物属于免疫球蛋白G类、免疫球蛋白A类、免疫球蛋白M类、免疫球蛋白D类或免疫球蛋白E类。
24.根据权利要求1至12的任一项的方法，其中所述异源寡聚蛋白质是胰岛素。
25.根据权利要求1至24的任一项的方法，其中所述异源寡聚蛋白质的至少一个或至少两个或多个亚基含有内质网滞留信号KDEL。
26.根据权利要求1至25的任一项的方法，其中突变所述异源核酸序列从而部分或全部地从所述异源寡聚蛋白质除去糖基化位点。
27.根据权利要求1至26的任一项的方法，其中改造所述植物、植物组织或植物细胞以改变所述异源寡聚蛋白质的糖基化方式。
28.根据权利要求1至27的任一项的方法，其中所述植物是单子叶或双子叶植物。
29.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物属于茄科。
30.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物是烟草物种。
31.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物是烟草或本氏烟草。
32.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物属于十字花科。
33.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物属于豆科。
34.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物是紫苜蓿。
35.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物属于藜科。
36.根据权利要求28的方法，其中所述双子叶植物是甜菜。
37.在植物、植物组织或植物细胞中生产包含至少第一和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括在植物细胞中从一个或多个正义单链RNA病毒载体共表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基。
38.在植物或植物组织中生产包含至少第一蛋白质亚基和第二蛋白质亚基的抗体的方法，所述方法包括通过以下方式在植物细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基：
(i)通过农杆菌介导的转染向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供第一正义单链RNA病毒载体的DNA前体和第二正义单链RNA病毒载体的DNA前体，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中至少所述第一病毒载体或所述第二病毒载体缺少编码所述第一或所述第二病毒载体在所述植物中系统移动所需要的功能性蛋白质的开放阅读框；或
(ii)通过农杆菌介导的转染向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供编码至少所述第一和所述第二蛋白质亚基的正义单链RNA病毒载体的DNA前体，其中所述病毒载体缺少编码系统移动需要的功能性蛋白质的ORF。
39.在植物、植物组织或植物细胞中生产包含至少第一蛋白质亚基和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括通过向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供至少第一和第二正义单链RNA病毒载体，在植物细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体衍生自不同的正义单链植物RNA病毒。
40.在植物、植物组织或植物细胞中生产包含至少第一蛋白质亚基和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括通过向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供至少第一和第二正义单链RNA病毒载体在植物细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体在除了编码所述第一和第二蛋白质亚基的序列部分之外的序列部分不同。
41.在植物、植物组织或植物细胞中生产包含至少第一蛋白质亚基和第二蛋白质亚基的异源寡聚蛋白质的方法，所述方法包括通过向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供至少第一和第二正义单链RNA病毒载体在植物细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体衍生自属于不同种的正义单链RNA病毒。
42.在植物、植物组织或植物细胞中生产包含至少第一和第二蛋白质亚基的抗体的方法，所述方法包括通过向所述植物、所述植物组织或所述植物细胞提供至少第一和第二正义单链RNA病毒载体在植物细胞中表达至少所述第一和所述第二蛋白质亚基，所述第一病毒载体编码至少所述第一蛋白质亚基，所述第二病毒载体编码至少所述第二蛋白质亚基，其中所述第一病毒载体和所述第二病毒载体是不同的病毒载体。
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