BRPI0607053B1

BRPI0607053B1 - Processo para produzir em uma planta, tecido vegetal, ou em células vegetais, um anticorpo como uma proteína hetero-oligomérica que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda subunidade proteica

Info

Publication number: BRPI0607053B1
Application number: BRPI0607053-1A
Authority: BR
Inventors: Giritch Anatoly; Marillonnet Sylvestre; Klimyuk Victor; Gleba Yuri
Original assignee: Icon Genetics Gmbh
Priority date: 2005-01-28
Filing date: 2006-01-27
Publication date: 2018-02-06
Also published as: ATE547429T1; BRPI0607053A2; AU2006208631B2; KR20070102570A; JP5015012B2; JP2008535473A; EP1686176A1; US20150315604A1; ES2383670T3; WO2006079546A2; EP1844152B1; KR101293218B1; IL184574A; AU2006208631A1; CA2595328A1; US20090111145A1; MX2007008993A; US8940963B2; DK1844152T3; CA2595328C

Abstract

produção de proteínas heterooligoméricas em plantas. a presente invenção refere-se a um processo para produzir em uma planta, em um tecido da planta, ou em células da planta, uma proteína heterooligomérica que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda subunidade da proteína, sendo que o dito processo compreende expressar em células da planta pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidade da proteína, (i) disponibilizar para a dita planta, o dito tecido da planta ou as ditas células da planta, um vetor viral de rna de fita simples, sentido positivo, que codifica pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidade da proteína, ou (ii) disponibilizar para a dita planta, o dito tecido da planta ou as ditas células da planta, um primeiro e um segundo vetor viral de rna de fita simples, sentido positivo, sendo que o dito primeiro vetor viral codifica pelo menos a dita primeira subunidade da proteína, o dito segundo vetor viral codifica pelo menos a dita segunda subunidade da proteína, com o que pelo menos o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são vetores virais não-competitivos.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA PRODUZIR EM UMA PLANTA, TECIDO VEGETAL, OU EM CÉLULAS VEGETAIS, UM ANTICORPO COMO UMA PROTEÍNA HETERO-OLIGOMÉRICA QUE COMPREENDE PELO MENOS UMA PRIMEIRA E UMA SEGUNDA SUBUNIDADE PROTEICA (51) Int.CI.: C12N 15/82; C12N 15/67; C12N 15/63 (30) Prioridade Unionista: 28/01/2005 EP 05 001819.1, 28/01/2005 US 60/593.606 (73) Titular(es): ICON GENETICS GMBH (72) Inventor(es): ANATOLY GIRITCH; SYLVESTRE MARILLONNET; VICTOR KLIMYUK; YURI GLEBA

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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO PARA PRODUZIR EM UMA PLANTA, TECIDO VEGETAL, OU EM CÉLULAS VEGETAIS, UM ANTICORPO COMO UMA PROTEÍNA HETERO-OLIGOMÉRICA QUE COMPREENDE PELO MENOS UMA PRIMEIRA E UMA SEGUNDA SUBUNIDADE PROTEICA.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se à produção de proteínas heterooligoméricas em plantas, partes de plantas ou culturas de células vegetais, usando vetores virais com RNA de fita simples, sentido positivo. O processo e os vetores descritos na presente invenção produzem células vegetais com maior rendimento de proteína recombinante heterooligomérica, tal como um anticorpo de comprimento inteiro ou seus derivados sintéticos heterooligoméricos, incluindo fusões com outras proteínas ou seus fragmentos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A lavoura molecular baseada em plantas é uma oportunidade atraente para a produção de proteínas recombinantes destinadas ao uso no campo da saúde humana ou animal, de preferência devido ao custo de produção potencialmente baixo e às tentativas pela indústria farmacêutica de eliminar proteínas derivadas de animais dos processos de fabricação por causa da possível contaminação desses produtos por patógenos humanos, tais como a encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou doença de Creuzfeld-Jacob (CJD, vCJD). Entretanto, a produção com alto rendimento de proteínas heterooligoméricas em células vegetais é um problema que não pode ser solucionado com a ajuda de sistemas de expressão convencionais, baseados no uso de fortes promotores constitutivos ou específicos de tecidos, pelas seguintes razões: primeiramente, a maioria dessas proteínas recombinantes tem um efeito prejudicial sobre o crescimento e desenPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 11/82

2/54 volvimento das plantas, comprometendo muito dessa forma o rendimento; em segundo lugar, o uso de promotores específicos de tecidos (como por exemplo, específicos de sementes) exigiria a incorporação estável de genes que codificam proteínas farmacêuticas no genomas de plantas de culturas comestíveis (como por exemplo, arroz, milho, trigo) que poderiam causar problemas com o controle do fluxo de transgenes no caso de cultivo em campo aberto. Além disso, esses sistemas não são comercialmente viáveis, se usados em ambiente fechado (estufas), devido ao baixo rendimento do produto.

[003] Os sistemas de expressão transiente baseados em vírus (para obter uma revisão, vide: Porta e Lomonossoff, 1966 Mol. Biotechnol. 5:209-221; Yusibov et al., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 240:81-94; Gleba et al., 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7:182-188) são capazes de proporcionar altos níveis de expressão emtecidos de folhas de plantas e, até um certo grau, são capazes de superar os problemas citotoxicidade de proteínas recombinantes e seu efeito prejudicial sobre o desenvolvimento de plantas, pois a tecnologia permite separar os estágios de crescimento e produção. Os sistemas bemestabelecidos e comercialmente viáveis baseiam-se em vetores virais com RNA de fita simples, sentido positivo, de preferência em vetores derivados do vírus mosaico do tabaco (Kumagai et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:427-430; Mallory et al., 2002, Nature Biotechnol. 20:622-625; documentos nos US 5.316.931, US 5.589.367, US 5.866.785, US 5.866.785, US 5.977.438, WO 02088369, WO 02097080, WO 0229068, US 5.491.076). Entretanto, estes sistemas padecem de sérias limitações que restringem seu uso para a produção de proteínas simples relativamente pequenas. Em parte, isso é causado pela instabilidade de vetores virais e pela alta freqüência da sua reversão para o tipo selvagem, caso eles carreguem seqüências heterólogas maiores do que 1 kb. Além disso, uma séria limitação da tecPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 12/82

3/54 nologia é a ausência de sistemas de vetores virais capazes de expressar proteínas heterooligoméricas complexas, tais como anticorpos monoclonais terapêuticos e seus derivados que representam o grupo mais valioso de proteínas recombinantes.

[004] Há apenas uma publicação que trata da expressão de um anticorpo monoclonal de comprimento inteiro em plantas, usando vetores virais vegetais (Verch et al., 1998, J. Immunol. Meth. 220:69-75). Este trabalho descreve o uso de dois vetores virais baseados em TMV sistêmico para a expressão de cadeias pesadas e leves de anticorpo monoclonal em folhas sistêmicas, com o que as diferentes cadeias são expressadas a partir de diferentes vetores após co-infecção de plantas de N. benthamiana com transcritos sintetizados in vitro dos ditos vetores. Entretanto, o rendimento da proteína recombinante no dito sistema é tão baixo que a presença de anticorpo monoclonal montado teve de ser confirmada com testes altamente sensíveis, tais como Western blotting e ELISA. Devido ao rendimento desprezível do anticorpo recombinante, este sistema não é apropriado para aplicações práticas e não tem qualquer valor comercial. Como dois ou mais vetores virais baseados em TMV não estão normalmente presentes nos mesmos tecidos vegetais de uma planta infectada (vide Exemplo 1), a atividade de ligação detectada do antígeno pode ser dever ao anticorpo que foi montado in vitro durante o procedimento de isolamento a partir de cadeias pesadas e leves do anticorpo expressadas em células ou tecidos separados. Demonstrou-se anteriormente que anticorpos funcionais podem ser montados in vitro a partir de componentes de anticorpos desnaturados e reduzidos (Petersen e Dorrington, 1974, J. Biol. Chem. 17:5633-5641; Maeda et al., 1996, Protein Engineering 9:95-100). Entretanto, a eficiência de tal montagem na ausência de condições favoráveis para tal montagem é muito baixa.

[005] Portanto, não há qualquer sistema de expressão em larga

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4/54 escala para proteínas heterooligoméricas recombinantes em plantas, cujo rendimento e eficácia fossem suficientes para competir no mercado com outros sistemas de expressão em larga escala, tais como sistemas de expressão em células de fungos ou insetos. Tal expressão em plantas preencheria os seguintes critérios como tão boa quanto possível:

[006] alto rendimento, inclusive a expressão da proteína heterooligomérica de interesse no maior número possível de tecidos vegetais e no maior número possível de células dos ditos tecidos;

[007] para impedir um efeito prejudicial da expressão de proteína recombinante sobre o crescimento da planta, a expressão da proteína ou do produto de interesse deve ser transiente (ou comutável), de tal modo que a expressão possa der iniciada em um estágio desejado do desenvolvimento da planta;

[008] produzir uma proporção ideal de poliproteínas que codificam diferentes subunidades da proteína heterooligomérica na célula vegetal, proporcionando assim o alto rendimento da proteína recombinante no nível da dita montagem da proteína recombinante a partir das ditas subunidades.

[009] Portanto, é um objetivo desta invenção disponibilizar um processo eficiente para produzir uma proteína heterooligomérica em uma planta, parte de planta, ou cultura de células vegetais. Um outro objetivo da invenção é a disponibilização de um sistema de expressão com alto rendimento, capaz de expressar a proteína heterooligomérica. Outro objetivo da invenção é disponibilizar um processo eficiente para co-expressar mais do que um polipeptídeo de interesse na mesma célula vegetal. Além disso, é um objetivo da invenção fornecer um método rápido e com alto rendimento para expressar anticorpos em uma planta, parte de planta ou cultura de células vegetais. DESCRIÇÃO GERAL DA INVENÇÃO

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5/54 [0010] A invenção fornece um processo para produzir em uma planta, parte de planta, ou em células da planta, uma proteína heterooligomérica que compreende uma primeira e uma segunda subunidade da proteína, sendo que o dito processo compreende expressar nas células da planta pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidades da proteína [0011] disponibilizando para a dita planta, o dito tecido da planta ou as ditas células da planta, um primeiro e um segundo vetor viral com RNA de fita simples, sentido positivo, sendo que o dito primeiro vetor viral codifica pelo menos a dita primeira subunidade da proteína, o dito segundo vetor viral codifica pelo menos a dita segunda subunidade da proteína, com o que pelo menos o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são vetores virais não-competitivos; ou [0012] disponibilizando para a dita planta, o dito tecido da planta ou as ditas células da planta, um primeiro e um segundo vetor viral com RNA de fita simples, sentido positivo que codifica pelo menos a dita primeira subunidade e dita segunda subunidade da proteína.

[0013] Em uma modalidade, o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são não-competitivos pelo fato de que são vetores virais diferentes. Em outra modalidade, o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são não-competitivos pelo fato de que eles não são derivados a partir do mesmo RNA vírus. Em outra modalidade, o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são nãocompetitivos pelo fato de que eles diferem em uma parte da seqüência que não as partes das seqüências que codificam as ditas primeira e segunda subunidades da proteína. Em outra modalidade, o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são não-competitivos pelo fato de que eles são derivados dos RVA vírus pertencentes a espécies virais diferentes. Em outra modalidade, o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são não-competitivos pelo fato de que eles são

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6/54 derivados dos RVA vírus pertencentes a gêneros virais diferentes. [0014] Outra modalidade da invenção é um processo para produzir em uma planta, em tecido vegetal, ou em células vegetais, um anticorpo que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda subunidades da proteína, tal como uma cadeia pesada e uma cadeia leve do anticorpo, sendo que o dito processo compreende expressar em células vegetais pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidades da proteína, [0015] disponibilizando para a dita planta, para o dito tecido vegetal ou para as ditas células vegetais, por transfecção mediada por Agrobacterium, um precursor de DNA de um primeiro vetor viral com RNA de fita simples, sentido positivo e um precursor de DNA de um segundo vetor viral de RNA de fita simples, sentido positivo, sendo que o dito primeiro vetor viral codifica pelo menos a dita primeira subunidade da proteína, o dito segundo vetor viral codifica pelo menos a dita segunda subunidade da proteína, com o que pelo menos o dito primeiro vetor viral ou o dito segundo vetor viral carecem de uma janela aberta de leitura que codifica uma proteína funcional necessária para a movimentação sistêmica do dito primeiro ou do dito segundo vetor viral na dita planta; ou [0016] disponibilizando para a dita planta, para o dito tecido vegetal ou para as ditas células vegetais, por transfecção mediada por Agrobacterium, um precursor de DNA de um vetor viral com RNA de fita simples, sentido positivo que codifica pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidades da proteína, com o que o dito viral carece de uma janela aberta de leitura que codifica uma proteína funcional necessária para a movimentação sistêmica.

[0017] A invenção ainda fornece um processo para produção em uma planta, em tecidos ou plantas ou em células de plantam de uma proteína hetero-oligoméricas compreendendo pelo menos uma primeiPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 16/82

7/54 ra e uma segunda subunidade protéica, o referido processo compreendendo a expressão em células de plantas de pelo menos as referidas primeira e segunda subunidades protéicas a partir de um de mais vetores virais de RNA de fita simples, sentido positivo.

[0018] Outras modalidades da invenção estão descritas nas reivindicações e na descrição que se segue.

[0019] Os inventores da presente invenção identificaram surpreendentemente maneiras para produzir proteínas heterooligoméricas com alto rendimento em plantas, usando vetores virais vegetais. A produção eficiente de proteínas heterooligoméricas em plantas requer a produção com alto rendimento das diferentes subunidades protéicas da proteína heterooligomérica nas mesmas células vegetais. Desta maneira, a proteína heterooligomérica pode ser montada eficientemente em células que expressaram as ditas pelo menos duas subunidades da proteína, usando capacitações de montagem de proteínas naturais das ditas células tais como aquelas do retículo endoplasmático (ER). A montagem ineficiente in vitro da dita proteína heterooligomérica não é, portanto, necessária. A presente invenção conseguiu pela primeira vez a co-expressão eficiente de duas ou mais proteínas nas mesmas células pela etapa (i) acima ou pela etapa (ii) acima ou por uma combinação das etapas (i) e (ii) acima.

[0020] A dita primeira subunidade da proteína é codificada no vetor viral de RNA por uma primeira seqüência (ácido nucléico) heteróloga. A dita segunda subunidade da proteína é codificada no vetor viral por uma segunda seqüência (ácido nucléico) heteróloga. Estas seqüências heterólogas são, assim, seqüências de RNA do dito ou dos ditos vetores virais e compreendem ou codificam tipicamente seqüências reguladoras necessárias para expressar as ditas subunidades da proteína. Os exemplos de tais seqüências reguladoras são promotores subgenômicos, elementos IRES, e seqüências 3' não traduzidas. NesPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 17/82

8/54 te caso, uma seqüência é uma seqüência heteróloga se ela não ocorre naturalmente no vírus a partir do que o dito vetor ou os ditos vetores são derivados.

[0021] A proteína heterooligomérica produzível de acordo com a presente invenção tem pelo menos uma primeira e uma segunda subunidades, com o que a dita primeira e a dita segunda subunidades têm seqüências polipeptídicas diferentes. Assim sendo, a dita primeira e a dita segunda subunidades têm de ser tipicamente expressadas a partir de seqüências de ácidos nucléicos heterólogas diferentes. As subunidades de uma montagem de proteína oligomérica para formar a estrutura quaternária da proteína oligomérica. A montagem das subunidades envolve tipicamente ligações não-covalentes entre as subunidades. Adicionalmente, ligações covalentes podem ser formadas entre as ditas subunidades da proteína, como por exemplo, ligações dissulfeto.

[0022] Em uma modalidade, a dita proteína heterooligomérica é uma proteína heterodimérica, isto é, uma proteína que tem duas subunidades protéicas diferentes. Em outra modalidade, a dita proteína heterooligomérica pode ter mais do que duas subunidades protéicas, 3 ou 4 subunidades diferentes (proteína heterotrimérica ou heterotetramérica, respectivamente). Em uma outra modalidade, a dita proteína heterooligomérica pode ter duas subunidades diferentes, com o que uma ou ambas das ditas subunidades podem estar presentes na dita proteína heterooligomérica mais do que uma vez. Os exemplos da organização das subunidades da dita proteína heterooligomérica são AaBb, AaBbCc e AaBbCcDd, onde A representa uma primeira subunidade da proteína, B representa uma segunda unidade da proteína, e C e D representam outras subunidades da proteína. Cada letra maiúscula A, B, C e D representa subunidades protéicas diferentes das outras subunidades da proteína, e as letras minúsculas representam números

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9/54 inteiros de pelo menos 1, que indicam o número de cópias da respectiva subunidade da proteína na dita proteína heterooligomérica. Um exemplo de anticorpos de IgG que têm a organização de subunidades A2B2, onde A representa uma primeira subunidade da proteína (por exemplo, a cadeia pesada), e B representa uma segunda subunidade da proteína (por exemplo, a cadeia leve). De preferência, a proteína heterooligomérica produzida de acordo com a invenção tem duas ou três subunidades diferentes da proteína, mais preferivelmente, ela tem duas subunidades diferentes da proteína.

[0023] No processo da invenção, pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidades da proteína são expressadas em células da dita planta, do dito tecido da planta ou das células da dita planta, pela dita etapa (i) e/ou pela dita etapa (ii). Cada uma das ditas etapas (i) e (ii) permite a expressão de pelo menos a dita primeira subunidade e a dita segunda subunidade da proteína. nas mesmas células, de tal modo que a dita proteína heterooligomérica possa ser produzida eficientemente nas ditas células. As etapas (i) e (ii) podem ser realizadas em paralelo, eminentemente para a produção de proteínas heterooligoméricas que têm três, quatro ou mais subunidades diferentes da proteína (vide Exemplo 7).

[0024] O dito vetor viral ou vetores virais de RNA viral sentido positivo da invenção são também aqui referidos como vetor viral. Tipicamente, os ditos vetores virais de RNA de fita simples, sentido positivo são derivados de vírus de RNA vegetal de fita simples, sentido positivo.

[0025] Na etapa (ii), o dito tecido vegetal ou as ditas células vegetais são dotadas de um vetor viral de RNA de fita simples, sentido positivo, que codifica pelo menos a dita primeira subunidade e a dita segunda subunidade da proteína. O dito vetor viral que codifica pelo menos a dita primeira subunidade e a dita segunda subunidade da proteíPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 19/82

10/54 na contém, como uma inserção, uma primeira seqüência heteróloga que codifica a expressão da dita primeira subunidade da proteína, que pode ficar sob o controle de um primeiro promotor subgenômico. Além disso, o dito vetor viral contém, como uma inserção, uma segunda seqüência heteróloga que codifica a expressão da dita segunda subunidade da proteína, que pode ficar sob o controle de um segundo promotor subgenômico. Caso ambas ditas primeira e segunda subunidades da proteína sejam expressadas sob o controle de um promotor subgenômico, estes promotores subgenômicos, de preferência, diferem em seqüência para evitar auto-homologia no dito vetor viral, o que poderia levar a episódios de recombinação indesejados em células vegetais. Tais promotores subgenômicos diferentes podem ser retirados de cepas ou espécies diferentes de um vírus vegetal, como por exemplo, um promotor subgenômico pode ser (ou pode ser derivado de) o promotor subgenômico da proteína de revestimento (CP) do vírus mosaico do tabaco (TMV) U1 e o outro promotor subgenômico pode ser (ou ser derivado de) o promotor subgenômico da proteína de revestimento de TMV U5 ou do tobamovírus que infecta crucíferas (crTMV).

[0026] Em vez do dito primeiro ou do dito segundo promotor subgenômico, a tradução da dita primeira ou segunda subunidade da proteína pode ficar sob o controle de um elemento IRES (sítio de entrada de ribossoma interno). Embora a tradução da dita primeira subunidade da proteína e também da dita segunda unidade da proteína possa ficar sob o controle de elementos IRES, prefere-se que pelo menos uma das ditas subunidades da proteína seja expressada usando um promotor subgenômico. Os elementos IRES para uso na presente invenção podem ser retirados de vírus vegetais tais como TMV ou outros vírus de plantas (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5301-6 (2002); 1999, Virology 263:139-54; documento no WO 03020927; documento no WO

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0229068).

[0027] O dito vetor viral da etapa (ii) é, de preferência, incapaz de movimentação sistêmica na dita planta ou no dito tecido vegetal. Isto pode ser conseguido, por exemplo, omitindo uma origem funcional da montagem da partícula viral. No tobamovírus, por exemplo, a origem da montagem da partícula viral fica localizada no ORF de MP. Assim sendo, a origem da montagem da partícula viral pode ser omitida deletando total ou parcialmente a ORF de MP do dito vetor viral. O dito vetor viral é, assim, isento de uma proteína de movimentação funcional necessária para a movimentação sistêmica do dito vetor viral. Nesta modalidade, o dito vetor viral pode ser isento de uma ORF de proteína de movimentação funcional, e mais preferivelmente, o dito vetor viral é isento de uma ORF de proteína de movimentação funcional e também de uma ORF de proteína de revestimento funcional. Omitindo uma ORF de MP e/ou uma ORF de CP do vetor viral proporciona-se mais espaço para codificar pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidade da proteína no dito vetor viral, sem comprometer a estabilidade do vetor viral. Nesta modalidade, o dito vetor viral é, de preferência, disponibilizado para muitas células da dita planta ou do dito tecido da planta para conseguir a infecção de muitas células. Isto pode ser mais bem conseguido disponibilizando um precursor de DNA do dito vetor viral de rNA como T-DNA, usando Agrobacterium (vide abaixo). [0028] O vírus do dito vetor viral para a etapa (ii) é derivado de ou pode ser qualquer RNA vírus vegetal de fita simples plus sense, como por exemplo, aqueles listados no capítulo Descrição Detalhada da Invenção. Os grupos preferidos de vírus são tobamovírus, potexvírus e potivírus. Os vírus mais preferidos são TMV e PVX. O dito vetor viral deve conter pelo menos as janelas abertas de leitura (ORFs) do vírus do qual ele é derivado, que codificam as proteínas necessárias para a replicação do dito vetor viral. O dito vetor viral contém ainda tipicamenPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 21/82

12/54 te elementos reguladores para a replicação viral e pelo menos um promotor subgenômico.

[0029] Na etapa (i), o dito tecido vegetal ou as ditas células vegetais são dotadas de um primeiro e um segundo vetor viral com RNA de fita simples, sentido positivo. O dito primeiro vetor viral codifica pelo menos a dita primeira subunidade da proteína, e o dito segundo vetor viral codifica pelo menos a dita segunda subunidade da proteína.

[0030] A etapa (i) permite produzir proteínas heterooligoméricas que têm duas subunidades protéicas diferentes. A etapa (i) permite também produzir proteínas heterooligoméricas que têm mais do que duas subunidades diferentes, como por exemplo, três ou quatro subunidades protéicas diferentes. Neste caso, a dita planta, o dito tecido vegetal ou as células vegetais podem ser dotadas de um primeiro, um segundo e um terceiro vetor viral (e opcionalmente, um outro vetor viral), cada um codificando uma das ditas subunidades protéicas diferentes. Caso três ou quatro subunidades protéicas diferentes tenham de ser expressadas na etapa (i), os respectivos três ou quatro vetores virais são, de preferência, todos eles, vetores virais não-competitivos entre si. No caso de três vetores virais, o primeiro vetor viral pode ser derivado de um tobamovírus, o segundo vetor viral pode ser derivado de um potivírus, e o terceiro vetor viral pode ser derivado de um potexvírus.

[0031] Dois vetores virais são não-competitivos caso eles possam expressar eficientemente as subunidades da proteína na mesma célula vegetal (co-expressão). A co-expressão requer que pelo menos dois vetores virais diferentes não se derrotem durante a replicação antes de terem expressado quantidades substanciais das seqüências heterólogas que eles codificam. Quanto mais altas as diferenças das seqüências no nível do RNA dos ditos pelo menos dois vetores virais, mais eles são não-competitivos nas mesmas células vegetais. O dito primeiPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 22/82

13/54 ro vetor viral e o dito segundo vetor viral são vetores virais nãocompetitivos, pois o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são vetores virais diferentes.

[0032] Para serem não competitivos, o dito primeiro e o dito segundo vetores virais (os ditos dois vetores virais não-competitivos) diferem, em uma modalidade geral, pelo menos em uma parte da seqüência que não as ditas seqüências heterólogas que codificam as ditas subunidades da proteína. De preferência, tal diferença em uma parte da seqüência que não as ditas seqüências heterólogas é uma parte da seqüência derivada de um vírus com RNA vegetal, tal como a parte da seqüência envolvida em uma função viral, tal como a replicação viral em células vegetais (por exemplo, uma seqüência que codifica uma replicase), tradução de uma proteína viral (como por exemplo, um promotor subgenômico) ou movimentação viral de célula para célula ou de longas distâncias.

[0033] Para serem não competitivos, o dito primeiro e o dito segundo vetores virais (os ditos dois vetores virais não-competitivos) são, em outra modalidade geral, derivados de vírus vegetais diferentes. Em um exemplo desta modalidade, os ditos pelo menos dois vetores virais não-competitivos não são derivados de vírus da mesma cepa viral. Em outro exemplo, os ditos pelo menos dois vetores virais nãocompetitivos não são derivados de vírus da mesma espécie viral. Em um outro exemplo, os ditos pelo menos dois vetores virais nãocompetitivos não são derivados de vírus do mesmo gênero de vírus. Assim sendo, o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são, de preferência, derivados de vírus de cepas diferentes, mais preferivelmente, de vírus de espécies diferentes, e com a maior preferência, de vírus de gêneros diferentes.

[0034] O dito primeiro vetor viral pode ser derivado de um vírus pertencente ao gênero Potexvírus e o dito segundo vetor viral pode ser

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14/54 derivado de um vírus pertencente ao gênero Potyvírus. Especificamente, o dito primeiro vetor viral pode ser derivado do vírus X da batata e o dito segundo vetor viral pode ser derivado do vírus Y da batata.

[0035] No caso de um vetor potiviral, a dita subunidade da proteína pode ser expressada como uma fusão com uma poliproteína viral, com o que uma subunidade da proteína da invenção pode ser separada da dito poliproteína por um sítio de reconhecimento de protease potiviral.

[0036] Em outra modalidade, o dito primeiro vetor viral pode ser derivado de um vírus pertencente ao gênero Potexvírus e o dito segundo vetor viral pode ser derivado de um vírus pertencente ao gênero Tobamovírus. Especificamente, o dito primeiro vetor viral pode ser derivado do vírus X da batata e o dito segundo vetor viral pode ser derivado do vírus mosaico do tabaco.

[0037] Ser derivado de significa que o vetor viral contém elementos genéticos ou partes da seqüência do vírus do qual ele é derivado. Em uma modalidade, o dito vetor viral ou os ditos vetores virais contêm uma ORF (janela aberta de leitura) de uma replicase retirada de um RNA vírus. Em outra modalidade, um vetor viral contém uma ORF de proteína de movimentação de um RNA vírus e, opcionalmente, também uma ORF de replicase. Os elementos genéticos virais retirados de um RNA vírus podem, caso desejado, ser mutados, por exemplo, para introduzir os sítios de restrição necessários para clonagem do vetor viral.

[0038] Uma modalidade na qual o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral são, ambos, baseados no vetor viral do mosaico de tabaco, TMV 30 B, está excluída de etapa (i) do processo da invenção, pois neste caso o dito primeiro vetor viral e o dito segundo vetor viral não são vetores virais diferentes, mas são os mesmos vetores virais (cf. Verch et al., 1998, J. Immunological Methods 69-75).

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15/54 [0039] Os ditos primeiro e segundo vetores virais (os ditos vetores virais não-competitivos) têm, de preferência, uma homologia de seqüências no nível do RNA de no máximo 90%, mais preferivelmente de no máximo 80%, ainda mais preferivelmente, de no máximo 70%, e com a maior preferência, de no máximo 60%. Mais especificamente, qualquer segmento das seqüências do dito primeiro vetor viral de 100 bases tem a homologia de seqüência a qualquer segmento da seqüência de 100 bases do dito segundo vetor viral de no máximo 80%, ainda mais preferivelmente, de no máximo 70%, e com a maior preferência, de no máximo 60%.

[0040] Em uma modalidade, a ORF de replicase (ou ORFs, se a replicase é codificada por mais de uma ORF) do referido primeiro vetor viral e a ORF de replicase (ou ORFs, se a replicase é codificada por mais de uma ORF) do referido segundo vetor viral apresentam homologia de no máximo 90%, preferencialmente de no máximo 80%, mais preferencialmente de no máximo 70%, e mais preferencialmente ainda de no máximo 60%. Em outra modalidade, a ORF de replicase do referido primeiro vetor viral e a ORF da replicase do referido segundo vetor viral apresenta uma identidade de no máximo 85%, preferencialmente de no máximo 75%, mais preferencialmente de no máximo 65%, mais preferencialmente ainda de no máximo 55%.

[0041] Na etapa (i), o referido primeiro vetor viral preferencialmente contém uma primeira seqüência heteróloga codificando a expressão da referida primeira subunidade protéica, a qual pode estar sob controle de um primeiro promotor sub-genômico. O referido segundo vetor genômico contém uma segunda seqüência heteróloga codificando a expressão da referida segunda subunidade protéica, a qual pode estar sob controle de um segundo promotor sub-genômico. Um ou ambos referidos promotores sub-genômicos podem ser substituídos por um elemento IRES. Similarmente ao descrito acima para a etapa (ii), se

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16/54 ambas referidas primeira e segunda subunidades protéicas são expressas sob controle de um promotor sub-genômico, esses promotores sub-genômicos preferencialmente diferem em suas seqüências para evitar homologia entre os referidos primeiro e segundo vetores virais (e qualquer outro vetor viral), que pode levar a eventos de recombinações indesejadas em células de planta. Tais promotores subgenômicos diferentes podem ser obtidos a partir de diferentes cepas ou espécies de vírus de planta, por exemplo, um promotor pode ser o promotor sub-genômico da proteína capsídial (CP) do vírus do mosaico do tabaco (TMV) U1 e o outro promotor sub-genômico pode ser o promotor sub-genômico do TMV U5 ou tobamovírus que infecta crucíferas (cr-TMV).

[0042] Como as ORFs de vírus vegetais, que são necessárias para a movimentação de célula para célula ou de longas distâncias, podem ser omitidas depois de construir os vetores virais da invenção, a parecença dos ditos vetores virais não-competitivos pode ser determinada comparando as ORFs de replicase dos ditos vetores virais.

[0043] A dita primeira e a dita segunda seqüências heterólogas, que codificam a dita primeira e a dita segunda subunidades de proteína, respectivamente, podem ser adicionadas como uma seqüência adicional aos ditos vetores virais. As ditas seqüências heterólogas são, de preferência, adicionadas de tal modo que um alto nível de expressão seja atingido. Para este propósito, a dita seqüência heteróloga é adicionada na extremidade 3' do vírus, pois a ORF de 3' é freqüentemente a ORF que é expressada no nível mais alto em muitos vírus. De preferência, entretanto, as ditas seqüências heterólogas substituem uma seqüência nativa para o dito vírus, como por exemplo, a ORF de 3' do dito vírus que é a ORF de CP em muitos vírus, tais como os tobamovírus. Assim sendo, o dito primeiro e/ou o dito segundo vetores virais, de preferência, carecem de uma ORF para a movimentação sisPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 26/82

17/54 têmica do dito vetor viral. Os ditos vetores virais podem carecer de uma ORF para movimentação de célula para célula, tais como a ORF de MP nos tobamovírus.

[0044] Nesta invenção, a etapa (i) e a etapa (ii) podem ser combinadas, primordialmente para expressar três ou mais subunidades diferentes de uma proteína heterooligomérica. Caso uma proteína heterooligomérica com quatro subunidades diferentes vá ser produzida, duas subunidades da proteína podem ser expressadas de acordo com a etapa (i) e duas outras subunidades da proteína podem ser produzidas nas células de uma planta ou tecido da planta de acordo com a etapa (ii). De preferência, entretanto, duas subunidades da proteína podem ser expressadas a partir de um primeiro vetor viral e duas subunidades da proteína podem ser expressadas a partir de um segundo vetor viral que é não-competitivo com o primeiro vetor viral. Caso uma proteína heterooligomérica que tem três subunidades diferentes vá ser produzida, as ditas três subunidades da proteína podem ser expressadas de acordo com a etapa (i), expressando duas proteínas a partir de um primeiro vetor viral similarmente ao que foi descrito na etapa (ii) e expressando uma terceira subunidade da proteína a partir de um vetor viral não-competitivo.

[0045] Os vetores virais da invenção são tipicamente arquitetados no nível de DNA. Caso os ditos vetores virais sejam fornecidos para células de uma planta ou para células de um tecido vegetal como vetores virais de RNA, o dito DNA pode ser transcrito in vitro para os ditos vetores virais de RNA, por exemplo, usando uma polimerase bacteriófaga, tal como T7 polimerase, junto com um promotor apropriado. Dois vetores virais diferentes são, de preferência, aplicados à dita planta como uma mistura para assegurar que sejam fornecidos ambos vetores virais para as células da dita planta. De preferência, entretanto, os vetores virais da invenção são fornecidos para as células de uma planPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 27/82

18/54 ta ou para células do tecido da planta transformando a dita planta ou o tecido da planta com precursores de DNA dos ditos vetores virais de RNA. Os ditos precursores de DNA têm um promotor transcricional ativo em células da dita planta, para formar os ditos vetores virais por transcrição dos ditos precursores de DNA. Mais preferivelmente, os ditos precursores de DNA são T-DNA em plasmídeos Ti de Agrobacterium. Dois ou mais vetores virais podem ser então fornecidos para a dita planta ou tecido da planta, tratando a dita planta com uma mistura (por exemplo, uma suspensão) de duas ou mais cepas de Agrobacterium, com o que cada cepa contém um T-DNA que codifica um vetor viral específico. Tratar partes substanciais de uma planta com tal suspensão de Agrobacterium pode substituir a função de movimentação sistêmica e/ou a função de movimentação de célula para célula de vírus de plantas naturais.

[0046] A transfecção transiente da dita planta, tecido de planta ou células da planta com precursores de DNA dos ditos vetores virais por meio de Agrobacterium é mais preferida na presente invenção. Entretanto, os ditos precursores de DNA dos ditos vetores virais podem ser incorporados de forma estável no DNA cromossômico da planta. A liberação do dito vetor viral ou dos ditos vetores virais a partir do DNA cromossômico pode ser controlada por promotores induzíveis.

[0047] Caso os ditos vetores virais sejam fornecidos para a dita planta por meio de precursores de DNA, prefere-se que sejam tomadas medidas para melhorar a eficiência da transferência dos ditos vetores virais dos núcleos das células, onde eles são transcritos, para o citoplasma, onde os ditos vetores virais se replicam. Isto pode ser conseguido incluindo íntrons nos ditos precursores de DNA, primordialmente nas ORFs de replicase dos vetores virais, como descrito detalhadamente no pedido de patente internacional no PCT/EP05/000492, publicado como documento no WO 2005/71090, que é aqui incorporaPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 28/82

19/54 do como referência.

[0048] O processo da invenção pode ser aplicado a qualquer planta para a qual os sistemas de expressão viral vegetal existem ou serão elaborados no futuro. A dita planta pode ser um monocotilédone ou dicotilédone. Dentre os dicotilédones, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopododiaceae e Legume são preferidos. Dentre as solanáceas, o gênero Nicotiana, tal como N. tabacum ou N. benthamiana é preferida. Outras plantas preferidas são Medicago sativa e espécies Beta, tal como Beta vulgaris.

[0049] O processo da invenção é usado para produzir proteínas heterooligoméricas em sistemas vegetais. As proteínas heterooligoméricas preferidas são imunoglobulinas, tais como as imunoglobulinas das seguintes classes: imunoglobulina G, imunoglobulina A, imunoglobulina M, imunoglobulina D, e imunoglobulina E. Estas imunoglobulinas podem compreender pelo menos uma parte de um domínio ligante de antígeno. Conforme o caso requeira, estas imunoglobulinas produzidas de acordo com a invenção podem ser modificadas em relação às imunoglobulinas animais nativas, desde que elas compreendam pelo menos duas subunidades diferentes da proteína. A imunoglobulina pode compreender uma proteína protetora em associação com uma cadeia pesada de imunoglobulina, onde a proteína protetora compreende uma parte de um receptor de imunoglobulina. Outra proteína heterooligomérica preferida é insulina.

[0050] A proteína heterooligomérica da invenção pode ser modificada de muitas maneiras em relação à proteína nativa, conforme requeira o caso. Na proteína heterooligomérica, uma seqüência líder nativa que forma um sinal de secreção de uma ou mais subunidades da proteína heterooligomérica nativa pode ser substituída por peptídeos sinalizadores específicos de plantas. Os ditos peptídeos sinalizadores específicos de plantas podem ser derivados de calreticulina do tabaco

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20/54 e/ou de alfa-amilase do arroz. Pelo menos uma ou pelo menos duas ou mais subunidades da dita proteína heterooligomérica podem conter um sinal de retenção do retículo endoplasmático, KDEL, para melhorar a montagem da dita proteína heterooligomérica a partir das ditas subunidades em células vegetais. Além disso, as ditas seqüências heterooligoméricas que codificam as ditas subunidades da proteína podem ser mutadas para remover parcial ou completamente os sítios de glicosilação da dita proteína heterooligomérica. Além disso, o padrão de glicosilação da proteína heterooligomérica a ser expressada pode ser mudado, por exemplo, arquitetando um componente do maquinismo de glicosilação da planta, tais como uma ou mais glicosil transferases. [0051] A proteína heterooligomérica da invenção pode ser isolada a partir da planta, tecido da planta ou células da planta depois da expressão, de acordo com procedimentos geralmente conhecidos. A dita proteína heterooligomérica pode ser então purificada até uma homogeneidade substancial, estado este que pode ser definido de tal modo que as bandas devidas à dita proteína heterooligomérica em SDSPAGE corado com Coomassie representem pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80%, e mais preferivelmente pelo menos 90% da coloração de uma fileira, como determinado por uma leitora de gel convencional.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0052] A figura 1 (A) ilustra um padrão de distribuição da expressão de GFP e DsRed a partir de dois vetores baseados em TMV diferentes em folhas de N. benthamiana. Fotografia à esquerda: o ponto de luz na lateral esquerda no topo é a fluorescência GFP de uma ára infiltrada com pICH17272. O ponto de luz fracamente claro abaixo é a fluorescência vermelha de uma área infiltrada com o vetor pICH18505. O ponto de luz na lateral direita no fundo da fotografia da esquerda é uma área infiltrada com pICH17272 + pICH18505. As fotografias no

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21/54 lado direito ilustram protoplastos isolados a partir de uma área da folha co-infiltrada com dois vetores diferentes (topo: protoplastos sob condições de detecção de fluorescência GFP; quadro do fundo: os mesmos protoplastos quadro do fundo: os mesmos protoplastos sob condições de detecção de fluorescência DsRed).

[0053] (B) é uma representação esquemática de regiões do TDNA de PICH17272 e pICH18505. P - promotor da transcrição; T - região da terminação da transcrição; RdRP - RNA polimerase dependente de RNA viral; MP - proteína de movimentação viral; 3'NTR - região não-traduzida de 3' viral; Cr-Sgp - região do promotor subgenômico de CP de cepa TMV; GOI - gene de interesse.

[0054] (C) são representações esquemáticas de mapas de restrição das regiões do T-DNA de PICH17272 e pICH18505.

[0055] A figura 2 representa uma representação esquemática de uma região do T-DNA de um vetor viral desenhado para co-expressão de dois transgenes diferentes (GOI-1 e GOI-2) de promotores subgenômicos diferentes. P - promotor da transcrição; T - região da terminação da transcrição; RdRP - RNA polimerase dependente de RNA viral; MP - proteína de movimentação viral; 3'NTR - região não-traduzida de 3' viral; Cr-Sgp - região do promotor subgenômico de CP de cepa crTMV; GOI - gene de interesse.

[0056] A figura 3(A) representa representações esquemáticas de regiões do T-DNA das construções pICH17388, pICH17123, pICH15933, pICH7410, pICH10580, pICH10881, e pICH10745. RS sítio de recombinação reconhecido por PhiC31 integrase. As barras verticais cinza indicam íntrons.

[0057] (B) representa mapas de restrição das regiões do T-DNA de pICH17388, pICH17123, pICH15933.

[0058] (C) representa mapas de restrição das regiões do T-DANA de pICH7410, pICH10580 e pICH10745.

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22/54 [0059] A figura 4 ilustra microfotografias de microscópio de fluorescência de uma região da folha de N. benthamiana, 6 dias depois da distribuição de precursores do DNA de Agrobacterium, pICH 17388 e pICH15933, junto com uma fonte de recombinase. RS - sítio de recombinação reconhecido por PhiC31 integrase.

[0060] A figura 5 representa representações esquemáticas de regiões do T-DNA de sistemas de vetores diferentes para a expressão de cadeias pesada e leve de um anticorpo. RS - sítio de recombinação reconhecido por PhiC31 integrase.

[0061] A figura 6 ilustra um Western blot da expressão de uma IgG em folhas de Nicotiana benthamiana, usando um sistema pró-vetor viral.

[0062] A separação eletroforética de TSP foi conduzida sobre um gel a 12% sob condições não-redutoras. A detecção da proteína expressada foi realizada com fração de IgG não-humana de conjugado do coelho com HRP (Sigma) diluído 6 x 103.

[0063] Fileira 1 - tecido de folha não-infectado;

[0064] Fileira 2 - cadeia pesada de IgG expressada em Cytosol (pICH 17388);

[0065] Fileira 3 - cadeias pesada e leve de IgG, co-expressão com construções de promotores 35S (pIC0123+pICH19846);

[0066] Fileira 4 - igual à Fileira 3 com P19 (pICH6692);

[0067] Fileira 5 - GFP expressada com construções de vetores

35S e P19 ((pICH5290+pICH6692);

[0068] Fileira 6 - cadeias pesada e leve de IgG, co-expressão com construção bicistrônica pICH19860;

[0069] Fileira 7 - cadeias pesada e leve de IgG, co-expressão com construção bicistrônica pICH19860 (pró-vetor 5' pICH17123 deficiente em MP, MP em trans pICH10745);

[0070] Fileira 8 - GFP e dsRed co-expressadas em Cytosol, MP

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23/54 disponibilizada em trans (pICH17123 + pICH19919 + pICH10745). [0071] A figura 7 representa representações esquemáticas de regiões do T-DNA que codificam vetores virais não-competitivos desenhados para a co-expressão de subunidades diferentes de proteína, de interesse, na mesma célula vegetal. P - promotor da transcrição; T região da terminação da transcrição; RdRP - RNA polimerase dependente de RNA do vírus mosaico do tabaco; PVX RdRP - RNA polimerase dependente de RNA viral do vírus X da batata; MP - proteína de movimentação viral; 3'NTR - região não-traduzida de 3' viral; Cr-Sgp região do promotor subgenômico de CP da cepa cr TMV; GOI - gene de interesse que codifica uma subunidade protéica de interesse.

[0072] A figura 8 representa uma representação esquemática da região do T-DNA do vetor binário pIC0130.

[0073] A figura 9 ilustra a co-expressão de GFP e dsRed em células vegetais, usando vetores baseados em TMV (piCH17388+pICH10580 e PVX (pIC0130): visualização de GFP e dsRed em protoplasto isolado a partir de folhas de N. benthamiana inoculada com Agrobacterium.

[0074] A figura 10(A) representa uma representação esquemática das regiões do T-DNA de vetores binários, pICH17620, pICH20431, pICH21240, pICH20421 e pICH21370.

[0075] (B) é uma representação esquemática de regiões do TDNA de vetores binários pICH11599, pICH21910 e pICH21920.

[0076] (C) é uma representação esquemática de regiões do TDNA de vetores binários pICH21282, pICH10990, pICH222250 e pICH22240, Lv e Lc - regiões variáveis e conservativas da cadeia leve; Hv e Hc - regiões variáveis e conservativas da cadeia pesada.

[0077] (D) é uma representação esquemática do esquema de clonagem para o pró-vetor pICH21380 derivado de PVX.

[0078] A figura 11 (a) ilustra os resultados de um teste ELISA para

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24/54 a determinação dos níveis de co-expressão de cadeias leve e pesada de IgG, usando vetores PVX e crTMV. A numeração das cavidades da placa de cultura de tecido à esquerda corresponde à numeração das barras no histograma. O histograma indica a OD das cavidades a 405 nm.

[0079] 1,2 - tecido vegetal não-infectado;

[0080] 3, 4, 5 - calreticulina SP - Cadeia Pesada em PVX (pICH21240 - 1,5 - e 14 clones, respectivamente);

[0081] 6, 7, 8 - calreticulina SP- Cadeia Leve (LC) de IgG em PVX (deleção no terminal N, pICH21370-18, 19, 31, respectivamente);

[0082] 9, 10, 11 - calreticulina SP- Cadeia Leve (LC) de IgG em

PVX (pICH21370-40, 44, 45, respectivamente);

[0083] 12 - controle sem nada (nenhum extrato de proteína vegetal aplicado);

[0084] 13, 14, 15 - calreticulina SP- Cadeia Pesada (HC) de IgG em PVX (pICH21240-1, 5 e 14 clones, respectivamente), coexpressada com calreticulina SO - Cadeia Leve de IgG em crTMV (pICH17620+ pICH10881+pICH20431);

[0085] 16, 17, 18 - calreticulina-LC de IgG em PVX (deleção no terminal N, pICH21370 -18, 19, 31, respectivamente), co-expressada com calreticulina-HC em crTMV (pICH17620+pICH10881+pICH20421);

[0086] 19, 20, 21 - calreticulina SP-LC de IgG em PVX (pICH21370 -40, 44, 45, respectivamente), co-expressada com calreticulina SP-Cadeia Pesada em vetor baseado em crTMV (pICH17620+pICH10881+pICH20421);

[0087] 22 - GFP expressada com PVX (pIC0130);

[0088] 23 - GFP expressada com PVX (pICH20799);

[0089] 24 - calreticulina SP- Cadeia Leve (LC) de IgG expressada a partir de crTMV sozinho (pICH17620+pICH10881+pICH20431);

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25/54 [0090] 25 - calreticulina SP- Cadeia Pesada de IgG expressada a partir de vetor baseado em crTMV (pICH17620+pICH10881+pICH20421);

[0091] 26 - Cadeias Leve e Pesada de IgG expressadas sob o controle de promotor 35S forte na presença de supressor de PTGS, P19;

[0092] 27 - Cadeias Leve e Pesada de IgG, co-expressão a partir de vetor baseado em crTMV (pICH17388+pICH10881=pICH20421); [0093] 28 - Co-expressão de Cadeias Leve e Pesada a partir de vetor baseado em crTMV (pICH17388+pICH10881=pICH20241), MP (pICH10745) dispobilizado em trans;

[0094] - valor de OD450 bem acima de valores mensuráveis.

[0095] A figura 11(b) ilustra a análise eletroforética e Western blot de anticorpos anticâncer expressados em folhas de N. benthamiana. [0096] Acumulação de cadeias pesada e leve de um anticorpo anticâncer em folhas de Nicotiana banthamiana co-infectadas com próvetores de TMV e PVX. A cadeia leve é expressada com PVX e a cadeia pesada com TMV. As proteínas são separadas em gel de poliacrilamida a 12%, sob condições redutoras. O quadro superior ilustra a coloração com Coomassie; o quadro do meio ilustra uma Western blot com anticorpos caprinos (específicos de cadeia gama) anti-IgG humana conjugados com HRP (Sigma); o quadro inferior uma Western blot com anticorpos leporídeos (específicos de cadeia lambda) anti-IgG humana conjugados com HRP (Sigma); Uninf, tecido não-infectado; 211, dias após inoculação; S, mab (anticorpo monoclonal) anticâncer (6 dpi); HC, cadeia pesada expressada isoladamente com pró-vetores de TMV ( 6 dpi).

[0097] Purificação de mab anticâncer usando contas magnéticas de Proteína A (NEB). (A) mabs derivado de planta (fileira 1) e padrão (fileira 2), migrando em gel de poliacrilamida a 12% sob condições

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26/54 não-redutoras sobre gel corado com Coomassie.

[0098] Acumulação de mab anticâncer montado em folhas de Nicotiana benthamiana co-infectadas com pró-vetor de TMV que expressa HC, e o pró-vetor de PVX que expressa LC. As proteínas são separadas em gel de poliacrilamida a 12% sob condições não-redutoras. A Western blot foi sondada com anticorpos caprinos anti-IgG humana (específicos de cadeia gama). Uninf, tecido não-infectado; 2-11, dias após inoculação; S, padrão mab anticâncer; LC, cadeia leve expressada unicamente com pró-vetores de TMV ( 6 dpi). Heterotetrâmero H2L2:IgG, contendo duas cadeias pesadas e duas leves, H2L - heterotrímero, contendo duas cadeias pesadas e uma leve, H2- homodímero de cadeia pesada, L2- homodímero de cadeia leve.

[0099] A figura 12 ilustra uma representação esquemática de regiões do T-DNA de vetores binários, pICH17620, pICH-FSHA e pICHFSHB.

[00100] A figura 13 ilustra uma representação esquemática de regiões do T-DNA de vetores binários, pICH13388, pICH-MLCJ e pICHMHC.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00101] Os vetores virais descritos na presente invenção são vetores virais nos quais um único vetor codifica todas subunidades da proteína necessárias para formar a dita proteína heterooligomérica, ou pelo menos dois vetores virais não-competitivos diferentes, onde cada um dos ditos pelo menos dois vetores virais codifica a subunidade de proteína diferente necessária para formar a dita proteína heterooligomérica. Cada um dos ditos vetores virais não-competitivos pode expressar mais do que uma seqüência heteróloga de ácidos nucléicos, que codifica mais do que uma subunidade de proteína heterooligomérica recombinante. Os ditos vetores virais de RNA podem ser distribuídos de forma transiente para dentro de uma célula vegetal ou pode ser

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27/54 incorporado de forma estável dentro do DNA cromossômico da planta como precursor ou precursores de DNA.

[00102] A presente invenção fornece um processo para a produção com alto rendimento de proteínas heterooligoméricas em células vegetais. Este processo supera as limitações de sistemas de expressão existentes, baseados em vetores virais, tais como a limitação do tamanho das seqüências heterólogas a serem expressadas, a alta instabilidade dos ditos vetores e a incapacidade de co-expressar seqüências de ácidos nucléicos heterólogas diferentes na mesma célula vegetal. Além disso, o dito processo oferece melhores características de biossegurança, pois a remoção da proteína de revestimento viral do sistema impede a formação de partículas virais infecciosas e reversão para vírus do tipo selvagem. Praticando a invenção, o desenho de um sistema de expressão com alto rendimento para uma proteína heterooligomérica de interesse é possível para praticamente qualquer réplicon derivado de RNA vírus de planta, sendo que o dito réplicon é apropriado para a expressão de uma seqüência heteróloga de interesse, através da modificação do dito réplicon para ser capaz de expressar pelo menos duas seqüências heterólogas de interesse, que codificam subunidades diferentes da proteína heterooligomérica de interesse. Alternativamente, pode ser descoberto outro vetor viral não-competitivo que é capaz de se co-replicar com o dito vetor viral na mesma célula vegetal.

[00103] Os vírus de RNA de fita simples, sentido positivo (aqui referidos também como RNA vírus por motivo de concisão), pertencentes a grupos taxonômicos diferentes, são apropriados para construir os vetores virais de rNA de fita simples, sentido positivo (aqui referidos também como vetores virais por motivo de concisão) desta invenção. Neste relatório descritivo, um vetor viral é um vetor de RNA capaz de se replicar em células vegetais, isto é, formar outras moléculas de vePetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 37/82

28/54 tor RNA por polimerização de RNA dependente de RNA, usando o vetor viral de RNA como modelo. De preferência, os vetores virais da invenção contêm pelo menos um elemento de seqüência viral que tem uma função RNA viral, como por exemplo, uma replicase, um promotor subgenômico, uma origem de montagem de partículas virais, uma janela aberta de leitura (ORF), ou uma ORF de proteína de movimentação. Além disso, o vetor viral pode ter um elemento IRES viral de RNA. [00104] Um vetor viral pode ser construído, por exemplo, a partir do vírus a partir do qual ele é derivado introduzindo sítios de restrição no vírus, sendo que os ditos sítios de restrição representam sítios de clonagem apropriados para introduzir a seqüência heteróloga da invenção. Os versados nessas técnicas devem entender que a engenharia de ácidos nucléicos em vírus ou vetores de RNA é feita geralmente no nível do DNA, usando cópias do DNA dos ditos vírus ou vetores de RNA, respectivamente. Assim sendo, é mais preciso dizer que um RNA vírus é derivado introduzindo sítios de restrição na cópia do DNA do RNA vírus, sendo que os ditos sítios de restrição representam sírios de clonagem apropriados para introduzir a cópia do DNA da seqüência heteróloga da invenção no nível do DNA. Estas questões são óbvias para os versados nessas técnicas e não serão em geral aqui enfatizadas.

[00105] Caso uma cópia do DNA de um RNA vírus tenha naturalmente um sítio de restrição ou sítios de restrição apropriados para clonagem, o vírus em si pode ser um vetor viral. Neste relatório descritivo, o termo vetor viral refere-se ao caso no qual a dita seqüência heteróloga não está presente no dito vetor, ou ao caso no qual nenhuma seqüência que codifica uma subunidade protéica da invenção está presente no vetor. Os casos nos quais a dita seqüência heteróloga ou uma seqüência que codifica uma subunidade protéica da invenção é inserida dentro dos ditos vetores virais são identificados especificando

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29/54 explicitamente a presença de tal inserção.

[00106] Neste relatório descritivo, dois vetores virais são referidos como sendo diferentes se suas seqüências são diferentes antes de as ditas seqüências heterólogas ou uma seqüência que codifica uma subunidade protéica da invenção terem sido introduzidas. Dois vetores virais são referidos como sendo iguais, se eles apresentam as mesmas seqüências antes da referida seqüência heteróloga ou a seqüência qye cidifica para a subunidade protéica da invenção tenham sido introduzidas. Assim sendo, as ditas seqüências heterólogas ou seqüências que codificam as subunidades protéicas da invenção não são levadas em consideração quando se determina se dois vetores virais são diferentes ou iguais.

[00107] Neste relatório descritivo, os termos réplicon ou réplicon viral têm o mesmo significado que vetor viral.

[00108] Uma lista de RNA vírus que pode ser usada para arquitetar os vetores virais da invenção está apresentada abaixo. As denominações taxonômicas entre aspas (e não em letras itálicas) indicam que este táxon não tem uma denominação internacional aprovada pela ICTV. As denominações (vernaculares) das espécies são fornecidas em letras normais. Os vírus com nenhuma designação formal ao gênero ou família estão indicados:

[00109] RNA Vírus:

[00110] ssRNA Vírus:

[00111] Família: Bromoviridae, [00112] Gênero: Alfamovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico da alfafa, [00113] Gênero: Ilarvirus, espécie Tipo: vírus da necrose branca do tabaco, [00114] Gênero: Bromovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico do capim-cevadinha,

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30/54 [00115] Gênero: Cucumovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico do pepino;

[00116] Família: Closteroviridae, [00117] Gênero: Closterovirus, espécie Tipo: vírus do amarelo da beterraba, [00118] Gênero: Crinivirus, espécie Tipo: vírus do amarelo infeccioso da alface;

[00119] Família: Comoviridae, [00120] Gênero: Comovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico do feijão-fradinho, [00121] Gênero: Fabavirus, espécie Tipo: vírus 1 da murcha da fava, [00122] Gênero: Nepovirus, espécie Tipo: vírus da mancha anelar do tabaco;

[00123] Família: Potyviridae, [00124] Gênero: Potyvírus, espécie Tipo: vírus Y da batata; poxvírus da ameixa; vírus etch do tabaco; vírus das veias amarelas do trifólio; vírus do mosqueamento das veias do tabaco;

[00125] Gênero: Rymovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico do azevém, [00126] Gênero: Bymovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico amarelo da cevada;

[00127] Família: Sequiviridae [00128] Gênero: Sequivirus, espécie Tipo: vírus das pintas amarelas da pastinaca, [00129] Gênero: Waikavirus, espécie Tipo: vírus esférico tungro do arroz;

[00130] Família: Tombusviridae, [00131] Gênero: Carmovirus, espécie Tipo: vírus da mosca do craveiro,

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31/54 [00132] Gênero: Dianthovirus, espécie Tipo: vírus da mancha anelar do craveiro, [00133] Gênero: Machlomovirus, espécie Tipo: vírus da mancha clorótica do milho, [00134] Gênero: Necrovirus, espécie Tipo: vírus da necrose do tabaco, [00135] Gênero: Tombusvirus, espécie Tipo: vírus do retardamento do crescimento arbóreo do tomateiro;

[00136] Gêneros Não-Designados dos vírus ssRNA, [00137] Gênero: Capillovirus, espécie Tipo: vírus do acanalamento do tronco da macieira;

[00138] Gênero: Carlavirus, espécie Tipo: vírus latente do craveiro; [00139] Gênero: Enamovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico com enações da ervilha, [00140] Gênero: Furovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico do trigo veiculado pelo solo, [00141] Gênero: Hordeivirus, espécie Tipo: vírus do mosaico das listras da cevada, [00142] Gênero: Idaeovirus, espécie Tipo: vírus do nanismo arbóreo da framboesa;

[00143] Gênero: Luteovirus, espécie Tipo: vírus do nanismo amarelo da cevada;

[00144] Gênero: Marafivirus, espécie Tipo: vírus do raiado fino do milho, [00145] Gênero: Potexvírus, espécie Tipo: vírus X da batata;

[00146] Gênero: Sobemovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico do feijão sulino, [00147] Gênero: Tenuivirus, espécie Tipo: vírus das listras do arroz, [00148] Gênero: Tobamovírus, espécie Tipo: vírus do mosaico do tabaco,

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32/54 [00149] Gênero: Tobravirus, espécie Tipo: vírus rattle do tabaco, [00150] Gênero: Trichovirus, espécie Tipo: vírus da mancha clorótica das folhas da macieira;

[00151] Gênero: Tymovirus, espécie Tipo: vírus do mosaico amarelo do nabo;

[00152] Gênero: Umbravirus, espécie Tipo: vírus do mosqueamento da cenoura;

[00153] ssRNA Vírus Negativos: Ordem: Mononegavirales, Família: Rhabdoviridae, Gênero: Cytorhabdovirus, Espécie tipo: vírus do amarelo infeccioso necrótico da alface, [00154] Gênero: Nucleorhabdovirus, Espécie Tipo: vírus do nanismo amarelo da batata.

[00155] Os vetores virais de RNA são capazes de produzir um número extremamente alto de cópias de RNA heterólogo, proporcionando a expressão do gene de interesse ma célula vegetal. Entretanto, sabe-se que tais vetores tornam-se extremamente instáveis, caso o tamanho da seqüência de ácidos nucléicos heteróloga seja aumentado para além de certos limites, usualmente além de 1 kb. Devido a tais limitações, a aplicação de tais sistemas de vetores tem se restringido até agora à expressão de proteínas relativamente simples com um tamanho de pequeno a médio. As tentativas para expressar proteínas heterooligoméricas grandes ou complexas não levaram a um resultado bem sucedido. Descobriu-se agora surpreendentemente que os vetores virais podem ser adotados exitosamente para a expressão com alto rendimento de proteínas heterooligoméricas complexas, o que não foi possível no passado. As primeiras tentativas para expressar anticorpos monoclonais de comprimento inteiro (Verch et al., (1998) J. Immunol. Meth. 220:69-75) não produziram resultados satisfatórios devido à incompatibilidade dos vetores virais usados para a coexpressão de proteínas de interesse na mesma célula. No Exemplo 1,

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33/54 demonstra-se no nível de uma única célula que a co-expressão eficiente de dois genes diferentes (GFP e DsRed) a partir de réplicons virais derivados do mesmo vírus de RNA vegetal (TMV) não é possível. Na figura 1 (A - quadro da direita) não se pôde detectar protoplastos que apresentam a expressão de ambos genes repórteres - DsRed e GFP. Um padrão de expressão fraco de DsRed em alguns protoplastos no quadro do fundo à direita coincide com uma expressão forte de GFP (quadro do topo à direita) e é um resultado falso-positivo devido a um vazamento do filtro usado para a detecção de DsRed. Este vazamento leva a uma fluorescência fraca aparente de DsRed de protoplastos que contêm altas concentrações de GFP. Assim sendo, os réplicons de DNA, que são idênticos ou compartilham regiões extensas de homologia não podem coexistir em uma célula vegetal, mesmo quando eles carregam diferentes seqüências heterólogas de ácidos nucléicos que codificam proteínas recombinantes diferentes. A razão deste fenômeno não é atualmente conhecida. Uma explicação possível é que o aumento exponencial no número de cópias de um réplicon viral resulta na rápida derrota do outro réplicon viral. Assim sendo, um réplicon que é o segundo a iniciar a replicação em uma célula selecionada não consegue alcançar o primeiro, com o que os episódios que determinam a primeiro réplicon são predominantemente de caráter estatístico.

[00156] Nos presentes estudos para enfrentar esse problema, arquitetou-se um réplicon viral de tal modo que duas seqüências de ácidos nucléicos heterólogas diferentes, que codificam proteínas diferentes sob o controle de dois promotores subgenômicos diferentes, estejam presentes no dito réplicon. O esquema geral de uma região de TDNA que codifica tal réplicon de RNA está ilustrado na figura 2. Por questão de conveniência, para desenhar e otimizar tal vetor, usou-se a abordagem de pró-vetores descrita no pedido de patente anterior da

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34/54 mesma requerente (documento no WO 02088369; vide também Marillonet et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6852-6857). Esta abordagem permite montar in planta o vetor viral a partir de moléculas pré-produzidas por intermédio de recombinação específica de sítio, acelerando assim significativamente o desenho do vetor e a otimização do vetor. O desenho das construções está descrito no Exemplo 2 e as representações esquemáticas estão ilustradas na figura 3.

[00157] Descobriu-se surpreendentemente que, apesar do tamanho maior da inserção no réplicon final e da estrutura complexa do vetor, devido à presença de dois promotores subgenômicos fortes, o réplicon de RNA obtido apresentou alta estabilidade in planta e a capacidade de proporcionar a co-expressão de duas proteína recombinantes diferentes (GFP e DsRed) na mesma célula vegetal. Como está ilustrado na figura 4, a freqüência da co-expressão pode atingir até quase 100% de todas células em áreas infectadas. A substituição de genes repórteres (GFP e DsRed), por exemplo, pelas cadeias leve e pesada de uma IgG em tal construção (figura 5) com expressão adicional em folhas de N. benthaniana infiltradas produziu resultados surpreendentes. Como descrito no Exemplo 3, uma análise Western blot revelou uma concentração impressionantemente alta de anticorpos monoclonais montados (fileiras 6 e 7; figura 6). O rendimento de anticorpo monoclonal montado proporcionado pelo presente sistema é incomparavelmente mais alto do que aquele produzido pelo sistema das técnicas atuais (figura 6, fileira 4). Que seja do conhecimento atual, esta é a primeira evidência da expressão de uma proteína heterooligomérica complexa, tal como um anticorpo, usando um sistema de expressão baseado em vetor viral vegetal. Todas publicações anteriores se restringiram à expressão de derivados artificiais simples de anticorpos monoclonais, como por exemplo, a expressão de anticorpos de cadeia única (scFv), usando vetores virais de TMV (McCormick et al., (1999) Proc. Natl.

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Acad. Sci. USA 96:703-708; McCormick et al., (2003) J. Immunol. Meth. 278:95-104) e baseados em PVX (Smolenska et al., (1998) FEBS Lett. 441:379-382; Franconi et al., (1999) Immunotechnology 4:189-201; Hendy et al., (1999) J. Immunol. Meth. 231:137-146; Roggero et al., (2001) Protein Expr. Purif. 22:70-74).

[00158] Nesta invenção, preferiu-se não usar vetores virais sistêmicos. Em vez de vetores virais sistêmicos, preferiu-se substituir a capacidade de o vetor viral se locomover de forma sistêmica pela distribuição mediada por Agrobacterium de precursores de vetores virais dentro do sistema da planta. Isto permitiu substituir a proteína de revestimento viral por uma seqüência heteróloga a ser expressada. Esta abordagem contribui para a possibilidade de aumentar a capacidade do vetor viral para seqüências heterólogas. Ao mesmo tempo, esta abordagem elimina a probabilidade de o vetor viral ser convertido em um vírus do tipo selvagem devido à deleção espontânea de seqüências heterólogas, o que comprometeria a produtividade do sistema. [00159] Embora o presente sistema baseado em réplicons produzisse melhor rendimento do anticorpo monoclonal do que os sistemas das técnicas anteriores, examinou-se a possibilidade de aumentar ainda mais o rendimento diminuindo o tamanho do réplicon viral. Considerando que há possibilidades limitadas para diminuir o tamanho de um réplicon viral que expressa duas cadeias de um anticorpo secretório, tentou-se a expressão de cadeias pesadas e leves de anticorpos a partir de dois réplicons virais diferentes. Considerando que os réplicons baseados no mesmo vírus não são capazes de co-expressar duas seqüências heterólogas diferentes na mesma célula vegetal (vide acima, Exemplo 1), testou-se a possibilidade de co-expressar dois genes diferentes na mesma célula vegetal, clonando separadamente genes de DsRed e GFP em vetores virais derivados dos vírus não-homólogos de plantas, o vírus do mosaico do tabaco (TMV) e o vírus X da

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36/54 batata (PVX) (vide Exemplo 4). A representação esquemática de regiões do T-DNA que contêm DNAc's dos ditos vetores virais está ilustrada nas figura 7 e 8 (PVX apenas). No Exemplo 4, por questão de conveniência, usou-se um vetor viral baseado em TMV montado in planta a partir de módulos do vetor por intermédio de recombinação específica de sítio. Surpreendentemente, descobriu-se que os protoplastos isolados a partir de uma região da folha da planta co-infiltrada apresentou praticamente 100% de freqüência de co-expressão dos genes repórteres de DsRed e GFP (figura 9).

[00160] Recentemente, um estudo sobre a separação espacial de vírus diferentemente marcados foi apresentado por Dietrich e Maiss (2003 J. Gen. Virology 84:2871-2876). Neste estudo, proteínas fluorescentes foram expressadas como repórteres. A produção de proteínas heterooligoméricas não foi mencionada. Além disso, a coexpressão no nível de protoplastos isolados não foi investigada. Como os produtos de genes repórteres podem se difundir para células vizinhas por difusão através dos plamodesmata, nenhuma informação estava disponível se os pares selecionados de vírus expressaram os genes repórteres nas mesmas células ou em células circunvizinhas. As publicações anteriores relatam a sinergia entre vírus do tipo selvagem após infecção de plantas, mas não referem-se à expressão de proteínas heterooligoméricas em células vegetais (Rochow e Ross, (1955) Virology 1:10-27; Goodman e Ross, (1974) Virology 58:16-24; Goodman e Ross, (1974) Virology 59:314-318; Goodman e Ross, (1974) Virology 58:263-271). Desenvolvimentos posteriores desses estudos iniciais sobre interações sinérgicas de vírus em plantas co-infectadas (Vance et al., (1995) Virology 206:583-590; Pruss et al., (1997) Plant Cell 9:859-868) levaram à descoberta de supressores de silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS). O desenvolvimento adicional de sistemas de expressão de proteínas recombinantes foi direcionado paPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 46/82

37/54 ra estudar tais supressores de PTGS para maior produção de proteínas recombinantes. Não há qualquer alusão nas técnicas anteriores para a expressão de proteínas usando sistemas de expressão viral baseados em vírus sinérgicos.

[00161] A invenção demonstra que vetores virais não-competitivos representam uma ferramenta eficiente para a produção de proteínas heterooligoméricas em células vegetais ou plantas. Dois ou mais vetores virais são não-competitivos entre si caso os ditos vetores virais sejam capazes de se replicar na mesma célula vegetal e não se diluam entre si durante a dita replicação e transfecção de outras células. A ausência de diluição significa que pelo menos 10%, de preferência 50%, mais preferivelmente 90%, e com a maior preferência, 100% das células vegetais transfectadas sejam co-transfectadas, por exemplo, contenham os ditos dois ou mais vetores virais diferentes. De preferência, os ditos vetores virais são capazes de se replicar e expressar seqüências de ácidos nucléicos heterólogas. Mais preferivelmente, as ditas seqüências de ácidos nucléico heterólogas codificam proteínas diferentes. Ainda mais preferivelmente, as ditas proteínas diferentes são subunidades de proteína heterooligomérica. Para determinar se os vetores virais são competitivos ou não-competitivos, a freqüência de co-transfecção de células vegetais pode ser medida. Isto pode ser feito pelo seguinte protocolo: dois vetores virais são marcados com dois genes repórteres diferentes, como por exemplo, DsRed e GFP. Os ditos vetores diferentemente marcados são co-distribuídos (por exemplo, por intermédio de agroinfiltração) para dentro do tecido da folha da planta, e 3 a 6 dias depois, os protoplastos isolados da região infectada podem ser contados para determinar a proporção de protoplastos que co-expressam ambos genes repórteres, em comparação com o número de protoplastos com expressão de apenas um gene repórter. Os experimentos que demonstram tais medições estão descritos nos

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Exemplos 2 e 4 (vide também as figuras 1A e 9). Usualmente, os vetores virais não-competitivos podem derivar de vírus que são sinérgicos, por exemplo, podem co-transfectar com sucesso no mesmo hospedeiro vegetal. Os exemplos de tais pares de vírus de RNA sinérgicos incluem:

[00162] Vírus X da batata (PVX)/Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV);

[00163] PVX/Vírus do Mosqueamento da Veia do Tabaco (TVMV); [00164] PVX/Vírus do Etch do Tabaco (TEV);

[00165] PVX/Vírus da Veia Amarela do Trifólio (CIYVV);

[00166] PVX/Poxvírus da Ameixa (PPV);

[00167] PVX/Vírus Y da Batata (PVY).

[00168] A razão mecanística para a competitividade ou nãocompetitividade de vetores virais não é conhecida. Uma explicação possível é que os réplicons virais derivados de vetores virais sinérgicos formam complexos de replicação viral (VRCs) (Kawakami et al., (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6291-6296) em diferentes compartimentos subcelulares, e assim sendo, eles não estão competindo entre si pelo espaço necessário para formar VRCs. Como foi estabelecido experimentalmente, os vetores virais não-competitivos podem ser derivados de espécies diferentes de vírus que são significativamente diferentes no nível de suas seqüências de ácidos nucléicos. Os ditos vetores virais não-competitivos podem ser derivados de vírus vegetais sinérgicos que podem co-infectar com êxito o mesmo hospedeiro vegetal. Os vírus sinérgicos usualmente pertencem a gêneros diferentes. Por exemplo, PVX pertence ao gênero Potexvírus, enquanto que os vírus sinérgicos com ele, tais como TVMV, TEV, PPV e CIEVV pertencem ao gênero Potyvírus. Outros vírus sinérgicos (não-competitivos) com vírus PVX, tais como TMV, TVCV e crTMV pertencem ao gênero Tobamovírus. Obviamente, a homologia de genomas entre represenPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 48/82

39/54 tantes de gêneros diferentes é muito baixa, usualmente abaixo de 50% de identidade no nível do RNA.

[00169] A clonagem de cadeias pesadas e leves de um anticorpo monoclonal em diferentes vetores virais (por exemplo, baseados em PVX e TMV) após co-expressão das ditas cadeias em tecido vegetal co-infectado está descrita no Exemplo 5. As representações esquemáticas dos vetores está ilustrada na figura 10. A medição comparativa de ELISA do rendimento de anticorpos monoclonais produzidos com a ajuda deste e de outros sistemas de expressão indicou o melhor desempenho do dito sistema baseado em dois vetores virais nãocompetitivos (figura 11). A expressão eficiente de proteínas heterooligoméricas recombinantes em células vegetais com a ajuda de um vetor ou vetores virais não é conhecida nas técnicas anteriores.

[00170] Com base nos presentes dados, seqüências derivadas de vírus dos vetores virais não devem apresentar homologia significativa suficiente para considerar os ditos vírus relacionados entre si. Um exemplo de tais vírus é o par de vírus TMV e PVX e vetores virais baseados nos mesmos. Estes vetores virais não apresentam qualquer homologia. Outro requisito para selecionar pares de vírus aceitáveis pode ser a sinergia dos vírus do tipo selvagem originais durante a coinfecção de um hospedeiro vegetal.

[00171] Os experimentos discutidos acima foram feitos com sistemas de expressão transiente, baseados na distribuição de precursores de DNA mediada por Agrobacterium, para dentro de células vegetais. Entretanto, uma aplicação alternativa desta invenção é para plantas transgênicas com um precursor de DNA do(s) dito(s) réplicon(s) de RNA incorporado em um cromossoma nuclear da planta. Isto permite superar muitas limitações de sistemas baseados em vetores virais de plantas, tais como as restrições ao tamanho máximo de seqüências heterólogas que os vetores virais conseguem tolerar. Como o precurPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 49/82

40/54 sor de DNA estará presente em cada célula da planta transgênica, não há exigência absoluta da movimentação sistêmica ou da movimentação de célula para célula do réplicon de RNA (disseminação de réplicons). Isto pode ser compensado pela alta eficiência da formação e transporte dos réplicons de rNA da invenção para dentro do citoplasma. Entretanto, a capacidade do vetor para movimentação de célula para célula pode ser de um valor adicional, pois a formação dos réplicons de RNA nem seem mpre ocorre em todas células.

[00172] Métodos diferentes podem ser usados para disponibilizar uma planta, tecido vegetal ou células vegetais com DNA heterólogo. Os ditos vetores podem ser transformados em células vegetais por um vetor plasmídico Ti carregado por Agrobacterium (patentes nos US 5.591.616, US 4.940.838, US 5.464.763) ou bombardeio de partículas ou microprojéteis (documentos nos US 05100792, EP 00444882B1, EP 00434616B1). Outros métodos de transformação de plantas também podem ser usados, tais como microinjeção (documentos nos WO 09209696, WO 09400583A1, EP 175966B1), eletroporação (documentos nos EP 00564595B1, EP 00290395B1, WO 08706614A1) ou transformação de protoplastos mediada por PEG, etc. A escolha do método para distribuição de vetores pode depender da espécie da planta a ser transformada. Por exemplo, o bombardeio de microprojéteis é preferido geralmente para transformação de monocotilédones, enquanto que para dicotilédones, a transformação mediada por Agrobacterium resultam melhores resultados em geral.

[00173] Nos exemplos da invenção, usou-se a distribuição transiente de vetores (o dito DNA heterólgo), mediada por Agrobacterium, para dentro de células de Nicotiana. Entretanto, os ditos vetores podem ser introduzidos de forma estável dentro das plantas de acordo com qualquer uma das técnicas usuais apropriadas para a transformação estável ou transiente da espécie vegetal de interesse. As técnicas de transPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 50/82

41/54 formação de dicotilédones são bem conhecidas na técnica e incluem técnicas baseadas em Agrobacterium e técnicas que não requerem Agrobacterium. As técnicas sem Agrobacterium envolvem a captação de material genético exógeno diretamente por protoplastos ou células. Estas técnicas incluem captação mediada por PEG ou eletroporação, distribuição mediada por bombardeio de partículas e microinjeção. Os exemplos destas técnicas estão descritos em Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169-177 (1985); Reich et al., Biotechnology 4:1001-1004 (1986); e Klein et al., Nature 327:70-73 (1987). Em cada caso, as células transformadas são regeneradas para plantas integrais, usando técnicas padronizadas. [00174] A transformação mediada por Agrobacterium é uma técnica preferida para a transformação de dicotilédones por causa da sua alta eficiência de transformação e sua ampla utilidade com muitas espécies diferentes. As muitas espécies de culturas que podem ser transformadas rotineiramente por Agrobacterium incluem tabaco, tomate, girassol, algodão, colza, batata, soja, alfafa e choupo (documentos nos EP 0 317 511 (algodão), EP 0 249 432 (tomate), WO 87/07299 (brássica), patente US n° 4.795.855 (choupo)).

[00175] Nos exemplos desta invenção, empregou-se distribuição de T-DNA mediada por Agrobacterium para a expressão transientes de gene(s) de interesse (Vaquero et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11128-11133 (1999)). Este método é uma ferramenta extremamente útil, não somente para sistemas de produção de proteínas recombinantes em escala pequena a média, mas também para expressão em larga escala.

[00176] A liberação de precursores de réplicons virais incorporados de forma estável no DNA cromossômico de plantas pode ser conseguida usando promotores induzíveis ou qualquer outro promotor regulado (por exemplo, regulado no desenvolvimento). Os promotores inPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 51/82

42/54 duzíveis podem ser divididos em duas categorias de acordo com suas condições de indução: aqueles induzidos por fatores abióticos (temperatura, luz, substâncias químicas) e aqueles que podem ser induzidos por fatores bióticos, como por exemplo, ataque de patógenos ou pragas. Os exemplos da primeira categoria são promotores induzíveis por calor (documento US n° 05187287) e induzíveis por frio (documento US n° 05847102), um sistema induzível por cobre (Mett et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., 90:4567-4571), sistemas induzíveis por esteróides (Aoyama & Chua, Plant J. 11:605-612 (1997); McNellis et al., Plant J. 14:247-257 (1998); documento US n° 06063985), um sistema induzível por etanol (Caddick et al., (1997) Nature Biotech. 16:177-180; documento no WO 09321334), e um sistema induzível por tetraciclina (Weinmann et al., (1994) Plant J., 5:559-569). Um dos últimos desenvolvimentos na área de sistemas quimicamente induzíveis para plantas é um promotor quimérico que pode ser ativado pelo glicocorticóide dexametasona e desativado por tetraciclina (Bohner et al., (1999) Plant J. 19:87-95). Para obter uma revisão sobre sistemas quimicamente induzíveis, vide: Zuo & Chua (2000 Current Opin. Biotechnol. 11:146-151) e Padidam, M. (2003 Curr. Opin. Plant Biol. 6:169-177). Outros exemplos de promotores induzíveis são promotores que controlam a expressão de genes relacionados a patogênese (PR) em plantas. Estes promotores podem ser induzidos pelo tratamento de uma planta com ácido salicílico, um componente importante de vias sinalizadoras de plantas em resposta a um ataque patogênico, ou outros compostos químicos (benzo-1,2,3-tiadiazol ou ácido isonicotínico) que são capazes de disparar a expressão de genes relacionados a patogêneses (documento US n° 05942662).

[00177] Esta invenção não está limitada a vetores baseados em TMV e PVX descritos nos exemplos, mas é aplicável a réplicons derivados de outros RNA vírus de plantas, sujeito ao estabelecimento de

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43/54 sistemas de expressão derivados dos ditos réplicons virais. A sinergia mais bem estudada em plantas co-infectadas é conhecido pelo par de vírus PVX/PVY (Rochow & Ross, 1955, Virology 1:10-27); Goodman & Ross, Virology 58:16-24 (1974)). É muito possível que muitos desses vírus possam co-replicar na mesma célula vegetal. Dietrich e Maiss (2003, J. Gen. Virol. 84:2871-2876) demonstraram que pares de vírus marcados de forma diferente, como por exemplo, o poxvírus da ameixa (PPV) e o vírus X da batata (PVX), vírus do mosqueamento da veia do tabaco (TVMV) e PVX, vírus das veias amarelas do trifólio (CIYVV) e PVX, podem co-expressar genes repórteres diferentes na mesma região infectada do tecido vegetal. Usando a estratégia descrita nesta invenção, foram desenvolvidos sistemas de expressão de proteínas heterooligoméricas recombinantes para praticamente qualquer par de réplicons derivados de RNA vírus de fita simples, sentido positivo, que são capazes de co-replicação na mesma célula vegetal. Por exemplo, vetores virais baseados no vírus do mosaico da alfafa (AMV) do gênero alfamovírus podem ser usados nesta invenção.

[00178] Os genes de interesse que codificam proteínas complexas (heterooligoméricas), seus fragmentos (funcionais ou não-funcionais) e seus derivados artificiais e fusões, podem ser expressados em plantas ou células de plantas usando a presente invenção. Muitos grupos de proteínas heterooligoméricas comercialmente valiosas podem ser produzidos e purificados usando a invenção. Esses grupos incluem, porém sem limitações, proteínas industriais e para pesquisas, bem como proteínas para aplicações na área de saúde humana ou animal. Entretanto, o grupo mais preferido é o grupo de proteínas com respostas imunes, especificamente anticorpos monoclonais selecionados entre diferentes classes de imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA e IgD) e seus derivados sintéticos, tais como as versões mutantes e diferentes tipos de fusões com outras proteínas ou partes delas.

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EXEMPLOS [00179] Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar a presente invenção. Modificações e variações podem ser feitas sem afastar-se do espírito e escopo da invenção.

Exemplo 1 [00180] Falta de co-expressão de GFP e DsRed a partir de dois vetores virais de RNA baseados em TMV, que são derivados do mesmo RNA vírus vegetal [00181] Tecido de folha foi infectado com dois vetores virais baseados em TMV derivados do mesmo RNA vírus vegetal, mas contendo dois genes diferentes de interesse (figura 1). Esta abordagem foi testada usando os genes marcadores visuais GFP e DsRed clonados em um vetor viral baseado em TMV. A primeira construção, pICH17272 (vide figura 1 de Marillonet et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:718-723), contém GFP, e é similar a pICH18711 (vide pedido de patente internacional no PCT/EP03/12530, publicado como documento no WO 2005049839; Marillonet et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:718-723), com a exceção que a seqüência codificadora RdRP no vetor contém 9 íntrons de plantas em vez de 14. O pICH18722 (Marillonet et al., 2005, Nat. Biotechnol. 23:718-723) é construído sobre a cadeia principal de duas cepas de TMV intimamente relacionadas, Cr-TMV (Dorokhov et al., 1994, FEBS Lett. 350:5-8) e TVCV (Lartey et al., 1994, Arch, Virol. 138:287-298), e contém o genoma viral colocado sob o controle de um promotor vegetal, com a seqüência da proteína de revestimento substituída por uma seqüência heteróloga. A presença de 11 íntrons na RdRP e MP aumenta a eficiência da iniciação da replicação viral depois da distribuição mediada por Agrobacterium do vetor para o tecido da folha, e portanto, aumenta a probabilidade de co-expressão dos dois vetores virais na mesma célula. O pICH8505 é similar ao pICH17272, exceto que a seqüência codificadora de GFP foi substituíPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 54/82

45/54 da pela seqüência codificadora de DsRed usando sítios de restrição Xho 1-Not (figura 1). Os mapas de restrição detalhados de regiões do T-DNA de pICH18505 e pICH17272 estão ilustrados na figura 1C. pICH18505 e pICH17272 foram transformados na cepa de Agrobacterium GV3101, e o tecido da folha foi infiltrado em Nicotiana benthamiana como descrito anteriormente (Marillonet et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6852-6857). Os protoplastos foram preparados a partir da área infiltrada, 7 dias depois da infiltração (dpi) e observados sob luz azul ou vermelha sob o microscópio. Poucos protoplastos expressaram GFP e também DsRed (figura 1A), mesmo quando os protoplastos foram preparados a partir da área infiltrada vários dias depois. Isto sugere que, depois que uma célula fica infectada com um primeiro vetor viral baseado em TMV, ela torna-se incapaz de ser reinfectada por um segundo vetor baseado em TMV.

Exemplo 2

Co-expressão de GFP e DsRed a partir de um único réplicon viral [00182] Dois genes de interesse foram expressados a partir de um vetor viral de RNA, sob o controle de dois promotores subgenômicos separados (figura 2). Ambos promotores subgenômicos podem ser idênticos, mas, para evitar o risco de deleção entre seqüências repetidas na construção durante a replicação viral, prefere-se usar promotores subgenômicos de cepas de TMV relacionadas; neste caso, o segundo promotor subgenômico e e a região 3' não-traduzida advém da cepa de TMGMV U5 (Shivprasad et al., 1999, Virology 255:312-323; Marillonet et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 6852-6857). Além disso, por conveniência de clonage, GFP e DsRed foram clonados em pró-vetores virais (descrito no documento no WO 02/088369 e por Marillonet et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6852-6857), ao invés de em um vetor completo montado. Os dois pró-vetores, pICH17388 e pICH15933 (figura 3) foram convertidos em um vetor viPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 55/82

46/54 ral baseado em TMV completamente funcional por recombinação específico de sítio entre ambos módulos de pró-vetores in planta. pICH17388 é similar a pICHNOP (Marillonet et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6852-6857) , com a exceção que 11 íntrons estão presentes nas seqüências virais (como em ICH17272). pICH15933 é equivalente a pICHGFPSYS (Marillonet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6852-6857 (2004)), exceto que a seqüência codificadora de TMGMV U5 foi substituída pela seqüência codificadora de DsRed. [00183] O pICH15933 foi transformado na cepa de Agrobacterium GV3101 e infiltrado na folha de Nicotiana benthamiana junto com pICH17388 e pICH10881 (figura 3). Cinco dias depois da infiltração, todos os focos que expressam GFP também estavam expressando DsRed, apresentando co-expressão excelente de dois genes nas mesmas células vegetais (figura 4).

Exemplo 3

Expressão de um anticorpo a partir de um único réplicon viral [00184] As seqüências codificadoras de GFP e DsRed em pICH15933 foram substituídas pelas cadeias leve e pesada do anticorpo de IgG, respectivamente, resultando na construção pICH20241 (figura 5). Como controle, as cadeias pesada e leve foram clonadas em um pró-vetor baseado em TMV, substituindo a seqüência codificadora de pICH1740, resultando em construções pICH20421 e pICH20431 (figura 5). O pICH20241 foi co-infiltrado em folhas de Nicotiana benthamiana junto com pICH17388 (figura 3).

[00185] A análise Western blotI de proteína solúvel total extraída de folhas infiltradas foi realizada com anticorpos leporídeos anti-IgG humana, diluídos 1:6.000, marcados com peroxidase de raiz-forte (HRP) (Sigma). Os resultados da análise estão indicados na figura 6A. Fica evidente que o nível de expressão de um anticorpo atingido com a ajuda de um único vetor viral (fileiras 6 e 7, figura 6) é significativaPetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 56/82

47/54 mente mais alto do que aquele atingido com a ajuda de um promotor constitutivo forte, mesmo na presença do supressor de PTGS, P19 (fileiras 3-4, figura 6).

Exemplo 4

Co-expressão de GFP e DsRed com vetores virais baseados em TMV e PVX [00186] Uma outra estratégia para a co-expressão de dois genes é usar vetores virais separados construídos em vírus diferentes que podem co-infectar e replicar na mesma célula. Como um exemplo, um vetor de expressão baseado no vírus X da batata (PVX) pode coesxistir na mesma célula com TMV. As representações esquemáticas de dois desses vetores virais não-competitivos estão ilustradas na figura 7.

[00187] O inóculo de PVX (cepa PV0014) foi obtido na German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) como material foliar infectado desidratado, e foi usado para inoculação de plantas de Nicotiana benthamiana. As folhas sistêmicas de plantas inoculadas que apresentaram sintomas virais foram usadas para a preparação do RNA total. O DNAc de primeiro filamento foi preparado usando os iniciadores pvxpr2, pvxpr4 e pvxpr6. Três fragmentos do DNAc foram ampliados por PCR a partir do DNAc de PVX, usando uma mistura de Pfu-Taq polimerase:

[00188] Fragmento 1 ampliado com os iniciadores:

[00189] pvxpr1: ttt ggtctc a tgaa gaaaactaaaccatacaccaccaacacaac (SEQ ID NO: 1) [00190] pvxpr2: ctttttccagcccggagaccatttctgtgatgg (SEQ ID NO: 2) [00191] Fragmento 1 digerido com Bsal.

[00192] Fragmento 2 ampliado com os iniciadores:

[00193] pvxpr3: ttt cgtctc a gggctggaaaaagaggacttccctgaagg (SEQ ID NO: 3)

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48/54 [00194] pvxpr4: gagtcgtctcctgcataaacttgagcag (SEQ ID NO: 4) [00195] Fragmento 2 digerido com Esp3I [00196] Fragmento 3 ampliado com os iniciadores:

[00197] pvx5: ttt gaagac aa tgcaggagacgactccgcactgg (SEQ ID NO: 5) [00198] pvx6: cg gacgtc tttttttttttttttttttttttt atttatattattcatacaatcaaaccagaaaatac (SEQ ID NO: 6) [00199] Fragmento 3 digerido com Bpil AatII [00200] Fragmento 4, contendo o promotor do gene actin2 de Arabidopsis, (An et al., 1996, Plant J. 10:107-121) foi ampliado a partir do DNA genômico de Arabidopsis com os iniciadores:

[00201] Act2pr1: ttt acgcgt ttcgacaaaatttagaacgaacttaattatg (SEQ ID NO: 7) [00202] Act2pr2: ttt ggtctc a ttca ttcaaagcggagaggaaaatatatg (SEQ ID NO: 8) [00203] Fragmento 4 digerido com Miu1 e Bsa1.

[00204] Como uma alternativa ao promotor do gene actin 2 de Arabidopsis, o promotor de CaMV 35 também foi usado para acionar a transcrição do vetor viral baseado em PVX (vide figura 10D, pICH20788; pICH21380). A estratégia geral para produzir vetores baseados em PVX foi usada como descrito por Baulcombe e colaboradores (1995, Plant Journal 7:1045-1053).

[00205] Todos os quatro fragmentos foram clonados juntos em um vetor binário digerido com Miu1 e Aatll. Vinte clones da construção resultante foram transformados na cepa de Agrobacterium GV3101 e cada clone foi infiltrado para dentro de uma folha de uma planta de Nicotiana benthamiana. Uma semana depois, Nicotiana benthamiana foram tiradas de forma fenotípica quanto a sintomas de infecção viral, e os clones de plasmídeos positivos foram reservados (pICHPVX). [00206] Um vetor de clonagem foi preparado a partir deste DNAc

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49/54 funcional completo para clonar um gene de interesse a jusante do promotor subgenômico de CP. O gene de GFP foi clonado como um exemplo. Um ATG na área do promotor subgenômico da CP foi mutado para AGG (posição 5651 no acesso do GenBank, acesso M95516). O gene de GFP foi clonado a 3' do sítio NheI (coordenadas 5662 a 5667). A extremidade 3' de PVX (coordenadas 5618 a 6435) foi clonada a jusante da seqüência de GFP, e esta seqüência foi seguida de um estiramento de 12 a 24 A. Esta construção (pICH0130, figura 8) foi agroinfiltrada para dentro da folha de Nicotiana benthamiana. A fluorescência de GFP apareceu na área infiltrada, dois a três dias depois da infiltração. A movimentação sistêmica da GFP apareceu alguns dias depois.

[00207] O pIC0130 foi co-infiltrado para dentro da folha de Nicotiana benthamiana junto com os vetores pICH17388, pICH10580 e pICH10881 (figura 3), proporcionando a expressão de DsRed. Seis dias depois da co-infiltração, os protoplastos foram preparados a partir da área infiltrada e observados sob a microscópio sob luz azul. Quase todos os protoplastos expressaram GFP e também dsRed, apresentando um nível excelente de co-expressão (figura 9).

Exemplo 5

Expressão de um anticorpo monoclonal com vetores baseados em

TMV e PVX [00208] As cadeias pesada e leve da IgG foram clonadas em um vetor de PVX, substituindo a seqüência codificadora de GFP em pIC0130, gerando duas construções, pICH21240 e pICH21370, contendo a cadeia pesada ou a cadeia leve, respectivamente (figura 10A). Clones de partes do pró-vetor de TMV, que continham a cadeia leve ou a pesada do anticorpo, também foram construídos (pICH20431 e pICH20421, figura 10A). Misturas de agrobactérias que proporcionam duas cadeias diferentes expressadas a partir de vetores baseados em

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PVX e TMV foram infiltradas para dentro de folhas de Nicotiana benthamiana, e o nível de expressão de anticorpos foi medido por ELISA, 10 dias depois da inoculação. Os resultados (figura 11) indicam um nível extremamente alto de anticorpos funcionais montados no caso da co-expressão de cadeias pesadas e leves a partir de vetores baseados em PVX e TMV. Estes níveis foram significativamente mais altos do que aqueles obtidos a partir de um vetor de TMV que expressa ambas cadeias (Exemplo 3).

[00209] Ainda outro anticorpo monoclonal específico de tumor humano, pertencente à subclasse IgG1, mab anticâncer, foi subclonado em vetores baseados em TMV e PVX, da seguinte maneira: o fragmento NcoI-NotI 730, contendo a seqüência codifícadora da cadeia leve do mab anticâncer foi diminuída no sítio NotI e ligada dentro do vetor de clonagem do módulo 3', baseado em TMV, pICH11599 (figura 10B) aberto com NcoI-XbaI e diminuído no sítio XbaI, resultando em pICH21910 (figura 10B). A mesma estratégia foi usada para subclonar o fragmento NcoI-NotI de 1.421 pares de bases com a seqüência codificadora da seqüência da cadeia pesada do mab anticâncer em pICH11599 (figura 10B), que resultou na construção pICH21920 (figura 10B). O módulo 3' baseado em PVX para a expressão de GFP, pICH21282 (figura 10C), foi criado na base do vetor de clonagem com módulo 3' baseado em TMV, pICH10990 (figura 10C). Ele foi conseguido em várias etapas de clonagem por intermédio da inserção da seqüência codificadora de GFP em pICH10990 (figura 10C) e conseqüentemente substituição da região não-traduzida 3' de TMV pela região 3' não-traduzida de PVX. Similarmente, o módulo do pró-vetor em 3' baseado em TMV, pICH21920 (figura 10B) foi convertido na construção do pró-vetor em 3' baseado em PVX, pICH22250 (figura 10C) pela substituição da região 3' não-traduzida de TMV pela região 3' não-traduzida de PVX. Ele foi conseguido pela ligação do fragmento

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HindIII-NdeI com 575 pares de bases de pICH21282 (figura 10C) diminuída no sítio de HindIII com o fragmento SaII-NdeI de pICH21920 diminuído no sítio SaII. Um fragmento NcoI-EcoRI de 723 pares de bases, contendo a seqüência codificadora da cadeia leve do mab anticâncer, foi subclonado em pICH22250 (figura 10C), digerido com NcoIEcoRI, resultando em pICH22240 (figura 10C).

[00210] O pró-vetor de 5', pICH21380 (figura 10D), foi preparado da seguinte maneira: a construção pICH17388 (figura 3B) foi usada como modelo para ampliar por PCR o fragmento com a ajuda dos iniciadores pv5p5F (SEQ ID NO: 9) (5' cagctagcaa caaacaagaa aggtaagttt c-3') e pv5p5R (SEQ ID NO: 10) (5'-tctgagctct gcatgctacg cccccaactg agag3'), digerido com as enzimas de restrição Nhe1 e Sac1 e ligado com o fragmento grande Nhe1-Sac1 de pICH20788, substituindo a parte 3' do vetor de PVX pela extremidade 5' do íntron e o sítio de recombinação AttP. O esquema de clonagem está indicado na figura 10D. A estratégia de usar pró-vetores 5' com pró-vetores 3' para montar um vetor viral in planta por intermédio de recombinação específica de sítio foi como descrito anteriormente (Marillonet et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:6852-6857).

Procedimento de Agroinfiltração [00211] Todas construções resultantes foram transformadas na cepa de Agrobacterium GV3101, usando um protocolo de eletroporação padrão, e usadas para agroinfiltração adicional de folhas de Nictotiana benthamiana. Volumes iguais de culturas de Agrobacterium desenvolvidas de um dia para o outro, com DO600 na faixa entre 1,8 e 2,5, foram misturadas e sedimentadas a 6.000 x g por 3 min. O pélete foi ressuspenso em uma solução contendo MES 10 mM (pH 5,5) e MgSO4 10 mM, resultando em uma diluição 10-1 para cada cultura individual. Folhas de plantas de Nicotiana benthamiana com 6 a 8 semanas de idade cultivadas em estufa foram infiltradas usando uma sePetição 870170022713, de 06/04/2017, pág. 61/82

52/54 ringa sem agulha. No caso de usar pró-vetores para a agroinfiltração, a mistura agrobacteriana usualmente carregava 5 cepas agrobacterianas, cada uma delas fornecendo um dos seguintes componentes: fonte de recombinase (integrase) (pICH10881); pró-vetor de 5'PVX (pICH21380); um pró-vetor de 3'PVX que fornece uma das cadeias de IgG (pICH2250 para cadeia pesada ou pICH22240 para cadeia leve, dependendo de qual cadeia complementar é fornecida pelo pró-vetor de TMV); pró-vetor de 5'TMV (pICH17388); um pró-vetor de 3'TMV (pICH21910 que codifica a cadeia leve ou pICH21920 que codifica a cadeia pesada).

SDS-PAGE e Western blot [00212] Amostras de 100 mg de folhas de N. benthaniana infiltradas com Agrobacterium foram moídas em nitrogênio líquido com 300 ml de tampão de extração de proteína (Tris 0,1 M, NaCl a 150 mM e 0,1% de Tween 20, pH 8,0). Os extratos brutos das folhas foram resolvidos em géis de poliacrilamida a 10% (condições não-redutoras) ou 12% (condições redutoras), usando o sistema de tampão de Laemmli, e em seguida, por coloração com Azul Brilhante de Coomassie. Para a análise Western blot, as proteínas de SDS-PAGE foram transferidas de forma eletroforética para uma membrana Hybond P (Amersham Biosciences, Reino Unido), usando Tampão para Blotting ((Tris a 25 mM, glicina a 192 mM, 20% de metanol, pH 8,3). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em TBST (Tris a 50 mM, NaCl 100 mM, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) e sondadas com anticorpos caprinos antiIgG humana conjugados com HRP específico de cadeia leve lambda (Sigma, Reino Unido), ou anticorpos caprinos anti-IgG humana conjugados com HRP específico de cadeia leve gama (Sigma, Reino Unido), diluídos em 2,5% de leite desnatado/TBS 1:10.000 e 1:5.000, respectivamente. Os anticorpos ligados foram detectados usando o Reagente de Detecção ERL (Amersham Biosciences, Reino Unido). Os

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53/54 resultados das separações eletroforéticas e das análises Western blot estão ilustrados na figura 11B. A comparação com padrão de IgG indicou que o rendimento de anticorpos monoclonais no tecido vegetal atinge 0,2 a 0,35 mg por grama de biomassa fresca de folhas. Isolamento de Mabs Recombinantes Derivados de Plantas [00213] As proteínas solúveis totais foram extraídas das folhas de N. benthaniana agroinoculadas com tampão que contém fosfato de sódio a 100 mM, NaCl a 150 mM e 0,05% de Tween 20 (pH 8,0). O isolamento em pequena escala do Mab anticâncer a partir dos estratos protéicos brutos foi realizado usando purificação por afinidade em uma etapa com Contas Magnéticas de Proteína A (New England Biolabs, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. O gel corado com Coomassie com Mab purificado derivado de planta está ilustrado na figura 11B (quadro B).

Exemplo 6

Expressão de hormônio estimulador de folículos (FSH) com vetores baseados em TMV e PVX [00214] Os genes (cDNA) que codificam as seqüências alfa polipeptídeos (nucleotídeos correspondentes às seqüências codificadoras 101-463 do GenBank no de acesso NM_173901) e beta polipeptídeos (nucleotídeos correspondentes às seqüências codificadoras 70-459 do GenBank no de acesso NM_174060) de FSH bovino foram sintetizados flanqueados com sítios de restrição (5'Nco1-3'EcoR1 para as subunidades FSH-alfa e FSH-beta) e clonados no pró-vetor de TMV (pICH20431, derivado de pICH11599, figura 10B) e no vetor de PVX (pICH21240), substituindo as seqüências codificadoras para as cadeias pesada e leve de IgG, e gerando duas construções, pICH-FSHA e pICH-FSHB, contendo as seqüências que codificam a subunidade alfa e a subunidade beta, respectivamente (figura 12). A mistura de agrobactérias que fornece duas subunidades diferentes expressadas a

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54/54 partir de vetores baseados em PVX e TMV foi preparada e infiltrada em folhas de N. benthaniana como descrito acima e o nível de expressão de FSH heterodimérico foi medido por ELISA 10 dias depois da inoculação, usando anticorpos específicos de dímero de FSH, disponíveis comercialmente (FSH117) e detectado com o sistema quimioluminescente Tropix (Tropix, Bedford, MA, EUA).

Exemplo 7

Expressão de IgM com vetores baseados em TMV e PVX [00215] As seqüências codificadoras de GFP e DsRed em pICH15933 foram substituídas pelas seqüências que codificam as cadeias leve e J de IgM, respectivamente, resultando na construção pICH-MLCJ (figura 13). O gene que codifica a cadeia pesada de IgM foi clonado no vetor de PVX (pICH21240), substituindo as seqüências codificadoras pela cadeia pesada de IgG e gerando a construção pICH-MHC (figura 13). A mistura de agrobactérias que fornece três cadeias diferentes de IgM, expressadas a partir de vetores baseados em PVX e TMV foi infiltrada dentro de folhas de N. benthamiana e o nível de expressão do complexo heterooligomérico foi medido por ELISA 10 dias depois da inoculação, usando anticorpos específicos de IgM disponíveis comercialmente.

[00216] Os teores do pedido de patente europeu no 05 001 819.1 e do pedido de patente US n° 60/593.606, cujas prioridades são reivindicadas pelo presente pedido de patente, são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir em uma planta, tecido vegetal, ou em células vegetais, um anticorpo como uma proteína heterooligomérica que compreende pelo menos uma primeira e uma segunda subunidade proteica, caracterizado pelo fato de que compreende expressar em células vegetais pelo menos a dita primeira e a dita segunda subunidade proteica, por meio do fornecimento de forma transiente à dita planta, ao dito tecido vegetal ou às ditas células vegetais, um primeiro e um segundo vetor viral de RNA de fita simples, sentido positivo, em que o dito primeiro vetor viral codifica pelo menos a dita primeira subunidade proteica, o dito segundo vetor viral codifica pelo menos a dita segunda subunidade proteica, em que o dito primeiro vetor viral é derivado de Vírus X da Batata e o dito segundo vetor viral é derivado de Vírus do Mosaico do Tabaco.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que prossegue com o isolamento da dita proteína hetero-oligomérica a partir da dita planta, do dito tecido vegetal, ou das ditas células vegetais.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro vetor viral contém uma primeira sequência heteróloga que codifica a dita primeira subunidade proteica, e o dito segundo vetor viral contém uma segunda sequência heteróloga que codifica a dita segunda subunidade proteica, com o que a expressão da dita primeira e/ou da dita segunda subunidade proteica fica sob o controle de um promotor subgenômico.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o(s) dito(s) vetor(es) viral(is) é(são) fornecido(s) de forma transiente para a dita planta, tecido vegetal ou células vegetais, por transfecção com Agrobacterium.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1,

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2/2 caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é uma imunoglobulina G, uma imunoglobulina A, uma imunoglobulina M, uma imunoglobulina D, ou uma imunoglobulina E.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea pertence à família Solanacea.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea é uma espécie Nicotiana. 9. Processo, de acordo com a reivindicação 7,

caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea é Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea pertence à família Brassicacea.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea pertence à família Legume.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea é Medicago sativa .

13. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea pertence à família Chenopodiaceae.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita planta dicotiledônea é Beta vulgaris.

Petição 870170055184, de 02/08/2017, pág. 7/10

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