KR101293218B1 - 식물에서 이형-올리고머 단백질의 생산 - Google Patents

식물에서 이형-올리고머 단백질의 생산 Download PDF

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Abstract

적어도 1차와 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질을 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 하기의 방법에 의해 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하는 방법.
(i) 상기 식물, 상기 식물 조직, 또는 상기 식물 세포에 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공하고, 또는
(ii) 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차와 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 적어도 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 적어도 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 적어도 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터가 비-경쟁의 바이러스 벡터에 의한 방법.

Description

식물에서 이형-올리고머 단백질의 생산{PRODUCTION OF HETERO-OLIGOMERIC PROTEINS IN PLANTS}
본 발명은 식물, 식물 일부 또는 식물 세포 배양에서 플러스-센스 단일 가닥 RNA 바이러스 벡터를 사용하는 이형-올리고머 단백질의 생산에 관한 것이다. 본 발명에서 기술한 방법과 벡터들은 전체-길이 항체 또는 다른 단백질들 또는 그들의 단편들과의 융합체를 포함하는 그들의 이형-올리고머 생합성 유도체와 같은 기능성 이형-올리고머 재조합 단백질의 수율이 증가한 식물 세포를 제공한다.
식물-기반 분자 농업은 바람직하게는 잠재적으로 낮은 생산 비용과 광우병(Bovine Spongifom Encephalopathy; BSE) 또는 크로이츠펠트 야곱병(Creuzfeld-Jacob Disease; CJD, VCJD)과 같은 인간 병원체에 의한 생산물들의 가능한 오염 때문에 제조방 법으로부터 동물-유래 단백질을 제거하기 위한 생물약제학 산업에 의한 시도들 때문에 인간과 동물의 건강 분야에서 사용되는 재조합 단백질의 생산을 위한 흥미를 끄는 기회이다. 그러나 식물 세포에서의 이형-올리고머 단백질의 고-수율 생산은 하기의 이유들 때문에 강한 구조적 또는 조직-특이적 프로모터의 사용에 기반한 표준 발현 시스템에서는 해결될 수 없는 문제이다: 첫째로, 그러한 재조합 단백질들의 대부분은 식물 생장과 발달에 해로운 영향을 주므로, 수율에 강하게 손상을 준다; 둘째로, 조직-특이적 프로모터(예를 들어, 종자-특이적)의 사용은 섭취가능한 농작물(예를 들어, 쌀, 옥수수, 밀)의 게놈에 약제학적 단백질을 암호화하는 유전자의 안정적인 결합을 요구하고, 이것은 개방 농지 경작의 경우에서 외래도입유전자의 이동 조절의 문제를 야기한다. 또한, 상기 시스템들을 생산물의 낮은 수율 때문에 만약 폐쇄(온실) 환경에서 사용되면, 상업적으로 실용가능하지 않다.
식물 바이러스-기반 일시적 발현 시스템들(리뷰를 위해 Porta & Lomonossoff, 1996, Mol . Biotechnol ., 5, 209-221; Yusibov et al., 1999, Curr.Top. Microbiol . Immunol ., 240, 81-94; Gleba et al., 2004, Curr . Opin . Plant Biol ., 7, 182-188를 참조하라)은 식물 잎 조직에서 고 발현량을 제공할 수 있고, 생장과 생산 단계의 분리를 가능하게 하는 기술에 의해, 어느 정도까지는 재조합 단백질의 세포 독성과 식물 발달에 대한 그들의 해로운 영향의 문제를 다루는 것이 가능하다. 가장-안 정화되고 상업적으로 실용적인 시스템은 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터들, 바람직하게는 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus; TMV)-유래 벡터들(Kumagai et al ., 1994, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90, 427-430; Mallory et al ., 2002, Nature Biotechnol. 20, 622-625; US5316931; US5589367; US5866785; US5977438; WO02088369; WO02097080; WO0229068; US5491076)에 기반한다. 그러나 상기 시스템들은 간단하고, 상대적으로 작은 단백질의 생산에 그들의 사용이 제한되는 심각한 제한을 겪는다. 만약, 바이러스 벡터가 1 kb 이상의 이형 서열을 운반한다면, 일부분 이것은 바이러스 벡터의 비안정성과 야생종으로의 그들의 복귀의 고 빈도에 의해 발생한다. 또한, 기술의 심각한 제한점은 재조합 단백질의 가장 유용한 집단을 대표하는 치료용 단일 항체와 이들의 유도체와 같은 복잡한 이형-올리고머 단백질의 발현이 가능한 바이러스 벡터 시스템이 없다는 것이다.
식물 바이러스 벡터를 사용한 식물에서의 전체-길이 단일 항체의 발현을 다루는 문헌은 오직 하나뿐이다(Verch et al., 1998, J. Immunol . Meth ., 220, 69-75). 이 논문은 잎 전체에서 단일 항체의 중쇄와 경쇄의 발현을 위한, 두 가지 전신 TMV-기반 바이러스 벡터의 이용을 기술하고, 상기 벡터들의 in vitro 생합성 된 전사체로 니코티아나 벤타미아나 (N. benthamiana ) 식물들을 공동-감염함으로써 다른 사슬들은 다른 벡터에서 발현된다. 그러나 상기 시스템에서 재조합 단백질의 수율은 매우 낮아서 조합된 단일 항체의 존재 여부는 웨스턴 블랏팅과 ELISA와 같은 고 감도 테스트로 확인돼야한다. 재조합 단백질의 무시할 만한 수준의 수율 때문에, 상기 시스템은 실용적인 적용에 적당하지 않고, 상업적 가치가 없다. 두 개 또는 그 이상의 TMV-기반 바이러스 벡터는 일반적으로 감염된 식물의 동일한 식물조직에 존재하지 않기 때문에(실시예 1 참조), 검출된 항원 결합 활성은 분리된 세포 또는 조직에서 발현되는 중쇄 및 경쇄 항체로부터 정제 과정 동안 in vitro 조합된 항체에 기인할 것이다. 기능성 항체가 변성되고 환원된 항체 조성물로부터 in vitro 조합될 수 있는 것은 이미 알려져 있다(Petersen & Dorrington, 1974, J. Biol . Chem ., 17, 5633-5641; Maeda et al ., 1996, Protein Engineering, 9, 95-100). 그러나 상기 조합에 유용한 조건의 결여에서 상기 조합의 효율은 매우 낮다.
그러므로, 곰팡이 또는 곤충 세포 발현 시스템과 같은 다른 대-규모 발현 시스템의 시장과 경쟁하기에 충분한 수율과 효율의 식물에서 재조합 이형-올리고머 단백질을 위한 대-규모 발현 시스템은 없다. 상기 식물 발현은 가능한 하기의 기준을 충실히 이행해야 할 것이다:
(i) 가능한 많은 식물 조직과 상기 조직의 많은 세포에서 관심있는 이형-올리고머 단백질의 발현을 포함하는 고 수율;
(ii) 식물 생장에서 재조합 단백질 발현의 해로운 영향을 방지하기 위해, 단백질 또는 관심의 생산물의 발현은, 발현이 식물 발달의 원하는 단계에서 시작될 수 있는 것처럼 일시적(또는 변환 가능한) 이어야 한다;
(iii) 식물 세포에서 이형-올리고머 단백질의 상이한 서브유닛을 암호화하는 폴리단백질의 최적화된 비율을 제공하여, 상기 서브유닛으로부터 상기 재조합 단백질 조합의 수준에서 재조합 단백질의 고 수율을 지원함.
그러므로, 본 발명의 목적은 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포 배양에서 이형-올리고머 단백질 생산의 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 추가된 목적은 이형-올리고머 단백질 발현이 가능한 고-수율 식물 발현 시스템의 제공이다. 본 발명의 또 다른 목적은 동일한 식물 세포에서 관심있는 하나 이상의 폴리펩티드를 공동-발현하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다. 추가로, 본 발명의 목적은 식물, 식물 일부 또는 식물 세포 배양에서 항체를 발현하기 위한 빠르고 고-수율의 방법을 제공하는 것이다.
발명에 대한 일반적 설명
본 발명은 적어도 1차와 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질을 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 하기의 방법에 의해 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
(i) 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 적어도 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 적어도 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 적어도 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터가 비-경쟁의 바이러스 벡터에 의하고; 또는
(ii) 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공.
실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 그들이 상이한 바이러스 벡터라는 점에서 비-경쟁한다. 또 다른 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 그들이 동일한 RNA 바이러스로부터 유래되지 않았다는 점에서 비-경쟁한다. 또 다른 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 그들이 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열 부분을 제외한 서열 부분에서 상이하다는 점에서 비-경쟁한다. 또 다른 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 그들이 상이한 바이러스 종에 속하는 RNA 바이러스들로부터 유래된 점에서 비-경쟁한다. 또 다른 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 그들이 상이한 바이러스 속에 속하는 RNA 바이러스들로부터 유래된 점에서 비-경쟁한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 중쇄 및 경쇄 항체와 같은 적어도 1차와 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 항체를 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 하기의 방법에 의해 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하는 방법이다.
(i) 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 아그로박테리움-매개 형질감염에 의해 1차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터의 DNA 전구체 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터의 DNA 전구체를 제공하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 적어도 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 적어도 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 적어도 상기 1차 바이러스 벡터 또는 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 식물에서 상기 1차 또는 상기 2차 바이러스 벡터의 전신 이동에 필요한 기능성 단백질을 암호화하는 ORF(open reading frame)가 결여되고; 또는
(ii) 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 아그로박테리움-매개 형질감염에 의해 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터의 DNA 전구체를 제공하고, 상기 바이러스 벡터는 전신 이동에 필요한 기능적 단백질을 암호화하는 ORF(open reading frame)가 결여한다.
본 발명은 추가로 식물, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 1차와 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 식물 세포에서 하나 또는 그 이상의 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터(들)로부터 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 발현하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가된 실시예는 청구항들과 하기에서 기술된다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 식물에서 고 수율로 식물 바이러스 벡터를 이용하여 이형-올리고머 단백질의 생산하는 방법을 밝혀냈다. 식물에서 이형-올리고머 단백질의 효율적인 생산은 동일한 식물 세포에서 이형-올리고머 단백질의 상이한 단백질 서브유닛들의 고-수율 생산을 필요로 한다. 이런 식으로, 이형-올리고머 단백질은 상기 적어도 두 개의 단백질 서브유닛을 발현한 세포에서 소포체(endoplasmatic reticulum; ER)의 것들과 같은 상기 세포들의 자연 단백질 조립 능력을 사용하여 효율적으로 조립될 수 있다. 상기 이형-올리고머 단백질의 비능률적인 in vitro 조립은 그 결과 필요하지 않다. 본 발명은 상기 단계 (i) 또는 상기 단계 (ii) 또는 상기 단계 (i) 및 (ii)의 조합에 의한 동일한 세포에서 두 개 또는 그 이상의 단백질의 효율적인 공동-발현을 처음으로 달성한다.
상기 1차 단백질 서브유닛은 1차 이형(핵산) 서열에 의해 RNA 바이러스 벡터에 암호화된다. 상기 2차 단백질 서브유닛은 2차 이형(핵산) 서열에 의해 바이러스 벡터에 암호화된다. 상기 이형 서열들은 이와 같이 상기 바이러스 벡터(들)의 RNA 서열이고, 일반적으로 상기 단백질 서브유닛의 발현을 위해 필요한 조절 서열을 포함하거나 암호화한다. 상기 조절 서열의 예로는 서브게놈 프로모터, IRES 요소, 및 3'-비번역 서열이 있다. 여기에서, 서열은 바이러스 벡터(들)가(이) 유래한 바이러스에서 자연적으로 발생하지 않는다면 이형 서열이다.
본 발명에 따라서 생산 가능한 이형-올리고머 단백질은 적어도 1차와 2차 서브유닛을 포함하고, 상기 1차와 상기 2차 서브유닛은 상이한 폴리펩티드 서열을 갖는다. 그러므로, 상기 1차와 2차 서브유닛은 일반적으로 상이한 이형 핵산 서열로부터 발현되어야 한다. 올리고머 단백질의 서브유닛은 올리고머 단백질의 4차 구조를 형성하기 위해 조립된다. 서브유닛의 조립은 일반으로 서브유닛 사이에서 비-공유성 결합을 포함한다. 추가로, 예를 들어, 이황 결합과 같은 공유성 결합이 상기 단백질 서브유닛 사이에서 형성될 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 이형-올리고머 단백질은 이형-이량체 단백질, 즉, 두 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하는 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 이형-올리고머 단백질은 두 개 이상의 상이한 서브유닛, 즉, 3 개 또는 4 개의 상이한 서브유닛을 포함할 것이다(각각, 이형-삼량체 또는 이형-사량체 단백질). 추가된 실시예에서, 상기 이형-올리고머 단백질은 두 개의 상이한 서브유닛을 포함할 것이고, 상기 서브유닛들의 하나 또는 각각은 상기 이형-올리고머 단백질에 1회 이상 존재할 것이다. 상기 이형-올리고머 단백질의 서브유닛 조직의 예들로는 AaBb, AaBbCc, 및 AaBbCcDd이 있고, A 는 1차 단백질 서브유닛을 나타내고, B 는 2차 단백질 서브유닛을 나타내고, 및 C 와 D 는 추가의 단백질 서브유닛을 나타낸다. 각각의 대문자 A, B, C 및 D 는 다른 단백질 서브유닛과 상이한 단백질 서브유닛을 나타내고 소문자는 상기 이형-올리고머 단백질에서 각각의 단백질 서브유닛의 복제 수를 나타내는 최소한 1 이상의 정수를 나타낸다. 예로는 A가 1차 단백질 서브유닛(예를 들어, 중쇄)을 나타내고 B 는 2차 단백질 서브유닛(예를 들어, 경쇄)를 나타내는 서브유닛 조직 AaBb을 포함하는 IgG 항체가 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 생산된 이형-올리고머 단백질은 두 개 또는 세 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하고, 더욱 바람직하게는 두 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함한다.
본 발명의 방법에서, 적어도 상기 2차와 상기 2차 단백질 서브유닛은 상기 식물, 상기 식물 조직, 또는 상기 식물 세포의 세포에서 상기 단계 (i) 또는/및 상기 단계 (ii)에 의해 발현된다. 상기 단계 (i) 및 (ii)의 각각은 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 동일한 세포에서 발현하게 하고, 상기 이형-올리고머 단백질이 상기 세포에서 효율적으로 생산될 수 있다. 단계 (i) 및 (ii)는 특히 세 개, 네 개, 또는 그 이상의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질의 생산을 위해 나란히 실행될 수 있다(실시예 7 참조).
본 발명의 상기 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터(들)은 또한 "바이러스 벡터"로서 본 명서세에서 간단하게 지시된다. 일반적으로, 상기 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터들은 플러스-센스 단일-가닥 식물 RNA 바이러스들로부터 유래 된다.
단계 (ii)에서, 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포는 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터와 함께 제공된다. 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 상기 바이러스 벡터는, 삽입물로서, 1차 서브-게놈 프로모터의 조절을 받을 것인 상기 1차 단백질 서브유닛 발현을 암호화하는 1차 이형 서열을 포함한다. 더불어, 상기 바이러스 벡터는, 삽입물로서, 2차 서브-게놈 프로모터의 조절을 받은 것인 상기 2차 단백질 서브유닛 발현을 암호화하는 2차 이형 서열을 포함한다. 만약 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛 모두가 서브게놈 프로모터의 조절을 받아 발현된다면, 상기 서브게놈 프로모터는 상기 바이러스 벡터에서 식물 세포에서 불필요한 재조합 건을 야기하는 자가-상동성을 막기 위하여 바람직하게는 서열이 다를 것이다. 상기 상이한 서브게놈 프로모터는 식물 바이러스의 상이한 변종 또는 종으로부터, 예들 들면, 하나의 서브게놈 프로모터는 담배 모자이크 바이러스(tobacco mosaic virus; TMV) U1의 외피 단백질(coat protein; CP) 서브게놈 프로모터일 것이고(또는 이로부터 유래할 것이고), 다른 서브게놈 프로모터는 TMV U5의 CP 서브게놈 프로모터일 것이고(또는 이로부터 유래할 것이고), 또는 십자화과-감염 토바보바이러스(crucifer-infecting tobamovirus; cr-TMV)로부터 얻게 될 것이다.
상기 1차 또는 상기 2차 서브게놈 프로모터 대신에, 상기 1차 또는 상기 2차 단백질의 서브유닛의 번역은 IRES(내부 리보솜 진입 부위; internal ribosome entry site)의 조절을 받게 될 것이다. 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛 모두의 번역이 IRES 요소의 조절을 받더라도, 상기 단백질 서브유닛의 적어도 하나는 서브게놈 프로모터를 사용하여 발현되는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되기 위한 IRES 요소은 cr-TMV 와 같은 식물 바이러스들 또는 다른 식물 바이러스들로부터 수득될 것이다(Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 5301-6; Virology 1999, 263, 139-54; WO03020927; WO0229068).
단계 (ii)의 상기 바이러스 벡터는 바람직하게도 상기 식물 또는 상기 식물 조직에서 전신 이동이 불가능하다. 이것은 예를 들어 바이러스성 입자 조립의 기능성 기원의 삭제에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 토바모바이러스(tobamoviruses)에서, 바이러스성 입자 조립의 기원은 MP ORF에 위치한다. 그러므로, 바이러스성 입자 조립의 기원은 상기 바이러스 벡터로부터 MP ORF의 전체 또는 일부의 결실에 의해 삭제될 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 그러므로, 바람직하게 기능성 이동 단백질(movement protein; MP) ORF가 없다. 더욱 바람직하게, 상기 바이러스 벡터는 상기 바이러스 벡터의 전신 이동에 필수적인 기능성 단백질이 없다. 상기 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 기능성 외피 단백질 ORF가 없을 것이고, 가장 바람직하게 상기 바이러스 벡터는 기능성 이동 단백질 ORF 및 기능성 외피 단백질 ORF가 없다. 바이러스 벡터로부터의 MP ORF 및/또는 CP ORF의 삭제는 바이러스 벡터 안정성의 손상 없이 상기 바이러스 벡터에 적어도 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하기 위한 더 많은 공간을 제공한다. 상기 실시예에서, 상기 바이러스 벡터는 많은 세포에서의 감염을 이루기 위해 바람직하게 상기 식물 또는 상기 식물 조직의 많은 세포에 제공된다. 상기는 아그로박테리움을 이용한 상기 RNA 바이러스 벡터의 DNA 전구체를 T-DNA로서 제공함으로써 가장 잘 달성될 것이다(하기 참조).
단계 (ii)의 바이러스 상기 바이러스 벡터는 예를 들어, "상세한 기술" 단원에서 열거된 모든 플러스-센스 단일-가닥 식물 RNA 바이러스로부터 유래한다. 바이러스의 바람직한 그룹은 토바모바이러스(tobamoviruses), 포텍스바이러스(Potexviruses), 및 포티바이러스(Potyviruses)이다. 가장 바람직한 바이러스들은 TMV 및 PVX 이다. 상기 바이러스는 적어도 그것이 유래한 바이러스로부터 상기 바이러스 벡터의 복제에 필요한 암호화 단백질의 ORF를 포함할 것이다. 상기 바이러스 벡터는 일반적으로 추가로 바이러스 복제를 위한 조절 성분 및 적어도 하나의 서브게놈 프로모터를 포함한다.
단계 (i)에서, 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포는 1차와 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 1차 바이러스 벡터는 적어도 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 적어도 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화한다.
단계 (i)는 두 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질을 생산하도록 한다. 단계 (i)는 또한 두 개 이상의 상이한 단백질 서브유닛, 예를 들어 세 개 또는 네 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질을 생산하도록 한다. 이런 경우에는, 상기 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 각각 상기 상이한 단백질 서브유닛의 하나를 각각 암호화하는 1차, 2차, 및 3차 바이러스 벡터(그리고 선택적으로 그 이상의 바이러스 벡터)를 포함할 것이다. 만약 세 개 또는 네 개의 상이한 단백질 서브유닛이 단계 (i)에서 발현돼야 한다면, 각각의 세 개 또는 네 개의 바이러스 벡터는 바람직하게는 모두 상호 간에 비-경쟁의 바이러스 벡터들이다. 세 개의 바이러스 벡터의 경우에서, 1차 바이러스 벡터는 토바모바이러스로부터 유래할 것이고, 2차 바이러스 벡터는 포티바이러스로부터 유래할 것이고, 및 3차 바이러스 벡터는 포텍스바이러스로부터 유래할 것이다.
두 개의 바이러스 벡터는 만약 동일한 식물 세포에서 그것들이 암호화하는 단백질 서브유닛들을 효과적으로 발현할 수 있다면(공동-발현), 비-경쟁한다. 공동-발현은 두 개의 상이한 바이러스 벡터가 그것들이 암호화하는 이형 서열의 상당한 양이 발현되기 전에 복제하는 동안 적어도 서로에게 경쟁하지 않는 것을 필요로 한다. 상기 적어도 두 개의 바이러스 벡터의 RNA 수준에서 서열이 많이 상이할수록 그것들은 동일한 식물 세포에서 더욱 비-경쟁한다. 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 상이한 바이러스 벡터들이기 때문에, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 비-경쟁의 바이러스 벡터이다.
비-경쟁이 되기 위해서, 상기 1차와 상기 2차 바이러스 벡터(상기 두 개의 비-경쟁의 바이러스 벡터들)들은 일반적인 실시예에서, 적어도 상기 단백질 서브유닛을 암호화하는 상기 이형 서열을 제외한 서열 부분에서 다르다. 바람직하게는, 상기 이형 서열을 제외한 서열 부분에서의 상기 상이함은 식물 세포에서 바이러스 복제(예를 들어, 레플리카아제를 암호화하는 서열), 바이러스성 단백질의 번역(예를 들어, 서브게놈 프로모터) 또는 바이러스성 세포간(cell-to-cell) 또는 장거리 이동과 같은 바이러스성 기능을 포함하는 서열 부분과 같은 식물 RNA 바이러스로부터 유래한 서열 부분이다.
비-경쟁이 되기 위해서, 상기 1차와 상기 2차 바이러스 벡터(상기 두 개의 비-경쟁 바이러스 벡터들)들은 일반적인 실시예에서, 동일한 식물 바이러스들로부터 유래하지 않는다. 상기 실시예의 하나의 예에서, 상기 적어도 두 개의 비-경쟁의 바이러스 벡터들은 동일한 바이러스 변종의 바이러스들로부터 유래하지 않는다. 또 다른 예에서, 상기 적어도 두 개의 비-경쟁의 바이러스 벡터는 동일한 바이러스 종의 바이러스들로부터 유래하지 않는다. 추가된 예에서, 상기 적어도 두 개의 비-경쟁의 바이러스 벡터들은 동일한 바이러스 속의 바이러스들로부터 유래하지 않는다. 그러므로, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 바람직하게는 다른 변종의 바이러스들, 더욱 바람직하게는 다른 종의 바이러스들, 가장 바람직하게는 다른 속의 바이러스들로부터 유래한다.
상기 1차 바이러스 벡터는 포텍스바이러스 속에 속하는 바이러스로부터 유래할 것이고, 상기 2차 바이러스 벡터는 포티바이러스 속에 속하는 바이러스로부터 유래할 것이다. 특히, 상기 1차 바이러스 벡터는 감자 바이러스 X(Potato Virus X)로부터 유래할 것이고, 상기 2차 바이러스 벡터는 감자 바이러스 Y(Potato Virus Y)로부터 유래할 것이다.
포티바이러스성 벡터의 경우에서, 상기 단백질 서브유닛은 바이러스성 폴리단백질과의 융합으로 발현될 수 있을 것이고, 본 발명의 단백질 서브유닛은 포티바이러스성 프로테아제 인식 부위에 의해 상기 폴리단백질로부터 분리될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터는 포텍스바이러스 속에 속하는 바이러스로부터 유래할 것이고, 상기 2차 바이러스 벡터는 토바모바이러스 속에 속하는 바이러스로부터 유래할 것이다. 특히, 상기 1차 바이러스 벡터는 감자 바이러스 X(Potato Virus X)로부터 유래하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus)로부터 유래할 것이다.
"바이러스로부터 유래함"은 바이러스 벡터가 그것이 유래한 바이러스로부터 유전물질 또는 서열 부분을 포함하는 것을 의미한다. 하나의 실시예에서, 상기 바이러스 벡터(들)는(은) RNA 바이러스로부터 수득한 레플리카아제 ORF(open reading frame)를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 바이러스 벡터는 RNA 바이러스로부터 이동 단백질 ORF와, 선택적으로, 또한 레플리카아제 ORF를 포함한다. RNA 바이러스로부터 수득한 바이러스성 유전물질은, 만약 필요하다면, 예를 들어, 바이러스 벡터의 클로닝에 필요한 제한 부위를 도입하게 위해 돌연변이 될 것이다.
상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터가 모두 담배 모자이크 바이러스 벡터 TMV 30 B로부터 기반한 실시예가 본 발명의 방법의 단계 (i)로부터 제외된 것은, 이런 경우에는 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 상이한 바이러스 벡터가 아니라 동일한 바이러스 벡터이기 때문이다(Verch et al., J. Immunological Methods 220 (1998) 69-75 을 참조하라).
상기 1차와 상기 2차 바이러스 벡터(상기 비-경쟁의 바이러스 벡터들)는 RNA 레벨에서 바람직하게 최대 90%, 더 바람직하게는 최대 80%, 더욱 바람직하게는 최대 70%, 및 가장 바람직하게는 최대 60%의 서열 상동성을 가진다. 더욱 명확하게는, 100개의 염기의 상기 1차 바이러스 벡터의 모든 서열 단편은 바람직하게 상기 2차 바이러스 벡터의 100개의 염기의 모든 서열 단편에 최대 90%, 바람직하게 최대 80%, 더욱 바람직하게 70%, 및 가장 바람직하게 60%의 서열 상동성을 가진다.
하나의 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF(또는 레플리카아제가 하나 이상의 ORF로 암호화되었다면, ORF들)와 상기 2차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF(또는 레플리카아제가 하나 이상의 ORF로 암호화되었다면, ORF들)는 최대 90%, 더 바람직하게는 최대 80%, 더욱 바람직하게는 최대 70%, 및 가장 바람직하게는 최대 60%의 상동성을 가진다. 또 다른 실시예에서, 상기 1차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF와 상기 2차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF는 최대 85%, 더 바람직하게는 최대 75%, 더욱 바람직하게는 최대 65%, 및 가장 바람직하게는 최대 55%의 동일성을 갖는다.
단계 (i)에서, 상기 1차 바이러스 벡터는 바람직하게 1차 서브-게놈 프로모터의 조절을 받을 것인 상기 1차 단백질 서브유닛 발현을 암호화하는 1차 이형 서열을 포함한다. 상기 2차 바이러스 벡터는 2차 서브게놈 프로모터의 조절을 받을 것인 상기 2차 단백질 서브유닛 발현을 암호화하는 2차 이형 서열을 포함한다. 상기 서브게놈 프로모터들의 하나 또는 모두는 IRES 요소에 의해 대체될 것이다. 단계 (ii)에 대해 상기에서 기술된 것과 유사하게, 만약 상기 1차와 2차 단백질 서브유닛 둘은 서브게놈 프로모터의 조절에 의해 발현된다면, 상기 서브게놈 프로모터들은 식물 세포에서 원하지 않은 재조합을 이끌어 낼 수 있는 상기 1차와 상기 2차(및 모든 추가의 바이러스 벡터) 바이러스 벡터 사이의 상동성을 막기 위해 바람직하게 서열이 상이하다. 상기 상이한 서브게놈 프로모터들은 식물 바이러스의 상이한 변종 또는 종으로부터 수득 될 것이고, 예를 들어, 하나의 서브게놈 프로모터는 담배 모자이크 바이러스(TMV) U1의 외피 단백질(CP) 서브게놈 프로모터일 것이고, 다른 서브게놈 프로모터는 TMV U5의 CP 서브게놈 프로모터일 것이고, 또는 십자화과-감염 토바모바이러스(cr-TMV)로부터 수득 될 것이다.
세포 간 또는 장거리 이동을 위해 필요한 식물 바이러스의 ORF들은 본 발명의 바이러스 벡터 설계 시에 제거될 것이기 때문에, 상기 비-경쟁의 바이러스 벡터들의 관계는 상기 바이러스 벡터들의 레플리카아제 ORF를 비교함으로써 결정될 것이다.
상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 상기 1차와 상기 2차 이형 서열들은 각각 상기 바이러스 벡터들에 추가적인 서열로 첨가될 것이다. 상기 이형 서열들은 바람직하게는 고 수준 발현이 달성되도록 첨가된다. 상기 목적을 달성하기 위해, 상기 이형 서열이 바이러스의 3' 말단에 첨가되고, 3' ORF는 종종 많은 바이러스에서 최고 수준으로 발현되는 ORF이기 때문이다. 그러나 바람직하게는 상기 이형 서열, 예를 들면, 토바모바이러스와 같은 많은 바이러스에서 CP ORF인 상기 바이러스의 자연 그대로의 3' ORF는 상기 바이러스에서 본래의 서열을 대신한다. 그러므로, 상기 1차 및/또는 상기 2차 바이러스 벡터는 바람직하게 상기 바이러스 벡터의 전신 이동을 위한 ORF를 결여한다. 상기 바이러스 벡터는 토바모바이러스에서 MP ORF와 같은 세포간 이동을 위한 ORF를 추가로 결여할 수 있다.
본 발명에서, 특히, 이형-올리고머 단백질의 세 개 또는 그 이상의 상이한 서브유닛의 발현을 위해, 단계 (i)와 단계 (ii)는 결합될 것이다. 만약 네 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질이 생산되면, 두 개의 단백질 서브유닛은 단계 (i)에 따라 발현될 것이고, 두 개의 추가의 단백질 서브유닛은 단계 (ii)에 따라서 식물 또는 식물 조직의 세포에서 생산될 것이다. 그러나 바람직하게는, 두 개의 단백질 서브유닛은 1차 바이러스 벡터로부터 발현될 것이고, 두 개의 단백질 서브유닛은 1차 바이러스 벡터와 비-경쟁인 2차 바이러스 벡터로부터 발현될 것이다. 만약 세 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하는 이형-올리고머 단백질이 생산된다면, 상기 세 개의 단백질 서브유닛은 단계 (ii)에 기술된 것과 유사하게 1차 바이러스 벡터로부터 두 개의 단백질을 발현하고 비-경쟁의 바이러스 벡터로부터 세 번째 단백질 서브유닛을 발현함으로써 단계 (i)에 따라 발현될 것이다.
본 발명의 바이러스 벡터들은 일반적으로 DNA 수준에서 유전자조작된다. 만약 상기 바이러스 벡터가 RNA 바이러스 벡터로서 식물의 세포 또는 식물 조직의 세포를 포함한, 상기 DNA는 in vitro로 상기 RNA 바이러스 벡터에서, 예들 들어, 적절한 프로모터와 함께 T7 중합효소와 같은 박테리오파아지 중합효소를 사용하여 복제될 것이다. 두 개의 상이한 바이러스 벡터는 바람직하게는 상기 식물의 세포가 양쪽의 바이러스 벡터들을 포함하는 지를 확인하기 위해 혼합물로서 상기 식물에 적용될 것이다. 그러나 바람직하게는, 본 발명의 바이러스 벡터들은 상기 식물 또는 상기 식물 조직을 상기 RNA 바이러스 벡터의 DNA 전구체들로 형질전환 함으로써 식물의 세포 또는 식물 조직의 세포에 제공된다. 상기 DNA 전구체들은 상기 DNA 전구체의 전사에 의해 상기 바이러스 벡터들을 형성하기 위해 상기 식물의 세포에서 전사 프로모터 활성을 지닌다. 가장 바람직하게는, 상기 DNA 전구체는 아그로박테리아 Ti 플라스미드의 T-DNA 이다. 두 개 또는 그 이상의 바이러스 벡터들은 상기 식물 또는 상기 식물 조직에 두 개 또는 그 이상의 아그로박테리움 변종의 혼합물(예를 들어, 현탁액)과 함께 상기 식물을 처리함으로써 제공될 것이고, 각각의 변종들은 특정 바이러스 벡터를 암호화하는 T-DNA를 포함한다. 아그로박테리움 현탁액과 같은 것으로 식물의 실체 부분을 처리하는 것은 자연의 식물 바이러스의 전신 이동 기능 및/또는 세포간 이동 기능을 대체할 것이다.
아그로박테리움 방법에 의한 상기 바이러스 벡터의 DNA 전구체를 이용한 상기 식물, 식물 조직 또는 식물 세포의 일시적 형질감염은 본 발명에서 가장 바람직하다. 그러나 상기 바이러스 벡터들의 상기 DNA 전구체들은 식물 염색체 DNA에 안정적으로 도입될 것이다. 염색체 DNA로부터 상기 바이러스 벡터(들)의 방출은 유도성 프로모터에 의해 조절될 것이다.
만약, 상기 바이러스 벡터들이 DNA 전구체 방법에 의해 상기 식물에 제공된다면, 바이러스 벡터가 전사되는 세포 핵으로부터 바이러스 벡터가 복제되는 세포질로의 상기 바이러스 벡터의 이동 효율을 향상시키기 위한 수단을 취하는 것이 바람직하다. 이것은 상기 DNA 전구체들에, 특히 본 명세서에 참조로 포함된 국제 특허 출원 PCT/EP05/000492, 공개 WO2005/71090에서 자세히 기술된 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF에, 인트론을 포함함으로써 달성될 것이다.
본 발명의 방법은 식물 바이러스 발현 시스템이 존재하는 모든 식물에 적용되거나 또는 장차 수행될 것이다. 상기 식물은 단자엽 또는 쌍자엽이 될 것이다. 쌍자엽중에서, 가지과(Solanaceae), 십자화과(Brassicaceae), 명아주과(Chenopodiaceae), 및 협과(Legume)가 바람직하다. 가지과 중에서, 담배(N. tabacum) 또는 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana)와 같은 담배(Nicotiana) 속이 바람직하다. 다른 바람직한 식물은 알파파(Medicago sativa)와 사탕무우(Beta vulgaris)와 같은 베타(Beta) 종이다.
본 발명의 방법은 식물 시스템에서 이형-올리고머 단백질의 생산을 위해 사용된다. 바람직한 이형-올리고머 단백질은 하기 종류의 면역단백질과 같은 면역단백질이다: 면역단백질 G, 면역단백질 A, 면역단백질 M, 면역단백질 D, 및 면역단백질 E. 상기 면역단백질들은 적어도 항원 결합 도메인 부분을 포함할 것이다. 필요한 경우에 따라서, 본 발명에 따라 생산된 상기 면역단백질들은 자연 동물 면역단백질들에 관하여 변형되고, 적어도 두 개의 상이한 단백질 서브유닛을 포함하도록 제공될 것이다. 면역단백질들은 면역단백질 중쇄와 공동으로 방어 단백질을 포함할 것이고, 방어 단백질은 폴리면역단백질 수용체의 일부를 포함한다. 또 다른 바람직한 이형-올리고머 단백질은 인슐린이다.
본 발명의 이형-올리고머 단백질은 필요한 경우에 따라서 천연 단백질에 관하여 많은 상이한 방법으로 변형될 것이다. 이형-올리고머 단백질에서, 천연 이형-올리고머 단백질의 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유닛의 분비 신호(secretion signal)를 형성하는 천연 리더 시퀀스(native leader sequence)는 식물-특이적 신호 펩티드(signal peptide)에 의해 대체될 것이다. 상기 식물-특이적 신호 펩티드는 담배 칼레티큘린(Calreticulin) 및/또는 쌀 알파-아밀라아제(alpha-amylase)로부터 유래될 것이다. 상기 이형-올리고머 단백질의 적어도 하나 또는 적어도 두 개 또는 그 이상의 서브유닛은 식물 세포에서 상기 서브유닛으로부터 상기 이형-올리고머 단백질의 조립을 개선하기 위해 소포체 보유 신호 KDEL(endoplasmatic reticulum retention signal KDEL)을 포함할 것이다. 더불어, 상기 단백질 서브유닛을 암호화하는 상기 이형 서열은 상기 이형-올리고머 단백질로부터 당화(glycosylation) 부위를 일부 또는 전부 제거하기 위해 돌연 변이될 것이다. 게다가, 발현될 이형-올리고머 단백질의 당화 패턴은, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 글리코실 전이효소(glycosyl transferases)와 같은 식물 당화 기구의 성분을 유전자 조작함으로써 변경될 것이다.
본 발명의 이형-올리고머 단백질은 일반적으로 알려진 절차에 따른 발현 후에 식물, 식물 조직 또는 식물 세포로부터 분리될 것이다. 상기 이형-올리고머 단백질은 이어서 상당한 균질성으로 정제될 것이고, 상태는 쿠마시-염색된 SDS-PAGE에서 상기 이형-올리고머 단백질에 기인하는 밴드가 기존의 겔 리더기에 의해 결정된 레인의 염색의 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 및 가장 바람직하게 적어도 90% 인 것을 만족하는지 확인될 것이다.
발명의 상세한 기술
본 발명에서 기술한 바이러스 벡터들은 상기 이형-올리고머 단백질을 형성하기 위해 필요한 모든 단백질 서브유닛을 암호화하는 단일 벡터, 또는 적어도 두 개의 상이한 비-경쟁의 바이러스 벡터들이고, 상기 적어도 두 개의 바이러스 벡터의 각각은 상기 이형-올리고머 단백질 형성에 필요한 상이한 단백질 서브유닛을 암호화한다. 상기 비-경쟁의 바이러스 벡터의 각각은 재조합 이형-올리고머 단백질의 하나의 서브유닛 이상을 암호화하는 하나 이상의 이형 핵산 서열을 발현할 수 있다. 상기 RNA 바이러스 벡터는 식물 세포에 일시적으로 전달될 수 있거나 또는 DNA 전구체로서 식물의 염색체 DNA에 안정적으로 도입될 수 있다.
본 발명은 식물 세포에서 이형-올리고머 단백질의 고-수율 생산을 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 발현될 이형 서열의 크기 제한, 상기 벡터의 높은 불안정성과 동일한 식물 세포에서 상이한 이형 핵산 서열의 공동-발현에 대한 무능력함과 같은, 현존하는 바이러스 벡터-기반 발현 시스템의 한계를 극복한다. 더불어, 시스템으로부터 바이러스성 외피 단백질의 제거가 감염성 바이러스성 입자의 형성과 야생형 바이러스로의 복귀를 막는 것과 같이, 상기 방법은 더 좋은 생물안정성 특성을 제공한다. 발명의 실행에 의하여, 관심 있는 이형-올리고머 단백질의 고-수율 발현 시스템의 설계는 실질상 모든 식물 RNA 바이러스-유래 레플리콘에서 가능하고, 상기 레플리콘은 관심 있는 이형-올리고머 단백질의 상이한 서브유닛을 암호화하는 관심 있는 적어도 두 개의 이형 서열을 발현 가능하도록 상기 레플리콘을 변이함으로써 관심 있는 이형 서열의 발현에 적당하다. 선택적으로, 또 다른 비-경쟁의 바이러스 벡터는 동일한 식물 세포에서 상기 바이러스 벡터와 함께 공동-복제가 가능함이 발견될 수 있다.
상이한 분류학적 그룹에 속하는 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스(또한, 본 명세서에서 간략하게 "RNA 바이러스"로 불림)는 본 발명의 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터(또한, 본 명세서에서 간략하게 "바이러스 벡터"로 불림)의 제작에 적당하다. 본 명세서에서, 바이러스 벡터는 식물 세포에서 복제 가능한 RNA 벡터, 즉, 주형으로서 RNA 바이러스 벡터를 사용하는 RNA-의존성 RNA 중합반응에 의한 추가의 RNA 벡터 분자를 형성한다. 바람직하게는 본 발명의 바이러스 벡터는 RNA 바이러스성 기능을 지니는 적어도 하나의 바이러스 서열 성분, 예를 들면, 레플리카아제, 서브게놈 프로모터, 바이러스성 입자 조립의 기원, 외피 단백질 ORF, 또는 이동 단백질 ORF를 포함한다. 더불어, 바이러스 벡터는 RNA 바이러스성 IRES 요소을 포함할 것이다.
바이러스 벡터는 예를 들면, 바이러스에 제한효소 자리를 삽입함으로써 바이러스가 유래한 바이러스로부터 제조될 수 있고, 상기 제한효소 자리는 본 발명의 이형 서열을 삽입하기에 적당한 클로닝 자리를 나타낸다. RNA 바이러스 또는 벡터에서 핵산의 유전자 조작은 일반적으로 상기 RNA 바이러스 또는 벡터의 각각의 DNA 복사본을 사용하여 DNA 수준에서 수행되는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러므로, RNA 바이러스 벡터의 DNA 복사본이 RNA 바이러스의 DNA 복사본에 제한효소 자리를 도입함으로써 RNA 바이러스가 유래한 RNA 바이러스의 DNA 복사본으로부터 제조되었다고 하는 것이 좀 더 정확하고, 상기 제한효소 자리는 DNA 수준에서 본 발명의 이형 서열의 DNA 복사본의 도입에 적당한 클로닝 자리를 나타낸다. 상기 문제들은 당업자에게 자명하고, 본 명세서에서 보통은 강조되지 않을 것이다.
만약 RNA 바이러스의 DNA 복사본이 클로닝에 적절한 제한효소 자리를 자연적으로 지닌다면, 바이러스가 자체가 바이러스 벡터가 될 것이다. 본 명세서에서, 용어 "바이러스 벡터"는 상기 이형 서열이 상기 벡터에 존재하지 않는 경우 또는 본 발명의 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열이 벡터에 존재하지 않는 경우를 나타낸다. 상기 이형 서열 또는 본 발명의 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열이 상기 바이러스 벡터에 삽입된 경우는 상기 삽입물의 존재를 명확히 상술함으로써 확인된다.
본 명세서에서, 만약 두 개의 바이러스 벡터의 서열이 상기 이형 서열 또는 본 발명의 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열이 도입되기 전에 상이하면, 두 개의 바이러스 벡터는 상이한 것으로서 나타내진다. 만약 두 개의 바이러스 벡터의 서열이 상기 이형 서열 또는 본 발명의 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열이 도입되기 전에 동일하면, 두 개의 바이러스 벡터는 동일한 것으로서 나타내진다. 그러므로, 상기 이형 서열 또는 본 발명의 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열은 두 개의 바이러스 벡터가 상이하거나 또는 동일한 것이 결정되는 때에 고려되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "레플리콘" 또는 "바이러스 레플리콘"은 "바이러스 벡터"와 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 바이러스 벡터를 유전공학적 조작하기 위해 사용될 수 있는 RNA 바이러스의 목록이 하기에 나타낸다. 인용된 분류군 명(그리고 이탤릭체가 아님)은 상기 분류군이 ICTV 국제 공인 명칭을 갖지 않는 것을 나타낸다. 종(속) 명은 정자로 제공된다. 속 또는 과에 대한 공식 명칭이 할당되지 않은 바이러스는 표시된다):
RNA 바이러스:
ssRNA 바이러스:
과: 브로모비리대 ( Bromoviridae ),
속: 알파모바이러스 ( Alfamovirus ), 모식종 : 알팔파모자이크바이러스(alfalfa mosaic virus),
속: 이라바이러스 ( Ilarvirus ), 모식종 : 담배위축바이러스(tobacco streak virus),
속: 브로모바이러스 ( Bromovirus ), 모식종 : 브롬모자이크바이러스(brome mosaic virus),
속: 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus), 모식종 : 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus);
과: 클로스테로비리대 ( Closteroviridae ),
속: 클로스테로바이러스 ( Closterovirus ), 모식종 : 사탕수수황화바이러스(beet yellows virus),
속: 크리니바이러스( Crinivirus) , 모식종 : 전염성 양상추황화바이러스(Lettuce infectious yellows virus),
과: 코모비리대 ( Comoviridae ),
속: 코모바이러스 ( Comovirus ), 모식종 : 동부모자이크바이러스(cowpea mosaic virus),
속: 파바바이러스( Fabavirus) , 모식종 : 잠두위조바이러스(broad bean wilt virus 1),
속: 네포바이러스( Nepovirus) , 모식종 : 담배윤문바이러스(tobacco ringspot virus);
과: 포티비리대 ( Potyviridae ),
속: 포티바이러스( Potyvirus) , 모식종 : 감자바이러스 Y(potato virus Y), 자두곰보병 바이러스(plum pox virus); 담배식각바이러스(tobacco etch virus); 크로버 엽맥황화 바이러스(clover yellow vein virus); 담배 엽맥 반점 바이러스(tobacco vein mottling virus);
속: 리모바이러스 ( Rymovirus ), 모식종 : 독보리모자이크바이러스( ryegrass mosaic virus ),
속: 비모바이러스 ( Bymovirus ), 모식종 : 보리황화모자이크바이러스(barley yellow mosaic virus);
과: 시퀴비리대 ( Sequiviridae ),
속: 시퀴바이러스( Sequivirus) , 모식종 : 파스닙황화반점바이러스(parsnip yellow fleck virus),
속: 와이카바이러스 ( Waikavirus ), 모식종 : 벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus);
과: 톰부스비리대 ( Tombusviridae ),
속: 카르모바이러스(Carmovirus ), 모식종 : 카네이션반점바이러스(carnation mottle virus),
속: 디안쏘바이러스 ( Dianthovirus ), 모식종 : 카네이션윤문바이러스(carnation ringspot virus),
속: 마클로모바이러스 ( Machlomovirus ), 모식종 : 옥수수황화반점바이러스(maize chlorotic mottle virus),
속: 네크로바이러스 ( Necrovirus ), 모식종 : 담배괴저바이러스(tobacco necrosis virus),
속: 톰부스바이러스 ( Tombusvirus ), 모식종 : 토마토 덤불 발육 저해 바이러스(tomato bushy stunt virus),
ssRNA 바이러스의 비할당 속,
속: 캐필로바이러스 ( Capillovirus ), 모식종 : 사과줄기홈바이러스(apple stem grooving virus);
속: 카르라바이러스 ( Carlavirus ), 모식종 : 카네이션 잠복 바이러스(carnation latent virus);
속: 에나모바이러스 ( Enamovirus ), 모식종 : 완두주름모자이크바이러스(pea enation mosaic virus),
속: 푸로바이러스( Furovirus) , 모식종 : 보리오갈모자이크바이러스(soil-borne wheat mosaic virus),
속: 호르데이바이러스 ( Hordeivirus ), 모식종 : 보리줄무늬모자이크바이러스(barley stripe mosaic virus),
속: 이대오바이러스 ( Idaeovirus ), 모식종 : 라즈베리 덤불 왜화 바이러스(raspberry bushy dwarf virus);
속: 루테오바이러스( Luteovirus) , 모식종 : 보리누른왜화바이러스(barley yellow dwarf virus);
속: Marafivirus , 모식종 : maize rayado fino virus;
속: Potexvirus(포텍스바이러스 ), 모식종 : 감자바이러스 X(potato virus X);
속: Sobemovirus , 모식종 : 남부콩모자이크바이러스(Southern bean mosaic virus),
속: 테누이바이러스 ( Tenuivirus ), 모식종 : 벼줄무늬바이러스(rice stripe virus),
속: 토바모바이러스 ( Tobamovirus ), 모식종 : 담배모자이크바이러스(tobacco mosaic virus),
속: 토브라바이러스( Tobravirus) , 모식종 : 담배얼룩바이러스(tobacco rattle virus),
속: 트리코바이러스 ( Trichovirus ), 모식종 : 사과황화잎반점바이러스(Apple chlorotic leaf spot virus);
속: 티모바이러스 ( Tymovirus ), 모식종 : 순무황화모자이크바이러스(turnip yellow mosaic virus);
속: 움브라바이러스( Umbravirus) , 모식종 : 당근반점바이러스(carrot mottle virus);
음성( negative ) ssRNA 바이러스: 목: 모노네가바이러스 ( Mononegavirales ), 과: 라브도비리대 ( Rhabdoviridae ), 속: 사이토라브도바이러스( Cytorhabdovirus) , 모식종 : 상추괴저황화바이러스 ( lettuce necrotic yellows virus ),
속: 뉴클레오라브도바이러스( Nucleorhabdovirus) , 모식종 : 감자누른왜화바이러스(potato yellow dwarf virus).
RNA 바이러스 벡터는 식물에서 관심 유전자를 발현하기 하게 이형 RNA의 매우 많은 복제본을 제공하는 것이 가능하다. 그러나 만약 이형 핵산 서열의 크기가 특정 제한을 넘어서 커지면, 보통 1 kb 이하, 상기 벡터들은 극심하게 불안정해지는 것으로 알려져 있다. 이런 제한 때문에, 이런 벡터 시스템의 적용은 지금까지 상대적으로 작고 단순한 것부터 중간 크기의 단백질의 발현에 국한되어 왔다. 크거나 또는 복잡한 이형-올리고머 단백질을 발현하려는 시도들은 성공적인 결과를 내지 못해왔다. 본 발명자들은 놀랍게도 바이러스 벡터가 전에는 가능하지 않았던 복잡한 이형-올리고머 단백질의 고-수율 발현을 위해 성공적으로 적용될 수 있음을 발견했다. 전체 길이 단일 항체의 발현을 위한 초기의 시도들(Verch et al ., 1998, J. Immunol . Meth ., 220, 69-75)은 동일한 세포에서 관심 단백질의 공동-발현을 위해 사용된 바이러스 벡터의 불친화성 때문에 만족스러운 결과를 제공하지 못했다. 실시예 1에서 본 발명자들은 동일한 식물 RNA 바이러스(TMV)로부터 유래한 바이러스 레플리콘들로 두 개의 상이한 유전자(GFP 및 DsRed)의 유효한 공동-발현이 가능하지 않음을 단일 세포 수준에서 증명하였다. 도 1 (A-오른쪽 패널)에서 본 발명자들은 양쪽 리포터 유전자 - DsRed 및 GFP의 발현을 보이는 원형질체를 검출할 수 없었다. 오른쪽 하단 패널에서 다소의 원형질체 안에서 DsRed의 약한 발현 패턴은 강한 GFP 발현(오른쪽 상단 패널)과 동시에 발생하고, DsRed 검출에 사용된 필터의 누출(leakage)에 기인한 거짓-양성 반응(False Positive) 결과이다. 상기 누출은 높은 농도의 GFP를 포함하는 원형질체의 명백히 약한 DsRed 형광을 유도한다. 그러므로, 동일하거나 또는 상동(homology)의 넓은 영역을 공유하는 RNA 레플리콘들은 상이한 재조합 단백질을 암호화하는 상이한 이형 핵산 서열을 운반하더라도 하나의 식물 세포에서 공동-존재할 수 없다. 상기 현상의 이유는 현재 알려져 있지 않다. 가능한 설명은 하나의 바이러스 레플리콘의 복제본 수의 급격한 증가는 다른 바이러스 레플리콘이 빠른 초과경쟁을 초래한다는 것이다. 그래서 선택된 세포에서 복제를 시작하려는 2차 레플리콘은 1차 레플리콘을 따라잡을 수 없고, "1차" 레플리콘을 결정하는 사건은 통계적 성격이 우세하다.
상기 문제를 해결하기 위한 연구 중, 본 발명자들은 바이러스 레플리콘을 제작하였고, 두 개의 상이한 서브게놈 프로모터의 조절을 받는 상이한 단백질을 암호화하는 두 개의 상이한 이형 핵산 서열이 상기 레플리콘에 존재한다. 상기 RNA 레플리콘을 암호화하는 T-DNA 영역의 일반 모식도는 도 2에서 나타낸다. 상기 벡터의 설계와 최적화를 위해 편의상, 본 발명자들은 본 발명자들의 이전 특허 출원에서 기술된 프로-벡터 접근법을 사용하였다(WO02088369; Marillonnet et al., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 101, 6852-6857 도 참조하시오). 상기 접근법은 자리-특이적 재조합에 의하여 이미-만들어져 있는 기본 단위로부터 최종 벡터를 in planta로 조립가능하게 하고, 그러므로 벡터 설계와 벡터 최적화의 능률을 상당히 올린다. 제조물의 설계는 실시예 2에서 상술 되고, 모식도는 도 3에서 나타낸다.
본 발명자들은 놀랍게도 최종 레플리콘의 삽입물이 더 큰 크기와 두 개의 강한 서브게놈 프로모터의 존재에 기인한 벡터의 복잡한 구조에도 불구하고, 수득한 RNA 레플리콘은 in planta 고 안정성과 동일한 식물 세포에서 두 개의 상이한 재조합 단백질(GFP 및 DsRed)의 공동-발현을 제공하는 능력을 나타냈다. 도 4에서 나타낸 것처럼, 공동-발현 빈도는 감염된 영역에서 모든 세포의 거의 100%에 이를 수 있다. 리포터 유전자(GFP 및 DsRed)의 대체, 예를 들면, 침투된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎에서 추가로 발현하게 상기 구조물(도 5)에서 IgG의 경쇄 및 중쇄로의 대체는 놀라운 결과를 만들어 냈다. 실시예 3에서 기술된 것과 같이, 웨스턴 블랏 분석은 조립된 단일 항체의 인상적으로 높은 농도를 나타냈다(레인 6 및 7; 도 6). 본 발명의 시스템에 의해 제공된 조립된 단일 항체의 수율은 현재의 기술 시스템에 의해 생산된 것보다 비교할 수 없을 정도로 높다(도 6, 레인 4). 알고 있는 바로는, 상기는 식물 바이러스 벡터-기반 발현 시스템을 사용하여 항체와 같은 복잡한 이형-올리고머 단백질 발현의 첫 번째 증거이다. 이전의 모든 발표에서 단일 항체의 간단한 인위적 유도체의 발현, 예를 들면, TMV-바이러스 벡터(McCormick et al., 1999, Proc Natl Acad Sci U S A, 96, 703-708; McCormick et al., 2003, J. Immunol. Methods, 278, 95-104)와 PVX-기반(Smolenska et al., 1998, FEBS Lett., 441, 379-382; Franconi et al., 1999, Immunotechnology, 4, 189-201; Hendy et al., 1999, J. Immunol. Methods, 231, 137-146; Roggero et al., 2001, Protein Expr. Purif., 22, 70-74)을 이용한 단쇄 항체(single chain antibodies; scFv)의 발현에 제한되었다.
본 발명에서, 본 발명자들은 바람직하게 전신성 바이러스 벡터를 사용하지 않는다. 전신성 바이러스 벡터 대신에, 본 발명자들은 바람직하게는 전신적으로 이동하려는 바이러스 벡터의 능력을 식물 시스템에서 바이러스 벡터의 전구체의 아그로박테리움-매개 전달로 바꾼다. 상기는 바이러스 외피 단백질을 발현될 이형 서열과 대체할 수 있게 한다. 상기 접근법은 이형 서열에 대한 바이러스 벡터의 증가된 수용력의 가능성에 기여한다. 동시에, 상기 접근법은 시스템의 생산성을 손상시키는, 이형 서열의 임의의 결실에 기인한 야생형 바이러스로 복귀하려는 바이러스 벡터의 가능성을 제거한다.
비록 본 발명의 바이러스 레플리콘-기반 시스템이 이전의 기술 시스템보다 상당히 더 좋은 수율로 단일 항체를 생산할지라도, 본 발명자들은 바이러스 레플리콘의 크기를 감소시키는 것에 의한 추가로 수율 증가의 가능성을 실험하였다. 분비성 항체의 두 개의 사슬을 발현하는 바이러스 레플리콘의 크기를 감소시키는 가능성이 제한이 있음을 고려하여, 본 발명자들은 두 개의 상이한 바이러스 벡터로부터 중쇄와 경쇄 항체의 발현을 시도해 보았다. 동일한 바이러스에 기반한 레플리콘들은 동일한 식물 세포에서 두 개의 상이한 이형 서열들을 발현할 수 없음을 고려하여(상기 참조, 실시예 1), 본 발명자들은 비-상동성 식물 바이러스 담배 모자이크 바이러스(TMV)와 감자 바이러스 X(PVX)로부터 유래한 바이러스 벡터들에 DsRed 및 GFP 유전자를 개별적으로 클로닝 함으로써 동일한 식물 세포에서 두 개의 상이한 유전자를 공동-발현하는 가능성을 테스트하였다(실시예 4 참조). 상기 바이러스 벡터들의 cDNA를 포함하는 T-DNA 영역의 모식도는 도 7 및 도 8(PVX 단독)에 나타내었다. 실시예 4에서, 편의상, 본 발명자들은 위치-특이적 재조합에 의해 벡터 기본 단위로부터 in planta 조립된 TMV-기반 바이러스 벡터를 사용하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 공동-침투된 식물 잎 영역에서 분리된 원형질체가 실제로 DsRed 및 GFP 리포터 유전자의 100% 공동-발현 빈도를 나타내는 것을 발견하였다(도 9).
최근에, 상이하게 표지된 바이러스의 공간적 분리에 대한 연구가 Dietrich와 Maiss에 의해 보고되었다(2003, J. Gen . Virology , 84, 2871-2876). 상기 연구에서, 형광 단백질은 리포터로서 발현되었다. 이형-올리고머 단백질의 생산은 언급되지 않았다. 더불어, 분리된 원형질체 수준에서의 공동-발현은 연구되지 않았다. 리포터 유전자 생산물은 원형질 연락사(plasmodesmata)를 통한 확산에 의해 이웃 세포로 확산할 수 있기 때문에, 바이러스의 선택된 쌍이 리포터 유전자를 동일한 또는 이웃 세포에서 발현했는지 여부에 대한 정보는 얻을 수 없다. 이전의 발표는 식물 감염에 대한 야생형 바이러스 사이의 공동작용에 관련하나, 식물 세포에서의 이형-올리고머 단백질의 발현에 관련하지는 않는다(Rochow & Ross, 1955, Virology, 1, 10-27; Goodman & Ross, 1974, Virology , 58, 16-24; Goodman & Ross, 1974, Virology , 59, 314-318; Goodman & Ross, 1974, Virology , 58, 263-271). 공동-감염된 식물에서 바이러스의 공동작용에 대한 상기 초기 연구의 후속 개발은(Vance et al ., 1995, Virology , 206, 583-590; Pruss et al ., 1997, Plant Cell, 9, 859-868) 전사후 유전자침묵현상(post-transcriptional gene silencing, PTGS)의 억제에 대한 발견을 이끌어 냈다. 재조합 단백질 발현 시스템의 후속 개발은 재조합 단백질의 향상된 생산을 위한 상기 PTGS 억제의 연구로 이어졌다. 이전의 기술에서 공동작용하는 바이러스에 기반한 바이러스 발현 시스템을 이용한 단백질 발현에 대한 어떠한 암시도 존재하지 않는다.
본 발명은 비-경쟁의 바이러스 벡터들이 식물 세포 또는 식물에서 이형-올리고머 단백질의 생산을 위한 효율적인 수단임을 증명한다. 만약, 상기 바이러스 벡터가 동일한 식물 세포에서 복제할 수 있고 다른 세포에서 상기 복제와 형질감염하는 동안 서로를 약화시키지 않으면, 두 개 또는 그 이상의 바이러스 벡터들은 각자에게 비-경쟁적이다. 저하의 부재는 형질감염된 식물 세포의 적어도 10%, 바람직하게는 50%, 더욱 바람직하게는 90%, 및 가장 바람직하게는 100%가 공동-형질감염되는, 예를 들면, 상기 두 개 또는 그 이상의 상이한 바이러스 벡터를 포함하는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 바이러스 벡터는 이형 핵산 서열을 복제 및 발현 가능하다. 더 바람직하게는, 상기 이형 핵산 서열은 상이한 단백질을 암호화한다. 더욱 바람직하게는, 상기 상이한 단백질은 이형-올리고머 단백질의 서브유닛이다. 바이러스 벡터가 경쟁 또는 비-경쟁인지 결정하기 위해, 식물 세포의 공동-형질감염의 빈도가 측정될 수 있다. 상기는 하기의 프로토콜에 의해 수행될 수 있다: 두 개의 바이러스 벡터가 두 개의 상이한 리포터 유전자, 예를 들면, DsRed 및 GFP으로 표지 된다. 상기 상이하게 표지 된 벡터는 식물 잎 조직에 공동-전달되고(예를 들면, 아그로-침투에 의해서) 3-6일 후에, 감염된 영역으로부터 분리된 원형질체는 오직 하나의 리포터 유전자만 발현하는 원형질체의 개수와 비교한 두 개의 리포터 유전자 모두를 공동-발현하는 원형질체의 비율을 결정하기 위해 개수가 계산될 수 있다. 상기 측정을 설명하는 실험들은 실시예 2 와 실시예 4에 기술된다(도 1A 및 도 9 또한 참조). 통상적으로, 비-경쟁의 바이러스 벡터는 공동작용하는, 예를 들면 동일한 식물 숙주에 성공적으로 공동-형질감염될 수 있는 바이러스들로부터 유래할 수 있다. 공동작용하는 RNA 바이러스의 상기 쌍의 예로는 하기를 포함한다:
감자 바이러스 X(Potato Virus X; PVX)/ 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus; TMV);
PVX/담배 엽맥 반점 바이러스(Tobacco Vein Mottling Virus; TVMV);
PVX/담배식각바이러스(Tobacco Etch Virus; TEV);
PVX/크로버 엽맥황화 바이러스(Clover Yellow vein virus; ClYVV);
PVX/자두곰보병 바이러스(Plum Pox Virus; PPV);
PVX/감자 바이러스 Y(Potato Virus Y; PVY).
바이러스 벡터의 경쟁성 또는 비-경쟁성의 기계적 원인은 알려지지 않았다. 하나의 가능한 설명은 공동작용의 바이러스 벡터로부터 유래한 바이러스 레플리콘이 상이한 서브-세포질 구획에서 바이러스 복제 복합체(viral replication complexes; VRCs)를 형성하고(Kawakami et al , 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 6291-6296), 그러므로 그것들이 서로에게 VRC 형성을 필요한 공간을 위해 서로 경쟁하지 않게 된다. 실험적으로도 잘 수립된 것처럼, 비-경쟁의 바이러스 벡터들은 그들의 핵산 서열의 수준에서 현저하게 차이가 나는, 상이한 종의 바이러스들로부터 유래할 것이다. 상기 비-경쟁의 바이러스들은 동일한 식물 숙주에서 성공적으로 공동-감염될 수 있는 공동작용의 식물 바이러스들로부터 유래할 수 있다. 공동작용의 바이러스들은 일반적으로 상이한 속에 속한다. 예를 들면, PVX는 포텍스바이러스 속에 속하고, 반면 TVMV, TEV, PPV, 및 ClEVV와 같은 것에 공동작용하는 바이러스들은 포티바이러스 속에 속한다. TMV, TVCV, 및 crTMV 와 같은, PVX 바이러스에 공동작용 하는(비-경쟁의) 다른 바이러스들은 토바모바이러스 속에 속한다. 자명하게는, 상이한 속의 표본들 사이에서 게놈 상동성은 오히려 낮고, 보통 RNA 수준에서 50% 동일성 이하이다.
상이한 바이러스 벡터(예를 들면, PVX 및 TMV-기반)로의 단일 항체의 중쇄와 경쇄의 클로닝과 공동-감염된 식물 조직에 상기 사슬들을 공동-발현하는 것을 더 포함하는 것은 실시예 5에서 상술 된다. 벡터의 모식도는 도 10에서 나타낸다. 상기와 다른 발현 시스템에 의해 생산된 단일 항체의 수율의 비교적 ELISA 측정은 두 개의 비-경쟁의 바이러스 벡터에 기반한 상기 시스템의 최고의 실행을 나타낸다(도 11). 바이러스 벡터(들)의 도움으로 식물 세포에서 재조합 이형-올리고머 단백질의 효과적인 발현은 이전의 기술에서 알려지지 않았다.
본 발명의 데이터에서 기반하여, 바이러스 벡터의 바이러스-유래한 서열은 상기 바이러스를 서로와 관련하여 고려하기에 상당히 충분한 상동성을 나타내지 않을 것이다. 상기 바이러스들의 예로는 TMV 및 PVX 바이러스 쌍이 있고, 바이러스 벡터는 이들로부터 기반했다. 상기 바이러스 벡터들은 상기 상동성을 나타내지 않는다. 만족스러운 바이러스 쌍을 선택하기 위한 또 다른 요구 조건은 식물 숙주의 공동-감염 동안 원래의 야생형 바이러스의 공동작용이 될 수 있다.
상기에서 논의된 실험들은 식물 세포로의 아그로박테리움-매개 DNA 전구체 전달에 기반한 일시적 발현 시스템으로 수행되었다. 그러나 본 발명의 또 다른 적용은 식물 핵 염색체에 안정적으로 도입된 상기 RNA 레플리콘(들)의 DNA 전구체를 이용한 형질전환 식물이다. 상기는 바이러스 벡터가 허용할 수 있는 이형 서열의 최대 크기의 제한과 같은 식물 바이러스 벡터-기반 시스템의 많은 제한점들을 극복할 수 있게 한다. DNA 전구체가 형질전환 식물체의 각각의 세포에 존재함으로써, RNA 레플리콘의 전신적 이동 또는 세포 간 이동(레플리콘 확산)을 위해 요구되는 것은 없다. 상기는 고 효율 생성 및 세포질에서 본 발명의 RNA 레플리콘의 이동에 의해 보상될 수 있다. 그러나 RNA 레플리콘 형성이 모든 세포에서 항상 발생하지 않기 때문에, 세포 간 이동을 위한 벡터의 능력은 추가될 수 있다.
식물, 식물 조직 또는 식물 세포에 이형 DNA를 제공하기 위해 다른 방법들이 사용될 것이다. 상기 벡터들은 아그로박테리움( Agrobacterium) 에 의해 이동되는 Ti-플라스미드 벡터(US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763) 또는 입자충격 또는 유전자총(US 05100792; EP 00444882B1; EP 00434616B1)에 의해 식물 세포로 형질전환될 것이다. 또한 미세주입(WO 09209696; WO 09400583A1; EP 175966B1), 전기천공(EP00564595B1; EP00290395B1; WO 08706614A1) 또는 PEG-매개 원형질체의 형질전환 등과 같은 다른 식물 형질전환 방법도 또한 사용될 수 있다. 벡터 전달을 위한 방법의 선택은 형질전환된 식물 종에 의존적일 것이다. 예를 들면, 유전자총은 일반적으로 단자엽 형질전환에서 바람직하고, 반면에 쌍자엽에 대해서는 아그로박테리움-매개 형질전환이 일반적으로 더 좋은 결과를 나타낸다.
본 발명의 실시예에서, 본 발명자들은 니코티아나(Nicotiana ) 세포로 벡터(상기 이형 DNA)의 일시적 아그로박테리움-매개 전달을 사용했다. 그러나 상기 벡터들은 관심있는 식물 종의 안정적 또는 일시적 형질전환에 적당한 모든 표준의 기술에 의해서 식물에 안정적으로 도입될 것이다. 쌍자엽 식물에 대한 형질전환 기술은 당기술분야에서 잘 알려져 있고, 아그로박테리움-기반 기술과 아그로박테리 움을 필요로 하지 않는 기술을 포함한다. 비-아그로박테리움 기술은 원형질체 또는 세포에 의한 직접적인 외인성 유전 물질의 섭취를 포함한다. 상기 기술들은 PEG 또는 전기천공 관련 섭취, 입자충격-매개 전달 및 유전자총을 포함한다. 상기 기술들의 실시예들은 Paszkowski 외, EMBO J 3, 2717-2722 (1984), Potrykus 외, Mol. Gen . Genet . 199, 169-177 (1985), Reich 외, Biotechnology 4:1001-1004 (1986), 및 Klein 외, Nature 327, 70-73 (1987)에 기술되어 있다. 각각의 경우에서, 형질전환된 세포는 표준 기술을 이용하여 전체 식물에서 생성된다.
아그로박테리움-매개 형질전환은 고 형질전환 효율과 많은 다양한 종에서의 넓은 유용성 때문에 쌍자엽 식물의 형질전환에 바람직한 기술이다. 아그로박테리움에 의해 일상적으로 형질전환될 많은 농작물 종들은 담배, 토마토, 해바라기, 목화, 평지기름(oilseed rape), 감자, 콩, 알파파 및 포플러(EP 0 317 511(목화), EP 0 249 432(토마토), WO 87/07299(유채( Brassica), U.S. Patent 4,795,855(포플러))를 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 관심 있는 유전자의 일시적 발현을 위한 T-DNA의 아그로박테리움-기반 전달(Vaquero et al., 1999, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 96, 11128-11133)이 사용되었다. 상기 방법은 중-소규모 재조합 단백질 생산 시스템뿐만 아니라, 대-규모 발현에서도 매우 유용한 기술이다.
식물 염색체 DNA 에 안정적으로 도입된 바이러스 레플리콘 전구체의 방출은 유도성 또는 모든 다른 조절된(예를 들면, 발달상으로 조절된) 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 유도성 프로모터들은 그들의 유도 조건에 따라서 두 종류로 나누어 질 수 있다: 비생물적 인자에 의해 유도되는 것들(온도, 빛, 화학 물질) 및 생물적 인자에 의해 유도될 수 있는 것들, 예를 들면, 병원균 또는 해충 침범. 첫 번째 종류의 예로는 열-유도성(US 05187287) 및 저온-유도성(US05847102) 프로모터, 구리-유도성 시스템(Mett et al., 1993, Proc . Natl . Acad . Sci ., 90, 4567-4571), 스테로이드-유도성 시스템(Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al ., 1998, Plant J., 14, 247-257; US06063985), 에탄올-유도성 시스템(Caddick et al ., 1997, Nature Biotech ., 16, 177-180; WO09321334), 및 테트라싸이클린(tetracycline)-유도성 시스템(Weinmann et al ., 1994, Plant J., 5, 559-569)이 있다. 식물에 대한 화학적 유도성 시스템 분야에서 가장 최근에 개발된 것 중의 하나는 글루코코르티코이드 덱사메타손(glucocorticoid dexamethasone)에 의해 켜지고 테트라싸이클린에 의해 꺼지는 키메라 프로모터이다(Bohner et al ., 1999, Plant J., 19, 87-95). 화학적 유도성 시스템에 대한 재고를 위해선 하기를 참조하시오: Zuo & Chua, (2000, Current Opin . Biotechnol ., 11, 146-151) 및 Padidam, M (2003, Curr . Opin . Plant Biol ., 6, 169-177). 유도성 프로모터들의 다른 예로는 식물에서 병발생-매개(pathogenesis-related; PR) 유전자의 발현을 조절하는 프로모터가 있다. 상기 프로모터들은 병원균 침범에 대응하는 식물 신호 전달 경로의 중요한 구성성분인 살리실산, 또는 PR 유전자 발현을 자극할 수 있는(US05942662) 다른 화학적 화합물(벤조-1,2,3-티아디아졸(benzo-1,2,3-thiadiazole) 또는 이소니코틴산(isonicotinic acid))으로 식물을 처리함으로써 유도될 수 있다.
본 발명은 실시예에서 기술된 TMV 및 PVX-기반 벡터에 제한되지 않으나, 상기 바이러스 레플리콘으로부터 유래한 발현 시스템의 제작을 위해 다른 식물 RNA 바이러스들로부터 유래한 레플리콘에 적용가능하다. 공동-감염된 식물에서 가장 잘 연구된 공동작용은 PVX/PVY 바이러스 쌍에 대한 것이다(Rochow & Ross, 1955, Virology, 1, 10-27; Goodman & Ross, 1974, Virology , 58, 16-24). 아마도 상기 바이러스들이 다수는 동일한 식물 세포에서 잘 공동-복제될 것이다. Dietrich & Maiss (2003, J. Gen . Virol ., 84, 2871-2876)는 상이하게 표지된 바이러스 쌍, 예를 들면, 자두곰보병 바이러스(PPV) 및 감자 바이러스 X(PVX), tobacco vein mottling virus(TVMV) 및 PVX, 크로버 엽맥황화 바이러스(ClYVV) 및 PVX 쌍이, 식물 조직의 동일한 감염 부위에서 상이한 리포터 유전자를 공동-발현할 수 있음을 보여주었다. 본 발명에서 기술된 전략을 사용하여, 동일한 식물 세포에서 공동-복제가 가능한 실질상 모든 식물 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스-유래한 레플리콘 쌍에 대한 재조합 이형-올리고머 단백질 발현 시스템이 개발될 수 있다. 예를 들면, 알파모바이러스(alfamovirus) 속의 알파파 모자이크 바이러스(AMV)에 기반한 바이러스 벡터가 본 발명에서 사용될 수 있다.
복잡한(이형-올리고머) 단백질을 암호화하는 관심 유전자, 이들의 단편(기능적 또는 비-기능적) 및 이들의 인공적인 유도체와 융합체는 본 발명을 이용하여 식물 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 이형-올리고머 단백질의 많은 상업적으로 가치있는 그룹들은 본 발명에 의해 생산되고 정제될 수 있다. 상기 그룹들은 인간 또는 동물 건강의 분야에서 적용할 단백질뿐만 아니라 산업적 및 연구 목적의 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 그러나 가장 바람직한 것은 면역 반응 단백질 그룹, 특히 - 면역단백질(IgG, IgM, IgA 및 IgD)의 상이한 종류 및 돌연변이 개조판과 같은 합성 유도체 및 다른 단백질 또는 그 일부와 융합된 다양한 형태의 융합체로부터 선택된 단일 항체이다.
도 1(A)는 침투된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎에서 두 개의 상이한 TMV-기반 벡터로부터 GFP와 DsRed의 발현 분포 패턴을 나타낸다. 왼쪽 도면: 상측 왼쪽의 밝은 점은 pICH17272로 침투된 영역의 GFP 형광이다. 하측의 약하게 밝 은 점은 pICH18505 벡터로 침투된 영역의 붉은 형광이다. 왼쪽 도면의 하측의 오른쪽의 밝은 점은 pICH17272 + pICH18505로 침투된 영역이다.
오른쪽의 도면은 두 개의 상이한 벡터로 공동-침투된 잎 영역으로부터 분리된 원형질체를 나타낸다(상측: GFP 형광 검출 조건하에서의 원형질체; 하측 패널: DsRed 형광 검출 조건하에서의 동일한 원형질체.
(B)는 pICH17272 및 pICH18505의 T-DNA 영역의 모식도이다. P - 전사 프로모터; T - 전사 종결 영역; RdRP 바이러스성 RNA-의존성 RNA 중합효소; MP - 바이러스성 이동 단백질; 3' NTR - 바이러스성 3' 비-번역 영역; Cr-sgp - crTMV 변종의 CP 서브게놈 프로모터 영역; GOI - 관심 유전자.
(C)는 pICH17272 및 pICH18505의 T-DNA 영역의 제한 지도의 모식도이다.
도 2는 상이한 서브게놈 프로모터로부터 두 개의 상이한 외래도입유전자(GOI-1 및 GOI-2)의 공동-발현을 위해 설계된 바이러스성 벡터의 T-DNA 영역의 모식도를 묘사한다. P - 전사 프로모터; T - 전사 종결 영역; RdRP 바이러스성 RNA-의존성 RNA 중합효소; MP - 바이러스성 이동 단백질; 3' NTR - 바이러스성 3' 비-번역 영역; Cr-sgp - crTMV 변종의 CP 서브게놈 프로모터 영역; 3PK - 3중 슈도 낫(triple pseudo knot) 영역; U5sgp - TMV-U5 변종의 CP 서브게놈 프로모터 영역; GOI - 관심 유전자.
도 3(A)는 구조물 pICH17388, pICH17123, pICH15933, pICH7410, pICH10580, pICH10881 및 pICH10745의 T-DNA 영역의 모식도이다. RS - PhiC31 인테그라아제에 의해 인식된 재조합 사이트. 회색 수직선 막대는 인트론을 지시한다.
(B)는 pICH17388, pICH17123, pICH15933의 T-DNA 영역의 제한 지도를 묘사한다.
(C)는 pICH7410, pICH10580, pICH10881 및 pICH10745의 T-DNA 영역의 제한 지도를 묘사한다.
도 4는 (A)에서 재조합효소 소스와 함께 DNA 전구체 pICH17388 및 pICH15933 의 아그로박테리아 전달 후 6일의 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎 영역의 형광 현미경 사진을 나타낸다. RS - PhiC31 인테그라아제에 의해 인식된 재조합 사이트.
도 5는 항체의 중쇄와 경쇄의 발현을 위한 상이한 벡터 시스템의 T-DNA 영역의 모식도이다. RS - PhiC31 인테그라아제 에 의해 인식된 재조합 사이트.
도 6은 바이러스성 프로벡터 시스템을 사용한 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana) 잎에서 IgG의 발현의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다.
TSP 의 전기영동 분리는 비-환원 조건하에서 12% 겔에서 수행되었다. 발현된 단백질의 검출은 6 ×103으로 희석된 HRP(Sigma)와 접합 된 래빗 항-인간 IgG 분획으로 수행되었다.
레인: 1- 비감염된 잎 조직; 레인 2- 사이토졸에서 발현된 IgG 중쇄(pICH17388);
레인 3 - IgG 중쇄 및 경쇄, 35S 프로모터 구조물과 함께 공동-발현(pIC0123+pICH19846); 레인 4- P19와 함께 레인 3 과 동일(pICH6692);
레인 5- 35S 프로모터 구조물과 P19로 발현된 GFP(pICH5290+pICH6692);
레인 6- 바이시스트로닉(bicistronic) 구조물 pICH19860과 함께 IgG 중쇄 및 경쇄의 공동-발현;
레인 7- 바이시스트로닉(bicistronic) 구조물 pICH19860과 함께 IgG 중쇄 및 경쇄의 공동-발현(MP 결여된 5' 프로-벡터 pICH17123, MP in trans pICH10745);
레인 8- 사이토졸에서 공동-발현된 GFP 및 dsRED, in trans로 제공된 MP(pICH17123 + pICH19919 + pICH10745).
도 7은 동일한 식물 세포에서 관심 있는 상이한 단백질 서브유닛의 공동-발현을 위해 설계된 비-경쟁의 바이러스 벡터를 암호화하는 T-DNA 영역의 모식도이다. P - 전사 프로모터; T - 전사 종결 영역; TMV RdRP 담배 모자이크 바이러스의 바이러스성 RNA-의존성 RNA 중합효소; PVX RdRP 감자 바이러스 X의 바이러스성 RNA-의존성 RNA 중합효소; MP - 바이러스성 이동 단백질; 3' NTR - 바이러스성 3' 비-번역 영역; Cr-sgp - crTMV 변종의 CP 서브게놈 프로모터 영역; GOI - 관심 있는 단백질 서브유닛을 암호화하는 관심 유전자.
도 8은 바이너리 벡터 pIC0130의 T-DNA 영역의 모식도이다.
도 9는 TMV(pICH17388+pICH10580) 및 PVX-기반(pIC0130) 벡터를 사용하여, 식물 세포에서 GFP 및 dsRED의 공동-발현을 나타낸다: 아그로접종된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎으로부터 분리된 원형질체에서 GFP 및 dsRED의 시각화.
도 10 (A)는 바이너리 벡터 pICH17620, pICH20431, pICH21240, pICH20421, 및 pICH21370의 T-DNA 영역의 모식도이다.
(B)는 바이너리 벡터 pICH11599, pICH21910 및 pICH21920의 T-DNA 영역의 모식도이다.
(C)는 바이너리 벡터 pICH21282, pICH10990, pICH22250 및 pICH22240의 T-DNA 영역의 모식도이다. Lv 및 Lc - 경쇄의 가변 영역과 보존 영역; Hv 및 Hc - 중쇄의 가변 영역과 보존 영역.
(D)는 PVX-유래 프로벡터 pICH21380의 클로닝 설계의 모식도이다.
도 11 (a)는 PVX 및 crTMV 벡터를 사용한 IgG 경쇄 및 중쇄의 공동-발현량을 결정하기 위한 ELISA 검사 결과를 나타낸다. 왼쪽의 조직 배양 플레이트의 웰의 번호는 히스토그램의 막대의 번호와 일치한다. 히스토그램은 405 ㎚에서 측정한 웰의 OD를 나타낸다.
1,2- 비감염된 식물 조직;
3,4,5- PVX에서 칼레티큘린 SP-중쇄(각각, pICH21240-1, 5 및 14 클론);
6,7,8- PVX에서 IgG의 칼레티큘린 SP-경쇄(LC) (N-terminus에서 결실, 각각, pICH21370-18, 19, 31);
9, 10, 11- PVX에서 IgG의 칼레티큘린 SP-경쇄(각각, pICH21370-40, 44, 45);
12- 블랭크 대조군(식물 단백질 추출물이 적용되지 않음);
13, 14, 15- crTMV(pICH17620+pICH10881+pICH20431)에서 IgG의 칼레티큘린 SP-경쇄와 공동-발현된 PVX에서 IgG의 칼레티큘린 SP-중쇄(HC) (각각, pICH21240-1, 5 및 14 클론);
16, 17, 18- crTMV(pICH17620+pICH10881+pICH20421)에서 칼레티큘린-HC 와 함께 공동-발현된 PVX에서 IgG의 칼레티큘린-LC(N-terminus에서 결실, 각각, pICH21370-18, 19, 31);
19, 20, 21- crTMV-기반 벡터(pICH17620+pICH10881+pICH20421)에서 칼레티큘린 SP-중쇄와 함께 공동-발현된 PVX에서 IgG의 칼레티큘린 SP-LC(각각, pICH21370-40, 44, 45);
22- PVX로 발현된 GFP(pIC0130);
23- PVX로 발현된 GFP(pICH20799);
24- crTMV 단독으로 발현된 IgG의 칼레티큘린 SP-경쇄(pICH17620+pICH10881+pICH20431);
25- crTMV-기반 벡터 단독으로 발현된 IgG의 칼레티큘린 SP-중쇄(pICH17620+pICH10881+pICH20421);
26- PTGS 억제제 P19의 존재 시 강한 35S 프로모터의 조절하에 공동-발현된 IgG의 경쇄 및 중쇄;
27- crTMV-기반 벡터로부터 IgG 경쇄 및 중쇄 공동-발현(pICH17388 +pICH10881= pICH20241);
28- crTMV-기반 벡터로부터 경쇄 및 중쇄 공동-발현(pICH17388 +pICH10881= pICH20241), in trans로 제공된 MP(pICH10745);
* - OD405 값이 측정가능치를 훨씬 상회 함.
도 11(b)는 니코티아나 벤타미아나 (N. benthamiana ) 잎에서 발현된 항-암 항체의 전기영동과 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다.
(A) TMV 및 PVX 프로-벡터로 공동-감염된 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana) 잎에서 항-암 항체의 중쇄 및 경쇄의 축적. 경쇄는 PVX로, 중쇄는 TMV로 발현된다. 단백질은 환원 조건에서 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리된다. 상 단 패널은 쿠마시 염색 결과를 나타낸다; 중간 패널은 HRP-접합된 염소 항-인간 IgG(감마 사슬-특이적) 항체(Sigma)로 수행한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다; 하단 패널은 HRP-접합된 래빗 항-인간 IgG(람다 사슬-특이적) 항체(Sigma)로 수행한 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. Uninf, 비감염 조직; 2-11, 접종 후 일자; S, 항-암 mab(단일 항체) 표준; LC, TMV 프로-벡터 단독으로 발현된 경쇄(6dpi); HC, TMV 프로-벡터 단독으로 발현된 중쇄(6dpi).
(B) 단백질 A 자성 비드(NEB)를 사용한 항-암 mab의 정제. (A) 쿠마시-염색된 비-환원 조건하의 12% 폴리아크릴아마이드 겔에서 이동한 식물-유래(레인 1) 및 표준(레인 2) mab.
(C) HC를 발현하는 프로-벡터 TMV 및 LC를 발현하는 PVX 프로-벡터로 공동-감염된 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana) 잎에서 조립된 항-암 mab의 축적. 단백질은 비-환원 조건하의 10% 폴리아크릴아마이드 겔에서 분리된다. 웨스턴 블랏은 염소 항-인간 IgG(감마 사슬-특이적) 항체로 탐침 되었다. Uninf, 비감염 조직; 2-11, 접종 후 일자; S, 항-암 mab 표준; LC, TMV 프로-벡터 단독으로 발현된 경쇄(6dpi); HC, TMV 프로-벡터 단독으로 발현된 중쇄(6dpi). H2L2: 두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄를 포함하는 IgG 이형사량체, H2L- 두 개의 중쇄와 하나의 경쇄를 포함하는 이형삼량체, H2- 중쇄 동형이량체, L2- 경쇄 동형이량체.
도 12는 바이너리 벡터 pICH17620, pICH-FSHA 및 pICH-FSHB의 T-DNA 영역의 모식도를 나타낸다.
도 13은 바이너리 벡터 pICH17388, pICH-MLCJ 및 pICH-MHC의 T-DNA 영역의 모식도를 묘사한다.
하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위하여 제시된다. 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않는 한 수정 및 변형이 이루어질 것이다.
실시예 1
동일한 식물 RNA 바이러스로부터 유래한 두 개의 TMV -기반 RNA 바이러스 벡터로부터 GFP 및 DsRed 공동-발현의 결여
잎 조직이 두 개의 상이한 관심 유전자를 포함하는 동일한 식물 RNA 바이러스로부터 유래한 두 개의 TMV-기반 바이러스 벡터로 감염되었다(도 1). 본 발명자들은 TMV-기반 바이러스 벡터에 클로닝된 시각적 마커 유전자인 GFP 및 DsRed 를 이용하여 상기 접근법을 실험하였다. 첫 번째 구조물, pICH17272(Marillonnet et al., 2005, Nat . Biotechnol ., 23, 718-723의 도 1을 참조)은 GFP를 포함하고, 벡터에서 RdRP 암호화 서열이 14개 보다는 9 개의 식물 인트론을 포함하는 것을 제외하고는 pICH18711(국제특허출원번호 PCT/EP03/12530, 공개번호 WO2005049839; Marillonnet et al ., 2005, Nat . Biotechnol ., 23, 718-723를 참조)과 유사하다. pICH18722(Marillonnet et al ., 2005, Nat . Biotechnol ., 23, 718-723)는 TMV, Cr-TMV(Dorokhov et al ., 1994, FEBS Lett . 350, 5-8) 및 TVCV(Lartey et al ., 1994, Arch . Virol . 138, 287-298) 종의 두 개의 가깝게 연관된 종을 기간(backbone)으로 하여 설계되었고, 외피 단백질 서열을 대체한 이형서열과 함께 식물 프로모터의 조절을 받는 바이러스 게놈을 포함한다. RdRP 및 MP에서 11 개의 인트론의 존재는 잎 조직으로의 벡터의 아그로박테리움-매개 전달 이후에 바이러스 복제의 초기 효율을 증가시키고, 그러므로, 동일한 세포에서 두 개의 바이러스 벡터의 공동-발현의 가능성이 증가한다. pICH18505 는 GFP 암호화 서열이 Xho 1- Not 1 제한효소 자리를 사용하여 DsRed의 암호화 서열로 대체된 것을 제외하고 pICH17272 와 유사하다(도 1). pICH18505 및 pICH17272의 T-DNA 영역의 자세한 제한효소 지도는 도 1C에 나타낸다. pICH17272 및 pICH18505는 아그로박테리움 변종 GV3101에 형질전환되었고, 잎 조직은 이전의 기술에 따라 니코티아나 벤타미아 나( Nicotiana benthamiana) 에 침투되었다(Marillonnet et al ., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 6852-6857). 원형질체는 침투 7일 후(days post infiltration; dpi) 침투된 영역으로부터 제조되었고, 현미경하에서 파랑 또는 빨강의 빛으로 관찰되었다. 원형질체가 여러 날 후에 침투된 영역으로부터 제조되더라도, 매우 적은 원형질체만이 GFP 및 DsRed를 모두 발현하였다(Fig. 1A). 상기는 세포 하나에 한 번씩 1차 TMV-기반 바이러스 벡터로 감염되면, 이것은 일단 하나의 세포가 2차 TMV-기반 바이러스 벡터로 재감염될 수 없음을 암시한다.
실시예 2
단일 바이러스 레플리콘으로부터 GFP 및 DsRed 의 공동-발현
두 개의 관심 유전자가 두 개의 분리된 서브게놈 프로모터의 조절을 받아서 RNA 바이러스 벡터로부터 발현되었다(도 2). 양 서브게놈 프로모터는 동일할 수 있으나, 바이러스 복제 동안 구조물에서 반복된 서열 사이의 결실의 위험을 막기 위해, 연관된 TMV 변종으로부터 서브게놈 프로모터를 사용하는 것이 바람직하다; 상기 경우에서, 2차 서브게놈 프로모터와 3'비-번역 영역이 TMGMV 변종 U5(Shivprasad et al , 1999, Virology, 255, 312-323; Marillonnet et al ., 2004, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 101, 6852-6857)로부터 유래한다. 또한, 클로닝의 편의를 위해, GFP 및 DsRed는 조립이 완결된 벡터보다는 바이러스 프로벡터에 클로닝 된다(WO02/088369 및 Marillonnet et al ., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 6852-6857에서 상술). 두 개의 프로벡터, pICH17388 및 pICH15933(도 3)은 in planta로 양쪽 프로벡터 기본 단위 사이에서 자리-특이적 재조합에 의해 완전히 기능적인 TMV-기반 바이러스 벡터로 전환된다. pICH17388 는 11개의 인트론이 바이러스 서열에 존재하는 것을 제외하고는, pICHNOP 와 유사하다(Marillonnet et al., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 6852-6857) (pICH17272에서처럼). pICH15933 은 TMGMV U5 암호화 서열이 DsRed 암호화 서열로 대체된 것을 제외하고는, pICHGFPSYS 와 동일하다(Marillonnet et al ., 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 101, 6852-6857).
pICH15933 은 아그로박테리움 변종 GV3101 에 형질전환되었고, pICH17388 및 CH10881과 함께 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana) 잎에 침투되었다(도 3). 침투 5일 후, 모든 GFP-발현 집중점은 동일한 식물 세포에서 두 개의 우수한 공동발현을 나타내는 DsRed 역시 발현하고 있었다(도 4).
실시예 3
단일 바이러스 레플리콘으로부터 항체의 발현
pICH15933 에 GFP 및 DsRed를 암호화하는 서열이 각각, IgG 항체 경쇄 및 중쇄에 의해 대체되었고, 구조물 pICH20241를 제조했다(도 5). 대조군으로써, 중쇄 및 경쇄가 TMV-기반 프로벡터에 클로닝 되었고, pICH1740의 암호화 서열을 대체하여, 구조물 pICH20421 및 pICH20431을 제조했다(도 5). pICH20241 는 pICH17388 및 pICH10881과 함께 니코티아나 벤타미아나 ( Nicotiana benthamiana) 잎에 공동침투되었다(도 3).
침투된 잎으로부터 추출된 전체 가용성 단백질의 웨스턴 블랏 분석은 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRP; Sigma)로 표지 된 1:6000 배로 희석된 항-인간 IgG 래빗 항체로 수행되었다. 분석의 결과는 도 6 A에 나타내졌다. 상기는 단일 바이러스 벡터로 달성된 항체의 발현량이(도 6, 레인 6 & 7) PTGS 억제제 P19의 존재하에서 강한 구조적 프로모터로 달성된 것(도 6, 레인 3-4)보다 상당히 높다는 것에 대한 증거이다.
실시예 4
TMV - 및 PVX -기반 바이러스 벡터로 GFP 및 DsRed 의 공동-발현
두 개의 유전자의 공동발현을 위한 다른 전략은 동일한 세포에서 공동감염 및 복제될 수 있는 상이한 바이러스로 제조된 개별적인 바이러스 벡터를 사용하는 것이다. 예를 들면, 감자 바이러스 X(PVX)에 기반한 발현 벡터는 TMV와 함께 동일한 세포에서 함께 존재할 수 있다. 두 개의 상기 비-경쟁의 바이러스 벡터의 모식도가 도 7에 나타냈다.
PVX(PV0014 변종)의 접종원은 감염된 건조한 잎 재료로서 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)로부터 획득하였고, 그리고 Nicotiana bentamiana 식물의 접종을 위해 사용되었다. 바이러스의 징후가 나타나는 접종된 식물의 전신의 잎은 전체 RNA 추출을 위해 사용되었다. 1st 가닥 cDNA 가 pvxpr2, pvxpr4 및 pvxpr6 프라이머를 사용하여 제조되었다. 세 개의 cDNA 단편이 Pfu-Taq 중합효소 혼합물을 이용하여 PVX cDNA로부터 PCR 에 의해 증폭되었다:
단편 1이 하기 프라이머로 증폭되었다:
pvxpr1: ttt ggtctc a tgaa gaaaactaaaccatacaccaccaacacaac (서열번호: 1)
Pvxpr2: ctttttccagcccggagaccatttctgtgatgg (서열번호: 2)
Fragment 1 이 BsaI 효소로 절단되었다.
단편 2 가 하기 프라이머로 증폭되었다:
Pvxpr3: ttt cgtctc a gggctggaaaaagaggacttccctgaagg (서열번호: 3)
Pvxpr4: gagtcgtctcctgcataaacttgagcag (서열번호: 4)
Fragment 2 가 Esp3I 효소로 절단되었다
단편 3 이 하기 프라이머로 증폭되었다:
Pvx5: ttt gaagac aa tgcaggagacgactccgcactgg (서열번호: 5)
Pvx6: cg gacgtc tttttttttttttttttttttttt atttatattattcatacaatcaaaccagaa aatac (서열번호: 6)
단편 3 이 BpiI AatII 효소로 절단되었다
애기장대 액틴2(Arabidopsis actin2) 유전자 프로모터를 포함하는 단편 4 가(An et al ., 1996, Plant J., 10, 107-121), 애기장대 게놈 DNA로부터 하기 프라이머로 증폭되었다:
Act2pr1: ttt acgcgt ttcgacaaaatttagaacgaacttaattatg (서열번호: 7)
Act2pr2: ttt ggtctc a ttca ttcaaagcggagaggaaaatatatg (서열번호: 8)
단편 4 가 Mlu1 및 Bsa1 효소로 절단되었다.
애기장대 액틴 2 프로모터의 대체물로서, PVX-기반 바이러스 벡터의 전사를 작동시키기 위해 CaMV 35 프로모터도 역시 사용되었다(도 10D 참조, pICH20788; pICH21380). PVX-기반 벡터를 제조하기 위한 일반적인 전략은 Baulcombe 및 동료들(1995, Plant Journal, 7:1045-1053)에 의해 기술된 대로 사용되었다.
모든 네 개의 단편들은 Mlu1 및 AatII으로 절단된 바이너리 벡터에 함께 클로닝 되었다. 결과 구조물의 20 개의 클론들이 아그로박테리움 변종 GV3101 에 형질전환 되었고 각 클론은 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana ) 식물의 잎 한 장에 침투되었다. 1 주일 후,니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana)는 바이러스 감염 징후에 대해 표현형적으로 스크린 되었고, 양성 플라스미드 클론은 보존되었다(pICHPVX).
클로닝 벡터는 CP 서브게놈 프로모터의 관심있는 하류의 유전자를 클로닝하기 위해 상기 완전한 기능의 cDNA로부터 제조되었다. GFP 유전자는 예로써 클로닝 되었다. CP 게놈 프로모터 영역에서 ATG 는 AGG 로 돌연변이 되었다(Genbank accession M95516의 5651 위치). GFP 유전자는 NheI 자리의 3'에 클로닝 되었다(5662에서 5667에 통합하다). PVX의 3'말단(5618에서 6435에 통합하다)은 GFP 서열의 하류에 클로닝 되었고, 상기 서열에 이어서 12 내지 24 A(아데닌, adenine)의 범위가 이어졌다. 상기 구조물(pICH0130, 도 8)은 Nicotiana benthamiana 잎에 아그로침투되었다. GFP 형광은 침투 2 내지 3 일후 침투된 영역에서 나타났다. GFP의 전신적 이동은 며칠 뒤에 나타났다.
pIC0130 은 DsRed의 발현을 제공하는 pICH17388, pICH10580 및 pICH10881 벡터(도 3)로 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana ) 잎에 공동침투되었다. 공동-침투 6일 후, 원형질체가 침투된 영역으로부터 제조되었고, 파랑 빛으로 현미경에서 관찰되었다. 거의 모든 형질전환체는 우수한 수준의 공동발현을 나타내는 GFP 및 dsRed를 발현하였다(도 9).
실시예 5
TMV 및 PVX -기반 RNA 바이러스 벡터로 단일 항체의 발현
pIC0130의 GFP 암호화 서열을 대체하여, IgG의 중쇄 및 경쇄가 PVX 벡터에 클로닝 되어, 각각 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 pICH21240 및 pICH21370의 두 개의 구조물을 생성하였다(도 10 A). 항체의 경쇄 또는 중쇄를 포함하는 TMV 프로벡터 부분의 클론들 역시 제조되었다(pICH20431 및 pICH20421, 도 10A). PVX 및 TMV-기반 벡터로부터 발현되는 두 개의 상이한 사슬을 제공하는 아그로박테리아 혼합물은 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎에 침투되었고, 항체의 발현량은 접종 10일 후 ELISA 에 의해 측정되었다. 결과(도 11)는 PVX 및 TMV-기반 벡터로부터 중쇄 및 경쇄의 공동-발현의 경우에서 조립된 기능적 항체의 매우 높은 발현량을 나타낸다. 상기 발현량은 두 사슬을 모두 발현하는 TMV 벡터로부터 획득한 것보다 상당히 높았다(실시예 3).
이제 IgG1 서브클래스에 속하는 또 다른 인간 암-특이 단일 항체인, 항-암 단일항체가 하기에 따라 TMV 및 PVX-기반 벡터에 서브클로닝 되었다: 항-암 단일 항체 경쇄 암호화 서열을 포함하는, 730 NcoI-NotI 단편이 NotI 자리에서 블런트 되었고, NcoI-XbaI으로 열리고, XbaI 위치에서 블런트 된 TMV-기반 3' 기본 단위 클로닝 벡터 pICH11599(도 10B)에 결합되어 pICH21910 을 수득하였다(도 10B). 동일한 방법이 항-암 단일 항체 중쇄 암호화 서열로 pICH11599(도 10B)에 1432 bp의 NcoI- NotI 단편을 서브클로닝 하기 위해 사용되어, pICH21920(도 10B) 구조물을 제조하였다. GFP 발현 pICH21282 에 대한 PVX-기반 3' 기본단위(도 10C)가 TMV-기반 3' 기본 단위 클로닝 벡터 pICH10990(도 10C)을 근거로 하여 생성되었다. 상기는 pICH10990(도 10C)에 GFP 암호화 서열의 삽입과 TMV 3' 비번역 영역의 PVX의 3' 비번역 영역과의 후속의 대체를 통한 여러 클로닝 단계에서 달성되었다. 유사하게, TMV-기반 3' 프로-벡터 기본단위 pICH21920(도 10B)는 TMV 3' 번역 영역을 PVX의 3' 비번역 영역과 대체함으로써 PVX-기반 3' 프로-벡터 구조물 pICH22250(도 10C)로 전환되었다. 상기는 HindIII 부위에서 블런팅 된 pICH21282(도 10C)의 575 bp의 HindIII-NdeI 단편을 SalI 자리에서 블런팅 된 pICH21920의 SalI-NdeI 단편과 결합함으로써 달성되었다. 항-암 단일항체 경쇄의 암호 서열을 포함하는 723 bp NcoI-EcoRI 단편이 NcoI-EcoRI으로 절단된 pICH22250(도 10C)로 서브클로닝 되어, pICH22240(도 10C)를 제조하였다.
5' 프로벡터 pICH21380(도 10D)은 하기의 방식으로 제조되었다: 구조물 pICH17388(도 3B)은 프라이머 pv5p5F(서열번호: 9) (5' cagctagcaa caaacaagaa aggtaagttt c-3') 및 pv5p5R(서열번호: 10) (5'-tctgagctct gcatgctacg cccccaactg agag-3'를 이용한 단편의 PCR 증폭의 주형으로서 사용되었고, Nhe1 및 Sac1 제한효소로 절단되었고, pICH20788의 큰 Nhe1 - Sac1 단편과 결합하여, 인트론과 AttP 재조합 자리의 5' 말단을 PVX 벡터의 3' 부분과 대체하였다. 클로닝의 도해는 도 10D에서 나타낸다. 자리-특이적 재조합을 통한 in planta 바이러스 벡터의 조립을 위해 5' 프로벡터와 3' 프로벡터를 이용한 방법은 이미 기술되어 있다(Marillonnet et al, 2004, Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 101:6852-6857).
아그로침투 절차
모든 결과 구조물은 표준의 전기 천공 방법을 사용하여 아그로박테리움 변종 GV3101 에서 형질전환되었고, 니코티아나 벤타미아나 ( Nicotiana benthamiana ) 잎의 추가의 아그로침투를 위해 사용되었다. 밤새 배양된 아그로박테리움 배양액의, OD600 범위 1.8 내지 2.5의, 동일한 부피는 섞이고, 3분 동안 6000g에서 침강 되었다. 침전물(pellet)은 10 mM MES(pH5.5) 및 10mM MgSO4을 포함하는 용액에 현탁 되어, 각 개별의 배양액당 10-1 배로 희석하였다. 6-8 주 온실-배양된 니코티아나 벤타미아나( Nicotiana benthamiana) 식물의 잎은 바늘(needle)이 없는 주사기를 사용하여 침투되었다. 아그로침투에 프로벡터를 사용하는 경우에서, 아그로박테리아 혼합물은 하기의 성분들 중의 하나를 제공하는 5 개의 상이한 아그로박테리아 변종들의 각개를 운반한다. 재조합효소(인테그라아제) 근원(pICH10881); 5' PVX 프로벡터(pICH21380); IgG 사슬 중 하나를 제공하는 하나의 3' PVX 프로벡터(TMV 프로벡터에 의해 제공되는 상보적 사슬에 좌우되는 중쇄를 제공하는 pICH22250 또는 경쇄를 제공하는 pICH22240); 5' TMV 프로벡터(pICH17388); 하나의 3' TMV 프로벡터(경쇄를 암호화하는 pICH21910 또는 중쇄를 암호화하는 pICH21920 중의 하나).
SDS - PAGE 및 웨스턴 블랏
아그로박테리움으로 침투된 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎 100 ㎎ 시료를 300 ㎕ 단백질 추출 완충용액(0.1 M 트리스, 150 mM NaCl 및 0.1% 트윈 20, pH8.0)과 함께 액화 질소에서 갈아 주었다. 미정제된 잎 추출물은 10%(비-환원 조건) 또는 12%(환원 조건) 폴리아크릴아마이드 겔에서 램나이(Laemmli) 완충 시스템을 이용하여 분석되었고, 이어서 쿠마시 브릴런트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색되었다. 웨스턴 블랏 분석을 위해서, 블랏팅 완충용액(25 mM 트리스, 192 mM 글리신, 20% 메탄올, pH8.3)을 사용하여 SDS-PAGE의 단백질들이 하이본드 P 멤브레인(Amersham Biosciences, UK)으로 전기영동적으로 이동하였다. TBST(50 mM 트리스, 100mM NaCl, 0.05% 트윈 20, pH7.4)에 녹인 5% 스킴 밀크로 멤브레인을 차단하고, 각각 2.5% 스킴 밀크/TBS에 1:10000 및 1:5000으로 희석된, 염소 항-인간 람다 경쇄 HRP-접합 항체(Sigma, UK) 또는 염소 항-인간 IgG 감마 사슬 특이 HRP-접합 항체(Sigma, UK)로 탐지되었다. 결합된 항체들은 ECL 검출 용액(ECL Detection Reagent; Amersham Biosciences, UK)을 사용하여 검출되었다. 전기천공 분리와 웨스턴 블랏 분석의 결과가 도 11B에 나타내어진다. IgG 표준의 비교에서 식물 조직에서 단일 항체의 수율은 생 잎 생물량의 그램 당 0.2 - 0.35 ㎎에 이른다.
식물-유래 재조합 단일항체의 분리
전체 가용성 단백질이 100 mM 인산 나트륨, 150 mM NaCl 및 0.05% 트윈 20(pH8.0)을 포함하는 완충용액으로 아그로접종된 니코티아나 벤타미아나 ( Nicotiana benthamiana ) 잎 영역로부터 추출되었다. 미정제된 단백질 추출물로부터 항-암 단일항체의 소-규모 분리가 공급자의 사용설명서에 따라 단백질 A 자성 비드(Protein A Magnetic Beads; New England Biolabs, USA)와 함께 일-단계 친화도 정제법을 이용하여 수행되었다. 정제된 식물-유래 단일항체와 함께 쿠마시-염색된 겔은 도 11B(패널 B)에 나타내었다.
실시예 6
TMV 및 PVX -기반 벡터로 여포 자극 호르몬( follicule stimulating hormone ; FSH) 의 발현.
소(bovine)FSH의 알파(GenBank Acc. No. NM_173901의 암호화 서열 101-464 에 대응하는 뉴클레오티드) 및 베타(GenBank Acc. No. NM_174060의 암호화 서열 70-459 에 대응하는 뉴클레오티드) 폴리펩티드를 암호화하는 유전자(cDNA)가 제한효소 자리(FSH-알파 및 FSH-베타 서브유닛에 대한 5'Nco1- 3'EcoR1) 옆으로 끼어져서 생합성되고 TMV 프로-벡터(pICH20431, pICH11599의 유도물, 도 10B) 및 PVX 벡터(pICH21240)에 클로닝 되어 IgG 의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 서열을 대체하고 서브유닛 알파 및 서브유닛 베타를 암호화하는 서열을 각각 포함하는 두 개의 구조물, pICH-FSHA 및 pICH-FSHB를 생성하였다(도 12). PVX 및 TMV-기반 벡터로부터 발현된 두 개의 상이한 서브유닛을 제공하는 아그로박테리아의 혼합물이 제조되었고 상기에서 기술한 방법에 따라 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎에 침투되었고, 이형이량체 FSH의 발현량이 상업적으로 이용가능한 FSH 이량체-특이(FSH117) 항체를 이용하여 접종 후 10일에 ELISA로 측정되었고 트로픽스 화학발광 시스템(Tropix chemiluminescent system; Tropix, Bedford, MA)으로 검출되었다.
실시예 7
TMV 및 PVX -기반 벡터로 IgM 의 발현.
pICH15933 의 GFP 및 DsRed 암호화 서열은 IgM 경쇄와 J 사슬을 암호화하는 서열로 각각 대체되어, 구조물 pICH-MLCJ 를 생성하였다(도 13). IgM 중쇄를 암호화하는 유전자는 PVX 벡터(pICH21240)에 클로닝되어, IgG 중쇄를 암호화하는 서열을 대체하고 구조물 pICH-MHC를 생성하였다(도 13). PVX 및 TMV-기반 벡터로부터 발현된 IgM의 세 개의 상이한 사슬을 제공하는 아그로박테리아의 혼합물은 니코티아나 벤타미아나(N. benthamiana) 잎으로 침투되었고, 이형-올리고머 복합체의 발현량은 상업적으로 이용가능한 IgM-특이 항체를 이용하여 접종 10일 후 ELISA에 의해 측정되었다.
유럽특허 출원번호 05 001 819.1 및 미국특허 출원번호 60/593,606의 내용, 본 발명 출원에 의해 청구되는 우선권은 본 명세서에서 참조문헌으로 전체가 통합되어있다.
<110> ICON GENETICS GmbH <120> PRODUCTION OF HETERO-OLIGOMERIC PROTEINS IN PLANTS <130> 7FPI-06-11 <150> PCT/EP2006/000721 <151> 2006-01-27 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 tttggtctca tgaagaaaac taaaccatac accaccaaca caac 44 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ctttttccag cccggagacc atttctgtga tgg 33 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 tttcgtctca gggctggaaa aagaggactt ccctgaagg 39 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 gagtcgtctc ctgcataaac ttgagcag 28 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 tttgaagaca atgcaggaga cgactccgca ctgg 34 <210> 6 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cggacgtctt tttttttttt tttttttttt ttatttatat tattcataca atcaaaccag 60 aaaatac 67 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 tttacgcgtt tcgacaaaat ttagaacgaa cttaattatg 40 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 tttggtctca ttcattcaaa gcggagagga aaatatatg 39 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 cagctagcaa caaacaagaa aggtaagttt c 31 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 tctgagctct gcatgctacg cccccaactg agag 34

Claims (42)

1차와 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 헤테로-올리고머 단백질을 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 상기 1차와 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터의 제공에 의해 포함하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하며, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터가 (a) 동일한 바이러스 종의 바이러스들로부터 유래하지 않은 바이러스 벡터; (b) 상기 1차 및 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열 부분을 제외한 서열 부분이 상이한 바이러스 벡터; (c) 상기 1차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF와 상기 2차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF가 최대 90%의 상동성을 가지는 바이러스 벡터; 또는 (d) 상기 1차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF와 상기 2차 바이러스 벡터의 레플리카아제 ORF가 최대 85% 의 동일성을 가지는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 식물, 상기 식물 조직, 또는 상기 식물 세포로부터 상기 헤테로-올리고머 단백질을 분리하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터가 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하는 1차 핵산 서열을 포함하고, 상기 2차 바이러스 벡터가 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 2차 핵산 서열을 포함하고, 상기 1차 또는 상기 2차 단백질 서브유닛의 발현이 서브-게놈 프로모터(sub-genomic promoter)에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터가 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하는 1차 핵산 서열을 포함하고, 상기 2차 바이러스 벡터가 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 2차 핵산 서열을 포함하고, 상기 1차 또는 상기 2차 단백질 서브유닛의 발현이 IRES 요소에 의해 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터 또는 상기 2차 바이러스 벡터가
외피 단백질 ORF, 또는
이동 단백질 ORF
이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터가 포텍스바이러스(Potexvirus) 속에 속하는 바이러스로부터 유래하고, 상기 2차 바이러스 벡터가 포티바이러스(Potyvirus) 속에 속하는 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터가 감자 바이러스 X(Potato Virus X)로부터 유래하고, 상기 2차 바이러스 벡터가 감자 바이러스 Y(Potato Virus Y)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터가 포텍스바이러스(Potexvirus) 속에 속하는 바이러스로부터 유래하고, 상기 2차 바이러스 벡터가 토바모바이러스(Tobamovirus) 속에 속하는 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터가 감자 바이러스 X(Potato Virus X)로부터 유래하고, 상기 2차 바이러스 벡터가 담배 모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 및 상기 2차 바이러스 벡터가 최대 60% 서열 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 헤테로-올리고머 단백질이 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 상기 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에 일시적으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아그로박테리움(Agrobacterium) 형질감염에 의해 상기 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에 일시적으로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 바이러스 벡터 또는 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 RNA 바이러스 벡터의 DNA 전구체로서 식물 염색체 DNA에 안정적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 DNA 전구체로부터 상기 1차 바이러스 벡터 또는 상기 2차 바이러스 벡터의 방출 조절은 유도성 프로모터에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 1차 또는 상기 2차 단백질 서브유닛은 ER-표적화 신호(ER-targeting signal)로서 식물-특이적 신호 펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 식물-특이적 신호 펩티드는 담배 칼레티큘린(Calreticulin) 또는 쌀 알파-아밀라아제(alpha-amylase)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 항체는 항원 결합 도메인의 일부를 포함하는 면역글로불린(immunoglobulin)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 항체는 면역글로불린 중쇄와 공동으로 방어 단백질을 포함하고, 방어 단백질은 폴리면역글로불린 수용체의 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 항체 또는 그것의 유도체는 면역글로불린 G 클래스, 면역글로불린 A 클래스, 면역글로불린 M 클래스, 면역글로불린 D 클래스, 또는 면역글로불린 E 클래스에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 헤테로-올리고머 단백질이 인슐린인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 헤테로-올리고머 단백질의 하나 또는 두 개 또는 그 이상의 서브유닛이 소포체 보유 신호 KDEL(endoplasmatic reticulum retention signal KDEL)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 단백질 서브유닛을 암호화하는 핵산 서열은 상기 헤테로-올리고머 단백질로부터 당화(glycosylation) 부위를 일부 또는 전부 제거하기 위해 돌연 변이되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 상기 헤테로-올리고머 단백질의 당화 패턴을 변경하기 위해 유전자 조작되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 가지과(Solanacea)에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 꽃담배속(Nicotiana) 종인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 담배(Nicotiana tabacum) 또는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 양배추과(Brassicacea)에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 협과(Legume)에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 자주개자리(Medicago sativa)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 명아주과(Chenopodiaceae)에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 사탕무우(Beta vulgaris)인 것을 특징으로 하는 방법.
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1차 단백질 서브유닛과 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 헤테로-올리고머 단백질을 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공함으로써 상기 1차 및 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 상이한 플러스-센스 단일-가닥 식물 RNA 바이러스들로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
1차 단백질 서브유닛과 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 헤테로-올리고머 단백질을 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공함으로써 상기 1차 및 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 1차와 2차 단백질 서브유닛을 암호화하는 서열 부분을 제외한 서열 부분이 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
1차 단백질 서브유닛과 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 헤테로-올리고머 단백질을 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공함으로써 상기 1차 및 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 상이한 종에 속하는 플러스-센스 단일-가닥 식물 RNA 바이러스로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
1차 및 2차 단백질 서브유닛을 포함하는 항체를 식물, 식물 조직, 또는 식물 세포에서 생산하는 방법으로, 상기 방법은 상기 식물, 상기 식물 조직 또는 상기 식물 세포에 1차 및 2차 플러스-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 벡터를 제공함으로써 상기 1차 및 상기 2차 단백질 서브유닛을 식물 세포에서 발현하는 것을 포함하고, 상기 1차 바이러스 벡터는 상기 1차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 2차 바이러스 벡터는 상기 2차 단백질 서브유닛을 암호화하고, 상기 1차 바이러스 벡터와 상기 2차 바이러스 벡터는 상이한 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
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