JP2005110517A - Ｒｎａ依存性ｒｎａポリメラーゼ蛋白質の製造 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを可溶性蛋白質として得ることが可能な、当該ポリメラーゼの製造方法を提供し、さらに、この製造方法により得られた当該ポリメラーゼの活用手段を提供することにある。
【解決手段】下記の工程を行う、組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質の製造方法を提供し、当該蛋白質を用いることにより、上記の課題を解決し得ることを見いだした。
１）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列を有する核酸を組み込んだ、組み換えバキュロウイルスを、昆虫由来細胞に感染させる工程。
２）上記感染昆虫由来細胞をインキュベートする工程。
３）上記感染昆虫由来細胞の粗抽出液を、陽イオン交換樹脂に接触処理後、この陽イオン交換樹脂を塩の濃度勾配により溶出し、この溶出物中から、組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を分離する工程。
【選択図】 なし

Description

本発明は、特定のウイルス由来の酵素蛋白質の製造方法と、この方法により効率的に製造し得る酵素蛋白質、さらに、この酵素蛋白質を用いる薬剤の選別方法に関する発明である。
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（以下、ＲｄＲｐともいう）は、ＲＮＡを遺伝情報として用いるＲＮＡウイルスが、宿主において、その遺伝子を発現するための本質的な酵素である。
よって、このＲｄＲｐについて探求することは、やっかいなＲＮＡウイルスによる疾患の有効な治療手段を提供することにつながり、非常に有益である。
Vazquez AL et al, Journal of Virology (2000) Apr;74(8) 3888-91 Zei L et al, Journal of Virology (2001) Feb;75(3) 1211-1219 Journal of General Viorogy (1999), 80, p.291-206
ＲｄＲｐについての探求を行う場合に、精製された組み換えＲｄＲｐを相当量入手可能な状態であることは、非常に重要である。しかしながら、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスのＲｄＲｐをコードする遺伝子を大腸菌等で発現させると、得られる組み換え蛋白質は不溶性となることが多いが、不溶性の蛋白質は、精製するのが困難である。このため、生成させた不溶性の蛋白質を変性させたり、Ｃ末端側をコードする遺伝子の一部を除いて発現させて、可溶性にしている（Ferrari E et al, Journal of Virology (1999) Feb;73(2) 1649-54, Yamashita T. et al, J. Biol. Chem. (1998) June 19;273(25) 15479-86）。しかしながら、このようにして可溶化すると、この蛋白質の本来の活性や特異性が失われる可能性があり、また、精製したＲｄＲｐを実用化レベルで得るには、煩雑に過ぎ、不十分であると考えられる。
そこで、本発明が解決すべき課題は、簡便に、ＲｄＲｐを、本来のＲＮＡポリメラーゼ活性を有する可溶性蛋白質として得ることが可能な、ＲｄＲｐの製造方法を提供し、さらに、この製造方法により得られたＲｄＲｐ活用手段を提供することにある。
本発明者は、この課題に向けて鋭意検討を行った結果、下記の工程を行う、組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質（ＲｄＲｐ）の製造方法（以下、本製造方法ともいう）を提供することにより、上記の課題を解決することを見いだした。
１）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列を有する核酸を組み込んだ、組み換えバキュロウイルスを、昆虫由来細胞に感染させる工程（第１工程）。
２）上記感染昆虫由来細胞をインキュベートする工程（第２工程）。
３）上記感染昆虫由来細胞の粗抽出液を、陽イオン交換樹脂に接触処理後、この陽イオン交換樹脂を塩の濃度勾配により溶出し、この溶出物中から、組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を分離する工程（第３工程）。
また、本発明者は、上記の製造方法により、カリシウイルス科に属するヒト由来のノロウイルス（以下、ＮＶともいう）の、新規のＲｄＲｐを得た。そして、この新規のＲｄＲｐを用いた、ウイルスにおける核酸合成に影響を与える薬剤を選別する、薬剤の選別方法（以下、本選別方法ともいう）を提供するに至った。
＜本製造方法＞
本製造方法の第１工程で用いる組み換えバキュロウイルスは、常法により作出することができる。
すなわち、ＲｄＲｐの製造原料として用いるＲＮＡウイルスから、ウイルスの遺伝子ＲＮＡを常法により抽出し、この遺伝子ＲＮＡに対して、例えば、ＲＴ―ＰＣＲ法等の遺伝子ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを鋳型として、所望する遺伝子をＤＮＡとして増幅する、遺伝子の増幅方法を行うことにより得られる遺伝子増幅産物を、トランスファーベクター、例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＡｃＹＭ１、ｐＶＬ１３９２等に組み込み、これを用いて上記遺伝子増幅産物による組み換えバキュロウイルスを作出する。この組み換えバキュロウイルスによる、昆虫由来細胞、例えば、Ｔｎ５細胞、Ｓｎ７細胞、Ｓｆ９細胞等へのトランスフェクションを行い、感染細胞を得ることができる。
上記ＲＮＡウイルスとしては、例えば、Ｃ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルス、アストロウイルス、エンテロウイルス、コロナウイルス、デング熱ウイルス等を挙げることができる。これらの中でも、ノロウイルス、サポウイルス等のカリシウイルス科に属するウイルス、殊に、ノロウイルスを、ＲｄＲｐの製造原料と用いることが好適である。
また、上記のＲＴ―ＰＣＲ法等の遺伝子増幅法を行う際に用いる遺伝子増幅用プライマーの塩基配列は、ＲｄＲｐをコードする遺伝子の塩基配列が既知の場合には、その遺伝子の末端近傍の塩基配列に従って設計することが好適であり、未知の場合には、例えば、近縁にあたるウイルスのＲｄＲｐをコードする遺伝子の塩基配列を基に、目的ウイルスのＲｄＲｐをコードする遺伝子の塩基配列を推定して設計することが好適である。
次に、第２工程においては、常法に従い、感染昆虫由来細胞のインキュベートを行う。
第３工程においては、上記感染昆虫由来細胞の粗抽出液を、陽イオン交換樹脂に接触処理を行うことにより、この陽イオン交換樹脂に、上記感染細胞において発現された組み換えＲｄＲｐを吸着させる。ここで用いる陽イオン交換樹脂としては、陽イオン交換樹脂であれば特に限定されないが、例えば、S(methyl sulphonate)、SP(sulphopropyl)等を挙げることができる。また、この吸着は、カラム法によって行うことも可能であり、バッチ法によって行うことも可能である。
次いで、組み換えＲｄＲｐが吸着されたカラムから、溶出液により、この組み換えＲｄＲｐを溶出させる。溶出は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等の塩の濃度勾配によることが好適である。
上記の溶出液における、組み換えＲｄＲｐを含有するピーク溶液を得て、このピーク溶液から、組み換えＲｄＲｐを分離して、所望する組み換えＲｄＲｐの製造を行うことができる。
さらに組み換えＲｄＲｐの精製を行うことも可能であり、この精製は、常法、例えば、蛋白沈殿剤処理、限外濾過、ゲル濾過、液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、遠心分離、電気泳動、透析、陰イオン交換樹脂を用いる方法等を、単独または組み合わせることにより、行うことができる。
上述したように、本製造方法を行うことにより、組み換えＲｄＲｐを可溶性蛋白質として、容易に得ることが可能であり、後述する、現実的に薬剤の選別手段として用いるレベルで、組み換えＲｄＲｐを製造することが可能である。
後述するように、本製造方法により、配列番号３に示すヒトノロウイルス由来の、新規の組み換えＲｄＲｐを製造することができた（以下、この新規の組み換えＲｄＲｐを、本ＲＮＡポリメラーゼともいう）。
＜本選別方法＞
本選別方法は、本ＲＮＡポリメラーゼによる、ウイルスＲＮＡの核酸合成の、促進または阻害を指標に、ウイルスにおける核酸合成に影響を与える薬剤を選別する、薬剤の選別方法である。
本選別方法では、例えば、本ＲＮＡポリメラーゼを含む、in vitroのウイルスＲＮＡ合成系において、被験薬剤を添加した場合のウイルスＲＮＡの合成の促進または阻害を検出することにより、この被験薬剤の、in vivoにおけるウイルスの核酸合成への影響を推定して、目的とする薬剤を選別することができる。
具体的には、被験薬剤により、ウイルスＲＮＡの合成が促進された場合には、この被験薬剤は、in vivoにおけるウイルスの核酸合成を促進する薬剤として、例えば、そのウイルスを研究用に用いる場合や、ＲｄＲｐの製造原料として用いる場合の、ウイルス増殖促進剤として選択することが可能である。
また、逆に、被験薬剤により、ウイルスＲＮＡの合成が抑制された場合には、この被験薬剤は、in vivoにおけるウイルスの核酸合成を抑制する薬剤として、例えば、そのウイルスによる疾患の治療剤の有効成分として選択することが可能である。
なお、被験薬剤の種類は特に限定されず、例えば、有機化合物、無機化合物、蛋白質、核酸、糖蛋白質、糖鎖等のいずれを選択することが可能であり、さらに、天然物であっても合成物であってもよい。
また、本発明は、本選別方法を行うためのキット、すなわち、本ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を構成要素として含有する、本選別方法を行うためのキット（以下、本キットともいう）を提供する。
本キットは、本ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を必須の構成要素として含むが、その他、本選別方法を行う便宜に供することが可能な要素、例えば、希釈液、ポジティブコントロール用として核酸（ＲＮＡ）等を含有させることも可能である。
本キットが、構成要素のセットとして提供されることにより、本選別方法の実施者は、効率的に本選別方法を行うことができる。
本発明により、簡便に、ＲｄＲｐを可溶性蛋白質として得ることが可能な、ＲｄＲｐの製造方法が提供され、さらに、この製造方法により得られたＲｄＲｐの薬剤の選別方法としての活用手段が提供される。
食中毒の原因としては一般に、サルモネラ、腸炎ビブリオ、病原性大腸菌O-157などのバクテリア(細菌性食中毒)あるいはフグやキノコなどに含まれる自然毒(自然毒食中毒)が知られている。しかし、最近の疫学調査によると、ウイルスが原因である食中毒(ウイルス性食中毒)が、食中毒事例の多くの割合を占めていることが明らかになってきた。ウイルス性食中毒の原因ウイルスにはノロウイルス(Norovrus：ＮＶ,以前はノーウォークウイルスあるいはSRSVと呼ばれていた)、ロタウイルス、アストロウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルスなどが知られている。冬季に頻発するウイルス性食中毒の大多数は、ＮＶが原因であり、感染すると激しい嘔吐や下痢、胃腸炎などの症状が引き起こされる。
ノロウイルス（以下、ＮＶともいう）は、培養細胞系がないため、その増殖メカニズムの詳細な解析はなされていない。
ＮＶはカリシウイルス科に属し、3'末端にpolyA配列をもつ約7.5kbのプラス鎖で、1本鎖のＲＮＡをゲノムとして持っている。3つの蛋白質読み枠(ＯＲＦ)がゲノムおいて認められ、上流側からＯＲＦ1,ＯＲＦ2,ＯＲＦ3に分けられている。ＯＲＦ1の3D領域には、他のＲＮＡウイルスに見られるようなＲｄＲｐの特徴的なアミノ酸配列である、グリシン−アスパラギン酸−アスパラギン酸(GDDモチーフ)が存在する。ＲｄＲｐはプラス鎖を鋳型にマイナス鎖、さらにマイナス鎖からプラス鎖を合成し、ウイルスゲノムを複製する活性を有すると考えられている。しかし、カリシウイルス科ウイルスの中でＲｄＲｐ活性について報告があるのは、ウサギ出血熱ウイルス(RHDV)（Vazquez AL et al, Journal of Virology (2000) Apr;74(8) 3888-91）およびネコカリシウイルス(FCV)（Zei L et al, Journal of Virology (2001) Feb;75(3) 1211-1219）のみであり、ヒトに感染するタイプのカリシウイルスについてはＲｄＲｐがどのような性状を示すのか明らかになっていない。Journal of General Viorogy (1999), 80, p.291-206には、ヒトカリシウイルス（サザンプトンウイルス）の全配列が記載されているが、ウイルス自身が持つプロテアーゼによる切断位置が示され、ＲｄＲｐの位置が予測されているに過ぎず、未だに、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する、遺伝子における正確な部位も解明されていない。よって、当然、組み換え蛋白質として、活性を有するヒトＮＶのＲｄＲｐが得られていない。このようなヒトＮＶのＲｄＲｐのＲＮＡポリメラーゼ活性を伴う配列部分を明らかにし、かつ、当該ＲｄＲｐを可溶化蛋白質として製造することは、非常に技術的な価値の高い事項である。
ＮＶのＲｄＲｐは、同じプラス鎖ＲＮＡウイルスであるHCVやポリオウイルスなどが持っているＲｄＲｐと似たような立体構造を示すと考えられている。よって、ＲｄＲｐによるＮＶゲノム複製機構を解析することは、ＮＶの感染、増殖の分子機序の解明に役立つとともに、ＮＶのみならずプラス鎖ＲＮＡウイルスを広く阻害するようなＲｄＲｐをターゲットとした新たな薬剤の開発につながる可能性がある。そこで、ヒトＮＶのＲｄＲｐを、バキュロウイルスを用いて発現させ、これをコードする遺伝子の塩基配列とアミノ酸配列を解析し、さらに、ＲＮＡpolymerase活性の内容について検討を行った。
[ヒトＮＶのＲｄＲｐの製造]
組換えバキュロウイルスの作出と精製蛋白質の製造
図１において、ＮＶgenome構造を模式的に示す。本実施例では、野生型の3D(PVLwt3D)、GDDモチーフをGAAに置換したもの[PVLm3D(GAA)],GDDモチーフをGADに置換したもの[PVLm3D(GAD)],および3B(pVL3B)をクローニングし、組換えバキュロウイルスを作出した。
具体的には、Saitama U201(G2) ゲノムFull-length cDNAクローン（登録番号：AB039872）より、３Ｄ領域（＝ＲｄＲｐ）をＰＣＲで増幅し（増幅用プライマーとしては、EagI-3D（5'-TTTcggccgATGGGAGGTGACGACAAGGGCACCTAT-3'：配列番号１）及び3D-EcoRI（5'-AAAgaattcTTATTATTCGACGCCATCTTCATTCACAAA-3'：配列番号２）の２つのＤＮＡプライマーを用いた）、トランスファーベクター（ｐＶＬ１３９２）にクローニングした（図１）。これにバキュロウイルスＤＮＡ(BaculoGold, AcNPV)を加えて相同組換えを起こさせた。これをＳｆ９細胞に感染させ、培養上清より組換えバキュロウイルスを回収した。次にこの組換えバキュロウイルスをＴｎ５細胞に感染させて、３Ｄ領域を大量に発現させた。
得られた３Ｄ領域は、Seah E.L. et al, Journal of Virology (1999) Dec;(73)12 10531-10535, Seah E.L. et al, Journal of Virology (2002) June;(76)5949-5958等を参考にして、解析した。解析した３Ｄ領域をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列と、これに対応するアミノ酸配列を、配列番号３において示す。
また、GDDモチーフを、変異を入れたＰＣＲプライマーを用いて突然変異を誘発させることにより、GADまたはGAAに置換した、mutant cDNAを同様にクローニングした(図1)。また、ネガティブコントロールとして３Ｂ領域のcDNAをクローニングした。これらのcDNAクローンを用いて組替えバキュロウイルスを作製し、Tn5細胞に感染させ、4〜5日後に細胞を回収した。感染細胞をPBSで洗浄後、氷冷したcell-lysis buffer (20mM Tris-HCl, pH7.5, 1mM EDTA,10mM dithiothreitol, 2%Triton X-100, 500mM NaCl, 10mM MgCl2, 50%glycerol, and EDTA-free protease inhibitors)に懸濁し超音波破砕処理後、15,O00g xg, 30分の遠心によって上清を分離し、crude extractを得た。このcrude extractを、SP buffer(25mM MES,pH6.4,1mM EDTA,and1%Triton)に透析後、Hi-Trap SPカラム(cation-exchangeカラム;アマシャム社)にアプライし、SP bufferにO〜1000mM NaClを加えlinear gradientで蛋白質を溶出した。約56キロダルトンのＲｄＲｐは320-550mM NaCl溶出画分に見られた。これらの一部はＲｄＲｐ sample buffer (20mMTris-HCl, pH7.7, 1mM EDTA, 100mM NaCl, 10mM DTT, 2%Triton, and 50%glycerol)に透析し、ＲｄＲｐ活性測定に用いた。残りのＲｄＲｐを含む画分はすべて集めて、Q buffer (20mM Tris-HCl, pH7.7, 1.0 mM EDTA, and1%triton X-100)に透析後、Hi-Trap Qカラム(anion-exchangeカラム;アマシャム社)にアプライし、Q bufferにO〜1000mM NaClを加え、linear gradientで蛋白質を溶出した。ＲｄＲｐと考えられる蛋白質は、520mM NaCl溶出画分に認められた。この画分をＲｄＲｐ sample bufferで透析し、精製ＲｄＲｐとした。
精製蛋白質のＲＮＡポリメラーゼ活性の検討
ＮＶgenome ＲＮＡの3'側末端のＲＮＡをT７ＲＮＡ polymeraseで合成し、ＲｄＲｐ活性測定のための鋳型ＲＮＡとした。
ＲｄＲｐ活性測定には、15μl反応液中、375ng ＲｄＲｐ,5.0 pmol鋳型ＲＮＡを含む反応buffer(20mM Tris-HCl,pH6.8,2mM MnCl2,100mM NaCl,20mM DTT,20unitsＲＮＡse inhibitor,50ug/ml actinomycin D,250uM GTP,150uM ATP,150uM CTP,5.0uM UTP,4.0 uM[33P]UTP(>2500Ci/mmol)中で行った。
30℃、90分後、60μlのstop solution(10mM Tris-HCl,pH7.5,10mM EDTA,and1OOmM NaCl)を加えてＲｄＲｐ反応を停止させた。ＲＮＡ productをTRISOL-LS reagent(In vitrogen社)を用いて抽出した。イソパノール沈殿によって得られたＲＮＡを、ＲＮＡ sample buffer(80%formamide,1mM EDTA,and O.1%bromophenol blue)に溶解し、8.0M尿素を含む、6.0%あるいは10.0%変性ポリアクリルアミトゲル電気泳動に用いた。ラベルされたＲＮＡ productは、BAS1OOOシステム(富士フィルム社)で検出した。
その結果、組替えバキュロウイルスを感染させたTn5細胞に、約56キロダルトンのＲｄＲｐ蛋白質の発現が認められた。crude extractをcation-exchangeカラムにアプライしNaClのリニアグラジェントで溶出したところ、ＲｄＲｐは320-550mM NaCl画分に認められた(図２−１)。図２−１は、cation-exchangeカラムおよびanion-exchangeカラムから溶出したＲｄＲｐ蛋白質を示している。溶出した蛋白質を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離しCBB染色で検出した。cation-exchangeカラムからの320-550mM NaCl溶出画分を、ＲｄＲｐ活性測定と、anion-exchangeカラム分析に向けて用いた。
GDDモチーフをGAA,またはGADに置換したＲｄＲｐ蛋白質、あるいはネガティブコントロールである3B蛋白質も同様にcation-exchangeカラムで精製した。ＮＶgenomeの3'側ＲＮＡ(図２−２)を鋳型として、発現させたそれぞれの蛋白質の320-550mM NaCl画分をＲｄＲｐ活性測定に用いた。なお、図２−２では、ＲｄＲｐ活性測定に用いた鋳型ＲＮＡを模式的に示している。黒のBarで示した部分のＲＮＡ(ＯＲＦ3-pA)を合成して鋳型ＲＮＡとした。
その結果、GDDモチーフに変異を導入していない野生型のＲｄＲｐ(wt3D)にＲＮＡ合成活性が認められたが、GDDモチーフに変異を導入した変異型ＲｄＲｐであるm3D(GAA)およびm3D(GAD)にはほとんど活性が認められず、ネガティブコントロールの3Bと同程度のレベルであった(図２−３)。なお、図２−３は、cation-exchangeカラムからの溶出画分によるＲｄＲｐ活性を示している。野生型の3D、GDDモチーフをGAAに置換したもの（m3D(GAA)）、GDDモチーフをGADに置換したもの（m3D(GAD)）、および、3Bを発現させた細胞から得られたcation-exchangeカラム溶出画分をＲｄＲｐ反応に用いた。一番左のレーンには、ＯＲＦ3-pAＲＮＡをT７ＲＮＡpolymeraseによってラベルしＲＮＡサイズマーカーとして示してある。ＲＮＡ productは、8M尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、BAS1OOOシステムで検出した。
これらの結果から野生型のＲｄＲｐ(wt3D)は、ＲＮＡを鋳型にＲＮＡを合成する活性を有することが明らかになった。次に、ＲｄＲｐ活性を有する画分を集めanion-exchangeカラムにアプライし、NaClのリニアグラジェントで溶出したところ、ＲｄＲｐは520mM NaCl画分に認められた(図２−１) 。この画分を精製ＲｄＲｐとし、以降のＲｄＲｐ活性の検討に用いた。
上述した結果から、上記のトランスファーバキュロウイルスを用いて昆虫培養細胞に感染させ、イオン交換カラムを用いて精製することにより、活性を有するＲｄＲｐが大量に再現よく得ることが可能となることが明らかとなった。
得られたＲｄＲｐの性質
１）図３は、ＮＶ ＲｄＲｐの至適2価陽イオンとActinomycin Dのポリメラーゼ活性に対する影響について検討した図面である。なお、用いた鋳型ＲＮＡは、図２―２と同じである。ＲｄＲｐ Productは、図２と同様に検出した。
さまざまなウイルス由来のＲｄＲｐはそれ特有の2価陽イオンの要求性を示すことが知られている。そこで、ＮＶ ＲｄＲｐの2価陽イオンの要求性を明らかにするため、MgCl2,MnCl2,およびCaCl2を様々な濃度で加えＲｄＲｐ活性を測定した。図３（Ａ）に示すように、2価陽イオンの至適条件は2mM MnCl2であった。また、これらの活性が感染細胞内にもともと存在するDNA-dependent ＲＮＡpolymerase由来のものであることを否定するために、DNA-dependent ＲＮＡpolymeraseの阻害剤であるActinomycin Dを様々な濃度で添加した(図３（Ｂ）)。ＲＮＡ合成活性には変化が見られなかったことから、ＲＮＡ合成活性は発現させたＮＶ ＲｄＲｐ蛋白質由来のものであることが明らかになった。
２）図４は、ＲｄＲｐのTNT活性とS1 nuclease消化について検討した結果を示す図面である。
C型肝炎ウイルス(HCV)のＲｄＲｐは、ＲＮＡの3'末端に塩基を付加するterminal nucleotidyltransferase(TNT)活性を示すという報告がある。そこで、上記のようにして得られたＲｄＲｐ productが、鋳型ＲＮＡに対し相補的なＲＮＡを合成したものであることを確認するために、TNT活性により鋳型ＲＮＡの3'末端に[33P]UTPが付加されただけのものであるか否かについて検討した。図４（１）では、ＲｄＲｐ活性測定にもちいた鋳型ＲＮＡを模式的に示している。黒のBarで示した部分のＲＮＡ(608-pA)を合成して、鋳型ＲＮＡとした。
まず、反応液からラベルしていないcoldのATP,CTP,GTPを取り除きＲｄＲｐ反応を行い、鋳型ＲＮＡの3'末端に[33P]UTPが付加されるかどうか検討した。図４（２）おいては、TNT反応には、ＲｄＲｐ反応液からcoldのATP,GTP,CTPを除いたもの(レーン2)およびcoldのATP,GTP,CTP,UTPを除いたもの(レーン3)を用いたことが示されている。S1 nuclease digestionは、ＲｄＲｐ Productをあらかじめ熱変性しないもの(レーン5,6)およびＲｄＲｐ Productをあらかじめ熱変性したものを(レーン7)を用いて、S1 nucleaseで10分、あるいは30分インキュベートしたものを用いたことが示されている。なお、ＲｄＲｐ productは図２における過程と同様に検出した。
図４（２）、レーン１〜3に示すように [33P]UTPのみ、あるいは[33P]UTPとcoldのUTPのみを加えた場合ではラベルされたＲＮＡが検出されなかったことから、鋳型ＲＮＡの3'末端には[33P]UTPが付加されず、ＮＶＲｄＲｐにはTNT活性が認められなかった。次にＲｄＲｐ反応によって合成されたProduct ＲＮＡが2本鎖を形成しているのかを検討した。2本鎖を形成している場合にはＮＶ ＲｄＲｐは鋳型ＲＮＡに対し相補的なＲＮＡを合成していると言えるからである。1本鎖ＲＮＡ特異的に切断するS1 nucleaseをＲｄＲｐ productに作用させても分解されなかった(図４（２）レーン5,6)。
一方、ＲｄＲｐ productを前もって熱変性し、一本鎖にしたあとにS1nucleaseを作用させるとＲｄＲｐ productは完全に分解した。これらの結果から、ＲＮＡ productは2本鎖を形成していることが明らかとなった。ＮＶのＲｄＲｐにはTNT活性はなく、鋳型に相補的なＲＮＡをdenovoで合成する活性があると考えられた。
３）図５は、ＮＶ ＲｄＲｐのPoly(A)およびPrimer依存性の解析を行った結果を示す図面である。
ＮＶのgenomic ＲＮＡは、3'末端にPoly(A)配列をもつことが知られている。そこで、ＲｄＲｐにより、genomic ＲＮＡを鋳型に相補的なＲＮＡ合成する場合に、このpoly(A)配列が必須かどうかについて検討した。図５（１）において、ＲｄＲｐ活性測定に用いた鋳型ＲＮＡを模式的に示している。黒のBarで示した部分のＲＮＡを合成して鋳型ＲＮＡとした。すなわち、鋳型ＲＮＡとしてgenomic ＲＮＡの3'末端にPoly(A)配列をもつ608-pAおよびPoly(A)配列を除いた608-delAを用いた。
ＲＮＡサイズマーカーとして、T７ＲＮＡpolymeraseによってラベルしたＲＮＡをＲｄＲｐ Productと同時に電気泳動に用いた(図５（２）)。 図５（２）においては、608-pA(レーン2)および608-delA(レーン4)を鋳型にしたＲｄＲｐ Productの電気泳動像を示している。レーン1およびレーン3にはそれぞれ608-PAおよび608-delAをT７ＲＮＡ polymeraseでラベルし、ＲＮＡサイズマーカーとして示してある。この結果から、鋳型ＲＮＡからpoly(A)を除いてもＲｄＲｐ活性に変化は認められず、ＲＮＡサイズマーカーと同じ長さのＲＮＡが合成されていたことから、ＲｄＲｐ反応にはpoly(A)配列は必ずしも必要でないことが明らかとなった。
図５（３）では、ＲｄＲｐ反応のＲＮＡ primerによる影響について検討を行った結果を示している。608-pA ＲＮＡを鋳型として1.0pmol(レーン2),5.0 pmol(レーン3),20.0 pmol(レーン4)のoligo(U)15あるいは、10.0pmol(レーン5),1.0nmol(レーン6),10.0 nmol(レーン7)のUpUを加えた。ＲｄＲｐ Productは、図2に示す工程と同様にして検出した。この結果、ＲＮＡ primerは、ＲｄＲｐ Productの合成にはほとんど影響を与えないことが判明した。これらの結果から、ＮＶ ＲｄＲｐによる相補的ＲＮＡの合成はpoly(A)およびprimer非依存的であると考えられた。
[本選別方法の有用性の検討]
上述したように、本発明者は、酵素活性を有するＮＶ ＲｄＲｐ（本ＲＮＡポリメラーゼ）の発現及び精製に成功した。これを用いてＮＶＲｄＲｐ活性の測定を行うことにより、ＮＶ ＲｄＲｐの性状を明らかにすることが出来るとともに、ＲｄＲｐをターゲットとしたウイルス増殖阻害剤等のウイルスにおける核酸合成に影響を与える薬剤のスクリーニングも可能となる。
図６は、ＲｄＲｐ阻害剤の本ＲＮＡポリメラーゼの活性に及ぼす影響について検討した結果を示す図面である。
すなわち、HCVやPolivirusのＲｄＲｐに対する阻害効果を示すものとして、ホスホノ酢酸(PAA)およびG1iotoxinがあるが、これらの薬剤がＮＶＲｄＲｐに阻害効果を示すかどうか調べた。鋳型として、608-pA ＲＮＡ(図５参照のこと)を用い、25μM(レーン2), 100μM(レーン3), 250μM(レーン4)のgliotoxin、あるいは、5μM(レーン2), 100μM(レーン3), 250μM(レーン4)のPAAを含む反応液でＲｄＲｐ反応を行った。なお、ＲｄＲｐ Productは図２で行った工程と同様に検出した。
その結果、PAAはＮＶ ＲｄＲｐに対し阻害効果を示し、50%阻害効果を示す濃度(ID50)は20μM以下であった。一方、gliOtOXinを用いた場合は全く阻害効果が見られなかった。
ＮＶのＲｄＲｐは、他のプラス鎖ＲＮＡウイルスが持っているＲｄＲｐと似たような立体構造を示すと考えられている。ＮＶ ＲｄＲｐ活性を阻害する薬剤のスクリーニングを行うことにより、ＮＶによる胃腸炎等の予防のみならず、ＲＮＡウイルスを広く阻害する薬剤の開発につながる可能性がある。
ＮＶgenome構造を模式的に示した図面である。 cation-exchangeカラムおよびanion-exchangeカラムから溶出したＲｄＲｐ蛋白質を示している図面である。 ＲｄＲｐ活性測定に用いた鋳型ＲＮＡを模式的に示した図面である。 cation-exchangeカラムからの溶出画分によるＲｄＲｐ活性を示した図面である。 ＮＶ ＲｄＲｐの至適2価陽イオンとActinomycin Dのポリメラーゼ活性に対する影響について検討した図面である。 ＲｄＲｐのTNT活性とS1 nuclease消化について検討した結果を示す図面である。 ＮＶ ＲｄＲｐのPoly(A)およびPrimer依存性の解析を行った結果を示す図面である。 ＲｄＲｐ阻害剤の本ＲＮＡポリメラーゼの活性に及ぼす影響について検討した結果を示す図面である。

Claims (9)

  1. 下記の工程を行う、組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質の製造方法。
    １）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする塩基配列を有する核酸を組み込んだ、組み換えバキュロウイルスを、昆虫由来細胞に感染させる工程。
    ２）上記感染昆虫由来細胞をインキュベートする工程。
    ３）上記感染昆虫由来細胞の粗抽出液を、陽イオン交換樹脂に接触処理後、この陽イオン交換樹脂を塩の濃度勾配により溶出し、この溶出物中から、組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を分離する工程。
  2. 昆虫由来細胞が、Ｔｎ５細胞である、請求項１記載の組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質の製造方法。
  3. 組み換えＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質が、カリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質である、請求項１または２記載のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質の製造方法。
  4. カリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項３記載のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質の製造方法。
  5. 配列番号３に示すアミノ酸配列を有するノロウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質。
  6. 請求項５記載のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質による、ウイルスＲＮＡの核酸合成の、促進または阻害を指標に、ウイルスにおける核酸合成に影響を与える薬剤を選別する、薬剤の選別方法。
  7. ウイルスが、カリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスである、請求項６記載の薬剤の選別方法。
  8. カリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスが、ノロウイルスである、請求項７記載の薬剤の選別方法。
  9. 配列番号３に示すアミノ酸配列を有するノロウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ蛋白質を構成要素として含有する、請求項６〜８のいずれかの薬剤の選別方法を行うためのキット。
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