CN103554245A - 一种融合标签蛋白 - Google Patents

一种融合标签蛋白 Download PDF

Info

Publication number
CN103554245A
CN103554245A CN201310481574.0A CN201310481574A CN103554245A CN 103554245 A CN103554245 A CN 103554245A CN 201310481574 A CN201310481574 A CN 201310481574A CN 103554245 A CN103554245 A CN 103554245A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
fusion
albumen
hrev107n
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310481574.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103554245B (zh
Inventor
夏斌
段博
陈安琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Priority to CN201310481574.0A priority Critical patent/CN103554245B/zh
Publication of CN103554245A publication Critical patent/CN103554245A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103554245B publication Critical patent/CN103554245B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种融合标签蛋白。本发明的融合标签蛋白是在野生型HREVl07(1—125)蛋白的C89S突变体(记为HREVl07N)基础上构建的，包括SEQ ID No：1所示氨基酸序列的HREVl07N，以及在其P38-K57无规卷曲区域中插入的两段Linker和这两段Linker之间的多克隆位点对应短肽。本发明进一步提供了一种融合蛋白表达系统，包括编码所述融合标签蛋白的核酸分子，目的蛋白基因插入到所述多克隆位点中，在融合标签蛋白的C端还可以再连接rubredoxin标签蛋白和His标签，以利于融合蛋白的表达和纯化。

Description

一种融合标签蛋白
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型的融合标签蛋白，以及基于该融合标签的新型融合蛋白表达系统。
背景技术
将外源基因转入大肠杆菌等宿主细胞中表达以获得相应的目的蛋白，是科研以及生产过程中获取所需蛋白质的重要方法之一。大肠杆菌作为蛋白表达的宿主细胞有很多优点：比如易于繁殖，蛋白表达量高且价格便宜。但是它也有很多局限性，例如：一些异源蛋白在大肠杆菌体内表达时表达量很低，一些蛋白表达后易于降解，或者表达的外源蛋白对宿主细胞具有毒性，导致细菌生长停滞或死亡。或者虽然表达量较高，但表达时蛋白尚未正确折叠便聚合在一起形成包涵体。对包涵体进行体外变复性实验使其重新折叠的方法不仅复杂，而且难以保证变复性后蛋白的结构与正常生理状态下一致。
选择合适的表达载体和宿主细胞，或优化表达温度和时间等方法可以使一些蛋白的表达情况得到改善，但很多时候仍然难以凑效。目前使用较为广泛的方法是利用具有促表达以及促溶作用的标签蛋白与目的蛋白融合表达。
有一些蛋白质在大肠杆菌中表达时表达量很高，而且能够正确折叠成可溶性蛋白，性质稳定，常被用作标签蛋白与目的蛋白融合在一起表达。此类标签蛋白被称为SETs(Solubility-Enhancing Tags)，目前已发现了多种SETs，例如Trx、GST、MBP、NusA、SUMO、GB1等等(Esposito，D.and D.K.Chatterjee(2006).″Enhancement of soluble protein expressionthrough the use offusion tags.″CurrOpinBiotechnol17(4)：353-358.)。但此类标签蛋白究竟如何帮助目的蛋白的表达和折叠，机理目前尚不十分明确，且这些SETs不能帮助所有的蛋白质表达和折叠。对于某种难以表达的蛋白，我们可能需要尝试使用不同的SETs以找到合适的表达条件。
HREV107(又称H-REV107-1，H-REV107-3和HRSL3)是肿瘤抑制因子H-REV107家族蛋白中的一员。它在正常的组织中广泛表达，但在癌细胞中的表达受到明显的抑制。H-REV107的大量表达可以抑制肿瘤细胞的生长并且诱导细胞凋亡(Ren，X.，J.Lin，C.Jin andB.Xia(2010).″Solution structure of the N-terminal catalytic domain of human H-REV107--a novelcircular permutated NlpC／P60domain.”FEBS Lett584(19)：4222-4226.)。
H-REV107由亲水的N端结构域和疏水的C端结构域构成，分别具有不同的功能：N端结构域具有磷脂酶活性；C端是跨膜结构域，与细胞定位有关，并能够抑制肿瘤生长。HREV107亲水性的N端(1-125个残基)在大肠杆菌中表达时可溶表达量很高而且性质稳定。据此，我们研究了HREV107N作为一新型融合标签的可能性，并依据其结构特点构建了一种新型的融合标签以及相应的融合蛋白表达系统。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型的融合标签蛋白以及基于此标签蛋白所构建的新型融合蛋白表达系统。
所述新型融合标签蛋白涉及一种新型融合蛋白构建方法，此方法也在本发明所保护的范围之内。
本发明所提供的新型融合标签蛋白以HREV107的N端结构域(第1-125位残基)(记为HREV107N)为基础构建。本发明所述HREV107N的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。与野生型序列相比，本发明所述HREV107N序列中第89位为丝氨酸，而野生型序列该位置为半胱氨酸，即本发明所述HREV107N是其野生型的C89S突变体。此突变是为避免原有半胱氨酸残基参与形成二硫键，突变后蛋白整体结构不受影响。
本发明还涉及HREV107N的编码基因，其编码基因可以是序列表中SEQ ID No：2所示的DNA分子。当然，由于密码子的简并性，其它与SEQ ID No：2所示核苷酸序列同源且编码相同氨基酸序列的DNA分子也可用于构建本发明的融合标签蛋白。
HREV107的N端结构域在大肠杆菌中表达时可溶表达量很高而且性质稳定，故可作为一种潜在的具有促溶作用的标签蛋白。HREV107N蛋白质结构如图1所示。其结构中存在一段较长的无规卷曲(P38-K57)，这段区域不参与疏水核心的构建，独立地伸展在外。
基于HREV107N的此种特殊结构，我们猜测在HREV107N的P38-K57部分插入一种目的蛋白后，HREV107N其它部分应当依然能够按照原来的方式折叠，形成一种与原有结构基本相同的稳定结构域(参见图2)。而HREV107N的高表达量以及高度可溶的特性将增强融合蛋白的可溶表达。该猜想被核磁NHSQC实验所验证(见实施例二，图4)。
外源蛋白在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体，包涵体是由来不及正确折叠的蛋白质聚集在一起形成的沉淀。当目的蛋白插入到HREV107N的(P38-K57)无规卷曲区域表达时，由于HREV107N能够重组成为正确折叠的结构域，目的蛋白的自由度受到约束，目的蛋白之间发生相互作用聚集到一起形成包涵体的可能性降低。同时，目的蛋白被限定在HREV107N附近进行折叠，减少了其他因素的干扰，有助于其正确折叠。此外，在HREV107N的约束下，目的蛋白的生理活性有应当有所降低，某些外源蛋白对宿主细胞的毒性也应当有所下降。
基于上述研究，本发明提供的融合标签蛋白包括HREV107N，以及在其P38-K57区域中插入的两段Linker(连接肽)和这两段Linker之间的多克隆位点(MCS)对应短肽。
Linker区域序列可根据需要选择合适的蛋白酶切位点(例如PreScission蛋白酶酶切位点LEVLFQGP)以及其他氨基酸残基。通常每段Linker的长度为15-20氨基酸残基。多克隆位点便于目的蛋白的插入，可根据需要选择合适的限制性酶切位点。
上述融合标签蛋白的编码基因，以及含有该编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也在本发明的保护范围内。按照HREV107N的蛋白质一级序列，在其P38-K57区域内的某一位置将其分成两部分，这两部分的编码序列记为第一核酸片段和第二核酸片段，则所述融合标签蛋白的编码基因依次包括位于同一个阅读框架中的第一核酸片段、Linker1的编码序列、多克隆位点、Linker2的编码序列和第二核酸片段。
上述多克隆位点(MCS)位于两段Linker的编码序列(记为linker1和linker2)之间，即linker1-MCS-linker2；而linker1-MCS-linker2位于上述组成HREV107N编码基因的第一核酸片段和第二核酸片段之间。
在本发明的一个实施例中，Linker片段和MCS对应短肽插入到HREV107N的第47位和第48位氨基酸残基之间。其构建方式如下：
将HREV107N的蛋白质一级序列分开成HREV107(1-47)和HREV107(48-125)两部分，分别记为Hrevn和Hrevc。在这两部分对应的核酸片段之间加入两段Linker的编码序列以及这两段linker之间的多克隆位点(MCS)，如图3所示，得到所述融合标签蛋白的编码序列。
为进一步方便目的蛋白的表达和纯化，本发明还提供了以所述融合标签蛋白和另一标签蛋白rubredoxin(铁氧还蛋白)(Kohli，B.M.and C.Ostermeier(2003).″A Rubredoxin basedsystem for screening of protein expression conditions and on-line monitoring of the purificationprocess.″Protein ExprPurif28(2)：362-367.)为基础构建的融合蛋白表达系统。该融合蛋白表达系统包括一核酸分子，所述核酸分子编码的融合蛋白除了上述融合标签蛋白外，在其C端还连接有rubredoxin标签蛋白。
rubredoxin(铁氧还蛋白)是一种6KDa大小的含铁的蛋白质，当Fe为+2价时rubredoxin无色，当Fe为+3价时rubredoxin呈红色。氧化态rubredoxin具有颜色的特性可使得融合蛋白的表达和纯化可视化。
再进一步的，在上述融合蛋白表达系统在rubredoxin标签蛋白的C端还可以连接上His标签(图4)。His标签使得融合蛋白可用Ni-NTA吸附柱进行纯化。
本发明的融合蛋白表达系统在表达数种自身难以可溶表达的蛋白如AID(Alers，S.，A.S.Loffier,S.Wesselborg and B.Stork(2012).″Role of AMPK-mTOR-Ulk1／2in the regulation ofautophagy：cross talk，shortcuts，and feedbacks.”Mol Cell Biol32(1)：2-11.)、HREV107C端结构域、C-clamp(Hoverter,N.P，J.H.Ting，S.Sundaresh，P Baldi and M.L Waterman(2012).″AWNT／p21circuit directed by the C-clamp，a sequence-specific DNA binding domain in TCFs.”MolCell Biol32(18)：3648-3662.)时获得了很高的表达量。而对于另一种常规表达时导致大肠杆菌宿主死亡的蛋白质Killin，利用所述融合蛋白表达系统亦获得了很好的表达结果。
附图说明
图1显示了HREV107(1-125)区域结构，N端第1-37位氨基酸残基和C端第58-125位氨基酸残基之间为一段20个氨基酸残基长度的柔性区域，该部分不参与疏水核心的构建，独立伸展在外。
图2是本发明所述新型融合标签蛋白的构建示意图，在HREV107(1-47)和HREV107(48-125)之间插入目标蛋白后，HREV107N的两部分仍然能够重组成为正确折叠的蛋白质。
图3是本发明所述新型融合标签蛋白的一级结构示意图，由N端到C端依次是HREV107(1-47)、Linker1、MCS、Llinker2和HREV107(48-125)。
图4是HREV107N和在HREV107N中间柔性区域插入另一蛋白质rubredoxin后所得融合蛋白的NHSQC核磁实验结果，其中：黑色为HREV107N蛋白的信号，灰色为融合蛋白的信号。
图5是实施例三所构建的新型融合蛋白表达系统的折叠结构示意图，目标蛋白插入HREV107(1-47)和HREV107(48-125)之间。
图6是实施例三所构建的新型融合蛋白表达系统的蛋白一级结构示意图，由N端到C端依次是HREV107(1-47)、Linker1、MCS、Linker2、HREV107(48-125)、rubredoxin和His标签。
图7显示了AID、C-clamp、Hrev-C与Killin(8-50)单独表达以及利用新型融合表达系统表达时的表达情况，其中：A.AID与C-clamp单独表达时几乎无表达；B.Hrev-C单独表达时形成包涵体；C.Killin单独表达时导致宿主细胞死亡，故表达量很低；D.利用实施例三构建的新型融合表达系统，上述蛋白都获得了较高的可溶表达量，而且很少形成包涵体。UI：未诱导样品；T：全菌；S：细菌裂解后所得上清；P：细菌裂解后所得沉淀。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例具体说明本发明新型融合标签蛋白的构建过程以及新型融合蛋白表达系统的效果，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例中，如实验具体条件未注明，请参照《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克D.W拉塞尔著)所述常规实验条件，或者仪器、试剂供应商所提供的条件。常规质粒构建所涉及的PCR、酶切、连接等实验，以及蛋白质表达所涉及的转化、细菌培养、诱导等实验为本领域研究人员所熟悉，具体实验细节在本发明中不再做详细描述，亦可参照《分子克隆实验指南》。
实施例一：野生型HREV107(1-125)基因片段的获得以及C89S突变体构建
野生型HREV107(1-125)的DNA片段可以通过以人类肝脏cDNA文库(购自武汉三鹰生物技术有限公司)为模板的PCR扩增反应获得。
以人类肝脏cDNA文库为模板，以NdeI-REV-N／REV-XhoI-C为引物，进行PCR扩增，得到两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点的野生型HREV107(1-125)基因片段。将该片段通过这两个酶切位点插入pET-21a载体中，得到pET-21a-HREV107N-His质粒。引物序列如下：
NdeI-REV-N：5’-GGAATTCCATATGCGTGCGCCCATTCCA-3’(SEQ ID No：4)
REV-XhoI-C：5’-CCGCTCGAGGGCGACTCCATAGCGCAG-3’(SEQ ID No：5)
其中CATATG与CTCGAG分别为NdeI和XhoI限制性酶切位点。
由于野生型HREV107(1-125)结构中第89位半胱氨酸在蛋白质的表面，有可能与其他半胱氨酸之间形成二硫键，本发明将该半胱氨酸突变为丝氨酸。另外，113位的半胱氨酸由于在疏水核心内部，不需进行突变。
定点突变所用试剂购自上海赛百盛基因技术有限公司，具体实验过程细节请参阅试剂盒说明书。以从大肠杆菌中纯化得到的pET-21a-HREV107N-His质粒为模板，以C89S_F／C89S_R为引物，用Muta-directTM酶进行18个循环的PCR扩增反应，MutazymeTM酶处理选择突变克隆，转化。取LB平板上的克隆摇菌，提纯质粒并测序，选择正确的突变克隆，得到pET-21a-HREV107N_C89S-His质粒。
定点突变所用引物序列如下：
C89S_F：5’-GTACTCGCCGCTGCCCAGCAGCAAAATCATCCA-3’(SEQ ID No：6)
C89S_R：5’-TGGATGATTTTGCTGCTGGGCAGCGGCGAGTAC-3’(SEQ ID No：7)
为叙述简便，说明书其他地方不再对此突变进行强调，其他实施例中所涉及HREV107N序列均指突变体序列。
实施例二：Hrevn-rubredoxin-Hrevc-His融合蛋白的质粒构建、表达和表征
本实施例以rubredoxin蛋白作为目的蛋白，将其插入HREV107N的P38-K57区域。
本实施例所用rubredoxin蛋白以及构建过程中选择的linker、酶切位点等仅用于说明新型融合标签蛋白的构建方法，并不限定本发明的应用范围。
1)构建重组质粒
重组质粒表达区域从5’端至3’端共包括以下A至F共6部分，序列依次为：
A)HREV107(1-47)：参照序列表中SEQ ID No：2的第1-141位核苷酸序列，其编码SEQ IDNo：1的第1-47位氨基酸残基；
B)Linker1：
5’ccatggggtggttctggtggtggttctggtctggaagttctgttccaggggcccggatcc-3’(SEQ ID No：8)其中位于首尾的ccatgg与ggatcc序列分别为NcoI和BamHI限制性酶切位点，以便于变换linker。
对应氨基酸序列为：PWGGSGGGSGLEVLFQGPGS(SEQ ID No：9)
其中LEVLFQGP为PreScission蛋白酶酶切位点。
C)rubredoxin：参照序列表中SEQ ID No：3；
D)Linker2：
5’-gaattcggtggtggtggttctctggaagttctgttccaggggccctcttctggtatcgat-3’(SEQ ID No：10)
其中位于首尾的gaattc与atcgat序列分别为EcoRI和ClaI限制性酶切位点。
对应氨基酸序列为：EFGGGGSLEVLFQGPSSGID(SEQ ID No：11)
E)HREV107(48-125)：参照序列表中SEQ ID No：2的第142-375位核苷酸序列，其编码SEQ ID No：1的第48-125位氨基酸残基。
F)His标签
设计相应引物利用重叠PCR反应将前5部分(A至E)依次连接在一起，然后通过NdeI和XhoI限制性酶切位点插入pET-21a商业载体中，该载体带有一个His标签，在融合蛋白的C端。
2)融合蛋白的表达和纯化
将重组质粒转化大肠杆菌BL21表达菌株。35℃条件下培养细菌，先在20mL LB中培养12h，转入1L LB中继续培养。当菌液OD值为0.8时温和离心并将菌体转入500mL15N同位素标记的M9培养基。继续培养1h后加入0.4mMIPTG以及0.7mMFeCl3诱导蛋白表达。4h后收集细菌。超声破碎，离心，取上清液。利用DE52阴离子交换色谱或Ni-NTA吸附柱以及FPLC色谱分离纯化得到15N标记的融合蛋白。
3)利用核磁NHSQC实验观察融合蛋白的折叠情况
以15N标记的HREV107N蛋白为对照，对15N标记的融合蛋白进行核磁NHSQC实验，实验结果见图4。黑色为HREV107N蛋白的信号，灰色为融合蛋白的信号。可以看到HREV107N的大部分信号在融合蛋白的NHSQC图谱上均可找到，证明在融合蛋白中，HREV107N的结构与原结构基本相同。也就是说，在HREV107N中间柔性区域插入另一蛋白质rubredoxin后，HREV107N的两部分仍然能够重组成为正确折叠的蛋白质。
实施例三：新型融合蛋白表达系统的构建以及测试
在本实施例中，四种不同的蛋白被用来测试新型融合蛋白表达系统的效果。
1)测试所用目的蛋白介绍
AID：AID(auto-inhibiting domain)是腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase(AMPK))α亚基的一部分。AMPK是一种重要的蛋白激酶，它在人体的很多器官组织包括肝脏、大脑、骨骼肌中都有表达。生物体内AMP／ATP比例的升高能够激活AMPK的活性，AMPK被激活后能够促进多细胞生物体内一系列分解代谢过程，同时抑制一些合成代谢通路，比如脂类、蛋白质和碳水化合物的生物合成，从而使AMP与ATP的比例维持在恒定水平。因此AMPK是生物能量代谢的关键分子。
C-clamp：Wnt信号通路是多细胞真核生物中高度保守的信号通路，在胚胎发育、某些肿瘤发展等过程中起到重要作用。当Wnt信号通路激活时，下游转录因子LEF／T cellfactor(LEF／TCF)与基因组中的Wnt响应序列(Wnt response elements，WREs)结合，从而激活或抑制相应基因的转录过程。LEF／TCF蛋白与DNA的主要结合区域是HMG(high mobility group)box7。近来，有研究发现有一类LEF／TCF存在第二个与DNA结合的区域。该区域由约37个氨基酸构成，含有4个十分保守的半胱氨酸残基，因而被命名为C-clamp(Cystine clamp)模体。C-clamp能够特异性结合RGGC序列。对C-clamp结构以及其DNA结合机制的研究有助于阐明这一类LEF／TCF转录因子的作用机制。
Killin：Killin是p53靶基因编码的20KDa的核蛋白，它受p53调控抑制核内DNA的合成，对p53诱导的细胞凋亡起重要作用。它对DNA的结合能力很强，在体外它可抑制真核生物的DNA合成，在体内它可以引发细胞凋亡前的S期生长停滞。在试图用大肠杆菌大量表达并纯化6XHIS-tagged Killin时发现，在加入IPTG(isopropyl-D-thiogalactoside)诱导半个小时后，细菌生长停滞，已表达的蛋白由于量非常少，用Western blot检测时几乎不能用His-tag的单克隆抗体检测到，而且由于Killin结合了DNA使其His-tag不能和Ni结合，因此无法用Ni-NTA亲和色谱纯化得到Killin纯蛋白。研究发现Killin中对于抑制DNA合成起关键作用的DNA结合域是接近Killin N端的42个氨基酸残基(8-50)，它是保持Killin毒性的最短的片段。
Hrev-C：HREV107的C端结构域(126-162)，包括HREV107的第126-162位氨基酸残基。
AID和C-clamp在大肠杆菌中的表达量很低(见图7A)，而HREV107的C端结构域(126-162)(记为Hrev-C)在大肠杆菌中表达时为包涵体(见图7B)，Killin(8-50)区域则因为表达时导致宿主细胞死亡故而不能通过传统的表达方式获得蛋白(见图7C)。
2)新型融合蛋白表达系统的构建
参照图4，新型融合蛋白表达系统自5’端至3’端包括七部分，分别为：
A)HREV107(1-47)：参照序列表中SEQ ID No：2的第1-141位核苷酸序列，其编码SEQ IDNo：1的第1-47位氨基酸残基；
B)Linker1：
5’ccatggggtggttctggtggtggttctggtctggaagttctgttccaggggccc-3’(SEQ ID No：12)
其中ccatgg为NcoI限制性酶切位点，用于必要时候变换linker。
对应氨基酸序列为：PWGGSGGGSGLEVLFQGP(SEQ ID No：13)
其中LEVLFQGP为PreScission蛋白酶酶切位点。
C)MCS：多克隆位点(multiple cloning site)，用于目的蛋白的插入，本例中采用BamHI与EcoRI两个限制性酶切位点，即5’-GGATCCGAATTC-3’(SEQ ID No：14)。
D)Linker2：
5’-ggtggtggtggttctctggaagttctgttccaggggccctcttctggtacga-3’(SEQ ID No：15)
其中atcgat为ClaI限制性酶切位点。
对应氨基酸序列为：GGGGSLEVLFQGPSSGID(SEQ ID No：16)
E)HREV107(48-125)：参照序列表中SEQ ID No：2的第142-375位核苷酸序列，其编码SEQ ID No：1的第48-125位氨基酸残基。
F)rubredoxin：参照序列表中SEQ ID No：3。
G)His标签。
将前6部分(A至F)通过重叠PCR反应连接在一起，通过NdeI和XhoI限制性酶切位点插入到C端带有His标签的pET-21a商业载体中。其中HREV107(48-125)与rubredoxin之间再引入三个残基，避免二者之间互相干扰，序列为SSG。
3)将AID、C-clamp、Hrev-C以及Killin(8-50)通过BamHI和EcoRI限制性酶切位点分别插入新型融合蛋白表达系统，得到四个重组质粒。
4)将重组质粒转化BL21表达菌株。35℃条件下培养细菌，先在3mL LB中培养12h，转入20L LB中继续培养。当菌液OD值为0.8时加入0.4mMIPTG以及0.7mMFeCl3诱导蛋白表达。4h后收集细菌。
5)利用SDS-PAGE蛋白凝胶电泳分析各融合蛋白的表达情况，结果如图7D所示。
利用本发明的新型融合蛋白表达系统，原本表达量低或表达时形成包涵体的几种蛋白均获得了很高的可溶表达量。同时，该系统所带的rubredoxin标签蛋白由于具有颜色，使得表达与纯化过程变得可视化。表达系统中的His标签使得融合蛋白可用Ni-NTA吸附柱进行纯化。
Figure IDA0000395886960000021
Figure IDA0000395886960000031
Figure IDA0000395886960000041
Figure IDA0000395886960000051

Claims (10)

1.蛋白HREV107N，其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。
2.权利要求1所述蛋白HREV107N的编码基因。
3.如权利要求2所述的蛋白HREV107N的编码基因，其特征在于，该编码基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。
4.一种融合标签蛋白，包括权利要求1所述的蛋白HREV107N，以及在其第38-57位氨基酸残基组成的无规卷曲区域中插入的两段Linker和这两段Linker之间的多克隆位点对应短肽。
5.如权利要求4所述的融合标签蛋白，其特征在于，所述两段Linker和多克隆位点对应短肽插入到蛋白HREV107N的第47位和第48位氨基酸残基之间。
6.如权利要求4所述的融合标签蛋白，其特征在于，每段Linker长15-20氨基酸残基；优选的，在所述Linker中具有蛋白酶切位点；更优选的，两段Linker的序列如序列表中SEQ IDNo：14和SEQ ID No：16所示。
7.权利要求4～6任一所述融合标签蛋白的编码基因，以及含有该编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
8.一种融合蛋白表达系统，包括一核酸分子，该核酸分子编码的融合蛋白包含权利要求4～6任一所述的融合标签蛋白，其中所述的多克隆位点用于目的蛋白基因的插入。
9.如权利要求8所述的融合蛋白表达系统，其特征在于，所述核酸分子编码的融合蛋白还包含连接在权利要求4～6任一所述的融合标签蛋白C端的rubredoxin标签蛋白。
10.如权利要求9所述的融合蛋白表达系统，其特征在于，所述核酸分子编码的融合蛋白还包含连接在rubredoxin标签蛋白C端的His标签。
CN201310481574.0A 2013-10-15 2013-10-15 一种融合标签蛋白 Active CN103554245B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310481574.0A CN103554245B (zh) 2013-10-15 2013-10-15 一种融合标签蛋白

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310481574.0A CN103554245B (zh) 2013-10-15 2013-10-15 一种融合标签蛋白

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103554245A true CN103554245A (zh) 2014-02-05
CN103554245B CN103554245B (zh) 2014-12-31

Family

ID=50008635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310481574.0A Active CN103554245B (zh) 2013-10-15 2013-10-15 一种融合标签蛋白

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103554245B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838694A (zh) * 2016-05-18 2016-08-10 南京工业大学 一种融合标签蛋白
CN107529549A (zh) * 2017-09-29 2018-01-02 青岛大学 利用蓝藻黄素蛋白fnr直观检测目的蛋白表达纯化的方法
CN112321719A (zh) * 2020-07-28 2021-02-05 北京劲捷生物科技有限公司 一种药物载体蛋白及其应用
CN113777325A (zh) * 2017-02-15 2021-12-10 欧蒙医学实验诊断股份公司 改进的诊断花生过敏的测定法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN BG: "Expression purification and biochemical characterization of the N-terminal regions of human TIG3 and HRASLS3 proteins", 《PROTEIN EXPR PURIF》 *
REN X: "1H,13C,15N resonance assignments of human H-REV107 N-terminal domain", 《BIOMOL NMR ASSIGN》 *
XIAOBAI REN: "Solution structure of the N-terminal catalytic domain of human H-REV107-A novel circular permutated NlpC/P60 domain", 《FEBS LETTERS》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105838694A (zh) * 2016-05-18 2016-08-10 南京工业大学 一种融合标签蛋白
CN105838694B (zh) * 2016-05-18 2019-07-26 南京工业大学 一种融合标签蛋白
CN113777325A (zh) * 2017-02-15 2021-12-10 欧蒙医学实验诊断股份公司 改进的诊断花生过敏的测定法
CN107529549A (zh) * 2017-09-29 2018-01-02 青岛大学 利用蓝藻黄素蛋白fnr直观检测目的蛋白表达纯化的方法
CN107529549B (zh) * 2017-09-29 2020-10-02 青岛大学 利用蓝藻黄素蛋白fnr直观检测目的蛋白表达纯化的方法
CN112321719A (zh) * 2020-07-28 2021-02-05 北京劲捷生物科技有限公司 一种药物载体蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103554245B (zh) 2014-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Plater et al. Effects of site-directed mutations on the chaperone-like activity of αB-crystallin
Ayers et al. Introduction of unnatural amino acids into proteins using expressed protein ligation
Kämper et al. Multiallelic recognition: nonself-dependent dimerization of the bE and bW homeodomain proteins in Ustilago maydis
Song et al. Cultivation at 6–10 C is an effective strategy to overcome the insolubility of recombinant proteins in Escherichia coli
Steele et al. Identification of a surface on the β-propeller protein RACK1 that interacts with the cAMP-specific phosphodiesterase PDE4D5
Affandi et al. Mechanism of metal ion-induced activation of a two-component sensor kinase
CN103554245B (zh) 一种融合标签蛋白
Wang et al. Efficient therapeutic delivery by a novel cell-permeant peptide derived from KDM4A protein for antitumor and antifibrosis
Blanchard et al. Identification of β-glucosidase aggregating factor (BGAF) and mapping of BGAF binding regions on maize β-glucosidase
Kwon et al. Highly efficient protein expression and purification using bacterial hemoglobin fusion vector
Tyler et al. Formation of a multiple protein complex on the adenovirus packaging sequence by the IVa2 protein
Hirvas et al. Bacterial ‘histone-like protein I’(HLP-I) is an outer membrane constituent?
Aoki et al. Sec22b-dependent assembly of endoplasmic reticulum Q-SNARE proteins
Rumlová et al. Comparison of classical and affinity purification techniques of Mason-Pfizer monkey virus capsid protein: the alteration of the product by an affinity tag
WO2001098349A2 (en) Recombinant avidin monomer and its use in biotin binding
KR100843634B1 (ko) 세포막투과 전달 펩타이드 및 이를 포함하는 생물제제
Andreánsky et al. High-level expression of enzymatically active bovine leukemia virus proteinase in E. coli
Tang et al. Addition of C-terminal histidyl tags to PsaL and PsaKl proteins of cyanobacterial phtosystem I
KR100729830B1 (ko) 페너트라틴을 이용하여 단백질의 세포투과를 증진시키는대장균용발현벡터
CA2120499A1 (en) Methods and compositions for identifying inhibitors of papilloma virus replication
Bressanin et al. Proteolysis of the proofreading subunit controls the assembly of Escherichia coli DNA polymerase III catalytic core
KR20090046780A (ko) Ραｓ 변이체 및 이를 포함하는 벡터
Zepeda Mechanisms of Human LARP6 Nuclear Export
Borrero et al. Ross Rayne Vermeulen1, Anton Du Preez Van Staden1, 2* and Leon Dicks1
Park et al. Expression and characterization of N-terminal domain of Epstein–Barr virus latent membrane protein 2A in Escherichia coli

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant