CN109055378B - 单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用，所述单亚基RNA聚合酶为

类噬菌体单亚基RNA聚合酶，通过KP34RP制备长链cap‑cas9mRNA，见序列表SEQ ID NO.4，IRES‑cas9 mRNA，见序列表SEQ ID NO.5，和IRES‑sox7 mRNA，见序列表SEQ ID NO.6，cas9被广泛运用于基因编辑，sox7在胚胎发育中起重要作用。构建三种mRNA转录模板质粒时在其基因序列5’端和3’端加入了来源于非洲爪蟾核质蛋白定位信号序列NLS，见序列表SEQ ID NO.1、来自于丙肝病毒内部核糖体进入位点序列IRES，见序列表SEQ ID NO.2和poly(A)+BspQ I，见序列表SEQ ID NO.3序列元件，保证体外合成的mRNA在细胞内能被高效翻译成具有活性的功能蛋白。产物均一，纯度高，均达到毫克级别，完全能满足市场对于mRNA研究和应用需求。

Description

单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用

技术领域

本发明属于长链RNA合成研究生产领域，具体涉及单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用，运用KP34噬菌体单亚基RNA聚合酶合成可用于细胞基因编辑的cap-cas9 mRNA、IRES-cas9 mRNA，影响胚胎发育的转录因子IRES-sox7 mRNA的生产技术。

背景技术

在过去的数十年间，随着siRNA、miRNA、mRNA、长链非编码RNA、RNA适配体、核酶等RNA技术飞速发展，RNA在生物学上越来越受到重视(Burnett J C.，2012)。以往的一些实验方法已逐渐不能满足科研和临床实验对RNA的需求，越来越多的RNA生物学研究中需要用到几十毫克级甚至上百毫克的高纯度RNA；与此同时，越来越多的RNA开始作为药物分子进入临床实验阶段，有的已经被FDA批准上市，作为药物运用于临床无疑对RNA产品的质量也提出了更高的要求(Easton L E.，2010)。

目前的技术，化学合成短链RNA小于50nt比较有优势(JunichiYano，2012)，但当需要合成大于50nt以上的长链RNA时，化学合成成本会大幅增加，长度100nt的RNA已经达到化学合成的极限，科研人员只能依靠RNA聚合酶体外转录合成的方法来合成大于100nt的RNA(McKenna S A.，2007)。

当今用于体外合成RNA的标准酶工具是来自大肠杆菌噬菌体T7 RNA聚合酶，这个酶在上世纪70年代被鉴定(Chamberlin,M.)，在随后的数十年中，人们对T7 RNA聚合酶进行了大量的优化和改造，以满足大家提出的对RNA合成的各种需求，但是T7本身的一些特性是很难根本解决的，比如说对起始转录碱基强烈偏好性(“GG”)，未知的转录终止现象，转录产物末端不均一性(转录产物3’端非特异性加入若干碱基)和修饰性碱基掺入效率低等问题(Maslak，M.，1994；Sousa R，2003)。直到30多年后，一个与T7噬菌体有亲缘关系但却更加古老的海洋蓝细菌噬菌体Syn5的基因组中克隆，表达了一个全新的RNA聚合酶(Zhu et al.,2013)。Syn5 RNA聚合酶体外合成RNA相关技术，在众多性能方面，尤其是T7系统的几个薄弱环节，Syn5 RNA聚合酶显示出极大的优势(Zhu et al.,NAR,2014&2015)。

本人通过对噬菌体单亚基RNA聚合酶研究的深入了解，发现来源于噬菌体的单亚基RNA聚合酶呈现丰富的种属多样性，转录性质各具特色，所以近年来我们一直在发掘新的单亚基RNA聚合酶，最终我们发现了噬箘体KP34，一种新型细菌病毒，其宿主为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae strains)。肺炎克雷伯氏菌是一种革兰氏阴性菌，是重要的条件致病菌和医源性感染菌之一，噬箘体KP34也被认为是治疗肺炎克雷伯氏菌的候选疗法之一。在形态上噬箘体KP34含有短的尾巴，与T7类同属于短尾噬箘体科(Podoviridae)(Druliskawa et al.,2011)。我们对KP34RP进行了一系列功能研究，发现其在短链RNA合成是表现出比T7RP和Syn5RP更好的特异性，在我们之前的发明专利(专利申请号：CN201810093606.2)有专门阐述。正是由于不同噬菌体来源的RNA聚合酶各具特点，KP34RP的发现，使我们又增加了一个具有自身特点的体外酶法合成RNA的有力工具，随着对KP34RP的深入研究，势必会发现其更多的新特点，它将与T7RP，Syn5RP一样，成为进行体外RNA合成的新选择。

目前，包括cas9蛋白在内的细胞内蛋白表达基本都是通过含有该基因序列的真核表达质粒载体转染到细胞中进行复制并转录成mRNA，最终翻译表达为目的蛋白(Hsu，P.D.,2013)。但是，比起插入了目的基因的真核表达质粒，直接向细胞内转入mRNA有明显优势。首先，转染mRNA比质粒DNA安全，没有质粒DNA可能整合到基因组中的风险；其次，直接转染mRNA，不用再考虑影响基因转录的启动子和终止子，还有就是质粒在细胞内长期存在，不断表达目的蛋白会造成一些未知效应风险，比如cas9蛋白如果在细胞内持续表达，势必会造成脱靶效应的风险提高。所以，如果我们只是想短暂表达某种蛋白，达到目的后这种蛋白能不再在细胞内残留，直接转入mRNA无疑是最好的选择，mRNA的稳定性和其翻译成的蛋白的半衰期一般都只有2天左右，所以其表达的蛋白一般会在4天后彻底消失，这为很多功能蛋白以及蛋白质药物留下了足够效用时间(R.Alexander，2018)。

单亚基RNA聚合酶KP34RP，为来自

类噬菌体的单亚基RNA聚合酶，在我们之前的发明专利(专利申请号：CN201810093606.2)中已经证明其RNA合成能力，KP34RP能够与现有的T7 RNA聚合酶一样，以双链DNA为模板，转录合成长链RNA，但在合成富含高级结构RNA时，KP34RP具有比T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶转录产物更均一的优点。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用，通过引入一些功能序列，显著降低了mRNA合成成本，且不影响mRNA翻译为目的蛋白。本发明意义在于运用国内首个自主知识产权的单亚基RNA聚合酶KP34RP(专利申请号：CN201810093606.2)在体外转录合成长链RNA，为长链RNA的合成提供一种新的有效的候选酶工具。在本文中，申请人提供了运用噬菌体单亚基RNA聚合酶(KP34RP)体外大量合成长链cap-cas9 mRNA、IRES-cas9 mRNA、IRES-sox7 mRNA的生产应用及其纯化方法，通过这一方法申请人获得了纯度和浓度都满足研究需求的毫克级长链mRNA。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

单亚基RNA聚合酶KP34RP转录起始所需的特异性启动子序列，所述特异性启动子序列见序列表SEQ ID NO.7，或包含有超过15个连续碱基序列与序列表SEQ ID NO.7同源性超过50％的碱基序列。

具体的，所述单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用，包括运用所述单亚基RNA聚合酶KP34RP体外批量合成长链mRNA，所述长链mRNA包括cap-cas9 mRNA，IRES-cas9 mRNA和IRES-sox7 mRNA，运用所述单亚基RNA聚合酶KP34RP体外批量合成长链mRNA的方法包括以下步骤：

(1)构建质粒DNA转录模板：

a、cap-cas9转录模板质粒构建；

b、IRES-cas9转录模板质粒构建；

c、IRES-sox7转录模板质粒构建；

(2)转录模板质粒线性化及纯化；

(3)单亚基RNA聚合酶KP34RP转录合成mRNA；

(4)消除模板DNA和mRNA纯化；

(5)mRNA加尾。

进一步的，所述步骤(1)-a的具体方法为：cas9基因5’端通过PCR和无缝克隆技术插入单亚基RNA聚合酶KP34RP转录起始所需的特异性启动子序列，所述特异性启动子序列见序列表SEQ ID NO.7；在所述特异性启动子序列后插入来源于非洲爪蟾核质蛋白的核定位信号序列NLS，所述NLS的序列见序列表SEQ ID NO.1；在cas9基因的3’端插入67个连续的碱基“A”并紧接着一个反向的BspQ I限制性酶切位点，所述67个连续的碱基“A”并紧接着一个反向的BspQ I限制性酶切位点的序列见序列表SEQ ID NO.3。

进一步的，所述步骤(1)-b的具体方法为：在步骤(1)-a构建的cap-cas9转录模板质粒的基础上，通过PCR和无缝克隆技术在单亚基RNA聚合酶KP34RP转录起始所需的特异性启动子序列与来源于非洲爪蟾核质蛋白的核定位信号序列NLS之间插入来自于丙肝病毒的内部核糖体进入位点序列IRES，所述IRES的序列见序列表SEQ ID NO.2。

进一步的，所述步骤(1)-c的具体方法为：在步骤(1)-b构建的IRES-cas9转录模板质粒的基础上，通过PCR和无缝克隆技术直接用sox7基因替换cas9基因。

进一步的，所述步骤(2)的具体方法为：将步骤(1)构建的转录模板质粒进行BspQI酶切线性化得到线性化的转录模板，采用酚氯仿加乙醇沉淀法对线性化的转录模板进行纯化并测定浓度。

进一步的，所述步骤(3)的具体方法为：将步骤(2)纯化后的线性化转录模板通过所述的单亚基RNA聚合酶KP34RP的特异性启动子开始mRNA体外转录，cap-cas9 mRNA反应体系为：5×转录buffer、四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，m7GTP，RNase抑制剂，焦磷酸酶，线性化转录模板，KP34RP，DEPC水；IRES-cas9 mRNA反应体系为：5×转录buffer、四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNase抑制剂，焦磷酸酶，线性化转录模板，KP34RP，DEPC水；IRES-sox7 mRNA反应体系为：5×转录buffer、四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNase抑制剂，焦磷酸酶，线性化转录模板，KP34RP，DEPC水。

进一步的，所述步骤(4)的具体方法为：用DNase将线性化转录模板消除，线性化转录模板消除反应体系为：转录体系1ml，RQ1 DNase 100ul，RQ1 DNase Buffer 100ul，反应体系置于37℃水浴30min；采用LiCl沉淀法纯化mRNA，加入适量的DEPC水溶解沉淀。

进一步的，所述步骤(5)的具体法为：在mRNA的转录产物的67nt连续碱基“A”的基础上利用E.coli Poly(A)Polymerase进一步加尾，加尾反应体系为：mRNA水溶液，E.coilPoly(A)Polymerase 20ul，10×E.coil Poly(A)Polymerase Buffer 50ul，RNase抑制剂10ul，100mM ATP 5ul，补充无RNase水到500ul，反应体系置于37℃水浴30min，中途翻转混匀一次，通过LiCl沉淀法对加尾后的mRNA进行纯化，将mRNA用1mM的柠檬酸钠溶液溶解，测定浓度并稀释成1ug/ul，分装后-80℃保存备用。

在本发明中，我们公布了运用单亚基RNA聚合酶KP34RP体外转录合成用于基因编辑的长链cap-cas9 mRNA、IRES-cas9 mRNA，合成用于调控胚胎发育的转录因子IRES-sox7mRNA的方法，通过该方法，我们不仅获得了毫克级别的大量高纯度mRNA，也证明我们发明的KP34RP可以运用于长链mRNA的大量合成制备。

通过基因克隆的方法，首先，构建了三种基于单亚基RNA聚合酶KP34RP特异性启动子的转录模板质粒，包括转录模板质粒cap-cas9(产物依赖加帽“m⁷GTP”)、不依赖加帽的IRES-cas9模板质粒和IRES-sox7模板质粒，IRES序列是源于丙肝病毒特有的内部核糖体进入位点序列IRES(HCV)，IRES序列可以帮助mRNA不依赖于帽子结构也可以在细胞内进行正常的蛋白质翻译表达。其次，在cas9和sox7基因的5’和3’端分别有两种不同的细胞核定位信号序列(其中3’端核定位信号序列为在购买质粒自带的，但cas9和sox7基因的5’端我们分别额外插入来源于非洲爪蟾核质蛋白的核定位信号序列NLS,见序列表：SEQ ID NO.1)，以保证cas9蛋白和sox7蛋白顺利入核的效率，从而实现其对应的基因编辑和转录调控功能。最后，我们在cas9和sox7基因的3’末端插入了一个含有67个连续poly(A)序列且在连续碱基“A”序列结束后紧邻一个反向BspQ I限制性内切酶的酶切位点，这对于提高mRNA在细胞内的稳定和蛋白质翻译有重要作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种单亚基RNA聚合酶KP34运用于长链cap-cas9 mRNA、IRES-cas9mRNA、IRES-sox7 mRNA合成的方法，转录产物与现有的T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶相比较时，均一性不相上下；重要的是，我们首次将丙肝病毒的内部核糖体进入位点序列IRES运用于体外转录mRNA的辅助翻译表达，并实现稳定量产，由于不需要额外进行mRNA加帽，我们的技术在显著提高RNA产量的同时显著降低体外mRNA合成的成本。

附图说明

图1为本发明构建的cap-cas9转录模板质粒结构示意图；

图2为本发明构建的IRES-cas9转录模板质粒结构示意图；

图3为本发明构建的IRES-sox7转录模板质粒结构示意图；

图4为本发明合成的三种mRNA：cap-cas9，IRES-cas9和IRES-sox7结构示意图；

图5：cap-cas9，IRES-cas9和IRES-sox7三种模板质粒经BspQ I酶切线性化后的琼脂糖凝胶电泳结果图：cap-cas9(7758bp)，IRES-cas9(8143bp)和IRES-sox7(5203bp)；

图6：以三种线性化质粒为模板，经KP34RP转录合成的三种mRNA琼脂糖凝胶电泳结果图：1、2泳道分别代表线性化质粒cap-cas9转录结果和模板消除后纯化的cap-cas9mRNA；3、4泳道分别代表线性化质粒IRES-cas9转录结果和模板消除后纯化的IRES-cas9mRNA；5、6泳道分别代表线性化质粒IRES-sox7转录结果和模板消除后纯化的IRES-sox7mRNA。

具体实施方式

下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中cas9质粒购买自addgene(http://www.addgene.org/72247/)，编号：72247。该质粒包含的cas9基因来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes Cas9 HF1)，但进行了哺乳动物密码子优化和部分点突变(N497A/R661A/Q695A/Q926A)。在细胞内由CMV启动子启动cas9 mRNA转录，cas9基因3’端紧邻-NLS(SV40)-3xFlag，此处的NLS为猿猴空泡病毒SV40核定位序列，为编号(722473)质粒本身带有；另外，质粒自带的3*Flag标签是为了后续蛋白表达水平检测的便利。模板质粒构建过程中使用的主要试剂盒为Takara的PCR高保真酶PrimeSTAR Max Premix和NEB无缝克隆试剂盒。

实施例1：三种模板质粒构建和线性化及纯化

(1)cap-cas9模板质粒的构建

在addgene购入的编号：72247的cas9质粒的的基础上，采用无缝克隆的方法将KP34RP启动子设计到PCR引物中直接插入到紧邻cas9基因前的Kozak序列(GCCGCCACC)的5’端，我们还在启动子序列和cas9基因之间额外插入一个来源于非洲爪蟾(Xenopus laevis)细胞核质蛋白的核定位信号序列NLS：见序列表SEQ ID NO.1，目的是提高cas9蛋白入核效率，进而提高cas9蛋白的基因组编辑效率；此外，我们在cas9基因的3’端的3xFlag标签后插入一个连续的67个A的poly(A)序列并紧接着一个用于进行质粒线性化的反向BapQ I酶切位点，所述67个A及反向BapQ I酶切位点的序列见序列表SEQ ID NO.3，最大限度地提高mRNA的poly(A)加尾效果，cap-cas9模板质粒示意图见图1。构建好的质粒转化DH5α感受态细胞，测序并保存，通过Axygen质粒中量提取试剂盒(AP-MD-P-25)进行质粒制备，-20℃保存备用。

(2)IRES-cas9模板质粒的构建

在步骤(1)构建好的依赖于加帽翻译的cap-cas9模板质粒的基础上，我们将合成好丙肝病毒的IRES序列通过无缝克隆的方法插入到KP34RP启动子序列和cas9基因5’端的核定位信号序列NLS之间，所述IRES的序列见序列表SEQ ID NO.2。利用IRES能被核糖复合体识别的特性，替代mRNA帽子结构，起始cas9 mRNA的翻译表达，IRES-cas9模板质粒示意图见图2。构建好的质粒转化DH5α感受态细胞，测序并保存，通过Axygen质粒中量提取试剂盒(AP-MD-P-25)进行中量质粒制备，-20℃保存备用。

(3)IRES-sox7模板质粒的构建

在步骤(2)构建好的IRES-cas9模板质粒的基础上，我们将合成好的sox7基因序列通过无缝克隆的方法替换掉cas9基因序列，其他序列保持不变，IRES-sox7模板质粒示意图见图3。构建好的质粒转化DH5α感受态细胞，测序并保存，通过Axygen质粒中量提取试剂盒(AP-MD-P-25)进行中量质粒制备，-20℃保存备用。

(4)转录模板质粒线性化及纯化

在转录开始之前便需要将环状的模板质粒进行线性化，在构建质粒时，在67个连续多聚碱基序列(A)后面插入了一个反向限制性内切酶BspQ I的酶切位点(-N↓N₄GAAGAGC)。据此使用BspQ I进行三种质粒的酶切线性化，酶切反应体系为：质粒(25ug)；BspQ I(22ul)；NEB Buffer 3.1(100ul)；补充无RNase水到1ml，置于50℃水浴酶切2h，每隔30min轻轻翻转混匀一次。三种线性化模板质粒在用于转录前，需要经2％琼脂糖凝胶电泳检测线性化是否完全，见图5(泳道：1，2，3)，三种质粒线性化完全彻底，可以进行纯化后用于后续的转录反应。

采用酚氯仿加乙醇沉淀法对线性化的转录模板进行纯化，该方法的主要操作如下：

a.酶切体系均分为两管500ul体系，加入2倍体积的DNA提取液(125:24:1，pH>7.8)，剧烈震荡，12000rpm离心10min；

b.把上层水相(约450ul)移入新的RNase free离心管中，加1/10体积的醋酸钠混匀后加2.5倍体积的无水乙醇，-20℃冷藏30min，13000rpm、4℃离心30min；

c.弃上清，加1ml预冷的75％乙醇，13000rpm、4℃离心20min；

d.用真空泵吸尽残留液体，每管加20ul DEPC水溶解沉淀，测定浓度后置于-20℃备用。

实施例2：运用KP34RP体外转录合成三种长链mRNA并纯化

在实施例1构建好的线性化模板质粒的基础上，用KP34RP进行体外转录大量合成mRNA，三种mRNA的序列结构示意图见图4，图4-A代表cap-cas9 mRNA序列结构示意，其对应核核酸序列见序列表：SEQ ID NO.4；图4-B代表IRES-cas9 mRNA序列结构示意，其对应核核酸序列见序列表：SEQ ID NO.5；图4-C代表IRES-sox7 mRNA序列结构示意，其对应核核酸序列见序列表：SEQ ID NO.6。

由于体外转录的产物为RNA，极易被环境中的RNase降解，所以在进行体外转录实验的过程中，须保证操作环境的洁净，且须避免人体的污染(即在操作进行过程中戴手套、口罩)。批量制备三种mRNA的转录反应体系如表1所示：

表1三种mRNA体外转录反应体系

表1中的“cap-cas9”表示cap-cas9 mRNA是采用在转录过程中对mRNA进行加帽m⁷GTP，即7-甲基鸟嘌呤通过5’-5’-三磷酸酯键后续第一个核苷酸残基相连接；由于市面上m⁷GTP的价格昂贵，所以本发明构建了“IRES-cas9”和“IRES-sox7”，在cas9基因和sox7基因5’端加入了IRES(HCV)序列代替mRNA帽子结构，这样能显著提高转录效率(RNA产量为加帽法的4倍)，并且在不影响mRNA功能的前提下显著降低成本，成本大概为加帽法的1/5。在整个转录体系中，除了rNTP、DNA模板、RNA聚合酶这些关键组分外，焦磷酸酶则是将转录过程中产生的焦磷酸(rNTP→rNDP+PPi)水解，减少转录副产物焦磷酸(PPi)对转录反应的抑制；而RNase抑制剂则是为了抑制转录过程中可能存在的痕量RNase活性，减少RNA降解风险。转录后产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，见图6(泳道：1，3，5)，由于RNA为单链，且容易形成大量的二级结构，导致其电泳速度比同等大小的双链DNA快一倍左右，故RNA琼脂糖电泳条带大小实际上为其真实大小的1/2左右。

(2)模板DNA消除及RNA纯化

DNA模板在转录完成后需要除去，因为与RNA同为核酸大分子，可能会在后续的纯化步骤中部分随RNA一起沉淀，严重影响RNA的纯度，而且可能会在随mRNA转入生物体内后产生不可预料的副作用，故需在进行RNA纯化之前先用DNase I将DNA模板降解掉。DNA模板降解反应体系为：转录体系1ml，RQ1 DNase 100ul，RQ1 DNase Buffer 100ul，反应体系置于37℃水浴30min。

在消化DNA模板后，含RNA的反应体系中仍含有酶、rNTP、离子等杂质，这些杂质会影响下一步poly(A)加尾酶(polymerase)的加尾反应。在此，采用LiCl沉淀法来纯化mRNA，步骤为：首先，往1ml的RNA溶液中加入500ul的7.5M LiCl轻轻混匀后，-20℃冷藏30min；然后，4℃、13000rpm离心30min后弃上清，加1ml 75％乙醇，4℃、13000rpm离心20min；最后，弃上清，根据沉淀大小，加入适量的DEPC水溶解，把RNA浓度稀释为1ug/ul，为后面的加尾反应做准备。

(3)mRNA加尾及纯化

由于构建模板质粒时在Cas9基因后面加入了67nt的连续碱基(A)，而真核生物体内的mRNA的多聚(A)长度一般大于100nt，所以为了使转录合成的mRNA能更好地适应真核生物的翻译系统并成功表达出目的蛋白，我们利用购自NEB的E.coil Poly(A)Polymerase进行加尾反应。mRNA加尾反应体系为：mRNA水溶液；E.coil Poly(A)Polymerase(20ul)；10×E.coil Poly(A)Polymerase Buffer(50ul)；RNase抑制剂(10ul)；100mM ATP(5ul)；补充无RNase水到500ul；反应体系置于37℃水浴30min，中途翻转混匀一次。然后按照上述的LiCl沉淀法对加尾后的RNA进行纯化，纯化后的三种mRNA进行2％浓度的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图6(泳道：2，4，6)。最后进行浓度测定，并将mRNA浓度稀释成1ug/ul，分装为100ul每管，封口膜封装后-80℃保存。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 武汉核圣生物技术有限公司

<120> 单亚基RNA聚合酶KP34RP在长链mRNA合成中的生产应用

<130> 1

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaggccgg cggccacgaa aaaggccggc caggcaaaaa agaaaaaggg ttctgga 57

<210> 2

<211> 385

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatatccctg tgaggaacta ctgtcttcac gcagaaagcg cctagccatg gcgttagtat 60

gagtgtcgta cagcctccag gcccccccct cccgggagag ccatagtggt ctgcggaacc 120

ggtgagtaca ccggaattgc cgggaagact gggtcctttc ttggataaac ccactctatg 180

cccggccatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga gtagcgttgg gttgcgaaag 240

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caccatgagc acaaatccta aacctcaaag aaaaaccaaa agaaacacca accgtcgccc 360

acaagacgtt aaggcggccg cgatg 385

<210> 3

<211> 74

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aaaaaaagaa gagc 74

<210> 4

<211> 4386

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggauaucggc aagagccgcc accaugaaaa ggccggcggc cacgaaaaag gccggccagg 60

caaaaaagaa aaaggguucu ggagauaaaa aguauucuau ugguuuagac aucggcacua 120

auuccguugg augggcuguc auaaccgaug aauacaaagu accuucaaag aaauuuaagg 180

uguuggggaa cacagaccgu cauucgauua aaaagaaucu uaucggugcc cuccuauucg 240

auaguggcga aacggcagag gcgacucgcc ugaaacgaac cgcucggaga agguauacac 300

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cgaacuucga cuuagcugaa gaugccaaau ugcagcuuag uaaggacacg uacgaugacg 900

aucucgacaa ucuacuggca caaauuggag aucaguaugc ggacuuauuu uuggcugcca 960

aaaaccuuag cgaugcaauc cuccuaucug acauacugag aguuaauacu gagauuacca 1020

aggcgccguu auccgcuuca augaucaaaa gguacgauga acaucaccaa gacuugacac 1080

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agucgaaaaa cggguacgca gguuauauug acggcggagc gagucaagag gaauucuaca 1200

aguuuaucaa acccauauua gagaagaugg augggacgga agaguugcuu guaaaacuca 1260

aucgcgaaga ucuacugcga aagcagcgga cuuucgacaa cgguagcauu ccacaucaaa 1320

uccacuuagg cgaauugcau gcuauacuua gaaggcagga ggauuuuuau ccguuccuca 1380

aagacaaucg ugaaaagauu gagaaaaucc uaaccuuucg cauaccuuac uaugugggac 1440

cccuggcccg agggaacucu cgguucgcau ggaugacaag aaaguccgaa gaaacgauua 1500

cucccuggaa uuuugaggaa guugucgaua aaggugcguc agcucaaucg uucaucgaga 1560

ggaugaccgc cuuugacaag aauuuaccga acgaaaaagu auugccuaag cacaguuuac 1620

uuuacgagua uuucacagug uacaaugaac ucacgaaagu uaaguauguc acugagggca 1680

ugcguaaacc cgccuuucua agcggagaac agaagaaagc aauaguagau cuguuauuca 1740

agaccaaccg caaagugaca guuaagcaau ugaaagagga cuacuuuaag aaaauugaau 1800

gcuucgauuc ugucgagauc uccgggguag aagaucgauu uaaugcguca cuugguacgu 1860

aucaugaccu ccuaaagaua auuaaagaua aggacuuccu ggauaacgaa gagaaugaag 1920

auaucuuaga agauauagug uugacucuua cccucuuuga agaucgggaa augauugagg 1980

aaagacuaaa aacauacgcu caccuguucg acgauaaggu uaugaaacag uuaaagaggc 2040

gucgcuauac gggcugggga gccuugucgc ggaaacuuau caacgggaua agagacaagc 2100

aaagugguaa aacuauucuc gauuuucuaa agagcgacgg cuucgccaau aggaacuuua 2160

uggcccugau ccaugaugac ucuuuaaccu ucaaagagga uauacaaaag gcacagguuu 2220

ccggacaagg ggacucauug cacgaacaua uugcgaaucu ugcugguucg ccagccauca 2280

aaaagggcau acuccagaca gucaaaguag uggaugagcu aguuaagguc augggacguc 2340

acaaaccgga aaacauugua aucgagaugg cacgcgaaaa ucaaacgacu cagaaggggc 2400

aaaaaaacag ucgagagcgg augaagagaa uagaagaggg uauuaaagaa cugggcagcc 2460

agaucuuaaa ggagcauccu guggaaaaua cccaauugca gaacgagaaa cuuuaccucu 2520

auuaccuaca aaauggaagg gacauguaug uugaucagga acuggacaua aaccguuuau 2580

cugauuacga cgucgaucac auuguacccc aauccuuuuu gaaggacgau ucaaucgaca 2640

auaaagugcu uacacgcucg gauaagaacc gagggaaaag ugacaauguu ccaagcgagg 2700

aagucguaaa gaaaaugaag aacuauuggc ggcagcuccu aaaugcgaaa cugauaacgc 2760

aaagaaaguu cgauaacuua acuaaagcug agaggggugg cuugucugaa cuugacaagg 2820

ccggauuuau uaaacgucag cucguggaaa cccgcgccau cacaaagcau guugcgcaga 2880

uacuagauuc ccgaaugaau acgaaauacg acgagaacga uaagcugauu cgggaaguca 2940

aaguaaucac uuuaaaguca aaauuggugu cggacuucag aaaggauuuu caauucuaua 3000

aaguuaggga gauaaauaac uaccaccaug cgcacgacgc uuaucuuaau gccgucguag 3060

ggaccgcacu cauuaagaaa uacccgaagc uagaaaguga guuuguguau ggugauuaca 3120

aaguuuauga cguccguaag augaucgcga aaagcgaaca ggagauaggc aaggcuacag 3180

ccaaauacuu cuuuuauucu aacauuauga auuucuuuaa gacggaaauc acucuggcaa 3240

acggagagau acgcaaacga ccuuuaauug aaaccaaugg ggagacaggu gaaaucguau 3300

gggauaaggg ccgggacuuc gcgacgguga gaaaaguuuu guccaugccc caagucaaca 3360

uaguaaagaa aacugaggug cagaccggag gguuuucaaa ggaaucgauu cuuccaaaaa 3420

ggaauaguga uaagcucauc gcucguaaaa aggacuggga cccgaaaaag uacgguggcu 3480

ucgauagccc uacaguugcc uauucugucc uaguaguggc aaaaguugag aagggaaaau 3540

ccaagaaacu gaagucaguc aaagaauuau uggggauaac gauuauggag cgcucgucuu 3600

uugaaaagaa ccccaucgac uuccuugagg cgaaagguua caaggaagua aaaaaggauc 3660

ucauaauuaa acuaccaaag uauagucugu uugaguuaga aaauggccga aaacggaugu 3720

uggcuagcgc cggagagcuu caaaagggga acgaacucgc acuaccgucu aaauacguga 3780

auuuccugua uuuagcgucc cauuacgaga aguugaaagg uucaccugaa gauaacgaac 3840

agaagcaacu uuuuguugag cagcacaaac auuaucucga cgaaaucaua gagcaaauuu 3900

cggaauucag uaagagaguc auccuagcug augccaaucu ggacaaagua uuaagcgcau 3960

acaacaagca cagggauaaa cccauacgug agcaggcgga aaauauuauc cauuuguuua 4020

cucuuaccaa ccucggcgcu ccagccgcau ucaaguauuu ugacacaacg auagaucgca 4080

aacgauacac uucuaccaag gaggugcuag acgcgacacu gauucaccaa uccaucacgg 4140

gauuauauga aacucggaua gauuugucac agcuuggggg ugacggaucc cccaagaaga 4200

agaggaaagu cucgagcgac uacaaagacc augacgguga uuauaaagau caugacaucg 4260

auuacaagga ugacgaugac aaggcugcag gaugaccggu caucaucacc aucaccauug 4320

aguaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4380

aaaaaa 4386

<210> 5

<211> 4772

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggauaaucgg auaucccugu gaggaacuac ugucuucacg cagaaagcgc cuagccaugg 60

cguuaguaug agugucguac agccuccagg ccccccccuc ccgggagagc cauagugguc 120

ugcggaaccg gugaguacac cggaauugcc gggaagacug gguccuuucu uggauaaacc 180

cacucuaugc ccggccauuu gggcgugccc ccgcaagacu gcuagccgag uagcguuggg 240

uugcgaaagg ccuuguggua cugccugaua gggcgcuugc gagugccccg ggaggucucg 300

uagaccgugc accaugagca caaauccuaa accucaaaga aaaaccaaaa gaaacaccaa 360

ccgucgccca caagacguua aggcggccgc gauggcaaga gccgccacca ugaaaaggcc 420

ggcggccacg aaaaaggccg gccaggcaaa aaagaaaaag gguucuggag auaaaaagua 480

uucuauuggu uuagacaucg gcacuaauuc cguuggaugg gcugucauaa ccgaugaaua 540

caaaguaccu ucaaagaaau uuaagguguu ggggaacaca gaccgucauu cgauuaaaaa 600

gaaucuuauc ggugcccucc uauucgauag uggcgaaacg gcagaggcga cucgccugaa 660

acgaaccgcu cggagaaggu auacacgucg caagaaccga auauguuacu uacaagaaau 720

uuuuagcaau gagauggcca aaguugacga uucuuucuuu caccguuugg aagaguccuu 780

ccuugucgaa gaggacaaga aacaugaacg gcaccccauc uuuggaaaca uaguagauga 840

gguggcauau caugaaaagu acccaacgau uuaucaccuc agaaaaaagc uaguugacuc 900

aacugauaaa gcggaccuga gguuaaucua cuuggcucuu gcccauauga uaaaguuccg 960

ugggcacuuu cucauugagg gugaucuaaa uccggacaac ucggaugucg acaaacuguu 1020

cauccaguua guacaaaccu auaaucaguu guuugaagag aacccuauaa augcaagugg 1080

cguggaugcg aaggcuauuc uuagcgcccg ccucucuaaa ucccgacggc uagaaaaccu 1140

gaucgcacaa uuacccggag agaagaaaaa uggguuguuc gguaaccuua uagcgcucuc 1200

acuaggccug acaccaaauu uuaagucgaa cuucgacuua gcugaagaug ccaaauugca 1260

gcuuaguaag gacacguacg augacgaucu cgacaaucua cuggcacaaa uuggagauca 1320

guaugcggac uuauuuuugg cugccaaaaa ccuuagcgau gcaauccucc uaucugacau 1380

acugagaguu aauacugaga uuaccaaggc gccguuaucc gcuucaauga ucaaaaggua 1440

cgaugaacau caccaagacu ugacacuucu caaggcccua guccgucagc aacugccuga 1500

gaaauauaag gaaauauucu uugaucaguc gaaaaacggg uacgcagguu auauugacgg 1560

cggagcgagu caagaggaau ucuacaaguu uaucaaaccc auauuagaga agauggaugg 1620

gacggaagag uugcuuguaa aacucaaucg cgaagaucua cugcgaaagc agcggacuuu 1680

cgacaacggu agcauuccac aucaaaucca cuuaggcgaa uugcaugcua uacuuagaag 1740

gcaggaggau uuuuauccgu uccucaaaga caaucgugaa aagauugaga aaauccuaac 1800

cuuucgcaua ccuuacuaug ugggaccccu ggcccgaggg aacucucggu ucgcauggau 1860

gacaagaaag uccgaagaaa cgauuacucc cuggaauuuu gaggaaguug ucgauaaagg 1920

ugcgucagcu caaucguuca ucgagaggau gaccgccuuu gacaagaauu uaccgaacga 1980

aaaaguauug ccuaagcaca guuuacuuua cgaguauuuc acaguguaca augaacucac 2040

gaaaguuaag uaugucacug agggcaugcg uaaacccgcc uuucuaagcg gagaacagaa 2100

gaaagcaaua guagaucugu uauucaagac caaccgcaaa gugacaguua agcaauugaa 2160

agaggacuac uuuaagaaaa uugaaugcuu cgauucuguc gagaucuccg ggguagaaga 2220

ucgauuuaau gcgucacuug guacguauca ugaccuccua aagauaauua aagauaagga 2280

cuuccuggau aacgaagaga augaagauau cuuagaagau auaguguuga cucuuacccu 2340

cuuugaagau cgggaaauga uugaggaaag acuaaaaaca uacgcucacc uguucgacga 2400

uaagguuaug aaacaguuaa agaggcgucg cuauacgggc uggggagccu ugucgcggaa 2460

acuuaucaac gggauaagag acaagcaaag ugguaaaacu auucucgauu uucuaaagag 2520

cgacggcuuc gccaauagga acuuuauggc ccugauccau gaugacucuu uaaccuucaa 2580

agaggauaua caaaaggcac agguuuccgg acaaggggac ucauugcacg aacauauugc 2640

gaaucuugcu gguucgccag ccaucaaaaa gggcauacuc cagacaguca aaguagugga 2700

ugagcuaguu aaggucaugg gacgucacaa accggaaaac auuguaaucg agauggcacg 2760

cgaaaaucaa acgacucaga aggggcaaaa aaacagucga gagcggauga agagaauaga 2820

agaggguauu aaagaacugg gcagccagau cuuaaaggag cauccugugg aaaauaccca 2880

auugcagaac gagaaacuuu accucuauua ccuacaaaau ggaagggaca uguauguuga 2940

ucaggaacug gacauaaacc guuuaucuga uuacgacguc gaucacauug uaccccaauc 3000

cuuuuugaag gacgauucaa ucgacaauaa agugcuuaca cgcucggaua agaaccgagg 3060

gaaaagugac aauguuccaa gcgaggaagu cguaaagaaa augaagaacu auuggcggca 3120

gcuccuaaau gcgaaacuga uaacgcaaag aaaguucgau aacuuaacua aagcugagag 3180

ggguggcuug ucugaacuug acaaggccgg auuuauuaaa cgucagcucg uggaaacccg 3240

cgccaucaca aagcauguug cgcagauacu agauucccga augaauacga aauacgacga 3300

gaacgauaag cugauucggg aagucaaagu aaucacuuua aagucaaaau uggugucgga 3360

cuucagaaag gauuuucaau ucuauaaagu uagggagaua aauaacuacc accaugcgca 3420

cgacgcuuau cuuaaugccg ucguagggac cgcacucauu aagaaauacc cgaagcuaga 3480

aagugaguuu guguauggug auuacaaagu uuaugacguc cguaagauga ucgcgaaaag 3540

cgaacaggag auaggcaagg cuacagccaa auacuucuuu uauucuaaca uuaugaauuu 3600

cuuuaagacg gaaaucacuc uggcaaacgg agagauacgc aaacgaccuu uaauugaaac 3660

caauggggag acaggugaaa ucguauggga uaagggccgg gacuucgcga cggugagaaa 3720

aguuuugucc augccccaag ucaacauagu aaagaaaacu gaggugcaga ccggaggguu 3780

uucaaaggaa ucgauucuuc caaaaaggaa uagugauaag cucaucgcuc guaaaaagga 3840

cugggacccg aaaaaguacg guggcuucga uagcccuaca guugccuauu cuguccuagu 3900

aguggcaaaa guugagaagg gaaaauccaa gaaacugaag ucagucaaag aauuauuggg 3960

gauaacgauu auggagcgcu cgucuuuuga aaagaacccc aucgacuucc uugaggcgaa 4020

agguuacaag gaaguaaaaa aggaucucau aauuaaacua ccaaaguaua gucuguuuga 4080

guuagaaaau ggccgaaaac ggauguuggc uagcgccgga gagcuucaaa aggggaacga 4140

acucgcacua ccgucuaaau acgugaauuu ccuguauuua gcgucccauu acgagaaguu 4200

gaaagguuca ccugaagaua acgaacagaa gcaacuuuuu guugagcagc acaaacauua 4260

ucucgacgaa aucauagagc aaauuucgga auucaguaag agagucaucc uagcugaugc 4320

caaucuggac aaaguauuaa gcgcauacaa caagcacagg gauaaaccca uacgugagca 4380

ggcggaaaau auuauccauu uguuuacucu uaccaaccuc ggcgcuccag ccgcauucaa 4440

guauuuugac acaacgauag aucgcaaacg auacacuucu accaaggagg ugcuagacgc 4500

gacacugauu caccaaucca ucacgggauu auaugaaacu cggauagauu ugucacagcu 4560

ugggggugac ggauccccca agaagaagag gaaagucucg agcgacuaca aagaccauga 4620

cggugauuau aaagaucaug acaucgauua caaggaugac gaugacaagg cugcaggaug 4680

accggucauc aucaccauca ccauugagua aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 4772

<210> 6

<211> 1831

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggauaucgga uaucccugug aggaacuacu gucuucacgc agaaagcgcc uagccauggc 60

guuaguauga gugucguaca gccuccaggc cccccccucc cgggagagcc auaguggucu 120

gcggaaccgg ugaguacacc ggaauugccg ggaagacugg guccuuucuu ggauaaaccc 180

acucuaugcc cggccauuug ggcgugcccc cgcaagacug cuagccgagu agcguugggu 240

ugcgaaaggc cuugugguac ugccugauag ggcgcuugcg agugccccgg gaggucucgu 300

agaccgugca ccaugagcac aaauccuaaa ccucaaagaa aaaccaaaag aaacaccaac 360

cgucgcccac aagacguuaa ggcggccgcg auggcaagag ccgccaccau gaaaaggccg 420

gcggccacga aaaaggccgg ccaggcaaaa aagaaaaagg guucuggagc uucgcugcug 480

ggagccuacc cuuggcccga gggucucgag ugcccggccc uggacgccga gcugucggau 540

ggacaaucgc cgccggccgu cccccggccc ccgggggaca agggcuccga gagccguauc 600

cggcggccca ugaacgccuu caugguuugg gccaaggacg agaggaaacg gcuggcagug 660

cagaacccgg accugcacaa cgccgagcuc agcaagaugc ugggaaaguc guggaaggcg 720

cugacgcugu cccagaagag gccguacgug gacgaggcgg agcggcugcg ccugcagcac 780

augcaggacu accccaacua caaguaccgg ccgcgcagga agaagcaggc caagcggcug 840

ugcaagcgcg uggacccggg cuuccuucug agcucccucu cccgggacca gaacgcccug 900

ccggagaaga gaagcggcag ccggggggcg cugggggaga aggaggacag gggugaguac 960

ucccccggca cugcccugcc cagccuccgg ggcugcuacc acgaggggcc ggcugguggu 1020

ggcggcggcg gcaccccgag caguguggac acguacccgu acgggcugcc cacaccuccu 1080

gaaaugucuc cccuggacgu gcuggagccg gagcagaccu ucuucuccuc ccccugccag 1140

gaggagcaug gccauccccg ccgcaucccc caccugccag ggcacccgua cucaccggag 1200

uacgccccaa gcccucucca cuguagccac ccccugggcu cccuggcccu uggccagucc 1260

cccggcgucu ccaugauguc cccuguaccc ggcugucccc caucuccugc cuauuacucc 1320

ccggccaccu accacccacu ccacuccaac cuccaagccc accugggcca gcuuuccccg 1380

ccuccugagc acccuggcuu cgacgcccug gaucaacuga gccaggugga acuccugggg 1440

gacauggauc gcaaugaauu cgaccaguau uugaacacuc cuggccaccc agacuccgcc 1500

acaggggcca uggcccucag ugggcauguu ccggucuccc aggugacacc aacggguccc 1560

acagagacca gccucaucuc cguccuggcu gaugccacgg ccacguacua caacagcuac 1620

agugugucag gaucccccaa gaagaagagg aaagucucga gcgacuacaa agaccaugac 1680

ggugauuaua aagaucauga caucgauuac aaggaugacg augacaaggc ugcaggauga 1740

ccggucauca ucaccaucac cauugaguaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1831

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agtgctagaa tccccgttct tcttctgcta aaaatttaat gttacaggag taggaatgaa 60

gttaaaacac actagtaaaa cttccgacta cactctcagg 100

Claims (8)

1.单亚基RNA聚合酶KP34RP转录起始所需的特异性启动子，其特征在于，所述特异性启动子的核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.7。

2.权利要求1所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，包括运用单亚基RNA聚合酶KP34RP体外批量合成长链mRNA，所述长链mRNA包括cap-cas9 mRNA，IRES-cas9 mRNA和IRES-sox7 mRNA，运用所述单亚基RNA聚合酶KP34RP体外批量合成长链mRNA的方法包括以下步骤：

(1)构建质粒DNA转录模板：

a.cap-cas9转录模板质粒构建；

b.IRES-cas9转录模板质粒构建；

c.IRES-sox7转录模板质粒构建；

所述步骤(1)-a具体方法为：cas9基因5’端通过PCR和无缝克隆技术插入单亚基RNA聚合酶KP34RP转录起始所需的特异性启动子，所述特异性启动子的核苷酸序列见序列表SEQID NO.7；在所述特异性启动子后插入来源于非洲爪蟾核质蛋白的核定位信号序列NLS，所述NLS的序列见序列表SEQ ID NO.1；在cas9基因的3’端插入67个连续的碱基“A”并紧接着一个反向的BspQI限制性酶切位点，所述67个连续的碱基“A”并紧接着一个反向的BspQI限制性酶切位点的序列见序列表SEQ ID NO.3；

(2)转录模板质粒线性化及纯化；

(3)单亚基RNA聚合酶KP34RP转录合成mRNA；

(4)消除模板DNA和mRNA纯化；(5)mRNA加尾。

3.如权利要求2所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，所述步骤(1)-b的具体方法为：在步骤(1)-a构建的cap-cas9转录模板质粒的基础上，通过PCR和无缝克隆技术在单亚基RNA聚合酶KP34RP转录起始所需的特异性启动子与来源于非洲爪蟾核质蛋白的核定位信号序列NLS之间插入来自于丙肝病毒的内部核糖体进入位点序列IRES，所述IRES的序列见序列表SEQ ID NO.2。

4.如权利要求2所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，所述步骤(1)-c的具体方法为：在步骤(1)-b构建的IRES-cas9转录模板质粒的基础上，通过PCR和无缝克隆技术直接用sox7基因替换cas9基因。

5.如权利要求2所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，所述步骤(2)的具体方法为：将步骤(1)构建的转录模板质粒进行BspQ I酶切线性化得到线性化的转录模板，采用酚氯仿加乙醇沉淀法对线性化的转录模板进行纯化并测定浓度。

6.如权利要求2所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，所述步骤(3)的具体方法为：将步骤(2)纯化后的线性化转录模板通过所述的单亚基RNA聚合酶KP34RP的特异性启动子开始mRNA体外转录，cap-cas9mRNA反应体系为：5×转录buffer、四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，m7GTP，RNase抑制剂，焦磷酸酶，线性化转录模板，KP34RP，DEPC水；IRES-cas9 mRNA反应体系为：5×转录buffer、四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNase抑制剂，焦磷酸酶，线性化转录模板，KP34RP，DEPC水；IRES-sox7 mRNA反应体系为：5×转录buffer、四种核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNase抑制剂，焦磷酸酶，线性化转录模板，KP34RP，DEPC水。

7.如权利要求2所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，所述步骤(4)的具体方法为：用DNase将线性化转录模板消除，线性化转录模板消除反应体系为：转录体系1ml，RQ1 DNase 100ul，RQ1 DNase Buffer 100ul，反应体系置于37℃水浴30min；采用LiCl沉淀法纯化mRNA，加入适量的DEPC水溶解沉淀。

8.如权利要求2所述的特异性启动子在长链mRNA合成中的应用，其特征在于，所述步骤(5)的具体方法为：在mRNA转录产物的67nt连续碱基“A”的基础上利用E.coli Poly(A)Polymerase进一步加尾，加尾反应体系为：mRNA水溶液，E.coil Poly(A)Polymerase 20ul，10×E.coil Poly(A)Polymerase Buffer 50ul，RNase抑制剂10ul，100mM ATP 5ul，补充无RNase水到500ul，反应体系置于37℃水浴30min，中途翻转混匀一次，通过LiCl沉淀法对加尾后的mRNA进行纯化，将mRNA用1mM的柠檬酸钠溶液溶解，测定浓度并稀释成1ug/ul，分装后-80℃保存备用。

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