CN101864434A - 羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及其制备方法。该重组疫苗包括以下组分：口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因所编码的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白；其制备方法包括：分别将口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因所表达蛋白和口蹄疫病毒3D蛋白稀释后，混和均匀，加入佐剂，乳化，即得。动物模型和动物免疫效力实验表明，本发明羊Asia1表位重组疫苗能产生全面的免疫保护反应，注射免疫羊不仅能诱导产生高水平的中和抗体，同时也能诱导细胞免疫应答，本发明重组疫苗能有效保护动物抵抗口蹄疫病毒强毒攻击。

Description

羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物重组疫苗，尤其涉及羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及其制备方法，属于羊口蹄疫病毒重组疫苗领域。

背景技术

口蹄疫作为重大动物疫病不仅严重威胁畜牧业的健康发展，而且会引起人们对食品安全的担忧等一系列社会问题。疫苗免疫仍然是有效防控口蹄疫的主要手段之一。但目前使用的疫苗大多是采用病原体研制的灭活疫苗，生产此类疫苗不仅需要防止病原体逃逸的高级别生物安全生产车间，而且需要区分疫苗免疫和自然感染动物。此外，病毒灭活不完全有引起疫苗毒株流行的危险，曾经在欧洲发生过由病毒灭活不彻底引起田间FMD流行的事例。再者，当口蹄疫流行时，疫苗免疫牛羊等反刍动物虽然不出现临床症状，但容易形成持续感染动物，有可能成为下次流行的潜在危险源。值得引起重视的是，羊感染口蹄疫病毒并不出现典型的临床症状，不易被发现，作为传染源到处流动，极大地威胁易感动物的安全，有口蹄疫病毒“贮存库”之称。2001年英国口蹄疫大流行的疫源是典型的无症状感染口蹄疫羊的流动导致疫情大暴发，造成450万动物被扑杀，经济损失高达103亿美元，因此，对羊口蹄疫的防控不容忽视。目前，除我国上海复旦大学郑赵鑫教授研制的猪口蹄疫病毒O型重组疫苗申获了专利，并获得农业部办法的“一类新兽药证书”外，没有查阅到有关羊口蹄疫病毒Asai1型多表位重组疫苗的专利信息。因此，研制价廉、安全、高效的羊反刍动物口蹄疫新型疫苗对提升我国口蹄疫防控能力，保护畜牧业健康可持续发展，保障农民增收、促进农村经济快速稳定发展等具有重要意义。

现代免疫学、基因组学、分子生物学和生物信息学技术的快速发展，为研制分子疫苗奠定了基础。但是，以小分子靶标抗原为基础的疫苗组装体系以及最大化模拟自然感染免疫的能力依然是小分子表位疫苗研究的瓶颈。早在20世纪80年代初，研究者发现口蹄疫病毒VP1结构蛋白能够诱导机体产生免疫应答，并能抵抗同源病毒攻击。1982年，Bittle等发现化学合成的口蹄疫病毒VP1结构蛋白部分短肽(表位)，能够诱导免疫应答。此后，研究者纷纷采用化学合成肽或基因工程技术研究分子疫苗。研究最为广泛的是用口蹄疫病毒VP1结构蛋白的优势抗原表位(140-160和200-213氨基酸序列)构建基因工程亚单位疫苗和DNA疫苗及合成肽，除了美国UBI公司研制的猪口蹄疫病毒O型合成肽已经商品化外，所有其他分子疫苗虽然能诱导小动物模型(小鼠、豚鼠)及部分本动物产生保护性抗体，保护动物抵抗病毒攻击。但大规模本动物试验均以失败告终(攻毒保护率达不到国家标准)，主要是由于研制的小分子抗原不能刺激机体产生保护水平的中和抗体，有些即使能产生一定水平的保护性抗体，但持续时间短，不能满足疫病防控的需要。另外，研制的病毒颗粒样衣壳蛋白能够诱导机体产生高效价的保护性抗体，免疫动物能够抵抗同源病毒的攻击，但是该抗原的低产量和高成本限制了该疫苗的应用。近来，人们通过增加T细胞表位和外源载体蛋白以加强抗原递呈能力、增加分子量、促进B细胞成熟分化等手段来提高疫苗的免疫原性，增强免疫应答能力、提升外周血循环抗体的水平和持续时间，虽然在某种程度上明显提高了抗原的免疫原性，但是多次免疫后能产生高水平的外源载体蛋白抗体，反而影响了靶标抗原的免疫效果；另外，由于研究者采用的T细胞表位不是通用性表位，即不能被所有宿主动物的主要组织相容性复合物(MHC分子)识别，故并不能诱导所有动物产生免疫应答。近年来，以主要免疫因子如IFN-γ、IL-2等与抗原表位小分子偶联构建的表位疫苗成为表位疫苗研究的新突破点，但对本动物的免疫效果并不理想。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种口蹄疫病毒多表位基因；

本发明的目的之二是提供一种口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因；

本发明的目的之三是提供一种羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗，该疫苗含有由上述口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白融合基因所表达的重组蛋白；

本发明的目的之四是提供上述羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗的制备方法；

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种口蹄疫病毒多表位基因，其碱基序列为SEQ ID NO：1所示；所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

一种口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因，由SEQ IDNO：1所示的碱基序列和羊IgG重链区基因组成；

本发明利用分子生物学、生物信息学以及相关技术分析Asia1型口蹄疫病毒的全基因组序列(JS/05株，GenBank accession number：)，采用计算机软件预测、设计和筛选优势抗原表位基因和辅助表位基因。本发明选取口蹄疫病毒的主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位(136-160aa，198-211aa)进行适当串联即136-160aa-linker-198-211aa，为了防止相邻表位相互连接形成新的表位，本发明采用一种全新高效的接头(GGSSGG)连接相邻的表位，避免不同表位连接后形成新表位，保护天然表位的结构和功能，以保证表位的结构和功能的完整性。为了增加表位的效价，将两个表位的串联体重复一次；为了提高表位的免疫原性即效价，将表位重复串联一次，即B1-B2-B1-B2，得到复合表位基因(SEQ ID NO：1)。

本发明采用RT-PCR扩增羊IgG重链基因，阳性扩增子与复合表位基因融合后插入表达载体pPRO-EXTb构建重组表达质粒pESIG。这种融合蛋白称为“抗体化抗原分子”。其中羊IgG重链区基因通过增加小分子表位的分子量使其完全抗原化，增强靶标抗原的免疫原性，另外，通过MHC分子与IgG分子Fc端的高效结合促进靶标抗原的递呈，不仅增加了靶标抗原的免疫原性，同时延长了靶标抗原的半衰期，保证了免疫后较长时间内血清高效价抗体水平。

本发明提供了羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗，该重组疫苗包括以下组分：口蹄疫病毒多表位基因和羊IgG重链区基因的融合基因所编码的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白；

一种制备上述羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗的方法，包括：(1)制备口蹄疫病毒多表位基因和羊IgG重链区基因的融合基因蛋白；(2)制备口蹄疫病毒3D蛋白；(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后，混和均匀，加入佐剂，乳化，即得。

优选的，步骤(3)中将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后按照等体积比例混合均匀，再加入与混合物体积相同的佐剂进行乳化。

其中，口蹄疫病毒3D蛋白基因的碱基序列为SEQ ID NO：3所示，所推导的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示；

基于传统疫苗和目前分子疫苗的诸多缺点和不足，本发明采用全新的免疫学理论，采用分子设计、基因操作、蛋白质工程及相关技术构建羊口蹄疫Asia1型多表位重组疫苗。本发明疫苗在设计上既考虑B细胞的功能，又兼顾T辅助细胞对B细胞的辅助功能及T细胞的细胞免疫功能。最主要的是选用了能被绝大多数动物MHC分子识别的T细胞表位即通用型表位，克服MHC分子的异质性限制，加强MHC分子对抗原的递呈能力和水平。另外，Th1细胞表位能诱导T细胞免疫应答。本发明采用宿主动物自身蛋白分子(IgG)作为载体蛋白，不仅增大了小分子靶标抗原的分子量，使其完全抗原化，明显增强了靶标抗原的免疫原性，延长了半衰期，而且最大程度降低了副反应。载体蛋白IgG作为主要免疫成分能被MHC分子有效识别，促进抗原的递呈能力和水平。

本发明通过实验动物模型和本动物免疫效力实验验证靶标抗原的免疫原性，即诱导产生保护性中和抗体和细胞免疫能力，以及抵抗病毒攻击的能力(PD50测定)，全面评价抗原的免疫效力。实验结果表明，本发明羊Asia1表位疫苗能产生全面的免疫保护反应，即注射免疫羊不仅能诱导产生高水平的中和抗体，同时也能诱导细胞免疫应答，有效保护动物抵抗口蹄疫病毒强毒攻击。

附图说明

图1本发明羊口蹄疫病毒Asia1多表位重组疫苗免疫豚鼠后血清抗体效价消长曲线图；：C为PBS对照，EC1为表位载体蛋白，EC1T为表位载体蛋白-3D，IV为灭活疫苗。

图2本发明羊口蹄疫病毒Asia1多表位重组疫苗免疫羊只后血清抗体效价消长曲线图；C为PBS对照，EC1为表位载体蛋白，EC1T为表位载体蛋白-3D。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗的制备

(1)口蹄疫多表位基因设计和合成：选用Asia1型口蹄疫病毒JS/05毒株全基因组序列(GenBank accession number：EF149009.1)进行多表位的设计，即选取主要结构蛋白基因VP1上的两个免疫原性B细胞表位(136-160aa，198-211aa)进行适当串联即136-160aa-linker-198-211aa，为了防止相邻表位相互连接形成新的表位，在相邻表位之间加入接头GGSSGG最大化减小相邻表位之间的影响，以保证表位的结构和功能的完整性。为了增加表位的效价，将两个表位的串联体重复一次，即：136-160aa-linker-198-211aa-linker-136-160aa-linker-198-211aa。为了将该多表位融合基因插入重组表达载体，在该融合基因的两端引入酶切位点，即5’端-BamH1，3’端-EcoR1，插入pUC-18载体即为重组质粒pUC-E。

复合多表位基因序列为：

TACGGAGAAGAATCCTCGCGGCGTGGTGATCTCGCCGCCCTTGCACGCAGAGTGAACAACCGGCTGCCCACTTCCGGTGGCTCTAGCGGCGGTCGCCGTAAACAGGAGATCATTGCACCTGAGAAACAGACTTGGGGTGGTTCTAGCGGCGGTTACGGAGAAGAATCCTCGCGGCGTGGTGATCTCGCCGCCCTTGCACGCAGAGTGAACAACCGGCTGCCCACTTCCGGTGGCTCTAGCGGCGGTCGCCGTAAACAGGAGATCATTGCACCTGAGAAACAGACTTGG(SEQ ID NO：1)所推导的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示：

(2)引物设计和目的基因的扩增：

参考羊IgG序列(Genbank accession number：X69797)设计特异性引物。即上游，5-GGGGAATTC(EcoR1)GCCTCAACAACACCCCCGAAA-3；下游，5-GGGCTCGAG(Xho1)TTTACCCGGAGGCTTA GAGATCGAC-3。

总RNA的提取及PCR扩增：用RNA提取试剂盒(Qigen)分别从羊新鲜脾脏中提取总RNA。用one step RNA PCR试剂盒(Takara，Japan)扩增目的基因：总反应体积为50μl，包含1μl10×one step RNAPCR buffer，10μl MgCl2，5μl dNTPs，1μl RNase inhibitor，1μl AMVRTase XL，1μl AMV Optimized Taq，1μl上游引物，1μl下游引物，5μlRNA，加无离子水20μl。按以下条件扩增，50℃反转录30min；94℃热变性5min；94℃，1min；60℃，1min；72℃，1min；30个循环。用DNA纯化回收试剂盒回收扩增产物，并插入pMD-18T载体(Takara，Dalian，China)进行测序鉴定。

(3)多表位-载体蛋白融合基因重组表达质粒的构建

上述(1)和(2)所目的基因分别用BamH1/EcoR1，EcoR1/Xho1酶切，纯化回收后，插入事先用BamH1/Xho1线性化的表达质粒pP_R0HTb(购自Invitrogen)，构建重组表达体pESIG.；

(3)富集T细胞表位的口蹄疫病毒基因的扩增及表达载体构建

参考(1)述Asia1型口蹄疫病毒JS/05株的基因组序列合成引物：上游5-GCTCCATGG(Nco1)AT GGATTGATAGTTGACACCAGAGAT-3；下游5-GCTAAGCTT(HindIII)TGCGT CACCGCACACGGCGTTC-3。参照(2)所述反应条件扩增口蹄疫病毒3D基因，扩增产物插入pMD-18T构建重组质粒pMD-3D，经生物公司(Takara，Dalian，China)测序验证目的基因的正确性。用Nco1/HindIII将目的基因3D从测序正确的阳性重组体切割下来插入表达载体pET30a(购自Novagen)，构建重组表达质粒pET30-3D。

(4)多表位融合抗原和3D蛋白的表达和纯化：

重组多表位抗原和3D抗原的表达按照《分子克隆实验指南》第三版第15章进行，科学出版社，2002年8月。融合蛋白的纯化参照试剂公司手册进行(Novagen，TB273Rev.A 0603)。

(5)疫苗制备

用PBS变性液将纯化的重组多表位抗原稀释成浓度为0.8mg/ml，3D蛋白稀释为0.4mg/ml。两种蛋白溶液等体积(0.5ml∶0.5ml)混匀后，加入等体积(1ml)206佐剂，用乳化机进行乳化(先低速搅拌，慢慢调高转速，总时间不超过2min)制备成疫苗(油包水)。以上操作均在无菌条件下进行。

(6)疫苗的无菌检测

取适当量的疫苗接种琼脂斜面、肉汤和肝汤培养基，37℃培养7天，以琼脂斜面未见菌落，液体清亮为合格，否则为不合格产品。另外，用BABL/c小鼠检测疫苗在动物体内的安全性，即选用5只BABL/c小鼠，每只注射0.5ml疫苗，观察72小时内是否出现不良反应，以未出现临床症状为合格。

试验例1本发明重组疫苗的免疫效力试验

为了验证本发明重组疫苗的免疫原性，在动物模型豚鼠及本动物牛羊身上进行了疫苗的免疫效力实验。

(1)选取健康豚鼠(250-300g)20只，分成4组，每组5只豚鼠。分别为表位载体蛋白组(SEQ ID NO：1+羊IgG重链区)，表位载体蛋白-3D组(口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因所编码的蛋白以及口蹄疫病毒3D蛋白)，灭活疫苗组(实施例1所制备的灭活疫苗)，PBS对照组。每只豚鼠经腹股沟注射抗原制剂1ml(300μg)，一免28天后同剂量加强免疫。分别予免疫前1天，免疫后7，14，28及加强免疫后14天采血，用全病毒作为包被抗原，采用间接ELISA测定循环抗体效价，结果如表1所示，首免后血清抗体随时间延长而上升，到28天达最高，加强免疫后，表位载体蛋白组上升幅度不明显，但表位载体蛋白-3D组血清抗体明显升高，说明重组抗原能诱导产生较高水平的中和抗体，但抗体水平低于全病毒灭活抗原的水平。令人鼓舞的是，加强免疫豚鼠能够抵抗1000个50％豚鼠感染剂量的攻击，100％保护。图2能明显反应各注苗组血清抗体效价消长情况随免疫次数及时间的动态变化趋势。

表1重组蛋白免疫豚鼠血清抗体效价测定结果

(2)重组抗原在羊体的免疫效力试验：选用口蹄疫病毒特异性抗体和非结构蛋白抗体均为阴性羊6只(4月龄)，分成3组，每组两只，分别注射PBS(C)，表位载体蛋白(EC1)，表位载体蛋白-3D(EC1T)。免疫羊只在一免后30天进行加强免疫。定期采血(免疫前、一免疫后30天及加强后14天)，用液相阻断ELISA测定血清抗体效价。如表2所示，多表位重组抗原能够诱导高水平保护性中和抗体，尤其是加强免疫后血清抗体水平高达1∶180，且随时间延长及免疫次数增加血清抗体效价呈现出正相关(图2)，具有良好的应用前景。

表2多表位重组抗原免疫羊血清抗体效价

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>羊口蹄疫病毒Asia1型多表位重组疫苗及制备方法

<130>KLPI0876

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>288

<212>DNA

<213>artifical sequence

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(288)

<223>

<400>1

tac gga gaa gaa tcc tcg cgg cgt ggt gat ctc gcc gcc ctt gca cgc    48

Tyr Gly Glu Glu Ser Ser Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ala Leu Ala Arg

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                85                  90                  95

<210>2

<211>96

<212>PRT

<213>artifical sequence

<400>2

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1               5                   10                  15

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                85                  90                  95

<210>3

<211>1410

<212>DNA

<213>Foot-and-mouth disease virus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1410)

<223>

<400>3

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1               5                   10                  15

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            100                 105                 110

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        115                 120                 125

ggt gcg ctc att gac ttc gag aac ggc act gtc gga ccc gag gtt aaa    432

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145                 150                 155                 160

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Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly

                165                 170                 175

agg act cgc att gtc gac gcc ttg cct gtt gaa cac att ctt tac acc    576

Arg Thr Arg Ile Val Asp Ala Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr

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Arg Met Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly

        195                 200                 205

ccg caa att ggc tcg gcg gtt ggt tgc aat cct gat gtt gat tgg caa    672

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    210                 215                 220

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Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp

225                 230                 235                 240

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Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met

                245                 250                 255

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Phe Glu Glu Val Phe Asn Thr Asp Phe Gly Phe His Pro Asn Ala Glu

            260                 265                 270

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        275                 280                 285

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    290                 295                 300

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305                 310                 315                 320

aga cac tat gag gga gtt gag ctg gac act tac acc atg atc tct tac   1008

Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr

                325                 330                 335

gga gac gac atc gtg gtt gca agt gat cac gat ctg gac ttt gag gcc   1056

Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp His Asp Leu Asp Phe Glu Ala

            340                 345                 350

ctc aag cct cac ttc aaa tcc ctt ggt caa acc atc act cca gcc gac   1104

Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp

        355                 360                 365

aaa agc gac aaa ggt ttt gtt ctt ggt cac tcc atc acc gat gtc act   1152

Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr

    370                 375                 380

ttc ctc aaa aga cac ttt cac atg gat tat gga act ggg ttt tac aaa   1200

Phe Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys

385                 390                 395                 400

cct gtg atg gct tcg aag acc ctc gag gct atc ctc tcc ttt gca cgc   1248

Pro Val Met Ala Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg

                405                 410                 415

cgt ggg acc ata cag gag aag ttg atc tcc gtg gca gga ctc gcc gtc    1296

Arg Gly Thr Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val

            420                 425                 430

cac tct gga cct gac gag tac cgg cgt ctc ttt gag cct ttc cag ggc    1344

His Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly

        435                 440                 445

ctc ttt gag att cca agc tac aga tca ctt tac ctg cgt tgg gtg aac    1392

Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn

    450                 455                 460

gcc gtg tgc ggt gac gca                                            1410

Ala Val Cys Gly Asp Ala

465                 470

<210>4

<211>470

<212>PRT

<213>Foot-and-mouth disease virus

<400>4

Gly Leu Ile Val Asp Thr Arg Asp Val Glu Glu Arg Val His Val Met

1               5                   10                  15

Arg Lys Thr Lys Leu Ala Pro Thr Val Ala His Gly Val Phe Asn Pro

            20                  25                  30

Glu Phe Gly Pro Ala Ala Leu Ser Asn Lys Asp Pro Arg Leu Asp Glu

        35                  40                  45

Gly Val Val Leu Asp Glu Ala Ile Phe Ser Lys His Lys Gly Asp Thr

    50                  55                  60

Lys Met Ser Glu Glu Asp Lys Ala Leu Ser Arg Arg Cys Ala Ala Asp

65                  70                  75                  80

Tyr Ala Ser Arg Leu His Ser Val Leu Gly Thr Ala Asn Ala Pro Leu

                85                  90                  95

Ser Ile Tyr Glu Ala Ile Lys Gly Val Asp Gly Leu Asp Ala Met Glu

            100                 105                 110

Pro Asp Thr Ala Pro Gly Leu Pro Trp Ala Leu Gln Gly Lys Arg Arg

        115                 120                 125

Gly Ala Leu Ile Asp Phe Glu Asn Gly Thr Val Gly Pro Glu Val Lys

    130                 135                 140

Ala Ala Leu Glu Leu Met Glu Lys Arg Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Gln

145                 150                 155                 160

Thr Phe Leu Lys Asp Glu Ile Arg Pro Met Glu Lys Val Arg Ala Gly

                165                 170                 175

Arg Thr Arg Ile Val Asp Ala Leu Pro Val Glu His Ile Leu Tyr Thr

            180                 185                 190

Arg Met Met Ile Gly Arg Phe Cys Ala Gln Met His Ser Asn Asn Gly

        195                 200                 205

Pro Gln Ile Gly Ser Ala Val Gly Cys Asn Pro Asp Val Asp Trp Gln

    2l0                 215                 220

Arg Phe Gly Thr His Phe Ala Gln Tyr Arg Asn Val Trp Asp Val Asp

225                 230                 235                 240

Tyr Ser Ala Phe Asp Ala Asn His Cys Ser Asp Ala Met Asn Ile Met

                245                 250                 255

Phe Glu Glu Val Phe Asn Thr Asp Phe Gly Phe His Pro Asn Ala Glu

            260                 265                 270

Trp Ile Leu Lys Thr Leu Val Asn Thr Glu His Ala Tyr Glu Asn Lys

        275                 280                 285

Arg Ile Thr Val Glu Gly Gly Met Pro Ser Gly Cys Ser Ala Thr Ser

    290                 295                 300

Ile Ile Asn Thr Ile Leu Asn Asn Ile Tyr Val Leu Tyr Ala Leu Arg

305                 310                 315                 320

Arg His Tyr Glu Gly Val Glu Leu Asp Thr Tyr Thr Met Ile Ser Tyr

                325                 330                 335

Gly Asp Asp Ile Val Val Ala Ser Asp His Asp Leu Asp Phe Glu Ala

            340                 345                 350

Leu Lys Pro His Phe Lys Ser Leu Gly Gln Thr Ile Thr Pro Ala Asp

        355                 360                 365

Lys Ser Asp Lys Gly Phe Val Leu Gly His Ser Ile Thr Asp Val Thr

    370                 375                 380

Phe Leu Lys Arg His Phe His Met Asp Tyr Gly Thr Gly Phe Tyr Lys

385                 390                 395                 400

Pro Val Met Ala Ser Lys Thr Leu Glu Ala Ile Leu Ser Phe Ala Arg

                405                 410                 415

Arg Gly Thr Ile Gln Glu Lys Leu Ile Ser Val Ala Gly Leu Ala Val

            420                 425                 430

His Ser Gly Pro Asp Glu Tyr Arg Arg Leu Phe Glu Pro Phe Gln Gly

        435                 440                 445

Leu Phe Glu Ile Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Tyr Leu Arg Trp Val Asn

    450                 455                 460

Ala Val Cys Gly Asp Ala

465                 470

Claims (9)

1.一种口蹄疫病毒多表位基因，其特征在于：其碱基序列为SEQID NO：1所示。

2.由权利要求1所述口蹄疫病毒多表位基因所编码的蛋白质，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

3.一种口蹄疫病毒多表位基因和载体蛋白的融合基因，其特征在于：由权利要求1所述的口蹄疫病毒多表位基因和羊IgG重链区基因连接组成。

4.羊口蹄疫病毒Asial型多表位重组疫苗，其特征在于，包括以下组分：权利要求3所述融合基因编码的蛋白和口蹄疫病毒3D蛋白。

5.一种制备权利要求4所述重组疫苗的方法，包括：(1)将权利要求3所述的融合基因表达得到重组蛋白；(2)制备口蹄疫病毒3D蛋白；(3)分别将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后，混和均匀，加入佐剂，乳化，即得。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(3)中将步骤(1)和步骤(2)所制备的蛋白稀释后按照等体积比例混合均匀，再加入与混合物体积相同的佐剂进行乳化。

7.权利要求1所述的口蹄疫病毒多表位基因在制备预防或治疗口蹄疫药物中的用途。

8.权利要求3所述的融合基因在制备预防或治疗口蹄疫药物中的用途。

9.按照权利要求7或8所述的用途，其特征在于：所述的口蹄疫是羊口蹄疫。

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