CN105176945A - 一种新型脂肪酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新型脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO：1。本发明提供的新型脂肪酶AFLip在pH3.0-4.0，pH6.0-7.0范围内能保持50％以上的酶活，具有宽泛的pH适用范围，且在中性和酸性条件下具有很强的耐受性；最适作用温度为40-50℃，且能在30-50℃范围内保持85％以上的酶活。本发明提供的脂肪酶AFLip对胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，能有效适应动物的胃、肠道环境，并能保持较高的酶活水平，因此更有利于其在饲料添加剂领域的应用。本发明所述脂肪酶AFLip能有效提高饲料中油脂类物质的利用率，从而显著提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高养殖动物的生产性能，增加经济效益，应用前景广泛。

Description

一种新型脂肪酶

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种新型脂肪酶及其应用。

背景技术

脂肪酶是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。

脂肪酶在生物体内具有相当重要的生理功能，外源脂肪需要经过脂肪酶消化分解后才能透过细胞膜，体内脂肪的储藏和动用也少不了脂肪酶，脂肪酶也参与细胞内脂类代谢。脂肪酶分解三酰甘油产生的单酰甘油、脂肪酸和甘油，除了作为生物体的能源外，还是合成磷脂、鞘脂等具有重要生理功能的类脂的前体。

作为主要的饲用酶制剂，脂肪酶已被普遍应用于畜禽养殖中。人们通过在饲料中添加脂肪酶，可以有效补充养殖动物内源消化酶的不足，降低营养性腹泻的发生率，提高饲料中脂肪的消化率和利用率，促进养殖动物对脂肪溶性维生素和其他微量元素的吸收利用，进而能大幅度提高饲料报酬，降低饲料成本，增加养殖户的经济效益。因此，对高酶活、性能优良的脂肪酶的筛选和研究仍是目前饲用酶制剂领域的研究热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型脂肪酶及其在饲料中的应用。本发明利用分子生物学手段从烟曲霉(Aspergillusfumigatus)中克隆得到一种新型脂肪酶，其在中性和酸性环境中能保持较高的酶活力，且对胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，这些特性使得该酶更适合应用于动物饲料中。

本发明一方面提供了一种新型脂肪酶，其氨基酸序列为SEQIDNO：1。

所述脂肪酶的编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO：2。

本发明还提供携带有上述脂肪酶基因的质粒。

本发明还包括携带有上述质粒的里氏木霉(Trichodermareesei)。

本发明提供的新型脂肪酶AFLip在pH3.0-4.0，pH6.0-7.0范围内能保持50％以上的酶活，具有宽泛的pH适用范围，且在中性和酸性条件下具有很强的耐受性；最适作用温度为40-50℃，且能在30-50℃范围内保持85％以上的酶活。本发明提供的脂肪酶AFLip对胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，能有效适应动物的胃、肠道环境，并能保持较高的酶活水平，因此更有利于其在饲料添加剂领域的应用。本发明所述脂肪酶AFLip能有效提高饲料中油脂类物质的利用率，从而显著提高肉鸡的采食量和日增重，降低料肉比，提高养殖动物的生产性能，增加经济效益，应用前景广泛。

附图说明

图1为脂肪酶AFLip作用pH-相对酶活曲线；

图2为脂肪酶AFLip作用温度-相对酶活曲线。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如

MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(AusubeL,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,3ndEd.(SingLetonetaL.,2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(HaLeetaL.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

除非另作说明，核酸是按5′至3′方向从左至右书写；氨基酸是按氨基至羧基的方向从左至右书写。

如本文所用，术语“脂肪酶”即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。其基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性决定于它的蛋白质结构。

如本文所用，术语“重组”当被用于指代细胞、核酸、蛋白或载体时，表示该细胞、核酸、蛋白或载体已通过导入异源核酸或蛋白或者通过改变天然核酸或蛋白而被修饰。因此，例如，重组细胞是表达在天然(非重组)形式的该细胞中不曾发现的基因，或者表达天然基因。

术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可以互换使用。本文使用氨基酸残基的传统的单字母或三字母代码。

如本文所用，术语“基因”指参与生产多肽的DNA片段，包括编码区之前和之后的区域，以及各编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

术语“核酸”包括DNA、RNA，单链或双链的，以及它们的化学修饰物。

术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可以互换使用。

术语“载体”指被设计用来将核酸导入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌粒、序列盒以及类似物。

术语“表达载体”表示包含DNA序列的DNA构建物，所述DNA序列被可操纵的连接于能够影响该DNA在合适宿主中表达的合适的控制序列。此类控制序列可以包括完成转录的启动子、可选的控制转录的操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译的终止的序列。

术语“启动子”表示参与结合RNA聚合酶以启动基因转录的的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

与另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，在比较这两个序列时所述百分比的碱基或氨基酸残基是相同的。

由于遗传密码是简并的，所以可以使用一种以上的密码子来编码特定的氨基酸，本发明包括编码特定的氨基酸序列的多核苷酸。

术语“宿主菌株”或“宿主细胞”是指表达载体或DNA构建物的合适宿主，所述表达载体或DNA构建物包含本发明的编码脂肪酶的多核苷酸。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1脂肪酶基因的克隆

1)提取烟曲霉总基因组DNA

将烟曲霉(Aspergillusfumigatus)接种至摇瓶培养基过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μL抽提缓冲液(100mMTris-HCL，100mMEDTA，250mMNaCL，1％SDS)；然后加入100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪中剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μL10MNH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；然后加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤2次；晾干，加入适量水溶解，于-20℃保存。

(2)基因克隆

以提取的基因组总DNA为模板，进行PCR扩增。所用引物序列为：

AFLip-F：AAATCTAGAATGTTCTCTGGACGGTTTGGAGTG；

AFLip-R：AAATCTAGATTATAGCAGGCACTTCGGAAATCG；

PCR扩增条件为：95℃4min；94℃30s，59℃40s，72℃1min30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

3)基因测序分析

将回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-ATL质粒，进行测序分析。测序结果显示，扩增产物的基因序列为SEQIDNO：2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：1。经过NCBIBLast序列比对发现，基因序列SEQIDNO：2与已公开的黑曲霉(Aspergillusniger)的脂肪酶序列相似性最高，为86％。但是，并未找到与氨基酸序列SEQIDNO：1同源性较高的序列。从而说明，本发明提供的氨基酸序列SEQIDNO：1编码一种新型的脂肪酶。

实施例2表达载体的构建

将实施例1克隆得到的基因序列SEQIDNO：2进行KpnI和XbaI过夜双酶切，然后凝胶回收目的基因片段；同样，对木霉表达载体pTG(含潮霉素hph基因)进行KpnI和XbaI双酶切和回收；将回收的基因片段和载体16℃过夜连接，并转化大肠杆菌DH5a，最后获得木霉重组表达质粒，命名为pTG-AFLip。

实施例3转化与筛选

吸取里氏木霉(Trichodermareesei)宿主菌孢子悬浮液于PDA平板中心(9cm培养皿)，待菌落长满整个培养皿，各切1cm×1cm大小的培养基，置于120mLYEG+U液体培养基中，30℃，200rpm，培养14～16h。

用无菌MiracLoth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过的菌丝体转移到40mL原生质体化溶液，30℃，90rpm，培养1-2h，用显微镜观察检测原生质体转化进展。

用无菌MiracLoth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生质体溶液分装于两个50mL无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，3000rpm，离心10min，弃去上清液，获得沉淀；用5mL溶液B再清洗沉淀两次；将沉淀重悬浮于10mL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目在1×10⁸个/mL左右。

在冰上，将200μL上述原生质体溶液加入预冷的无菌7mL离心管中，每个转化反应用1管，加入10μg重组质粒pTG-AFLip，加入50μL溶液C，温和混匀后再冰上放置20min。

将转化上层培养基熔化并保持在55℃；从冰中移出上述7mL离心管，并向管中加入2mL溶液C和4mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质体混合物；向3个顶层琼脂试管中的每一个中加入1mL上述原生质体混合物，并立即倾倒与转化下层平板上，并将平板在30℃下培养5-7d至有转化子长出。

挑取其中一个转化子过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000rpm离心5min，弃上清；加入400μL抽提缓冲液(100mMTris-HC，100mMEDTA，250mMNaCL，1％SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μL10MNH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

提取上述转化子的基因组DNA，并以此为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，对目的基因进行验证。

上游引物序列为：GGGGTACCATGGCTCTCTCCAAGCT；

下游引物序列为：GCTCTAGATTACAAGCACTGCGAATAC；

PCR扩增条件为95℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃3min，30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，并进行测序分析，结果显示PCR扩增产物的基因序列为SEQIDNO：2，从而说明本发明构建得到了含AFLip基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉AFLip(TrichodermareeseiAFLip)。

溶液A：2.5mL1MK2HPO4，2.5mL1MKH2PO4，48.156gMgSO4，加入dLH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

溶液B：5mL1MTris(pH7.5)，2.77gCaCL2，109.32g山梨醇，加入dLH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

溶液C：250gPEG4000，2.77gCaCL2，5mL1MTris(pH7.5)，加入dLH2O至终体积500mL，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

原生质体化溶液：将0.4mg裂解酶(LysingEnzymefromTrichoderma

harzianum，Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

转化下层平板：0.1％MgSO4,1％KH2PO4,0.6％(NH4)2SO4,1％葡萄糖,0.35％琼脂粉。

转化上层培养基：0.1％MgSO4,1％KH2PO4,0.6％(NH4)2SO4,1％葡萄糖,18.3％山梨醇,0.35％琼脂糖。

微量元素：在250mLdLH2O中加入1gFeSO4·7H2O，8.8gZnSO4·7H2O，0.4g

CuSO4·5H2O，0.15gMnSO4·4H2O，0.1gNa2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCL，完全溶解后用dLH2O定容至1L，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌。

PDA平板：20g葡萄糖，200g土豆蒸煮液，15g琼脂，加入dLH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

YEG+U液体培养基：20g葡萄糖，5g酵母提取物，1g尿苷，加入dLH2O至终体积1000mL，高压蒸气灭菌。

实施例4发酵验证和酶学性质分析

4.1发酵验证

将上述里氏木霉工程菌AFLip接种于MM发酵培养基(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH4)2SO4，0.09％MgSO4，2％KH2PO4，0.04％CaCL2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素，0.018％聚丙二醇-2000)，28℃培养48小时，然后25℃培养48小时，取发酵液离心处理，将上清液分别进行酶活测定和酶学性质分析。

脂肪酶活力定义

1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH条件下，1min水解底物产生1μmoL的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以u/g(u/mL)表示。

酶活测定方法：

取两个100mL三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加入底物溶液4.00mL和磷酸缓冲液5.00mL，再于A瓶中假如95％乙醇15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中预热5min，然后于A、B瓶中各加待测酶液1.00mL，立即混匀计时，准确反应15min后，于B瓶中立即补加95％乙醇15.00mL终止反应，取出；于空白和样品溶液中各加酚酞指示液两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保存30s，不褪色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。

脂肪酶的酶活力按下列公式计算：

$X_1=\frac{\left(V_1-V_2\right)\×C\×50\×n}{0.05}\×1/15$

式中：

X1——样品的酶活力，u/mL；

V1——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；

V2——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL；

c——氢氧化钠标准溶液的浓度，moL/L；

50——0.05moL/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmoL；

n——酶液稀释倍数；

0.05—氢氧化钠标准溶液浓度换算系数；

1/15——反应时间15min，以1min计；

所得实验结果表示至整数。

按照上述方法测得里氏木霉AFLip摇瓶发酵液中脂肪酶酶活为700U/mL。从而说明，本发明构建的重组菌株里氏木霉AFLip能高效表达脂肪酶AFLip。

4.2酶学性质分析

(1)最适pH分析：

分别用pH值为2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释里氏木霉AFLip发酵上清液，在40℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做作用pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，本发明提供的脂肪酶AFLip的最适作用pH为7.0，且在pH3.0-4.0，pH6.0-7.0范围内能保持50％以上的酶活。

(2)最适温度分析：

分别在20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，pH7.5条件下测定里氏木霉AFLip发酵上清液的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做作用温度-相对酶活曲线。结果如图2所示，本发明提供的脂肪酶AFLip的最适作用温度为40-50℃，且能在30-50℃范围内保持85％以上的酶活。

(3)pH耐受性分析：

分别用pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的缓冲液稀释里氏木霉AFLip发酵上清液；40℃保温30min后，分别测定其酶活力，以未处理的上清液酶活力为100％，计算酶活残留率，具体结果见表1。

表1在不同pH条件下处理30min后脂肪酶AFLip的酶活残留情况

pH	酶活残留率
		2.0	82％
3.0	89％
		4.0	90.5％
5.0	94.6％
		6.0	100％
7.0	100％
		8.0	21.2％

从表1的结果可以看出：本发明提供的脂肪酶AFLip在pH2.0-7.0的范围内的酶活残留率均高于80％，从而说明脂肪酶AFLip具有宽泛的pH适用范围，且在中性和酸性条件下具有很强的耐受性。

实施例5体外酶解的实验

(1)胃液和胃蛋白酶耐受性

先将里氏木霉AFLip发酵上清液以pH2.0的人工胃酸稀释至适当倍数；然后分别以pH2.0的人工胃酸和胃蛋白酶在40℃条件下处理2h后，在40℃，pH7.5条件下测定其残留酶活，以未处理的上清液酶活为100％，计算酶活残留率。具体结果见表2。

(2)pH6.8、胰蛋白酶耐受性

先将里氏木霉AFLip发酵上清液以pH6.8的缓冲液稀释至适当倍数；然后分别以pH6.8的缓冲液和胰蛋白酶在40℃条件下处理6h后，在40℃，pH7.5条件下测定其残余酶活，以未处理的上清液酶活为100％，计算酶活残留率，具体结果见表2。

表2在体外模拟动物胃、肠环境下脂肪酶AFLip的酶活残留情况

从表2的数据可以看出，本发明提供的脂肪酶AFLip对胃液/胃蛋白酶和胰蛋白酶均具有较好的耐受性，从而说明脂肪酶AFLip能有效适应动物的胃、肠道环境，并能保持较高的酶活水平，为其在饲料中的应用奠定基础。

实施例6脂肪酶AFLip对肉鸡生产性能的影响

1.材料与方法

1.1试验动物与分组

六和种鸡场提供的罗斯肉雏鸡300只，随机分为3个处理，每个处理10个重复，每个重复10只肉鸡。具体分组设计见表3。

表3试验分组设计

组别	处理说明	样品添加
			正对照组	正常商品料	0
负对照组	-75Kcal/kg(鸡鸭油)	0
			试验组	-75Kcal/kg(鸡鸭油)	250g/t脂肪酶AFLip

1.2试验样品

本试验选用本发明实施实例4制备得到的脂肪酶AFLip。

1.3测定指标

分别在肉鸡0d、7d、21d、35日龄时，对各栏试验鸡统一进行称重并记录采食量，计算日增重(ADG)、日采食量、料肉比(FCR)和体重(BW)等指标。

1.4数据处理与分析

试验数据采用SPSS13.0统计软件中ANOVA方法进行分析，所有指标以每个重复为试验单位，用Duncan’s多重比较进行检验。结果用均值及平均标准差表示，P<0.05为差异显著。

2.结果与分析

本发明提供的脂肪酶AFLip对0-35日龄肉鸡生产性能影响

表4脂肪酶AFLip对0-35日龄肉鸡生产性能的影响

组别	初重(g)	末重(g)	日增重(g)	日采食量(g)	料肉比
						正对照组	43.1±0.64	2188.6±143.9	61.3±2.5	104.1±8.1	1.69±0.05
负对照组	43.0±0.38	2132.1±108.4	60.1±2.0	103.9±4.0	1.72±0.04
						试验组	43.3±0.59	2298.1±162.5	64.2±4.0	104.9±5.6	1.64±0.06

注：表中数字右上角字母有相同字母或没有标注者者表示差异不显著(P＞0.05)，字母不同表示差异显著(P＜0.05)

由表4肉鸡0-35d试验结果可知，全期来看试验组肉鸡日增重在正对照组基础上提高了4.73％，在负对照组基础上提高了6.82％，料肉比在负对照组基础上降低了4.65％。试验组肉鸡日增重、采食量均高于正对照组和负对照组。在此阶段负对照组即降低油脂组，在采食量、日增重和料肉比等方面均不及其它组。总体来看试验组优势较为明显。试验全期增重料肉比均较好，优于其它各组。

上述实验结果表明，本发明提供的脂肪酶AFLip能显著提高饲料中油脂类物质的利用率。在日粮中降低油脂的添加量后添加脂肪酶AFLip，肉鸡的生产性能不仅优于负对照，还明显优于正对照，因此，使用本发明提供的脂肪酶能够显著减少油脂的添加，从而降低饲料成本，增加养殖户的经济效益。

Claims (7)

1.一种脂肪酶，其特征在于，所述的脂肪酶包含有：

1)氨基酸序列为SEQIDNO：1的脂肪酶；

2)在1)中的脂肪酶氨基酸序列上发生取代、缺少或添加一个或几个氨基酸，且具有1)中的脂肪酶酶学性质的酶。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的脂肪酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQIDNO：2。

4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求2或3所述的基因。

5.一种重组工程菌，其特征在于，所述的重组工程菌为携带有权利要求4所述的重组质粒的宿主菌。

6.如权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述的宿主菌为里氏木霉(Trichodermareesei)。

7.权利要求1所述的脂肪酶在制备畜禽饲料中的应用。