CN117925540A - 一种cv2117-hav-htlv-2多基因假病毒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CV2117‑HAV‑HTLV‑2多基因假病毒及其制备方法和应用，涉及生物技术领域，本发明提供的假病毒，可应用于CV2117、HAV和HTLV‑2多种RNA病毒检测，假病毒具有与病毒相似的结构，理论上更接近于真病毒，可替代质粒标准品作为外源病毒分子检测中的阳性对照；并且，多个基因在同一个假病毒体系，扩增得到的每个基因片段的理论值接近1：1，可更好地对PCR进行质控；同时，多个基因在一个假病毒体系中作为对照可降低假病毒生产的成本，提供了一种经济有效的分子检测对照体系。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种CV2117-HAV-HTLV-2多基因假病毒及其制备方法和应用。
背景技术
甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）是一种无包膜单股正链RNA病毒，为小核糖核酸病毒科嗜肝病毒属，是导致人类急性传染病-甲型肝炎的病原体。HAV主要通过粪-口途径传播，食用污染的食物或水可以引起感染甚至疫情暴发。人类T淋巴细胞病毒（HTLV）是致瘤性RNA病毒，属慢病毒亚科，可分为HTLV-1型和HTLV-2型。近来发现该病毒在人类可引起多种疾病：HTLV-1可引起成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATL）、热带痉挛性截瘫/HTLV相关性脊髓病等；HTLV-2与T-多毛细胞/巨粒细胞白血病等疾病相关。杯状病毒CV2117属杯状病毒科疱疹病毒属，从CHO细胞中分离得到，为无包膜的单链正链RNA病毒。CV2117的自然宿主尚不清楚，从表现出严重胃肠炎症状的狗中可以分离出CV2117，在人和猫身上也检测出CV2117类病毒抗体，尽管CV2117未表现出对人类的致病性，但会损害生产生物制剂的 CHO细胞的生长。鉴于生物制品可能存在上述外源病毒因子的污染，因此准确检测尤为重要。
在核酸检测过程中使用阳性质控品，以监测包括样本处理过程在内的PCR实验过程全流程，是确保核酸检测结果有效性，防止“假阴性”检测结果出现的最有效手段。但作为分子检测技术重要组成部分的阳性标准样品却成为制约检测技术发展和应用的瓶颈。
鉴于目前CV2117、HAV和HTLV-2尚无商品化的灭活病毒对照品，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种假病毒，以至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的目的之二在于提供上述假病毒的制备方法。
本发明的目的之三在于提供上述假病毒的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明提供了一种假病毒，所述假病毒颗粒内含有CV2117、HAV和HTLV-2的核酸片段，所述核酸片段用作检测所述CV2117、HAV和HTLV-2的靶标。
进一步的，所述CV2117的核酸片段具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述HAV的核酸片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HTLV-2的核酸片段具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
进一步的，所述CV2117、HAV和HTLV-2的核酸片段为融合基因。
进一步的，所述融合基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
进一步的，所述假病毒以pWPXL质粒载体为骨架。
本发明还提供了上述的假病毒的制备方法，包括将上述的假病毒引入工程细胞，培养所述工程细胞后，收集上清，得到所述假病毒。
进一步的，通过三质粒系统将所述假病毒引入工程细胞。
进一步的，所述三质粒系统包括pMD2.G、psPAX2和pWPXL；
优选地，所述pMD2.G：psPAX2：pWPXL质量比为1:3:4。
进一步的，所述工程细胞包括HEK293T细胞。
本发明还提供了上述的假病毒或采用上述的制备方法制备得到的假病毒在制备诊断CV2117、HAV和HTLV-2的阳性对照品中应用。
此外，本发明还提供了一种诊断试剂盒，包括上述的假病毒或采用上述的制备方法制备得到的假病毒。
进一步地，所述试剂盒还包括用于检测CV2117、HAV和HTLV-2的引物组；
优选地，所述引物组包括第一引物组合和第二引物组合；
优选地，所述第一引物组合包括：
CV2117 For1的序列如SEQ ID NO.5所示；
CV2117 Rev1的序列如SEQ ID NO.6所示；
CV2117 Probe1的序列如SEQ ID NO.7所示；
HAV For1的序列如SEQ ID NO.11所示；
HAV Rev1的序列如SEQ ID NO.12所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.13所示；
HTLV-2 F1的序列如SEQ ID NO.17所示；
HTLV-2 R1的序列如SEQ ID NO.18所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.19所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.20所示；
优选地，所述第二引物组合包括：
CV2117 For2的序列如SEQ ID NO.8所示；
CV2117 Rev2的序列如SEQ ID NO.9所示；
CV2117 Probe2的序列如SEQ ID NO.10所示；
HAV For2的序列如SEQ ID NO.14所示；
HAV Rev2的序列如SEQ ID NO.15所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.16所示；
HTLV-2 F1的序列如SEQ ID NO.17所示；
HTLV-2 R1的序列如SEQ ID NO.18所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.19所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.20所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的假病毒，可应用于CV2117、HAV和HTLV-2多种RNA病毒检测，假病毒具有与病毒相似的结构，理论上更接近于真病毒，可替代质粒标准品作为外源病毒分子检测中的阳性对照；并且，多个基因在同一个假病毒体系，扩增得到的每个基因片段的理论值接近1：1，可更好地对PCR进行质控；同时，多个基因在一个假病毒体系中作为对照可降低假病毒生产的成本，提供了一种经济有效的分子检测对照体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1a为本发明实施例提供的假病毒载体图谱，具体为pMD2.G图谱；
图1b为本发明实施例提供的假病毒载体图谱，具体为psPAX2图谱；
图1c为本发明实施例提供的假病毒载体图谱，具体为pWPXL图谱；
图2为本发明实施例提供的pWPXL-CV2117-HAV-HTLV-2重组质粒图谱；
图3为本发明实施例提供的假病毒感染HEK293T图片，其中（a）为细胞转染后48h明场照片，（b）为细胞转染后48h EGFP荧光照片；
图4为本发明实施例提供的流式细胞术检测假病毒感染阳性细胞数的结果图，其中（a）为阴性对照结果，（b）为细胞感染假病毒结果（右下为阳性细胞）；
图5a为本发明实施例提供的PCR检测CV2117的扩增和标准曲线结果图中第一引物组合扩增曲线；
图5b为本发明实施例提供的PCR检测CV2117的扩增和标准曲线结果图中第二引物组合扩增曲线；
图5c1为本发明实施例提供的PCR检测CV2117的扩增和标准曲线结果图中第一引物组合的标准曲线；
图5c2为本发明实施例提供的PCR检测CV2117的扩增和标准曲线结果图中第二引物组合的标准曲线；
图6a为本发明实施例提供的PCR检测HAV的扩增和标准曲线结果图中第一引物组合扩增曲线；
图6b为本发明实施例提供的PCR检测HAV的扩增和标准曲线结果图中第二引物组合扩增曲线；
图6c1为本发明实施例提供的PCR检测HAV的扩增和标准曲线结果图中第一引物组合的标准曲线；
图6c2为本发明实施例提供的PCR检测HAV的扩增和标准曲线结果图中第二引物组合的标准曲线；
图7a为本发明实施例提供的PCR检测HTLV-2的扩增和标准曲线结果图中第一引物组合扩增曲线；
图7b为本发明实施例提供的PCR检测HTLV-2的扩增和标准曲线结果图中第二引物组合扩增曲线；
图7c1为本发明实施例提供的PCR检测HTLV-2的扩增和标准曲线结果图中第一引物组合的标准曲线；
图7c2为本发明实施例提供的PCR检测HTLV-2的扩增和标准曲线结果图中第二引物组合的标准曲线。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
假病毒体系主要包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒等体系，根据其特点和应用目的不同可选择合适的假病毒体系。本发明基于慢病毒载体来源于HIV-1病毒骨架，可提供转录并包装RNA的辅助蛋白，利用表达质粒和包装质粒共转染细胞后能够包装成假病毒颗粒的特点，将来源于三种病毒的6个RNA病毒核酸构建至一个慢病毒穿梭质粒载体上，建立了一套包含三种RNA病毒核酸的慢病毒假病毒体系，并同时表达EGFP蛋白，用于评价病毒的感染滴度。本发明中包括甲型肝炎病毒（HAV）、杯状病毒（CV2117）和人类T淋巴细胞病毒（HTLV-2），主要用于检测生物制品中的外源病毒因子检查（分子法）的阳性对照。本发明中制备的假病毒是指由包膜蛋白包裹部分核酸，并且只具有一次感染能力的病毒颗粒。
根据本发明的第一个方面，提供了一种假病毒，所述假病毒颗粒内含有CV2117、HAV和HTLV-2的核酸片段，所述核酸片段用作检测所述CV2117、HAV和HTLV-2的靶标。
本发明提供的假病毒，可应用于CV2117、HAV和HTLV-2多种RNA病毒检测，假病毒具有与病毒相似的结构，理论上更接近于真病毒，可替代质粒标准品作为外源病毒分子检测中的阳性对照；并且，多个基因在同一个假病毒体系，扩增得到的每个基因片段的理论值接近1：1，可更好地对PCR进行质控；同时，多个基因在一个假病毒体系中作为对照可降低假病毒生产的成本，提供了一种经济有效的分子检测对照体系。
在一些优选的实施方式中，所述CV2117的核酸片段具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述HAV的核酸片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HTLV-2的核酸片段具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
为了便于与骨架载体连接，优选所述CV2117、HAV和HTLV-2的核酸片段为融合基因，优选所述融合基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。将多个基因融合能够取得经济、易行的效果。典型但非限制性的骨架载体包括pWPXL质粒。
根据本发明的第二个方面，提供了上述的假病毒的制备方法，包括将上述的假病毒引入工程细胞，培养所述工程细胞后，收集上清，得到所述假病毒。
利用本发明所提供的制备假病毒的方法，能够方便可靠地获得无传染性、拷贝数高、稳定性好的假病毒，能够很好地满足医院、食品卫生、质检、科研等检测机构的需要。
在一些优选的实施方式中，通过三质粒系统将所述假病毒引入工程细胞，优选三质粒系统包括pMD2.G、psPAX2和pWPXL。
pMD2.G、psPAX2和pWPXL作为辅助质粒、感染性噬菌体和目标质粒，通过之间的相互作用以及共同作用，能够实现高效的外源基因导入和表达，有效地将外源DNA转化为有用的功能基因表达载体。
在一些优选的实施方式中，所述pMD2.G：psPAX2：pWPXL质量比为1:3:4。通过对各质粒的用量进行限定，能够在保障表达效果的基础上，有效节约成本。
在一些可选的实施方式中，所述工程细胞包括HEK293T细胞。
根据本发明的第三个方面，本发明还提供了上述的假病毒或采用上述的制备方法制备得到的假病毒在制备诊断CV2117、HAV和HTLV-2的阳性对照品中应用。
此外，根据本发明的第四个方面，本发明还提供了一种诊断试剂盒，包括上述的假病毒或采用上述的制备方法制备得到的假病毒。
进一步地，所述试剂盒还包括用于检测CV2117、HAV和HTLV-2的引物组；
优选地，所述引物组包括第一引物组合和第二引物组合；
优选地，所述第一引物组合包括：
CV2117 For1的序列如SEQ ID NO.5所示；
CV2117 Rev1的序列如SEQ ID NO.6所示；
CV2117 Probe1的序列如SEQ ID NO.7所示；
HAV For1的序列如SEQ ID NO.11所示；
HAV Rev1的序列如SEQ ID NO.12所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.13所示；
HTLV-2 F1的序列如SEQ ID NO.17所示；
HTLV-2 R1的序列如SEQ ID NO.18所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.19所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.20所示；
优选地，所述第二引物组合包括：
CV2117 For2的序列如SEQ ID NO.8所示；
CV2117 Rev2的序列如SEQ ID NO.9所示；
CV2117 Probe2的序列如SEQ ID NO.10所示；
HAV For2的序列如SEQ ID NO.14所示；
HAV Rev2的序列如SEQ ID NO.15所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.16所示；
HTLV-2 F1的序列如SEQ ID NO.17所示；
HTLV-2 R1的序列如SEQ ID NO.18所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.19所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.20所示。
上述第一引物组合与第二引物组合可以分别单独使用，也可以合并使用。当合并使用上述引物组时，CV2117、HAV和HTLV-2分别设计2套引物探针，提高了扩增病毒的覆盖率，分别为100%、98%和100%。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
采用三质粒转染系统构建含有三种RNA病毒基因的假病毒体系。三质粒系统为pMD2.G、psPAX2和pWPXL，质粒图谱见图1。合成HTLV-2、HAV和CV2117假病毒基因序列（SEQID NO.4），通过人工合成的方式合成上述目的基因并插入至pWPXL质粒载体，构建pWPXL-CV2117-HAV-HTLV-2重组质粒载体（图2）。
SEQ ID NO.1，CV2117的核酸序列（385 bp）：
TTGATGCTCAAACATCGTGCTGCCTTGGGTTCCGACGATAGGGACTCAATCCAGTTTCGTTCCTGGTGGTCCGCCAGGCAAATGAGACAGGACACTGGCCTTGATCATGAAGACGTCACCGTAATTGGCAAAGGAAAGGTGAGTCACGAAGTGCACACATGCCGGAGTGAAACTAAATATTCAACGACAAAATTTGGATACAGAGGACAAAACTGATATAGGTGTTCATTTGGTCACTGGATTGAAAACTATTAAATCACAGGTTCCTGATGGTTGGCCCGACTATTACGGTCGAAACATCATTTTGGCCAACACAACAGCTAGCTTTGGCGAGGTTAGTGAAGCAATGCGTTTGGAACGTCACCTTGCAGTGTTAACTTGGCTT；
SEQ ID NO.2，HAV核酸序列（353 bp）：
TCATGAATCTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGACTCTCATCCAGTGGATGCATTGAGTGGATTGACTGTCAGGGCTGTCTCTAGGCTTAATTCCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACTATTTGGCCTTAAATGGGATTCTGTGAGAGGGGATCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTGTTTGCCTCTGAGGTACTCAGGGGCATTTAGGTTTTTC；
SEQ ID NO.3，HTLV-2核酸序列（221 bp）：
gtcgcggagactcaccttggggatccatcctctccaagcggcctcggtcgagacgccttccgtgggactgtctcccggcctcagcacctcctgaaCtgctccttccagggtaagtctcctctcaggtcgagctcggctgcctcttaggtagtcgctccccgagggtctttagagacacccgggttccgcctgcgctcggctagactctggcttaaaacctc；
SEQ ID NO.4，DNA合成序列（959 bp）：
TTGATGCTCAAACATCGTGCTGCCTTGGGTTCCGACGATAGGGACTCAATCCAGTTTCGTTCCTGGTGGTCCGCCAGGCAAATGAGACAGGACACTGGCCTTGATCATGAAGACGTCACCGTAATTGGCAAAGGAAAGGTGAGTCACGAAGTGCACACATGCCGGAGTGAAACTAAATATTCAACGACAAAATTTGGATACAGAGGACAAAACTGATATAGGTGTTCATTTGGTCACTGGATTGAAAACTATTAAATCACAGGTTCCTGATGGTTGGCCCGACTATTACGGTCGAAACATCATTTTGGCCAACACAACAGCTAGCTTTGGCGAGGTTAGTGAAGCAATGCGTTTGGAACGTCACCTTGCAGTGTTAACTTGGCTTTCATGAATCTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGACTCTCATCCAGTGGATGCATTGAGTGGATTGACTGTCAGGGCTGTCTCTAGGCTTAATTCCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACATCATTTGGCCTTAAATGGGATTCTGTGAGAGGGGATCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTGTTTGCCTCTGAGGTACTCAGGGGCATTTAGGTTTTTCGTCGCGGAGACTCACCTTGGGGATCCATCCTCTCCAAGCGGCCTCGGTCGAGACGCCTTCCGTGGGACTGTCTCCCGGCCTCAGCACCTCCTGAACTGCTCCTTCCAGGGTAAGTCTCCTCTCAGGTCGAGCTCGGCTGCCTCTTAGGTAGTCGCTCCCCGAGGGTCTTTAGAGACACCCGGGTTCCGCCTGCGCTCGGCTAGACTCTGGCTTAAAACCTC。
本实施例设计了6套引物探针，CV2117、HAV和HTLV-2分别设计2套引物探针，提高了扩增病毒的覆盖率，分别为100%、98%和100%。引物探针序列如下：
| 名称 | 序列 | 序号 |
| CV2117 For1 | GACGATAGGGACTCAATCCA | 5 |
| CV2117 Rev1 | TGCACTTCGTGACTCA | 6 |
| CV2117 Probe1 | FAM-ACGTCTTCATGATCAAGGCCAGT-BHQ1 | 7 |
| CV2117 For2 | GGTGTTCATTTGGTCACT | 8 |
| CV2117 Rev2 | CTAACCTCGCCAAAGCT | 9 |
| CV2117 Probe2 | HEX-ATCACAGGTTCCTGATGGTTGGC-BHQ1 | 10 |
| HAV For1 | AGGCTACGGGTGAAAC | 11 |
| HAV Rev1 | AATGCATCCACTGGATG | 12 |
| HAV Probe1 | FAM-TCCGCCGCTGTTACCCTA-BHQ1 | 13 |
| HAV For2 | TGTCAGGGCTGTCTCTA | 14 |
| HAV Rev2 | GTACCTCAGAGGCAAAC | 15 |
| HAV Probe2 | HEX-CTCTGTGCTTAGGGCAAA-BHQ1 | 16 |
| HTLV-2 F1 | ATCCATCCTCTCCAAGCG | 17 |
| HTLV-2 R1 | GGGGAGCGACTACCTAA | 18 |
| HTLV-2 Probe1 | FAM-TCCTCTCAGGTCGAGCTCG-BHQ1 | 19 |
| HTLV-2 Probe2 | HEX-CCTCAGCACCTCCTGAAC-BHQ1 | 20 |
步骤一：三质粒共转染至HEK293T细胞
按照pMD2.G：psPAX2：pWPXL-CV2117-HAV-HTLV-2质量比为1:3:4的比例进行转染，采用Sinofection（义翘神州，STF02）进行细胞转染，转染后4-6h更换完全培养基，分别收获转染后48h和72h的细胞病毒上清，离心去细胞碎片，0.45μm过滤后分装保存于-80℃备用。
步骤二：测定病毒感染滴度
于6孔板中接种HEK293T细胞，次日用收获的病毒上清感染细胞，病毒上清液0.2ml，全培养基1.8ml，加入终浓度8μg/ml polybrene，感染48h后收获细胞，采用流式细胞术检测病毒感染滴度，阳性细胞百分比为2.52%，根据细胞数和病毒稀释倍数计算假病毒的感染滴度约为1.06×105 TU/ml（图3图4）。
步骤三：病毒RNA提取和RT-qPCR检测
采用商品化病毒基因组提取试剂盒（天根DP315）提取病毒上清RNA，参照试剂盒说明书对病毒上清进行RNA提取；采用商品化反转录试剂盒（翌圣生物，货号11121ES60），参照试剂盒所提供的说明书对提取的RNA进行反转录；采用商品化PCR酶混合液，用于检测的探针使用浓度为0.1~1.0 μM，用于检测的上下游引物使用浓度为0.05~0.25 μM，反应总体系为25 μL。使用ABI Q5进行qPCR，设置反应条件为：37℃ 2min；95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火延伸1min（收集荧光信号），40个循环。反应完成后，自动进行基线和阈值的设定，绘制标准曲线对待测样本进行定性/定量分析，要求标准曲线的线性R2＞0.990，斜率在-3.60~-3.10之间；灵敏度Ct≤39.99且有明显扩增曲线；NTC（无模板对照）＞39.99或无明显扩增曲线，满足以上条件判定实验有效。
采用pWPXL-CV2117-HAV-HTLV-2质粒作为质粒对照品，实验结果提示，假病毒RNA经RT-qPCR可以检测到6个核酸片段，扩增效率良好，灵敏度（10 cop/反应）全部检出（图5图6图7）。结果提示所构建的多基因假病毒体系可以用于外源病毒分子（CV2117、HAV、HTLV-2）检测的阳性对照，鉴于有些病毒尚没有商品化的灭活病毒，可以考虑一类病毒（如RNA病毒或DNA病毒）根据应用目的构建到一套假病毒系统或根据序列信息减少需构建的假病毒对照数目，实现经济有效。
综上，本发明提供了获得一套假病毒系统携带多种外源病毒分子作为检测阳性对照的新思路。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种假病毒，其特征在于，所述假病毒内含有CV2117、HAV和HTLV-2的核酸片段，所述核酸片段用作检测所述CV2117、HAV和HTLV-2的靶标。
2. 根据权利要求1所述的假病毒，其特征在于，所述CV2117的核酸片段具有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列；
所述HAV的核酸片段具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述HTLV-2的核酸片段具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的假病毒，其特征在于，所述CV2117、HAV和HTLV-2的核酸片段为融合基因；
优选地，所述融合基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1~3任一项所述的假病毒，其特征在于，所述假病毒以pWPXL质粒载体为骨架。
5.权利要求1~4任一项所述的假病毒的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1~4任一项所述的假病毒引入工程细胞，培养所述工程细胞后，收集上清，得到所述假病毒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，通过三质粒系统将所述假病毒引入工程细胞；
优选地，所述三质粒系统包括pMD2.G、psPAX2和pWPXL；
优选地，所述pMD2.G：psPAX2：pWPXL质量比为1:3:4。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述工程细胞包括HEK293T细胞。
8.权利要求1~4任一项所述的假病毒或采用权利要求5~7任一项所述的制备方法制备得到的假病毒在制备诊断CV2117、HAV和HTLV-2的阳性对照品中应用。
9.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1~4任一项所述的假病毒或采用权利要求5~7任一项所述的制备方法制备得到的假病毒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测CV2117、HAV和HTLV-2的引物组；
优选地，所述引物组包括第一引物组合和第二引物组合；
优选地，所述第一引物组合包括：
CV2117 For1的序列如SEQ ID NO.5所示；
CV2117 Rev1的序列如SEQ ID NO.6所示；
CV2117 Probe1的序列如SEQ ID NO.7所示；
HAV For1的序列如SEQ ID NO.11所示；
HAV Rev1的序列如SEQ ID NO.12所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.13所示；
HTLV-2 F1的序列如SEQ ID NO.17所示；
HTLV-2 R1的序列如SEQ ID NO.18所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.19所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.20所示；
优选地，所述第二引物组合包括：
CV2117 For2的序列如SEQ ID NO.8所示；
CV2117 Rev2的序列如SEQ ID NO.9所示；
CV2117 Probe2的序列如SEQ ID NO.10所示；
HAV For2的序列如SEQ ID NO.14所示；
HAV Rev2的序列如SEQ ID NO.15所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.16所示；
HTLV-2 F1的序列如SEQ ID NO.17所示；
HTLV-2 R1的序列如SEQ ID NO.18所示；
HAV Probe1的序列如SEQ ID NO.19所示；
HAV Probe2的序列如SEQ ID NO.20所示。
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|---|---|
| CN (1) | CN117925540A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109195625A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-01-11 | 武田疫苗股份有限公司 | 活减毒甲病毒构建体及其方法和用途 |
| US20210340501A1 (en) * | 2018-08-27 | 2021-11-04 | The Regents Of The University Of California | Methods to Control Viral Infection in Mammalian Cells |
| WO2023122882A1 (zh) * | 2021-12-27 | 2023-07-06 | 上海鑫湾生物科技有限公司 | 双特异性t细胞衔接器、其重组溶瘤病毒及其用途 |
| CN116814859A (zh) * | 2023-07-31 | 2023-09-29 | 南通伊仕生物技术股份有限公司 | 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法 |
| WO2023242817A2 (en) * | 2022-06-18 | 2023-12-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2 |
-
2024
- 2024-03-22 CN CN202410332003.9A patent/CN117925540A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109195625A (zh) * | 2016-03-31 | 2019-01-11 | 武田疫苗股份有限公司 | 活减毒甲病毒构建体及其方法和用途 |
| US20210340501A1 (en) * | 2018-08-27 | 2021-11-04 | The Regents Of The University Of California | Methods to Control Viral Infection in Mammalian Cells |
| WO2023122882A1 (zh) * | 2021-12-27 | 2023-07-06 | 上海鑫湾生物科技有限公司 | 双特异性t细胞衔接器、其重组溶瘤病毒及其用途 |
| WO2023242817A2 (en) * | 2022-06-18 | 2023-12-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Recombinant rna molecules comprising untranslated regions or segments encoding spike protein from the omicron strain of severe acute respiratory coronavirus-2 |
| CN116814859A (zh) * | 2023-07-31 | 2023-09-29 | 南通伊仕生物技术股份有限公司 | 鉴别非洲猪瘟病毒基因ⅰ型和ⅱ型的引物探针组合物、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| COHEN JI等: "Hepatitis A virus (wild-type) RNA, complete genome", 《EMBL》, 31 January 1987 (1987-01-31) * |
| PLAVSIC M等: "Vesivirus 2117: Cell line infectivity range and effectiveness of amplification of a potential adventitious agent in cell culture used for biological production", 《BIOLOGICALS》, vol. 44, no. 6, 14 September 2016 (2016-09-14), pages 540 - 545, XP029808140, DOI: 10.1016/j.biologicals.2016.08.001 * |
| RAMESH, A.等: "Hepatovirus A isolate E0-198 polyprotein gene, partial cds", 《GENBANK》, 1 October 2018 (2018-10-01) * |
| ROCHA-JUNIOR MC等: "Rapid and Sensitive Qualitative Duoplex Real-Time PCR Method for Discriminatory and Confirmatory Diagnosis of HTLV-1 and HTLV-2 Infections: Brazilian Multicentric Study", 《FRONT MED (LAUSANNE)》, vol. 9, 9 June 2022 (2022-06-09), pages 10 * |
| 吴昌鸿等: "黄芪提取物抗病毒作用的研究进展", 《湖北农业科学》, vol. 60, no. 18, 25 September 2021 (2021-09-25), pages 5 - 8 * |
| 尹菊囡: "多重巢式PCR同步检测HBV、HCV和HIV-1方法的建立", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》, no. 2011, 15 June 2011 (2011-06-15), pages 060 - 17 * |
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