KR100824414B1 - 호흡기바이러스 진단을 위한 단일튜브-멀티플렉스ｒｔ－ｐｃｒ 방법 및 프라이머 - Google Patents

호흡기바이러스 진단을 위한 단일튜브-멀티플렉스ｒｔ－ｐｃｒ 방법 및 프라이머

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KR100824414B1
KR100824414B1 KR1020050108166A KR20050108166A KR100824414B1 KR 100824414 B1 KR100824414 B1 KR 100824414B1 KR 1020050108166 A KR1020050108166 A KR 1020050108166A KR 20050108166 A KR20050108166 A KR 20050108166A KR 100824414 B1 KR100824414 B1 KR 100824414B1
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Abstract

본 발명은 호흡기 감염 질환과 관련된 바이러스를 신속, 정확하게 진단하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR (single-tube multiplex RT-PCR) 방법 및 이를 이용한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프라이머에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 PIV 1, 2 및 3형; RSV A 및 B형; 및 아데노바이러스 51가지 혈청형 등의 호흡기바이러스를 동시에 진단할 수 있으므로 보다 신속하고 효율적인 호흡기바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있다.
단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR, 호흡기바이러스

Description

호흡기바이러스 진단을 위한 단일튜브-멀티플렉스 ＲＴ－ＰＣＲ 방법 및 프라이머 {MULTIPLEX PCR METHOD FOR DIAGNOSING RESPIRATORY VIRUSES AND PRIMERS THEREFOR}
도 1은 PIV, RSV 및 ADV 표준주 (Reference strain)를 이용한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 수행 결과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 PIV, RSV 및 ADV 분리주를 이용한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 수행 결과를 나타낸다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR법에 의한 다른 호흡기바이러스 및 호흡기세균과의 교차반응성을 확인한 결과를 나타낸다.
기술분야
본 발명은 호흡기바이러스를 진단하기 위한 RT-PCR 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 다양한 호흡기바이러스를 동시에 진단하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 키트 (kit) 및 이를 포함한 프라이머 (primers)에 관한 것이다.
종래기술
급성 호흡기 감염증을 유발하는 주요 바이러스로는 인플루엔자 바이러스 (INFV) A 및 B형; 파라인플루엔자 바이러스 (PIV, parainfluenza virus) 1, 2 및 3형; 호흡기세포융합바이러스 (RSV, respiratory syncytial virus) A 및 B형; 및 아데노바이러스 (ADV) 등이 알려져 있다. 또한 사스를 야기하는 사스코로나바이러스 (SARS-CoV)와 조류뿐만 아니라 인체에 대한 감염성을 갖는 조류 인플루엔자바이러스 (avian A/H5N1) 등이 있다.
이들 호흡기 질환을 야기하는 바이러스는 매우 높은 전염력을 가지고 있을 뿐만 아니라, 무증상 감염부터 중증 감염 또한 사망에 이를 수 있는 다양한 임상양상을 나타낸다. 각각의 바이러스에 의한 임상증상은 일반적인 감기증상부터 폐렴에 이르기까지 다양하며 보통 수일 내에 회복이 되나, 기침, 피로감 등은 2주 이상 지속될 수 있으며, 복통, 구토, 경련 등이 드물게 발생한다. 합병증으로서는 가장 흔한 것이 폐렴이며, 노년층이나 만성질환자 등에서 기저질환 악화와 합병증으로 인한 사망도 가능하다. 아데노바이러스에 의해 야기되는 호흡기질환에는 발열성 급성인두염 (acute pharyngitis), 급성호흡기질환 (acute respiratory disease; ARD) 및 폐렴 (pneumonia) 등이 있으며, 아데노바이러스 감염 환자 중 4 내지 18%는 폐렴의 형태로 나타나고 상기도 감염, 인후염 및 후두염 등 다양한 감염양상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 아데노바이러스의 호흡기 감염에 따른 폐 손상은 종종 매우 심각한 문제를 일으키기도 하는데, 폐렴환자의 경우 60 내지 65%, 상기도 감염 환자의 경우 10%가 폐쇄성 기관지염, 기관지 확장증 및 McLoed 증후군 등의 합병증을 포함한 다양한 폐 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 어린이에서 PIV 감염은 대부분 열을 동반한 코감기, 인후염, 그리고 기관지염의 증상을 보인다. 가장 일반적인 초기 증상은 기침과 열 증상이다. PIV는 모든 종류의 상, 하기도 질환과 연관되어 있으며 영유아나 면역력이 저하된 환자 그리고 노년층에서는 심각한 하기도 감염의 원인이 될 수도 있다. 영유아의 PIV 감염에 의한 가장 대표적인 질환은 급성후두기관 기관지염 (acute laryngotracheobronchitis; croup)으로 발열, 컹컹 짖는 듯한 기침 (hoarse barking cough), 후두폐색 (laryngeal obstruction), 그리고 흡기성 천명 (inspiratory stridor)의 증상을 보인다. RSV의 일차감염은 매우 어린 신생아를 제외하고, 일반적으로 상기도 증상에서 시작한다. 환자의 90% 이상은 점막성이거나 맑은 콧물을 동반하는 비충혈 (nasal congestion)의 증상을 보인다. 인후염과 발열 (38-40℃)도 일반적이다. 기침은 일반적인 증상(80%)으로 대부분 발작성의 심한 기침을 하지만 백일해와 차이가 있어 구분이 가능하다. 호흡곤란 (dyspnea), 빈삭호흡 (tachypnea), 그리고 호흡곤란 증후군은 늑간근수축 (intercostal muscle retractions)과 간혹 청색증으로 진행될 수 있다. 재감염의 경우 일차감염보다 증상이 경미하다. 3세 이상의 어린이에서 재감염은 일차적으로 상기도 증상과 발열을 유발한다. 성인에서의 재감염은 발열, 인후염, 그리고 기침의 증상이 일반적이지만, 보통 증상의 정도가 경미하다.
호흡기바이러스의 경우 바이러스의 일반적인 특성상 겨울철 발생빈도가 높으나 연중 지속적인 감염 양상을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 아데노바이러스 감염의 발생 양상은 늦겨울, 봄, 초여름에 걸쳐 발생빈도가 높지만 연중 산발적으로 발생하는 것으로 알려져 있다. 바이러스에 의한 호흡기질환에서 효과적인 백 신이 개발되지 않은 상태이며 치료법 역시 확립되지 않은 상태이므로 발열 시 적절한 수분 공급과 안정, 해열제 복용, 2차 감염방지를 위한 항생제 투여 등의 대증적인 요법 이외에는 특별한 치료법이 없는 실정이다. 따라서 원인 바이러스의 보다 신속하고 정확한 진단은 질환 확산의 조기 예방과 환자의 효과적인 치료에 매우 중요하다. 그러나 바이러스성 호흡기 감염 질환은 비교적 특징적인 임상 증상을 나타내는 경우를 제외하고는 임상적으로 원인 바이러스의 규명이 어려울 뿐 아니라 세균성 호흡기 감염과 감별이 어렵기 때문에 정확한 진단에 많은 어려움이 있는 실정이다.
현재 급성 호흡기감염증을 유발하는 바이러스의 진단법으로는 다양한 방법이 이용되고 있다. 바이러스 확인 진단에 사용되는 방법으로 해당 바이러스에 대해 감수성 있는 세포에 접종하여 바이러스 증식에 의한 세포병변 효과를 확인하는 바이러스 분리는 바이러스 진단법 중 가장 확실한 방법으로 알려져 있으나 진단에 장시간이 요구되며 숙련된 연구자의 많은 노력이 필요하다. 이 외에 바이러스의 항원 즉, 바이러스의 캡시드 (capsid) 또는 외피 (envelope)에 대한 항체를 이용하여 바이러스 항원을 확인하는 방법으로 항원 검출 (Antigen-capture) ELISA와 IFA 등이 있으나 환자 검체에서 항원 검출이 가능한 시기가 임상 증상이 있는 급성기에 제한된다는 문제가 있다. 항체 검출에 의한 진단은 급성기와 회복기 혈청에서 항체 상승에 의해 간접적으로 진단하여야 하므로 급성 질환 진단에는 적용하기 어려운 단점이 있다. 이러한 제한점을 극복하기 위한, 바이러스의 유전자를 검출하는 분자생물학적 방법이 많은 연구자들에 의해 개발되고 있다. 특히 유전자 진단에 사용되는 PCR법은 매우 민감한 방법으로 진단에 소요되는 시간을 단축할 수 있어 최근의 모든 바이러스 진단에 이용되고 있다. 한편, 다양한 호흡기 세균이나 바이러스가 유사한 임상증상을 나타내므로 각각의 병원체에 대한 진단법을 개별적으로 실시한 후 결과를 비교 분석하여 종합적인 진단을 하는 것이 필수적이었다. 그러므로 최종 진단을 하기까지는 과중한 진단 업무와 상당 시간이 소요되는 어려운 문제점을 가지고 있으며, 이러한 제한점을 극복하기 위하여 각각의 바이러스에 특이적인 프라이머를 제작하여 환자 검체로부터 유전자를 추출한 후 동시에 여러 바이러스를 진단하는 멀티플렉스 PCR법이 연구되고 있다.
결론적으로 다양한 바이러스에 의해서 질환이 야기되고 감염 초기 또는 급성기에 대부분 동일한 임상 양상을 나타내는 호흡기 질환의 원인체를 보다 신속하고 효과적으로 진단할 수 있는 방법에 대한 요구는 지속되고 있는 실정이다. 이에 본 발명자들은 PIV, RSV 및 ADV 바이러스로부터 멀티플렉스 RT-PCR을 수행하기 위한 프라이머와 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR법을 개발하고, 바이러스 진단에 있어서의 유용성 및 특이성을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 다양한 호흡기바이러스를 동시에 신속히 진단하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다양한 호흡기바이러스를 동시에 진단하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR에 사용되는 프라이머 세트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다양한 호흡기바이러스를 동시에 진단하기 위한 단일튜브- 멀티플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 다양한 호흡기바이러스의 특정 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 다양한 호흡기바이러스 검출용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 호흡기 바이러스 질환 의심환자에서 채취한 검체로부터 RNA 및 DNA를 추출하여 PIV 1, 2 및 3형; RSV A 및 B형; 및 아데노바이러스 51가지 혈청형을 모두 진단할 수 있는 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR법을 제공한다.
또한, 본 발명은 다양한 호흡기바이러스를 동시에 진단하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR에 이용할 수 있는 특이적인 프라이머를 제공한다.
본 발명에서, 호흡기바이러스 PIV, RSV 및 ADV를 단층 배양한 세포에 접종하고 세포병변효과를 관찰하여 분리한 후 이들 각각의 바이러스의 RNA 및 DNA를 분리하여 RT-PCR을 위한 프라이머를 제작한다. 본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트는 하기 표 1과 같다.
표 1. 호흡기 바이러스의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트
바이러스 프라이머 프라이머 서열 서열번호
PIV PIV1 F 5'-ATACCTATGACATCAACGACAA-3' 서열번호: 1
PIV1 R 5'-CAACTTGTCTTTTCTTTAG-3' 서열번호: 2
PIV2 F 5'-ATGGAATCAATCGCAAAAG-3' 서열번호: 3
PIV2 R 5'-GCCCATTGCCCTGTTGTATT-3' 서열번호: 4
PIV3 F 5'-TGGGGGTCAGAAGGAAG-3' 서열번호: 5
PIV3 R 5'-TAATATGACAGATGACACAATG-3' 서열번호: 6
RSV RSV F 5'-AGAAGTGGCTCCAGAATATAGG-3' 서열번호: 7
RSV R 5'-CTCCCATTATGCCTAGACCTGC-3' 서열번호: 8
ADV ADV F 5'-ATGTGGAAICAGGCIGTIGACAG-3' 서열번호: 9
ADV R 5'-CGGTGGTGITTIAAITTIACITTGTCCAT-3' 서열번호: 10
본 발명에 따른 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트는, PIV 1, 2 및 3형에 대한 프라이머 PIV1F, PIV1R, PIV2F, PIV2R, PIV3F 및 PIV3R; RSV A형, B형을 특이적으로 증폭하는 프라이머 RSV F 및 RSV R 및 ADV 51형을 특이적으로 증폭하는 프라이머 ADV F 및 ADV R을 포함한다. 본 발명에 따른 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트에 PIV 1, 2 및 3형; RSV에 대한 RNA; 및 ADV의 DNA를 첨가하여 수행한 결과는, 상기 6가지 유형의 바이러스를 특이적으로 진단할 수 있음을 제시한다.
본 발명에서, 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR의 유용성은 PIV, RSV 및 ADV 표준주 및 1998부터 2003년에 걸쳐 분리된 PIV, RSV 및 ADV 분리주를 이용하여 확인된다. PIV 표준주 ATCC에서 구입한 hPIV1(VR-94), hPIV2(VR-92), hPIV3(VR-93)를 이용하여 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 수행한 결과는 PIV 1, 2 및 3형에 대해 각기 399 bp, 196 bp 및 273 bp의 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 나타낸다 (도 1 참조). 각각의 PCR 결과물의 염기서열을 분석하고 그 결과를 종래 알려진 HN 부위의 염기서열과 비교하면, 각 유형의 해당 부위 염기서열과 일치함을 알 수 있다. RSV 표준주를 (ATCC에서 구입한 RSV-A (VR-1540), RSV-A(VR-26), RSV-B(VR1401) 이용하여 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 실시한 결과는 RSV A 및 B형에 대해 각기 550 bp 의 PCR 결과물을 제시한다 (도 1 참조). 각각의 PCR 결과물의 염기서열을 분석하고 그 결과를 종래 알려진 HN 부위의 염기서열과 비교하면, 각 유형의 해당 부위 염기서열과 일치함을 알 수 있다. ADV 표준주를 (ATCC에서 구입한 ADV 2 (VR-846), ADV 3 (VR-3), ADV 5 (VR-5), ADV 7 (ATCC VR-7)을 이용하여 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 실시한 결과는 ADV에 대해 각기 458 bp의 PCR 결과물을 제시한다 (도 1 참조). 각각의 PCR 결과물의 염기서열을 분석하고 그 결과를 종래 알려진 Hexon 부위의 염기서열과 비교하면, 각 유형의 해당 부위 염기서열과 일치함을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트의 바이러스 종에 따른 특이성을 확인하기 위해 호흡기 질환을 유발하는 다른 종의 바이러스와의 교차반응성을 검토한다. 교차반응 실험에서, INFV의 표준주 및 분리주를 사용하였다. 구체적으로, INFV는 A/ Taiwan/1/86 (H1N1), A/Pusan/102/00 (H1N1), A/ Johannesburg/33/94 (H3N2), A/Kyungnam/100/00 (H3N2), B/Panama/45/90과 B/ Pusan/104/00 주를 이용하였다. 또한, 홍역 바이러스 (Measles virus) (VR-24)와 유행성이하선염 바이러스 (Mumps virus) (VR-1438)를 이용하였다. 호흡기 질환을 야기하는 세균의 경우는 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus Influenzae) (ATCC 9795), 스타필로코쿠스 뉴모니애 (Staphylococcus Pneumonia) (ATCC 49619), 클라미디아 뉴모니애 (Chlamydia Pneumonia) (ATCC VR1355)를 이용하였다. 호흡기바이러스 RNA 및 DNA는 Qiamp viral RNA kit (Qiagen, Germany)로 분리하여 실험에 사용한다. 또한, 호흡기세균은 100℃에 가열하여 원심분리한 후 그 상층액을 이용하 였다. 교차반응성에 대한 실험 결과는 본 발명의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR이 상기 다른 종의 호흡기질환 바이러스 및 세균 모두에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않음을 보여 준다 (도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명의 호흡기바이러스 검출용 조성물은 상기 프라이머 세트 (올리고 뉴클레오티드) 및 일반적으로 허용되는 담체를 포함 한다. 여기서, 상기 조성물은 역전사효소, DNA 중합효소, DNA 염색시약 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며, 호흡기바이러스의 검출을 위한 임상 검체 및 세포 배양액 등에 적용 가능하다.
또한, 본 발명은 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 이용하여 호흡기바이러스를 검출하기 위한 RT-PCR 프라이머 세트, 반응 완충액, DNA 중합효소, 역전사효소를 포함하는 RT-PCR 프리믹스 키트에 있어서, RT-PCR 프라이머 세트가 서열번호: 1 및 서열번호: 2, 서열번호: 3 및 서열번호: 4, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 파리인플루엔자 바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 서열번호: 7 및 서열번호: 8의 염기서열을 포함하는 호흡기세포융합 바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트, 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 아데노바이러스 유전자 증폭을 위한 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트임을 특징으로 하는, 호흡기바이러스 검출을 위한 단일튜브 RT-PCR 프리믹스 키트에 관한 것이다.
이와 같이, 본 발명에 따르면 역전사 과정과 PCR 과정을 하나의 튜브에서 수행하고, PIV 1, 2 및 3, RSV A 및 B, 및 ADV 51가지 혈청형을 동시에 진단하므로, 호흡기질환 의심환자의 검체로부터 RNA 및 DNA를 직접 검출하여 매우 신속하고 정확하게 다양한 호흡기바이러스를 진단하여 질환의 정확한 유행양상 및 역학조사를 효과적으로 수행할 수 있다. 또한, 바이러스에 대한 진단 정보는 호흡기바이러스 백신 연구에 매우 유용한 자료로 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프리믹스 키트는 고도로 숙련되지 않은 실험자라도 용이하게 수행할 수 있으며, PCR에서 문제가 되는 오염을 최소화 할 수 있다는 이점이 있어 바이러스 진단에 매우 효율적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 유행 호흡기바이러스주의 확보 및 이의 분자생물학적 성상 연구에 이용될 수 있다.
이하, 실시 예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 상세한 설명에서 인용된 문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
실시예 1: PIV, RSV 및 ADV의 분리
PIV, RSV, ADV는 미국종균협회 (American Type Culture Collection) (ATCC)으로부터 분양 받은 PIV 1(VR-94), 2(VR-92), 3(VR-93), RSV A (VR-1540, VR-26), B(VR-1401)를 사용하였다. 또한 ADV 표준주로는 ADV 2 (VR-846), ADV 3 (VR-3), ADV 5 (VR-5), ADV 7 (VR-7)을 사용하였다. 각각의 바이러스는 ATCC으로부터 분양받아 단층 배양한 Hep-2 세포 (CCL-23)와 Vero 세포 (CCL-81)에 접종하고 세포병변효과를 관찰한 후 세포배양액을 본 실험에 이용하였다.
실시예 2: 바이러스 RNA 및 DNA 분리
PIV, RSV 및 ADV의 RNA 및 DNA는 바이러스 배양액으로부터 Qiaamp viral RNA 키트 (Qiagen, Germany)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 분리하였다.
실시예 3: 멀티플렉스 RT-PCR 프라이머 제작
PIV 1, 2 및 3형을 특이적으로 증폭하고, 아가로즈 젤 전기영동 후 각각의 바이러스를 PCR 결과물의 크기에 따라 분류할 수 있도록 PIV Haemaglutinin-Nuraminidase 유전자에 기초하여 프라이머를 제작하였다. 각각의 프라이머를 PIV1F, PIV1R, PIV2F, PIV2R, PIV3F 및 PIV3R로 명명하였다. RSV A형, B형에 대하여 특이적 증폭이 가능하고 PCR 산물을 아가로즈 젤 전기영동 수행 후 각각의 바이러스를 PCR 결과물의 크기에 따라 분류할 수 있도록 Nucleocapsid 유전자를 기초로 프라이머를 제작하고 각각 RSV F, RSV R로 명명하였다. ADV에 대한 프라이머는 51가지의 혈청형 모두 특이적으로 증폭 가능하며, 아가로즈 젤 전기영동 실시 후 각각의 바이러스와 PCR 결과물을 크기에 따라 구분할 수 있도록 ADV Hexon 유전자에 기초하여 제작하였다. 제작한 프라이머를 각각 ADV F 및 ADV R로 명명하였다.
실시예 4: 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR
호흡기 질환으로 의심되는 환자의 검체로부터 분리한 RNA 및 DNA를 사용하여 cDNA 합성과정이 없이 역전사 반응과 PCR 반응을 동시에 수행하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 키트를 제작하였다. 먼저, 역전사 효소와 Taq 폴리머라아제를 동시에 첨가한 프리믹스 키트 (premix kit)를 제작하였다. 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 프리믹스는 PIV 1, 2 및 3형에 대한 프라이머 PIV1F, PIV1R, PIV2F, PIV2R, PIV3F, PIV3R; RSV A형, B형에 대한 프라이머 RSV F, RSV R 및 ADV 51형에 대한 프 라이머 ADV F, ADV R을 포함하였다. 제작한 프리믹스에 PIV 1, 2 및 3형; RSV에 대한 RNA 샘플; 및 ADV의 DNA 샘플을 각 5㎕를 첨가하여 RT-PCR을 수행하였다. 42℃에서 1시간 1회 역전사 반응을 실시하고 94℃에서 3분간 사전변성 (predenaturation) 시킨 후, 94℃에서 1분간 변성 (denaturation), 54℃에서 1분간 어닐링 (annealing), 및 72℃에서 1분간 확장 (extension) 시키는 과정을 35회 반복 실시한 후 72℃에서 10분 동안 추가 반응을 실시하였다. PCR 반응 후 증폭된 DNA를 EtBr을 함유하는 1% 아가로즈 젤을 이용하여 전기영동을 실시하고 UV 하에서 관찰하였다. 그 결과 도 1에서 확인되는 바와 같이, 각 바이러스마다 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 제시하였다. PIV1형은 399 bp의 밴드를 나타냈고, PIV2형은 196 bp의 밴드를 형성하였다. PIV3형은 273 bp 밴드를 나타냈고, RSV은 550 bp의 밴드를 나타냈다. 또한, ADV는 458 bp의 밴드를 형성하였다. 따라서, 단 한 번의 PCR 반응으로 호흡기 질환을 유발하는 6가지 유형의 호흡기바이러스를 특이적으로 구분할 수 있었다.
실시예 5: 멀티플렉스 RT-PCR의 유용성 확인
실시예 4에서 제작한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR의 유용성을 PIV, RSV, ADV 표준주 및 1998년부터 2003년에 걸쳐 분리된 PIV, RSV, ADV 분리주를 이용하여 확인하였다. 각각의 바이러스로부터 RNA 및 DNA의 분리와 멀티플렉스-PCR은 위에서 기술한 방법과 동일하게 수행하였다. PIV 표준주를 이용하여 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 수행한 결과 PIV 1, 2 및 3형에 대해 각기 399 bp, 196 bp 및 273 bp의 서로 다른 크기의 PCR 결과물을 수득하였다 (도 1). 다음, RSV 표준주를 이용하여 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 실시하였고, 그 결과 RSV A, B형에 대해 각기 550 bp의 PCR 결과물을 수득하였다 (도 1). ADV 2, 3, 5, 7형 표준주를 이용하여 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR을 실시하였고, 그 결과 458 bp의 PCR 결과물을 수득하였다 (도 1). 도 1에서 제 1레인은 100bp DNA Ladder (Invitrogen), 제 2레인은 PIV 1, 제 3레인은 PIV 2, 제 4레인은 PIV 3, 제 5레인은 RSV A, 제 6레인은 RSV B, 제 7레인은 ADV 2, 제 8레인은 ADV 3, 제 9레인은 ADV 5, 제 10레인은 ADV 7, 제 11레인은 음성대조로 RNA 및 DNA를 첨가하지 않고 PCR을 수행한 것이다. 각각의 PCR 결과물의 염기서열을 분석하고 이를 종래 알려진 PIV; Haemaglutinin-Nuraminidase, RSV; Nucleocapsid, ADV; Hexon 유전자부위의 염기서열과 비교한 결과 각 유형의 해당 부위 염기서열과 일치하는 것이 확인되었다. 개발된 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR의 진단에의 유용성을 검토하기 위해 1998년에서 2003년에 분리된 PIV, RSV 및 ADV 22개의 분리주를 이용하여 확인 실험을 수행하였다. 각각의 분리주 PIV, RSV 및 ADV에 대해 멀티플렉스 RT-PCR을 수행한 결과, 각 유형에 대해 특이적인 PCR 결과물을 수득하였다 (도 2). 도 2에서 A 사진은 제 1레인은 100bp DNA Ladder, 제 2레인은 KNIH-2K2-1(PIV 2), 제3 레인은 KNIH-2K2-2(PIV 2), 제 4레인은 KNIH-2K3-1(RSV A), 제 5레인은 KNIH-2K3-2(RSV A), 제 6레인은 KNIH-2K3-3(RSV A), 제 7레인은 KNIH-2K3-4(RSV B), 제 8레인은 KNIH-2K3-5(RSV B), 제 9레인은 KNIH-2K4-1(RSV A), 제 10레인은 KNIH-2K4-2(RSV A), 제 11레인은 KNIH-2K4-3(RSV B), 제 12레인은 KNIH-2K4-4(RSV B), 제 13레인은 KNIH-2K0-1(ADV 2), 제 14레인은 KNIH-2K0-2(ADV 5), 제 15레인은 KNIH-2K2-1(ADV 3), 제 16레인은 KNIH-2K2-2(ADV 11), 제 17레인은 KNIH-2K3-1(ADV 2)이다. B 사진은 제 1레인은 100bp DNA Ladder, 제 2레인은 KNIH-2K3-2(ADV 5), 제 3레인은 KNIH-2K3-3(ADV 7), 제 4레인은 KNIH-2K4-1(ADV 1), 제 5레인은 KNIH-2K4-2(ADV 3), 제 6레인은 KNIH-2K4-3(ADV 7), 제 7레인은 KNIH-2K4-4(ADV 4), 제 8레인은 음성대조로 RNA 및 DNA를 첨가하지 않고 PCR을 수행한 것이다. 이는 본 발명에 다른 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR이 진단에 유용하게 이용될 수 있음을 지지한다.
실시예 6: 교차반응 (Cross reactivity)을 통한 멀티플렉스 RT-PCR의 특이성 확인
본 발명은 프라이머를 사용한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR의 바이러스 종에 따른 특이성을 확인하기 위해 호흡기 질환을 유발하는 다른 종의 바이러스 및 세균과의 교차반응성을 검토한다. 교차반응 실험에서, INFV의 표준주 및 분리주를 사용하였다. 구체적으로, INFV는 A/Taiwan/1/86 (H1N1), A/Pusan/102/00 (H1N1), A/Johannesburg/33/94 (H3N2), A/Kyungnam/ 100/00 (H3N2), B/Panama/45/90과 B/ Pusan/104/00 주를 이용하였다. 또한 Measles virus (VR-24), Mumps virus (VR-1438)를 이용하였다. 호흡기 질환을 야기하는 세균의 경우는 Haemophilus Influenzae (ATCC 9795), Staphylococcus Pneumonia (ATCC 49619), Chlamydia Pneumonia (ATCC VR1355)를 이용하였다. 호흡기바이러스 RNA 및 DNA는 Qiamp viral RNA kit (Qiagen, Germany)으로 분리하여 실험에 사용한다. 또한 호흡기세균은 100℃에 가열하여 원심분리한 후 그 상층액을 이용하였다. 교차반응성에 대한 실험 결과는 본 발명의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR이 상기 다른 종의 호흡기 질환 바이러스 및 세균 모두에 대해 전혀 반응성을 나타내지 않음을 보여 준다 (도 3 및 도 4 참조).
이와 같이, 본 발명의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR에 따르면, PIV 1, 2 및 3형; RSV A 및 B형; 및 아데노바이러스 51가지 혈청형의 호흡기바이러스를 동시에 신속하게 진단할 수 있다. 따라서 감염초기 임상증상에 커다란 차이가 없는 호흡기 감염질환의 원인체를 조기에 검출하므로써 보다 신속하고 효율적인 바이러스 진단 시스템을 구축할 수 있다. 또한, 본 발명의 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 방법은 RT와 PCR을 동시에 수행함으로 시간을 단축할 뿐만 아니라 RT과정 후 PCR 혼합액에 샘플을 다시 넣을 필요가 없으므로 실험자에 의한 DNA 오염을 방지할 수 있으므로 고도로 숙련되지 않은 실험실에서도 호흡기바이러스를 진단할 수 있다. 그리고 본 발명은 RNA 바이러스인 PIV, RSV와 DNA 바이러스인 ADV를 RNA와 DNA를 구분하지 않고 RT-PCR을 수행함으로 기존의 RNA와 DNA가 구분 된 PCR 방법에 비해 매우 유용할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 하기 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호: 4의 프라이머 세트, 서열번호: 5 및 서열번호: 6의 프라이머 세트, 서열번호: 7 및 서열번호: 8의 프라이머 세트, 및 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 프라이머 세트를 사용하는, 호흡기바이러스를 검출하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR 방법.
    바이러스 프라이머 프라이머 서열 서열번호 PIV (파라인플루엔자바이러스) PIV1 F 5'-ATACCTATGACATCAACGACAA-3' 서열번호: 1 PIV1 R 5'-CAACTTGTCTTTTCTTTAG-3' 서열번호: 2 PIV2 F 5'-ATGGAATCAATCGCAAAAG-3' 서열번호: 3 PIV2 R 5'-GCCCATTGCCCTGTTGTATT-3' 서열번호: 4 PIV3 F 5'-TGGGGGTCAGAAGGAAG-3' 서열번호: 5 PIV3 R 5'-TAATATGACAGATGACACAATG-3' 서열번호: 6 RSV (호흡기세포융합 바이러스) RSV F 5'-AGAAGTGGCTCCAGAATATAGG-3' 서열번호: 7 RSV R 5'-CTCCCATTATGCCTAGACCTGC-3' 서열번호: 8 ADV (아데노바이러스) ADV F 5'-ATGTGGAAICAGGCIGTIGACAG-3' 서열번호: 9 ADV R 5'-CGGTGGTGITTIAAITTIACITTGTCCAT-3' 서열번호: 10
  2. 호흡기바이러스를 검출하기 위한 단일튜브-멀티플렉스 RT-PCR에 사용되는, 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호: 4의 프라이머 세트, 서열번호: 5 및 서열번호: 6의 프라이머 세트, 서열번호: 7 및 서열번호: 8의 프라이머 세트, 및 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트.
  3. 호흡기바이러스를 검출하기 위한 RT-PCR 프라이머 세트, 반응 완충액, DNA 중합효소, 역전사효소를 포함하는 RT-PCR 프리믹스 키트에 있어서, RT-PCR 프라이머 세트가 서열번호: 1 및 서열번호: 2의 프라이머 세트, 서열번호: 3 및 서열번호: 4의 프라이머 세트, 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 세트, 서열번호: 7 및 서열번호: 8 프라이머 세트, 및 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 프라이머 세트로 구성됨을 특징으로 하는, 호흡기바이러스 검출을 위한 단일튜브 RT-PCR 프리믹스 키트.
  4. 역전사 중합효소연쇄반응에 이용되는 프라이머 세트, 역전사 효소, DNA 중합효소, DNA 염색 시약 및 적합한 담체를 포함하는 호흡기바이러스 검출용 조성물에 있어서, 프라이머 세트가 서열번호: 1 내지 서열번호: 2의 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호: 4의 프라이머 세트, 서열번호: 5 및 서열번호: 6의 프라이머 세트, 서열번호: 7 및 서열번호:8의 프라이머 세트, 및 서열번호: 9 및 서열번호: 10의 프라이머 세트로 구성됨을 특징으로 하는 호흡기바이러스 검출용 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220073673A (ko) 2020-11-25 2022-06-03 주식회사 에이치피바이오 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101939336B1 (ko) 2011-02-18 2019-01-16 주식회사 엘지화학 호흡기 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 호흡기 바이러스 검출용 키트
CN106521035B (zh) * 2016-12-13 2019-12-31 湖南圣湘生物科技有限公司 检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法
KR20220151090A (ko) 2021-05-04 2022-11-14 신한대학교 산학협력단 중동호흡기증후군 코로나바이러스 검출용 역전사중합효소연쇄반응 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출키트
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020081567A1 (en) 1995-11-03 2002-06-27 Henrickson Kelly J. Virus assay method
KR20040102741A (ko) * 2003-05-29 2004-12-08 (주)지노믹트리 사스 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드 및 디엔에이 칩
KR20050058620A (ko) * 2003-12-12 2005-06-17 삼성전자주식회사 사스 코로나바이러스 검출용 프라이머, 그를 이용한 사스코로나바이러스 검출 방법 및 키트
KR20060073457A (ko) * 2004-12-24 2006-06-28 삼성전자주식회사 핵산 프라이머 세트, 핵산 프로브 세트 및 그들을 이용한호흡기 질환 바이러스의 검출방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020081567A1 (en) 1995-11-03 2002-06-27 Henrickson Kelly J. Virus assay method
KR20040102741A (ko) * 2003-05-29 2004-12-08 (주)지노믹트리 사스 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드 및 디엔에이 칩
KR20050058620A (ko) * 2003-12-12 2005-06-17 삼성전자주식회사 사스 코로나바이러스 검출용 프라이머, 그를 이용한 사스코로나바이러스 검출 방법 및 키트
KR20060073457A (ko) * 2004-12-24 2006-06-28 삼성전자주식회사 핵산 프라이머 세트, 핵산 프로브 세트 및 그들을 이용한호흡기 질환 바이러스의 검출방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220073673A (ko) 2020-11-25 2022-06-03 주식회사 에이치피바이오 개인식별 및 호흡기 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도

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