CN106995799A - 一种增加有效细胞融合的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种增加有效融合细胞的方法。该方法包括：(一)、测定实验动物对LPS的免疫剂量:(二)、实验动物抗原免疫效果的监测：(三)、LPS对达到免疫条件的实验动物进行刺激免疫。本发明人经实验统计，本发明融合方法具有明显优势，本发明方法经过3次融合共获得24株细胞株，现有技术融合只获得3株细胞株。本发明方法在筛选获得目的细胞株的概率上是常规技术的8倍。本发明取得了显著进步。本发明方法可用于抗体如单克隆抗体的筛选和融合，有利于增加分泌抗体细胞株数量；有利于建立抗体库时筛选合适抗体。体外培养生产抗体时，可以加速细胞株生长，缩短时间，降低生产成本，本发明宜于工业化生产，具有较大的应用价值。

Description

一种增加有效细胞融合的方法
技术领域
本发明涉及生物技术，具体涉及一种增加有效融合细胞的方法。
背景技术
在常规的免疫，细胞融合中，因为针对目的抗原的浆细胞数目少，使得融合中大量的无意义B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0-Ag14，简写SP2/0)进行融合，增大了筛选目的细胞工作量，影响目的细胞株的获得，同时，在自然情况下，目的细胞株与杂细胞株竞争中，目的细胞株往往处于弱势，因而，通过一次融合得到目的细胞株很少甚至于没有。这就增加了免疫次数，延长了实验时间，不利于动物保护，增加了细胞融合获得有效细胞株的成本。奥韦赫罗实验室在2012年申请的专利200980160301.8，中间苍白杆菌的脂多糖及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途。该专利方法虽然有助于免疫获得良好的效果，但是其用途主要在于作为佐剂，而对于如何增加融合后筛选获得较多的有效细胞株并没有给予技术方案，因此，需要改进细胞融合方法。本发明人据脂多糖(LPS)等具有使B淋巴细胞、T淋巴细胞非特异性增殖的效果进行试验，并得到较好的效果，以此深入研究具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计细胞融合后获得更多目的细胞株的方法。
本发明提供一种增加有效融合细胞绝对量的方法。
该方法包括下列步骤：
(一)、测定实验动物对LPS的免疫剂量:
1)配制10mM磷酸盐缓冲液(PBS)
十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，溶解于1L纯化水中，在25℃下测定pH，以氢氧化钠、盐酸调pH至4.0-10.0，优选6.8-8.0，最优选7.0-7.4；
2)取6支eppendorf管，编号1-6，取LPS用PBS按照0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml稀释
3)将稀释后的溶液经0.22μm无菌滤膜(来自corning)过滤除菌,收集滤液；
4)每只小鼠注射0.01-0.5ml上述无菌滤液，并同时3组平行试验；
5)观察小鼠状态，记录各剂量试验小鼠的反应、状态，测定脂多糖免疫剂量；
结果见表1。
表1：不同剂量LPS刺激下小鼠状态记录表:
6)试验分析，从上表可以看出脂多糖每只免疫剂量在0.01mg-0.8mg范围内时，可以观察到较为明显的免疫反应(如毛发光亮度变差，体温升高等)。
(二)、实验动物抗原免疫效果的监测：
常规小鼠免疫，并在免疫后3-5天内进行断尾采血、离心10000g(g为离心力)、4分钟，取上清用PBS梯度稀释，进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定效价；
(三)、LPS对达到免疫条件的实验动物进行刺激免疫；
1)当抗原免疫效价达到500-60万，优选2000-40万，最优选2-10万时，进行加强免疫：取抗原(5-100μg)溶解于200μl PBS中，混匀后腹腔注射(10-200μl/只)；并在加强免疫的同时对小鼠注射LPS液:剂量为0.005-0.3mg/只，优选为0.08-0.12mg/只，最优选为0.1-0.15mg/只，观察小鼠情况；
2)融合前24小时再次对小鼠注射LPS液：剂量为0.05-0.4mg/只,优选为0.08-0.12mg/只，最优选为0.1-0.15mg/只；注射方法为腹腔注射或静脉穿刺，优选静脉穿刺；
3)小鼠经步骤2)注射LPS液24小时后融合：
Ⅰ取小鼠脾脏研磨，加含1％双抗DMEM培养基(双抗为链霉素、青霉素，购自gibco公司100倍母液，含1％双抗的DMEM培养液即为用DMEM稀释双抗母液100倍，如配制100ml含1％双抗的DMEM培养液：取1ml双抗母液，再加入99ml DMEM即可)1000g离心7分钟，2-3次，计数；
Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14，每次加DMEM1000g离心7分钟，2-3次，计数；
Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照1:2-1:10的比例混合；
Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；
Ⅴ在5s-90s内缓慢加入0.2-2.0ml聚乙二醇，分子量为3000-6000，优选为4000-5000，并轻轻搅拌，加入PEG时间控制30-60S,优选为40-50S，加入PEG的量为0.5-1.5ml，优选为0.8-1.2ml；
Ⅵ继续搅拌5-120s，优选为30-90S，最优选为50-70S；
Ⅶ静置5-120s，优选为15-60S，最优选为20-40S；
Ⅷ在1min内缓加DMEM,之后加快速度，使溶液体积达到10-80ml，离心，去上清，沉淀用含沉淀用含2倍HAT的DMEM培养基(HAT为购自gibco公司100倍母液，2倍HAT培养基，即为将HAT母液稀释50倍，如配制100ml HAT培养液：取2ml购自gibco公司的100倍HAT母液，再加入含有胎牛血清及抗生素的DMEM 98ml即可)稀释成50-150ml，优选为70-100ml，以每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养，并于第二日每孔补加含饲养细胞的DMEM培养液100μl
(饲养细胞可以为小鼠腹腔细胞、脾细胞等，一只小鼠的腹腔细胞用40-60ml DMEM培养液悬浮后可以作为4-6块96孔板的饲养细胞)；
4)在融合后5-15天对细胞板检测，优选7-10天检测，挑选阳性孔进行亚克隆；
5)经过3-5轮克隆直至得到全阳性细胞板，此时的细胞即为单克隆细胞。
本发明人经实验统计，本发明方法具有明显优势，经本发明方处理小鼠，在经过3次融合共获得24株细胞株，而同期利用现有技术，融合后只获得3株细胞株。本发明方法在筛选获得目的细胞株的概率上是常规技术的8倍。本发明取得了显著进步。
本发明方法的原理为：LPS可以促进B细胞分裂，在分裂比例一定的情况下，可以增加效应B细胞的绝对量，在融合时B细胞与SP2/0细胞接触，融合机会增大，降低了效应细胞未与SP2/0有效融合造成的基因丢失几率，在筛选时，因为有足够的有效B细胞与SP2/0融合，可以筛选到更多的有效融合细胞，达到增加获得目的细胞株的几率。本发明方法能在很大程度上增加筛选有效融合细胞的概率，增加有效基因丰度，也即增加了有效细胞的丰度，可以节省免疫、筛选等的资源，同时，因为减少了免疫，有利于动物福利的保护。本发明方法可用于单克隆抗体的筛选和融合，有利于获取有效单克隆抗体；对于无法体内免疫，需离体免疫获得分泌相关抗体的细胞株，有利于增加分泌抗体细胞株数量；有利于建立抗体库时筛选合适抗体。体外培养生产抗体时，可以加速细胞株生长，缩短时间，降低了生产成本，本发明方法宜于工业化生产，具有较大的应用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
试验材料：
小鼠购自苏州实验动物中心；
小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)：将冻存SP2/0细胞复苏后以8-杂氮鸟嘌呤溶液筛选1周，即可得到良好状态的SP2/0
LPS购自SIGMA；
磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾等购自国药；
DMEM、HAT、青霉素-链霉素母液等购自gibco公司；
佐剂(弗氏系列)购自sigma
细胞培养箱：THERMO水夹套恒温培养箱
离心机：1，上海中科TDL5M；
2，eppendorf 5417R
抗原：D-Dimer(分别来自Hytest、Abcam)
工作台：上海淀山湖公司；
酶标仪：伯乐公司
细胞培养板等来自corning和nunc公司
实施例1：小鼠对LPS产生明显免疫反应时最低剂量的测定
1)取6支离心管，用PBS按照0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml稀释LPS，每支1ml；
2)将上液分别经0.22μm滤器过滤除菌，分别收集得到0.8ml；
3)取18只体重在25±10g的BALB/c雌性小鼠，随机平均分成6组，按组分别每只注射0.1ml(0.2ml)上述稀释液，每种稀释度3个平行试验；
4)观察小鼠情况，记录小鼠产生明显免疫反应时用的LPS最低剂量
结果如下
实施例2：按照实施例1测定的剂量0.5mg/ml共免疫刺激小鼠制备单抗
1)第一次免疫：取抗原50μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散，达到乳化要求；
2)第二次免疫：取抗原25μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏不完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散达到乳化要求；
3)第二次免疫后3天断尾采血，采用间接酶联免疫法检测，测定效价达到16000，方法如下：
Ⅰ对小鼠断尾采血：采用外科手术剪小鼠尾部1-2mm，取血150μl；
Ⅱ对采得小鼠尾血离心(10000g，3min)，取上清；
Ⅲ上清用PBS从1000倍开始2倍梯度稀释至1024000倍，以未免疫小鼠血清作为阴性对照；
Ⅳ取抗原5μg以PBS稀释至10ml，以每孔100μl包被酶标板，4℃过夜，翌日，以1％牛血清白蛋白(BSA，购自sigma)封闭，37℃,2h,吸水纸吸干4℃保存；
Ⅴ上清稀释液分别以100μl/孔加入到包被有抗原的酶标板中，37℃,1h；
Ⅵ以含有0.06％吐温-20的PBS洗板液洗板3次，吸水纸吸干；
Ⅶ加入酶标二抗(HRP标记羊抗鼠抗体，来自Abcam)，37℃,0.5h；
Ⅷ洗板(同上Ⅵ)后加入TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)显色液，37℃,10min；
Ⅸ每孔加入50μl 2M硫酸终止反应，在波长1:450nm，波长2:630nm处测吸光度(OD)
Ⅹ吸光度高于3倍阴性对照OD值判定为阳性，显示阳性的最高稀释度即为效价。
4)再次免疫，步骤同第二次免疫；
5)第三次免疫3天后，再次断尾采血检测，效价达到32000(步骤同上)；
6)间隔第三次免疫14天后加强免疫，同时配合脂多糖刺激：取25μg抗原溶于50μl PBS中，混匀后与150μl 0.5mg/ml的LPS稀释液混合，注射入小鼠腹腔；
7)注意观察小鼠状况，融合前24h以0.15mg LPS注射小鼠尾静脉；
8)24小时后融合：(以下操作均在无菌环境进行，温度为室温(25℃±5℃)
Ⅰ取小鼠脾脏研磨，用DMEM培加含青霉素、链霉素各1％(体积比)的DMEM培养基(含1％抗生素的DMEM培养液购自Gibco公司)离心(1000g,7分钟)2次，计数；
Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)，用DMEM离心2次，计数；
Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照1:4的比例混合；
Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；
Ⅴ在1min内缓慢加入1ml PEG(分子量4500)，并轻轻搅拌；
Ⅵ继续搅拌60s；
Ⅶ静置30s；
Ⅷ在1min内缓加DMEM,之后加快速度，使溶液体积达到40ml，1000g离心5分钟，去上清，沉淀以HAT培养基(HAT母液购自gibco公司，配制100ml HAT培养液：取1ml购自gibco公司的100倍HAT母液，再加入含有胎牛血清及抗生素的DMEM 99ml即可)重悬至70ml。以每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养，并与第二日补加饲养细胞100ul；
9)在融合后7-10天据情况对细胞板检测(方法同测小鼠尾血效价，无需稀释，96孔细胞板对应96孔酶标板)，挑选阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，详细如下：
轻轻吹打使阳性孔细胞悬浮于培养液，将培养液稀释至10ml，再以100μl/孔加入至另一块96孔细胞板中，37℃,5％二氧化碳培养，重复该步骤，直到检测板全阳性即为单克隆细胞。
10)经过4轮克隆直到得到全阳性细胞板，此时细胞即为单克隆细胞；
11)实施例2获得4-6E1、4-2B11共2株细胞株。
实施例3：按照实施例1测定的剂量1mg/ml共免疫刺激小鼠制备单抗
1)第一次免疫：取抗原50μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散，达到乳化要求；
2)第二次免疫：取抗原25μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏不完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散即达到乳化要求；
3)第二次免疫后3天断尾采血，采用间接酶联免疫法检测，测定效价达到16000，方法如下：
Ⅰ对小鼠断尾采血，采用外科手术剪小鼠尾部1-2mm，取血150μl；
Ⅱ对采得小鼠尾血离心(10000g，3min)，取上清；
Ⅲ上清用PBS从1000倍开始2倍梯度稀释至1024000倍，以未免疫小鼠血清作为阴性对照；
Ⅳ取抗原5μg以PBS稀释至10ml，以每孔100μl包被酶标板，4℃过夜，翌日，以1％牛血清白蛋白(BSA，购自sigma)封闭，37℃,2h,吸水纸吸干4℃保存；
Ⅴ上清稀释液分别以100μl/孔加入到包被有抗原的酶标板中，37℃,1h；
Ⅵ以含有0.06％吐温-20的PBS洗板液洗板3次，吸水纸吸干；
Ⅶ加入酶标二抗(HRP标记羊抗鼠抗体，来自Abcam)，37℃,0.5h；
Ⅷ洗板(同上Ⅵ)后加入TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)显色液，37℃,10min；
Ⅸ每孔加入50μl 2M硫酸终止反应，在波长1:450nm，波长2:630nm处测吸光度(OD)
Ⅹ吸光度高于3倍阴性对照OD值判定为阳性，显示阳性的最高稀释度即为效价。
4)再次免疫，步骤同第二次免疫；
5)第三次免疫3天后，再次断尾采血检测，效价达到32000(步骤同上)；
6)间隔第三次免疫14天后加强免疫，同时配合脂多糖刺激：取25μg抗原溶于50μl PBS中，混匀后与150μl 1mg/ml的LPS稀释液混合，注射入小鼠腹腔；
7)注意观察小鼠状况，融合前24h以0.15mg LPS注射小鼠尾静脉；
8)24小时后融合：(以下操作均在无菌环境进行，温度为室温(25℃±5℃)
取小鼠脾脏研磨，加含1％双抗DMEM培养基(双抗为链霉素、青霉素，购自gibco公司100倍母液，含1％双抗的DMEM培养液即为用DMEM稀释双抗母液100倍，如配制100ml含1％双抗的DMEM培养液：取1ml双抗母液，再加入99ml DMEM即可)1000g离心7分钟，3次，计数；
Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14，每次加DMEM1000g离心7分钟，3次，计数；
Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照约1:4的比例混合；
Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；
Ⅴ在1min内缓慢加入1ml PEG(分子量4500)，并轻轻搅拌；
Ⅵ继续搅拌60s；
Ⅶ静置30s；
Ⅷ在1min内缓加DMEM,之后加快速度，使溶液体积达到40ml，1000g离心5分钟，去上清，沉淀以HAT培养基(HAT母液购自gibco公司，配制100ml HAT培养液：取1ml购自gibco公司的100倍HAT母液，再加入含有胎牛血清及抗生素的DMEM 99ml即可)重悬至70ml。以每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养，并与第二日补加饲养细胞100ul；
(饲养细胞为小鼠腹腔细胞，一只小鼠的腹腔细胞用40-60mlDMEM培养液悬浮后可以作为6块96孔板的饲养细胞)；
9)在融合后7-10天据情况对细胞板检测(方法同测小鼠尾血效价，无需稀释，96孔细胞板对应96孔酶标板)，挑选阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，详细如下：
轻轻吹打使阳性孔细胞悬浮于培养液，将培养液稀释至10ml，再以100μl/孔加入至另一块96孔细胞板中，37℃,5％二氧化碳培养，重复该步骤，直到检测板全阳性即为单克隆细胞。
10)经过4轮克隆直到得到全阳性细胞板，此时细胞即为单克隆细胞；
11)得到17株单抗细胞株，分别为5-11F5、5-6D10、5-7H9、5-4E5、5-2H8、5-7C5、5-2A6、5-4C8、5-7F7、5-7D7、5-1G2、5-5C11、5-6G8、5-3C8、5-1E6、5-7G5、5-1C8；
实施例4：按照实施例1测定的剂量2mg/ml共免疫刺激小鼠制备单抗
1)第一次免疫：取抗原50μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散，达到乳化要求；
2)第二次免疫：取抗原25μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏不完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散即达到乳化要求；
3)第二次免疫后3天断尾采血，采用间接酶联免疫法检测，测定效价达到16000，方法如下：
Ⅰ对小鼠断尾采血，采用外科手术剪小鼠尾部1-2mm，取血150μl；
Ⅱ对采得小鼠尾血离心(10000g，3min)，取上清；
Ⅲ上清用PBS从1000倍开始2倍梯度稀释至1024000倍，以未免疫小鼠血清作为阴性对照；
Ⅳ取抗原5μg以PBS稀释至10ml，以每孔100μl包被酶标板，4℃过夜，翌日，以1％牛血清白蛋白(BSA，购自sigma)封闭，37℃,2h,吸水纸吸干4℃保存；
Ⅴ上清稀释液分别以100μl/孔加入到包被有抗原的酶标板中，37℃,1h；
Ⅵ以含有0.06％吐温-20的PBS洗板液洗板3次，吸水纸吸干；
Ⅶ加入酶标二抗(HRP标记羊抗鼠抗体，来自Abcam)，37℃,0.5h；
Ⅷ洗板(同上Ⅵ)后加入TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)显色液，37℃,10min；
Ⅸ每孔加入50μl 2M硫酸终止反应，在波长1:450nm，波长2:630nm处测吸光度(OD)
Ⅹ吸光度高于3倍阴性对照OD值判定为阳性，显示阳性的最高稀释度即为效价。
4)再次免疫，步骤同第二次免疫；
5)第三次免疫3天后，再次断尾采血检测，效价达到32000(步骤同上)；
6)间隔第三次免疫14天后加强免疫，同时配合脂多糖刺激：取25μg抗原溶于50μl PBS中，混匀后与150μl 2mg/ml的LPS稀释液混合，注射入小鼠腹腔；
7)注意观察小鼠状况，融合前24h以0.15mg LPS注射小鼠尾静脉；
8)24小时后融合：(以下操作均在无菌环境进行，温度为室温(25℃±5℃)
Ⅰ取小鼠脾脏研磨，DMEM离心(1000g,7分钟)2次，计数；
Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0-Ag14)，用DMEM离心2次，计数；
Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照约1:4的比例混合；
Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；
Ⅴ在1min内缓慢加入1ml PEG(分子量4500)，并轻轻搅拌；
Ⅵ继续搅拌60s；
Ⅶ静置30s；
Ⅷ在1min内缓加DMEM,之后加快速度，使溶液体积达到40ml，1000g离心5分钟，去上清，沉淀以2倍HAT培养基(同上)重悬至70ml。以每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养，并与第二日补加饲养细胞(同上)；
9)在融合后7-10天据情况对细胞板检测(方法同测小鼠尾血效价，无需稀释，96孔细胞板对应96孔酶标板)，挑选阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆，详细如下：
轻轻吹打使阳性孔细胞悬浮于培养液，将培养液稀释至10ml，再以100μl/孔加入至另一块96孔细胞板中，37℃,5％二氧化碳培养，重复该步骤，直到检测板全阳性即为单克隆细胞。
10)经过4轮克隆直到得到全阳性细胞板，此时细胞即为单克隆细胞；
11)经统计得到5株单抗细胞株，分别为：6-4A11、6-1A2、6-4C3、6-12A6、6-10E4。
实施例5-7(对比例：采用现有技术的融合)
1)第一次免疫：取抗原50μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散即达到乳化要求；
2)第二次免疫：取抗原25μg溶于150μl PBS中，再加入150μl弗氏不完全佐剂，机械搅拌10min，使混合液成乳状，取一滴于水中，不分散即达到乳化要求；
3)第二次免疫后3天断尾采血，采用酶联免疫检测，测定效价达到16000；
4)再次免疫，步骤同第二次免疫；
5)第三次免疫3天后，再次断尾采血检测，效价达到32000；
6)加强免疫：取25μg抗原溶于200μl PBS中，混匀，小鼠腹腔内注射；
7)24小时后融合：(方法同上述实施例2)
最终分别获得1株、2株、0株细胞株，细胞株编号分别为：1-2G5；2-3F7、2-7D12。
表2：使用本发明方法(实施例2、3、4)与现有技术(实施例5、6、7)的对比：
结论：从表2可以明显说明，本发明融合方法具有明显优势，本发明方法经过3次融合共获得24株细胞株，现有技术融合只获得3株细胞株。本发明方法在筛选获得目的细胞株的概率上是常规技术的8倍。本发明取得了显著进步。

Claims (10)

1.一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(一)、测定实验动物对LPS的免疫剂量:
1)配制10mM磷酸盐缓冲液
十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，溶解于1L纯化水中，在25℃下测定pH，以氢氧化钠、盐酸调pH至6.0-9.0；
2)取6支eppendorf管，编号1-6；取LPS用PBS按照0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml稀释；
3)将稀释后的溶液经0.22μm无菌滤膜过滤除菌,收集滤液；
4)每只小鼠注射0.01ml-0.2ml上述无菌滤液，计每只小鼠0-0.8mgLPS无菌滤液，并同时3组平行试验；
5)观察小鼠状态，记录各剂量试验小鼠的反应、状态，据此测定脂多糖免疫剂量；
(二)、实验动物抗原免疫效果的监测：
常规小鼠免疫，并在免疫后3-5天内进行断尾采血、离心10000g、4分钟，取上清用PBS梯度稀释，进行酶联免疫吸附试验测定效价；
(三)、LPS对达到免疫条件的实验动物进行刺激免疫；
1)当抗原免疫效价达到500-60万，最优选2-10万时，进行加强免疫：取抗原5-100μg溶解于200μl PBS中，混匀后腹腔注射10-200μl/只；并在加强免疫的同时对小鼠注射LPS液:剂量为0.005-0.3mg/只，观察小鼠情况；
2)融合前24小时再次对小鼠注射LPS液：剂量为0.05-0.4mg/只,优选为0.1-0.4mg/只，最优选为0.12-0.2mg/只；注射方法为腹腔注射或静脉穿刺，优选静脉穿刺；
3)小鼠经步骤2)注射LPS液24小时后融合：
Ⅰ取小鼠脾脏研磨，加含1％双抗链霉素和青霉素的DMEM培养液1000g离心7分钟，2-3次，计数；
Ⅱ取处于对数期小鼠骨髓瘤细胞，每次加含1％双抗的DMEM培养液1000g离心7分钟2-3次，计数；
Ⅲ将脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞按照1:4-1:10的比例混合，优选为1:4-1:6的比例混合；
Ⅳ将上述混合细胞离心，去上清，敲击离心管底部，使细胞成糊状；
Ⅴ在5s-90s内缓慢加入0.2-2.0ml聚乙二醇，分子量为3000-6000，优选为4000-5000，并轻轻搅拌，加入PEG时间控制30-60S，优选为40-50s,加入PEG的量为0.5-1.5ml，优选为0.8-1.2ml；
Ⅵ继续搅拌5-120s，优选30-90s，最优选为50-70s；
Ⅶ静置5-120s，优选15-60s,最优选为20-40s；
Ⅷ在1min内缓加DMEM,之后加快速度，使溶液体积达到10-80ml，离心，去上清，沉淀用含2倍HAT的DMEM培养基稀释成50-150ml，优选为70-100ml，以每孔100μl加入到96孔板中，37℃，5％二氧化碳培养，并于第二日每孔补加含饲养细胞的DMEM培养液100μl；
4)在融合后5-15天据情况对细胞板检测，优选7-10天检测，挑选阳性孔进行亚克隆；
5)经过3-5轮克隆直至得到全阳性细胞板，此时的细胞即为单克隆细胞。
2.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述步骤(一)、1)磷酸盐缓冲液的浓度为5-10mM；pH为4.0-10.0。
3.根据权利要求2所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5-10mM；pH为6.8-8.0，最优选7.0-7.4。
4.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述步骤(三)1)当抗原免疫效价达到2000-40万时，可进行加强免疫：取抗原5-200μg溶解于200μl PBS中，混匀后腹腔注射10-200μl/只；并在加强免疫的同时对小鼠注射LPS液:剂量为0.08-0.12mg/只，观察小鼠情况。
5.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述步骤(三)1)当抗原免疫效价达到2000-40万时，可进行加强免疫：取抗原5-200μg溶解于200μl PBS中，混匀后腹腔注射10-200μl/只；并在加强免疫的同时对小鼠注射LPS液:剂量为0.1-0.15mg/只，观察小鼠情况。
6.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述实验动物小鼠为BALB/c小鼠或ICR小鼠。
7.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于所述步骤(三)、3)Ⅷ饲养细胞为小鼠腹腔细胞或脾细胞；一只小鼠的腹腔细胞用2-5毫升悬浮后作为4-6块96孔板的饲养细胞。
8.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述方法用于抗体的筛选和融合。
9.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述方法用于动物免疫。
10.根据权利要求1所述一种增加有效融合细胞的方法，其特征在于，所述方法用于提取RNA或蛋白质。
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