JP2531948B2 - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
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- JP2531948B2 JP2531948B2 JP62011023A JP1102387A JP2531948B2 JP 2531948 B2 JP2531948 B2 JP 2531948B2 JP 62011023 A JP62011023 A JP 62011023A JP 1102387 A JP1102387 A JP 1102387A JP 2531948 B2 JP2531948 B2 JP 2531948B2
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- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、心筋炎及び心筋症の研究、診断等に有用な
新規なモノクローナル抗体に関する。
新規なモノクローナル抗体に関する。
従 来 の 技 術 特発性心筋症は、原因不明の心筋疾患と定義され、肥
大型心筋症（HCM）及び拡張型心筋症（DCM）に２大別さ
れる。拡張型心筋症は、多種の病因による終末像と考え
られており、近年そのウイルス性心筋炎との関連が注目
されている。
大型心筋症（HCM）及び拡張型心筋症（DCM）に２大別さ
れる。拡張型心筋症は、多種の病因による終末像と考え
られており、近年そのウイルス性心筋炎との関連が注目
されている。
本発明者は、先に脳心筋炎ウイルス（encephalomyoca
rditiss virus,EMCウイルス）を用いることにより、高
度の心筋炎が高頻度に発症するウイルス性心筋炎実験モ
デルの開発並びにウイルス性心筋炎後に拡張型心筋症類
似の病変へと進展する心筋症実験モデルの開発に成功し
た〔Circulation,65（６）,1230−1235（1982）；同66
（２）,355−360（1982）；同71（４）,834−839（198
5）〕。
rditiss virus,EMCウイルス）を用いることにより、高
度の心筋炎が高頻度に発症するウイルス性心筋炎実験モ
デルの開発並びにウイルス性心筋炎後に拡張型心筋症類
似の病変へと進展する心筋症実験モデルの開発に成功し
た〔Circulation,65（６）,1230−1235（1982）；同66
（２）,355−360（1982）；同71（４）,834−839（198
5）〕。
上記実験モデル動物の開発によって、心筋炎及び心筋
症の予防及び治療の評価モデルが提供されたが、現在
尚、心筋炎及び心筋症を的確に且つ特異的に診断できる
方法は開発されていない。
症の予防及び治療の評価モデルが提供されたが、現在
尚、心筋炎及び心筋症を的確に且つ特異的に診断できる
方法は開発されていない。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記心筋炎及び心筋症の基礎研究に
おける解析手段、更にはかかる心筋炎及び心筋症の診断
及び予知を可能とする新規な測定用手段を提供すること
にある。
おける解析手段、更にはかかる心筋炎及び心筋症の診断
及び予知を可能とする新規な測定用手段を提供すること
にある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、脳心筋炎ウイルスと反応性を有する
モノクローナル抗体であって、ｉ）IgG2bクラスに属
し、正常心臓の房室弁組織とは反応性を有するが、心筋
組織とは反応性を有しない抗体又はii）IgG1クラスに属
し、心筋組織とは反応性を有するが、正常心臓の房室弁
組織とは反応性を有しない抗体のいずれかであることを
特徴とするモノクローナル抗体が提供される。
モノクローナル抗体であって、ｉ）IgG2bクラスに属
し、正常心臓の房室弁組織とは反応性を有するが、心筋
組織とは反応性を有しない抗体又はii）IgG1クラスに属
し、心筋組織とは反応性を有するが、正常心臓の房室弁
組織とは反応性を有しない抗体のいずれかであることを
特徴とするモノクローナル抗体が提供される。
本発明の抗体は、その抗原認識部位（認識する抗原決
定基）が、心筋発症の個体自身が認識するそれと同一で
あることを最大の特徴としており、心筋炎及び心筋症に
特異的である。従って本抗体の利用によれば、例えば、
心筋炎及び心筋症に高い特異性を有する抗原もしくは自
己抗体の免疫検定が可能であり、之等疾患の基礎研究、
診断、予知、治療法の検討、確立等を有効に行なうこと
ができる。
定基）が、心筋発症の個体自身が認識するそれと同一で
あることを最大の特徴としており、心筋炎及び心筋症に
特異的である。従って本抗体の利用によれば、例えば、
心筋炎及び心筋症に高い特異性を有する抗原もしくは自
己抗体の免疫検定が可能であり、之等疾患の基礎研究、
診断、予知、治療法の検討、確立等を有効に行なうこと
ができる。
本発明抗体は、例えば心筋炎発症動物を利用して容易
且つ簡便に製造できる。より詳しくは、心筋炎発症動物
の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞と
の融合細胞（hybridoma,ハイブリドーマ）を作成し、こ
れより正常心筋組織及び／又は起炎ウイルスを認識する
所望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの培
養により製造することができる。
且つ簡便に製造できる。より詳しくは、心筋炎発症動物
の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞と
の融合細胞（hybridoma,ハイブリドーマ）を作成し、こ
れより正常心筋組織及び／又は起炎ウイルスを認識する
所望抗体を産生するクローンを選択し、該クローンの培
養により製造することができる。
上記方法において、心筋炎発症動物としては、特に限
定されないが、本発明者が先に確立したウイルス性心筋
炎実験モデル動物が好ましく利用できる。これは、BALB
/cマウス、DBA/2マウス等にEMCウイルスを接種すること
により作成されたものであるが、起炎ウイルスとしては
EMCウイルスに限らず、例えばコクサッキーウイルス（c
oxackievirus）等の心筋親和性のある各種のものを用い
ることができる。また動物種としてもマウスに限らず通
常利用される各種の動物をいずれも利用できるが、該動
物の免疫細胞と細胞融合される形質細胞種細胞との適合
性を考慮すれば、マウス、ラット等が好ましい。
定されないが、本発明者が先に確立したウイルス性心筋
炎実験モデル動物が好ましく利用できる。これは、BALB
/cマウス、DBA/2マウス等にEMCウイルスを接種すること
により作成されたものであるが、起炎ウイルスとしては
EMCウイルスに限らず、例えばコクサッキーウイルス（c
oxackievirus）等の心筋親和性のある各種のものを用い
ることができる。また動物種としてもマウスに限らず通
常利用される各種の動物をいずれも利用できるが、該動
物の免疫細胞と細胞融合される形質細胞種細胞との適合
性を考慮すれば、マウス、ラット等が好ましい。
上記動物の免疫細胞としては、一般に脾細胞が使用さ
れる。該脾細胞としては、後述する抗体の検索方法に従
って確認される当該動物の血清抗体が高値を示す時期、
通像ウイルス接種の約20日後位のものが好ましい。
れる。該脾細胞としては、後述する抗体の検索方法に従
って確認される当該動物の血清抗体が高値を示す時期、
通像ウイルス接種の約20日後位のものが好ましい。
また、上記免疫細胞と融合される他方の親細胞として
の哺乳動物の形質細胞種細胞としては、既に公知の種々
のもの、例えばp3（p3/×63−Ag8）［Nature,256,495−
497（1975）］、p3−U1［Current Topics in Microbiol
ogy and Immunology,81,1−７（1978）］、NS−１［Eu
r.J.Immunol.,６,511−519（1976）］、MPC−11［Cell,
８,405−415（1976）］、SP2/0［Nature,276,269−270
（1978）］、FO［J.Immunol.Meth.,35,1−21（198
0）］、63.6.5.3.［J.Immunol.,123,1548−1550（197
9）］、S194［J.Exp.Med.,148,313−323（1978）］等
や、ラツトにおけるR210［Nature,277,131−133（197
9）］等の骨髄腫細胞等が使用される。
の哺乳動物の形質細胞種細胞としては、既に公知の種々
のもの、例えばp3（p3/×63−Ag8）［Nature,256,495−
497（1975）］、p3−U1［Current Topics in Microbiol
ogy and Immunology,81,1−７（1978）］、NS−１［Eu
r.J.Immunol.,６,511−519（1976）］、MPC−11［Cell,
８,405−415（1976）］、SP2/0［Nature,276,269−270
（1978）］、FO［J.Immunol.Meth.,35,1−21（198
0）］、63.6.5.3.［J.Immunol.,123,1548−1550（197
9）］、S194［J.Exp.Med.,148,313−323（1978）］等
や、ラツトにおけるR210［Nature,277,131−133（197
9）］等の骨髄腫細胞等が使用される。
上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知
の方法例えばマイルスタイン（Milstein）らの方法〔Me
thod in Enzymology,Vol.73,pp3（1981）〕等に準じて
行ない得る。より具体的には上記融合反応は、例えば融
合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行なわれる。融
合促進剤としては、通常用いられるもの、例えばポリエ
チレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等
が使用され、更に所望により融合効率を高めるために培
地にはジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用する
こともできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比
は、通常の方法と変りがなく、例えば形質細胞腫細胞に
対し、免疫細胞を約１〜10倍程度用いればよい。上記融
合時の培地としては、上記形質細胞腫細胞株の増殖に通
常使用される各種のもの、例えばRPMI−1640倍地、MEM
倍地、その他この種細胞培養に使用される各種培地を例
示できる。之等培地は通常牛胎児血清（FCS）等の血清
補液を抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と形質
細胞腫細胞との所定量を上記培地内でよく混合し、予め
37℃程度に加温したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6
000程度のものを、通常培地に約30〜60w/v％の濃度で加
えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培
地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返す
ことにより所望のハイブリドーマが形成される。
の方法例えばマイルスタイン（Milstein）らの方法〔Me
thod in Enzymology,Vol.73,pp3（1981）〕等に準じて
行ない得る。より具体的には上記融合反応は、例えば融
合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で行なわれる。融
合促進剤としては、通常用いられるもの、例えばポリエ
チレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等
が使用され、更に所望により融合効率を高めるために培
地にはジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用する
こともできる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比
は、通常の方法と変りがなく、例えば形質細胞腫細胞に
対し、免疫細胞を約１〜10倍程度用いればよい。上記融
合時の培地としては、上記形質細胞腫細胞株の増殖に通
常使用される各種のもの、例えばRPMI−1640倍地、MEM
倍地、その他この種細胞培養に使用される各種培地を例
示できる。之等培地は通常牛胎児血清（FCS）等の血清
補液を抜いておくのがよい。融合は上記免疫細胞と形質
細胞腫細胞との所定量を上記培地内でよく混合し、予め
37℃程度に加温したPEG溶液、例えば平均分子量1000〜6
000程度のものを、通常培地に約30〜60w/v％の濃度で加
えて混ぜ合せることにより行なわれる。以後、適当な培
地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰返す
ことにより所望のハイブリドーマが形成される。
得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別
用培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該HAT培地での培養は、目的とするハイブリ
ドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得ら
れるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目的
とする抗体産生株の検索及び単一クローン化に供され
る。
用培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該HAT培地での培養は、目的とするハイブリ
ドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分
な時間、通常数日〜数週間行なえばよい。かくして得ら
れるハイブリドーマは、通常の限界希釈法に従い、目的
とする抗体産生株の検索及び単一クローン化に供され
る。
目的抗体産生株の検索は、例えばELISA法［Engvall,
E.,Meth.Enzymol.,70,419−439（1980）］、蛍光抗体
法、プラーク法、スポツト法、凝集反応法、オクテロニ
ー（Ouchterlony）法、ラジオイムノアッセイ（RIA）法
等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法
［「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）
Ｒ＆Ｄプランニング発行、第30−53頁、昭和57年３月５
日］に従つて行ない得る。尚、上記検索において抗原と
しては、常法により調製された正常心筋組織及び起炎ウ
イルスを利用できる。
E.,Meth.Enzymol.,70,419−439（1980）］、蛍光抗体
法、プラーク法、スポツト法、凝集反応法、オクテロニ
ー（Ouchterlony）法、ラジオイムノアッセイ（RIA）法
等の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法
［「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、（株）
Ｒ＆Ｄプランニング発行、第30−53頁、昭和57年３月５
日］に従つて行ない得る。尚、上記検索において抗原と
しては、常法により調製された正常心筋組織及び起炎ウ
イルスを利用できる。
かくして得られる所望のモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また
液体窒素中で長期間保存可能である。
るハイブリドーマは、通常の培地で継代培養でき、また
液体窒素中で長期間保存可能である。
該ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
採取は、該ハイブリドーマを常法に従つて培養し、その
培養上清として得る方法や、或いはハイブリドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹
水として得る方法等が採用できる。前者の方法は高純度
の抗体を得るのに適しており、後者の方法は抗体の大量
生産に適している。
採取は、該ハイブリドーマを常法に従つて培養し、その
培養上清として得る方法や、或いはハイブリドーマをこ
れと適合性のある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹
水として得る方法等が採用できる。前者の方法は高純度
の抗体を得るのに適しており、後者の方法は抗体の大量
生産に適している。
上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析法、ゲル
過法、アフイニテイークロマトグラフイー等の通常の
手段により精製することができる。
過法、アフイニテイークロマトグラフイー等の通常の
手段により精製することができる。
発 明 の 効 果 本発明によれば、脳心筋炎ウイルス及び正常心臓の房
室弁組織とは反応性を有するか、心筋組織とは反応性を
有しないモノクローナル抗体及び脳心筋炎ウイルス及び
心筋組織とは反応性を有するが、正常心臓の房室弁組織
とは反応性を有しないモノクローナル抗体が提供され
る。本発明抗体の利用によれば、心筋炎及び心筋症に高
い特異性を有する抗原もしくは自己抗体の免疫検定が可
能であり、またかかる特異性の免疫組織化学手法を可能
とし、之等疾患の基礎研究、診断、予知、治療法の検
討、確立等を有効に行なうことができる。
室弁組織とは反応性を有するか、心筋組織とは反応性を
有しないモノクローナル抗体及び脳心筋炎ウイルス及び
心筋組織とは反応性を有するが、正常心臓の房室弁組織
とは反応性を有しないモノクローナル抗体が提供され
る。本発明抗体の利用によれば、心筋炎及び心筋症に高
い特異性を有する抗原もしくは自己抗体の免疫検定が可
能であり、またかかる特異性の免疫組織化学手法を可能
とし、之等疾患の基礎研究、診断、予知、治療法の検
討、確立等を有効に行なうことができる。
実施例 以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げ
るが、本発明は之等に限定されない。
るが、本発明は之等に限定されない。
実施例１ 松森らの方法［Circulation,65（６）,1230−1235
（1982）］に従い、４週齢BALB/cマウスにEMCウイルス
（FL細胞にて作成、100TCD50）を腹腔内に接種し、心筋
炎発症モデルマウスを作成した。
（1982）］に従い、４週齢BALB/cマウスにEMCウイルス
（FL細胞にて作成、100TCD50）を腹腔内に接種し、心筋
炎発症モデルマウスを作成した。
抗体の反応性は、同系正常マウスの心筋組織の凍結切
片を用いた蛍光抗体間接法［免疫生化学研究法、pp102
−105,1986年３月14日、（株）東京化学同人発行］及び
EMCウイルスＭ変異株（凍結融解後の遠心分離上清）を
用いたELISA法により検出した。
片を用いた蛍光抗体間接法［免疫生化学研究法、pp102
−105,1986年３月14日、（株）東京化学同人発行］及び
EMCウイルスＭ変異株（凍結融解後の遠心分離上清）を
用いたELISA法により検出した。
上記マウスの血清抗体（心筋組織反応性抗体）が最も
高い値を示す、ウイルス接種21日後に、マウスから脾臓
を摘出し、得られた脾細胞を骨髄腫細胞p3×63−Ag8.65
3と細胞融合させた。
高い値を示す、ウイルス接種21日後に、マウスから脾臓
を摘出し、得られた脾細胞を骨髄腫細胞p3×63−Ag8.65
3と細胞融合させた。
かくして得られたハイブリドーマを、HAT培地で選別
後、培養上清の抗体活性を、上記方法によりスクリーニ
ングし、陽性ウエルにつき界希釈法によりクリーニング
を繰返し、所望の抗体産生クローンを得た。
後、培養上清の抗体活性を、上記方法によりスクリーニ
ングし、陽性ウエルにつき界希釈法によりクリーニング
を繰返し、所望の抗体産生クローンを得た。
上記で得た所望の抗体産生クローンの代表例２例
につき、それらの特性を下記第１表に示す。尚、表中抗
体のサブクラスは、ELISA法（サンドイッチ法）を用い
て決定した。また、抗体のEMCウイルス又は心筋組織と
の反応性は、上記に記載の方法により調べたものであ
り、弁組織（同系正常心臓の房室弁）との反応性は、同
様の蛍光抗体間接法によった。
につき、それらの特性を下記第１表に示す。尚、表中抗
体のサブクラスは、ELISA法（サンドイッチ法）を用い
て決定した。また、抗体のEMCウイルス又は心筋組織と
の反応性は、上記に記載の方法により調べたものであ
り、弁組織（同系正常心臓の房室弁）との反応性は、同
様の蛍光抗体間接法によった。
また、各クローンの産生する抗体の蛍光像（心筋組織
又は弁組織）は、次の通りであった。
又は弁組織）は、次の通りであった。
クローンNo.III A4（心筋組織）： 心筋組織内に、微細な横紋状に染色性が認められた。
クローンNo.I B5（弁組織）： 弁膜に、著名な染色性が認められた。
尚、クローンNo.III A4の産生する抗体の蛍光抗体間
接法（心筋組織）の結果を、参考写真１（480倍）に示
す。また上記クローンNo.I B5の産生する抗体の結果
（弁組織）を同様に参考写真３（240倍）に示す。更に
上記蛍光抗体間接法（心筋組織）において、本発明抗体
を反応させることなく、二次抗体のみを反応させた対照
では、染色性は認められなかった。この対照における結
果を参考写真４（480倍）として示す。
接法（心筋組織）の結果を、参考写真１（480倍）に示
す。また上記クローンNo.I B5の産生する抗体の結果
（弁組織）を同様に参考写真３（240倍）に示す。更に
上記蛍光抗体間接法（心筋組織）において、本発明抗体
を反応させることなく、二次抗体のみを反応させた対照
では、染色性は認められなかった。この対照における結
果を参考写真４（480倍）として示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
Claims (1)
- 【請求項１】脳心筋炎ウイルスと反応性を有するモノク
ローナル抗体であって、ｉ）IgG2bクラスに属し、正常
心臓の房室弁組織とは反応性を有するが、心筋組織とは
反応性を有しない抗体又はii）IgG1クラスに属し、心筋
組織とは反応性を有するが、正常心臓の房室弁組織とは
反応性を有しない抗体のいずれかであることを特徴とす
るモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62011023A JP2531948B2 (ja) | 1987-01-19 | 1987-01-19 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62011023A JP2531948B2 (ja) | 1987-01-19 | 1987-01-19 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63177799A JPS63177799A (ja) | 1988-07-21 |
| JP2531948B2 true JP2531948B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=11766507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62011023A Expired - Lifetime JP2531948B2 (ja) | 1987-01-19 | 1987-01-19 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2531948B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1374274B1 (en) * | 2001-03-20 | 2006-07-26 | Advanced Electron Beams, Inc. | X-ray irradiation apparatus |
-
1987
- 1987-01-19 JP JP62011023A patent/JP2531948B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，７４［４］（１９８６）Ｐ．８６８−８７２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63177799A (ja) | 1988-07-21 |
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