JPH02303498A

JPH02303498A - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH02303498A
Application number: JP1125567A
Authority: JP
Inventors: Takashi Amegai; 雨貝　孝; Yoshitsugu Matsumoto; 芳嗣松本; Minoru Yamada; 稔山田; Yukio Yoshida; 幸雄吉田; Jiro Imanishi; 二郎今西
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1989-05-18
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 1990-12-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＬＬ上匹見■土１本発明はモノクローナル抗体、詳しくはヒト・ニューモ
シスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓｃａｒｉ
ｎｉｉ　）の栄養型（ｔｒｏｐｈｏｚｏＨｅ）の膜抗原
及び嚢子（ｃｙｓｔ　）の膜抗原に特異反応性を有する
モノクローナル抗体に関する。

【股立且韮ニューモシスチス・カリニは、いわゆる日和見感染病原
体（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｓｔｉｃ　ｐａｔｈｏｇｃｎ）
の−ツテあり、広くヒトや他の哺乳動物等の宿主の肺等
に存在しており、宿主が針車な場合は不顕性感染の形を
とっているが、例えば宿主が抵抗力の弱い小児、先天的
免疫不全児や白血病やその他の癌の治療のためステロイ
ド剤や制癌剤等の１Ω与を受けている場合、また自己免
疫疾患のため免疫抑制剤の長ｒＦ１投与を受けている場
合に免疫能が低下するために、肺胞内で急激に増殖して
顕在化し、極めて小筒な肺炎にニュー［シスチス・カリ
ニ肺炎）を発症さぼる。この肺炎の診断は通常極めて困
難であり、その確定診断は間胸肺生検、閉鎖的肺生検、
気管支鏡生検等の生検によらねばならず、かかる生検は
患者にとり大変なｌ！韓及び菖蒲を与え、川篤な患者で
は困難である。この様な現状からより安全に且つ♀朋に
確実に上記肺炎の診断を行なうための免疫血清学的診断
法の確立が要望されており、補体結合反応を利用する方
法や蛍光抗体法等の患者血清中の抗体を検索する技術が
報告されているが、本肺炎患者自体の免疫能低下が発症
原因の主なものであるため満足な結果は得られていない
。また近年上記免疫学的診断のための純粋な抗原を作製
するための集シスｈ法やシスト純化法が確立され［猪飼
ら、寄生生学雑誌、第２８巻、第２号、第７１〜８０頁
（１９７９年）］、これにより（すられる抗原を用いた
オクデロニイ（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法や免疫電気
泳動法による抗体の検索技術が訳みられた［灰塚ら、広
大医誌、２７：　　３１５〜３２６．１９７９］。

しかし尚診断法としての好成績【よ１ｑられていない。

発明が解決しようとする課題上記現状に鑑み、本発明者らもニューモシスチス・カリ
ニ肺炎を早期に確実にしかも安全に診断できる免疫学的
診断法の確立を目的として鋭意研究を重ねた結果、誘発
喀痰中のど１〜・二ｌ−モシスチス・カリニ由来抗原と
の特異選択的反応性をｆｉシ、該抗原の検出・測定に有
効な特定のｔツクロープール抗体の作成に成功し、ここ
に本発明を完成するに至った。

課題を解決するための手段即ち本発明は、ヒト・ニューモシスチス・カリニ由来抗
原で免疫した哺乳動物の免疫ＩＢＫｉと哺乳りＪ物の骨
髄腫細胞との融合４Ｉ胞（ハイブリドーマ）により産生
され、ヒト・ニューモシスチス・カリニの栄改を膜抗原
及び嚢子膜抗原に特異反応性を打することを特徴とづる
モノクローナル抗体に係る。

本発明のモノクローナル抗体は、後記に詳述する通り、
特定の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合により作成さ
れ、選別されたハイブリドーマのｉＳＭにより（７られ
ること及びヒト・ニューモシスチス・カリニの栄養型膜
抗原及び嚢子膜抗原と特異的に結合することを特徴とす
る。

上記本発明モノクローナル抗体は、その特異性を利用し
て、各種免疫測定法における特異抗体どして利用でき、
これにより部用な操作で容易迅速且つ安全に、しかも高
精度、高感度で正確に特定抗原の定情を可能とし、かく
してヒト・ニューし一シスデス・カリニ肺炎の早期詮所
技術を提供できる。

以下、本発明モノクローナル抗体の製ｊΔ法につき３Ｔ
述する。

本発明モノクローナル抗体は特定の融合細胞により収得
される。該融合細胞を得るための一方の親細胞としては
、ヒト・ニューモシスチス・カリニ由来抗原で免疫した
哺乳動物の免疫細胞を用いる。該免疫細胞は、ヒト・ニ
ューモシスチス・カリニ由来抗原を免疫抗原として用い
て通１贋の方法に従い調製される。ここで免疫抗原とし
てはヒ１〜・ニューモシスチス・カリニ病原体自体シス
トであってもよく、該病原体で感染した吐乳動物の感染
組織例えば肺組織やその精製物であってもよく、更には
之等のフラグメントをハブテンとして通常の方法に従い
担体と結合さＶたものであってもよい。特に好ましい免
疫抗原としてはヒト・ニュー上シスチス・カリニ感染叩
乳動物の肺よりシスト耗化法に従って集めたシスト又は
該シストの膜成分分離上清を挙げることができる。また
上記免疫抗原で免疫する吐乳動物としては特に限定はな
いが、細胞融合に用いる他方の親細胞とする骨Ｗ１１１
！細胞との適合性を考處して選択されるのが望ましく、
一般にはマウス、ヌードマウス、ラットなどを使用する
のがよい。免疫方法は一般的手法に従うことができ、例
えば上記免疫抗原を通常の緩衝液や生理食塩水に懸濁さ
せたものあるいはこれとフロイントの補助液等との混合
液を吐乳動物に腹腔内、皮下等の適当な経路で投与して
一次刺激後、必要に応じて同様の操作を繰返せばよい。

免疫抗原の投与量は、該抗原の種類、投与経路、吐乳動
物の種類等に応じて適宜決定されるが、該抗原としてシ
ストの膜成分分離上清を用いてこれをマウスに腹腔内投
与する場合は、通常総１す与最が１回あたり１９埒〜Ｉ
ＦＦ／マウス程度とするのがよく、病原体自体（シスト
）を同様に用いる場合１よ、通ｆｆ１ｌｌＱ与ｆｆｉ　
１　回アタ’）約Ｉ　Ｘ　１０　〜ｉ　ｘ１０６ｆｌ！
Ｊ／マウスとするのが適当である。引続く細胞融合に用
いる免疫細胞は、上記最終投与の約３日後に摘出した牌
臓細胞が好適である。

またＦ記免疫細胞と融合させる他方の親綱１１１として
の骨髄Ｉｌ！細胞（ミエローマ細胞）どしては、既にＩ
Ｘｔ立されている公知の各種１胞株、例えばマウスに３
３けるＮ５１−八ｇ　４／１　［Ｅｕｒ、Ｊ、ｌｍ１ｕ
ｎｏ１．．６：５１１−５１９　（１９γ６）Ｊ、　Ｐ
３　（Ｐ３ｘ　６３八ｇ　８．６．５．３３　［Ｎａｔ
ｕｒｅ。

２５６．４９５−４９７　　（１９７５）ｌ、　Ｐ３−
０１（Ｃｕｒｒｅｎｔ　　Ｔｏｐｉｃｓｉｎ　　Ｈｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ、８１：１−１−７（１９７］、ＨＰＣｌｌ−４
５，６ＴＧｌ、７［Ｃｃｌｌ、８：４０５−４１５　　
（１９７６）］　　、’５Ｐ２１０−八ｏ１４　　［Ｎ
ａｔｕｒｅ、２７６：２６９−２７０（１９７８）］　
　、　ＦＯ［Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．Ｈｅｔｈ、、３５：ｌ−２１（１９８
０）］、Ｘ　　Ｇ３．６．５．３　［ＪＩｍｍｕｎｏｌ
、、１２３：１５４８−１５５０　　（１９７９］］　
　、５１９４１５ＸＸＯＢＵ、　ｌ［Ｊ、　Ｅｘｐ、　
Ｈｅｄ、　、　１４８：３１３−３２３（１９７８）］
、Ｘ４５等や、ラットにおける２１０．　ＲＣＹ３．八
ｇ１．２．３［Ｎａｔｕｒｅ。

２７７：１３１−１３３　（１９７９］］　、　Ｙ３．
　Ａｇ１．２．　’３等をいずれも使用できる。

上記免疫１１Ｉ胞と骨髄腫細胞との融合反応は、基本的
には公知の方法、例えばオイ（Ｏｌ）及びヘルツエンベ
ルブ（ｌｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　）の方法［Ｓｅ！ｅｃｔ
ｅｄＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ、　３５１−３７１．Ｗ、ＩＩ。

Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、ＵＳ＾出版（１９８０）
　］等に準じて、融合促進剤としては通常用いられるポ
リエチレングリコール（ＰＥ（６）やセンダイウィルス
（ＨＶ　Ｊ　）等を使用でき、更に所望により融合効・
率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添
加使用することもできる。免疫細胞とｆ）ｆｆＪｉ肝細
胞どの使用比は、通常の方法と変りがなく、例えば骨髄
腫細胞に対し、免疫細胞を約１〜１０倍用いればよい。

上記融合時の培地としては、この種の細胞培養に使用さ
れる通常の各種栄養培地をいずれも使用できる。その代
表例としては例えばＲＰＭＩ−１６４０培地、その他ダ
ルベツコ改賀ＭＥＭ培地笠を例示でき、２等培地に【よ
通常用られるように例えば牛胎児血清（Ｆｅ２）、非必
須アミノ酸混合液、ピルビン酸すトリウム、２−メルカ
プ１〜エタノール等の血液補液を添加しておくこともで
きる。融合は、上記免疫細胞と骨髄ルｒ＋細胞との所定
けを血清を含まない上記培地内でよく混ぜて遠沈し、上
清を除去した後、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ、例
えば平均分子８約１０００〜６０００のものを、培地に
約３０〜６０％（Ｗ／Ｖ）の１度どなるように加えたも
のを細胞の沈渣に滴下して混ぜ合づことにより行なわれ
る。これを３７℃で６０秒ないし数分間反応させ。

適当な培地を逐次添加して１０分＠接室温におき遠沈し
、上清を除去する操作を行なうことにより、所望のハイ
ブリドーマが形成される。

得られた所望ハイブリドーマの分離は、通常の選択用培
地、例えばトＩＡＴ１ａ地（ヒボキサンチン、ミノプテ
リン及びチミジンを含むＪ？１ｊｆｉ　）を用いて行な
われる。該ＨＡＴ培地での細胞培養は、ハイブリドーマ
以外の細胞（未融合細胞）が死滅ガるのに充分な時間、
通゛常数日〜数週間を要して行なわれる。本発明におけ
る上記ハイブリドーマの選択は、好ましくは、上記１（
ＡＴ培地での培ａ後、更にＪ８差物をＨＴ培地（ヒボキ
サンチン及びチミジンを含む培地）で数日〜数週間ｊ８
７！することにより行なわれる。

かくして（ｑられるハイブリドーマについて、通常の限
界希釈法に従い、［ｉ的とする抗体の産１株の検索及び
単一クローン化を行なう。該［１的抗体産生株の検索は
、ニューモシスチス・カリニ栄養型又は貰子の細胞膜に
対する交ｎ反応性を模式１することにより実施される。

イの方法【よ例えば［しＩＳＡ　法　［Ｅｎｇｖａｌｌ
、［、、Ｈｅｔｈ、［ｎｚｙｍｏｌ、、　　７０．　４
１９−４３９　（１９８０）］　、プラーク法、スポッ
ト法、凝集反応性、オクテロニイ法、ラジオイムノアッ
セイ（ＲＩＡ）法等の一般の抗体の検出に利用される各
種方法に従うことができる（［ハイブリドーマ法とモノ
クローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、
ｐｐ３０〜５３、昭和５７年３月５日）。

より具体的には、ニューモシスチス・カリニ感染吐乳動
物の肺をシスト純化法［猪飼はが、寄生史学雑誌、第２
８巻、第２号、第７１−８０頁（１９７９年）］にて精
製したものを、例えばコレステロール、レシチン等を用
いてプレートにコーティング（塗抹）し、該プレート上
で上記ニューモシスチス・カリこと被検抗体（上記バイ
ブリド−７の培養土ｍ）とを反応させ、この反応物の存
在を、通常の方法例えば前記融合にマウスの細胞を用い
た場合は、ＦＩＴＣ（フルオレッセインイソヂＡシアナ
ート）−抗マウスγ−グロブリンを用いた蛍光抗体法等
によりｖ１１認する（上記反応物は蛍光色素により染色
される）。°上記ハイブリドーマの分離及び［１的抗体
産生株の検索操作（１、これらを数回繰返して行なうの
が望ましく、これにより目的Ｆτ体産生株の単一クロー
ン化を行ないＬ７る。

かくして得られる目的抗体産生株（ハイブリドーマ）は
、通常の培地で継代培養でき、また液体窒素中で容易に
長期間安定に保存することができる。

該ハイブリドーマの例としてはＴｌ−５、Ａ　２０〜１
０、Ｄ６−１、Ｆｌｌ−２８を挙げることができる。こ
れらのハイブリドーマは、工業技術院微生物工業技術研
究所に平成元年５月１２日付で寄託され、それぞれ受託
番号：微工仙菌奇第１０７１６．１０７１７゜１０７１
８及び１０７１９号が付与されている。

１記ハイブリドーマからの本発明モノクローナル抗体の
製造は、常法に従い該ハイブリドーマを培養し、培養上
清から分館ｉする方法、あるいは上記ハイブリドーマを
これと適合性のある吐乳ｆｌＪ物に投与し、Ｉ！Ｊ殖さ
せ、該動物の腹水より分離づ′る方法等の通常の方法に
より実施できる。前者の方法は特に高純度のものを得る
のに適しており、後者の方法は大旦産生に適している。

上記で製造された本発明のモノクローナル抗体（よ、更
に精製することもでき、例えば硫安分画法、ＤＥＡＥセ
ルロースカラムクロマトグラフィーなどのグル濾過法な
どの通常の分離手段によりＩｇ両分をｉｌｉ　［１する
ことにより本発明のモノクローナル抗体を収得できる。

かくして得られる本発明モノクローナル抗体は、後記す
る通り、ヒト・ニューモシスチス・カリニの栄養１′！
及び貰子の細胞膜抗原と特異選択的に反応′ＩＪるもの
であり、その利用によってニューモシスチス・カリニ肺
炎の診断、治療等に有用なものである。

以下本発明を具体的に説明するために実施例及び試験例
を記載するが、本発明はそれに限定されるものではない
。

実施例（１）ヒト・ニューモシスチス・カリニ抗原の調製ヒト
・ニューモシスチス・カリニ感染ヒト肺よリシスト純化
法に従いシストを分離精製し、これを生理食塩水に　１
％（Ｖ／Ｖ）となるように懸濁した。

（２）免疫化上記（１）で調製した懸濁液（抗原液）の１容量部を同
最のフロイント完全アジュバントと混合してエマルジョ
ンとし、その１−を８ＡＬＢ／Ｃ系マウスの腹腔内に投
与し一次抗原刺激とした。該−次抗原刺激の４０日後に
、同一の抗原液の１＃１１！を単独に投与して、二次抗
原刺激とし、その３日後のマウスの牌１１ａ細胞を免疫
細胞とした。

（３）細胞融合上記（２）で免疫したマウスの牌臓細胞を取りだし単細
胞浮遊液を調製した。該牌臓細胞及びマウスミエローマ
細胞（Ｐ３ｘ　６３．八ｇ８／６．５．３）を１：２と
なるように混合し、イーグルＭＥＭ培地で洗浄後、遠心
分離し、沈渣に５０％ボリエヂレングリコール（ＭＷ４
０００）を滴下し、３７℃で９０秒間インキュベートし
て、３７℃ｆ７）ＲＰＭ　Ｉ　−１６４０培Ｊａヲ２０
１ｄ滴下した後、１０分間放置して融合懸濁液を得た。

予め３時間前にフィーダーとして正常マウスＭ　ｒＪａ
　ｌ　Ｉｌａを９６穴マイクロプレートの各ウェルに、
！１Ｘ１０５個／ウェルとなるように蒔種調製した。

これに上記融合細胞懸濁液０．１ｄ　（２Ｘ　１０”　
ｌｉｌ胞／ウェル）をＨＡＴ選択培地（１０−４Ｍヒボ
キサンチン、４ｘ１０　　Ｍアくノブテリン、１．６Ｘ
　１０−５Ｍチミジン及び１０％ＦＣ５を含むＲＰＭ　
Ｉ　１６４０培地）に懸濁したものを加え、２〜３１］
間隔で各ウェルの１」Ａ丁培地の半量を交換しながら細
胞を増殖させた。２週間後置ウェルの培地をＩ−Ｉ　Ｔ
培地（１０−’Ｍヒボキサンヂン、１．６Ｘ　１０’Ｍ
チミジン及び１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ　ｌ−１６４０
培地）に交換し、更にｉｕ間細胞の増殖を行わせ、次い
で増殖細胞を２４穴プレートに移し、１０％ＦＣ３を含
むＲＰＭｊ　−１６４０培地にて７口開培養をＲ１続し
て、融合細胞の一次スクリーニングを行なった。該スク
リーニングは培養上清を用い、後記する塗床標本による
蛍光抗体法にて、特にヒト・ニューモシスチス・カリニ
の嚢子膜抗原に強い蛍光を与え、かつ栄養型膜抗原にも
蛍光を与えるウェルのｌｌｌ１胞を選び出した。

上記スクリーニングにより選択された各ウェルの細胞を
、次いで上記と同様にフィーダーを加えた９６穴プレー
トの各ウェルに平均０，３個／ウェルで蒔き、１０％Ｆ
Ｃ８を含むＲＰＭＩ−［４０培地で２週間培養し、培養
された２５ウエルの細胞を上記と同様のスクリーニング
操作に供し二次スクリーニングして、ヒト・ニューモシ
スチス・カリニの五子膜抗原に強い蛍光を与え、かつ栄
養型膜抗原にも蛍光を与える１８ウエルの細胞を（りた
。

（４）スクリーニング（塗抹標本による蛍光抗体法）無
蛍光スライドグラス（ＨへＴＳＵＮＩ旧、ＩＮＤ、　、
　Ｌｉｄ、）に、ヒト・ニューモシスチス・カリニ感染
ヒト肺からの試料を塗抹し、１０〜２０分乾燥後、該ス
ライドグラスに３７℃下に７セトンを１０分間接触竹用
させた。同温度で３０分間乾燥１０、スライドグラス上
を冷すンｌ！ｌ塩ａ衝液（以下ｒＰＢｓＪと略す）で３
〜４回洗浄し、これに前記（３）の各ウェル内培養細胞
上清１００庫を滴下接触させ、モイストチェンバー内で
３１℃下１時間放置して反応させた。次いで上記スライ
ドグラスを４℃下に冷ＰＢＳで１時間を要して頻回にＰ
ＢＳを交換しつつ洗浄した後、これにＰＢＳで２０倍希
釈したＦＩＴＣラベル−ウナギ抗マウス免疫グロブリン
抗体（ＤＡＫＯ社５ｆｆ）　　０．１ａｉ！を滴下し、
■イストヂエンバー内で３１℃下１時間放置して反応ざ
Ｉた。更に上記と同様にＰＢＳを頻回に交換しつつ冷Ｐ
ＢＳで４℃下に１時間を要してスライドグラス上反応物
を洗浄し、グリセリン−ＰＢＳ　（９：　１重り比）混
液１滴を加えて反応物を封入し、このスライドグラスに
つき、蛍光顕ｍ鏡下で蛍光の６無乃至強度を鏡検し、強
い蛍光の見られるものを陽性゛としてスクリーニングし
た。

上記操作はニューモシスチス・カリニ感染マウス及びラ
ッ］・の由来の塗抹標本を用いても同様にして実施した
。また対比のため正常組織由来の肺の塗抹標本を５作成
して同様に行なった。

（５）モノクローン細胞株による本発明上ツク［］−ナ
ル抗体の製造 ■）上記（４）のスクリーニング操作によりヒト・ニュ
ー［シスデス・カリニ抗原に対し反応し、マウス及びラ
ット・ニューモシスチス・カリニ抗原に対し殆ど反応し
ない抗体を産生じているつ１ル内のＩ［Ｉ胞（Ａ２０−
１０　、　ＤＧ−１、Ｆｌｌ−２８、Ｉ　１−５）を１
０％ＦＯ８を含むＲＰＭ　ｒ　−１６４０培地で培古し
、その１×１０７個を１週間前にブリステン（Ｐｒｅｓ
ｔｅｎｅ、アルドリッチ社製）　　０．５ｒｒｄ！を腹
腔内に投与したＢＡＬＢ／ｃ系マウスのｌ１ｕｌＷ内に
投与し、１週間後より３日おきに腹水を採取することに
より本発明のモノクローナル抗体を得た。

以下、本川ｍｉｇにおいて、本発明モノクローナル抗体
を、それを産生ずるモノクローンｌ１ｌｌ胞株（ハイブ
リドーマ）と同一名称で呼ぶことにする。

■）上記で製造された七ツクローナル抗体Ｆ１１−２８
の２０ａ２に最ＩＩ　１８度３３％になるように飽和硫
酸アンモニウムを加えて、４℃で一谷夜攪拌した優、遠
心法１２　（１０，ＯＯＯｒｐｍ　３０分間）して分離
し、沈澱をＰＢＳに溶解し、ＰＢＳで４日間透析してマ
ウスの免疫グロブリン分画を得た。

Ｉ［１）ｋ記■）と同様にして、抗体Ａ　２０−１０、
ＤＧ−１及び１１−５についても、マウスの免疫グロブ
リン分画を（ｑた。

試験例（１）免疫グロブリンのクラスの同定上記実施例で得た各モノクリ−ナル抗体のクラスまたは
サブクラスを、ウサギで作成された抗マウス１ｇクラス
特異抗体（マイルズ社￥Ｊ）を用いてオクテロニイ法に
従い検討した。

その結果、本発明モノクローナル抗体Ａ　２０−１０は
ＩＱＧ　　、ＤＧ−１はｌ　ｇＭ　、−Ｆ　１１−２８
はＩ　Ｑ　ｆｖｌ、１１−５はＩｑＧ２ｂであることが
ＩＩｇ認された。

（２）免疫グロブリン軽ｔｒｉ　（Ｉｉｇｈｔ　ｃｈａ
ｉｎｌの同定上記実施例で得られた各Ｌツクローナル抗
体の軽鎖のクラスを、ウサギ抗マウスに鎖抗体を用いて
、オクテロニイ法に従い検討した。

その結果、本発明モノクローナル抗体Δ２０−１０、Ｄ
Ｇ−１、Ｆｌｌ−２８および１１−５の軽ｔｎｌ（ｉに
ぐあることがＷ認された。

（３）シスト標本を用いた蛍光抗体法による解析ヒト、
ラット、マウスのニューモシスチス・カリニのシスト標
本に対する本発明のモノクロ−ナル抗体及び特開昭６０
−２３９４”２６号公報記載のしノク臼−ナル抗体の反
応特異性を、前述した蛍光抗体法にｔｌＦ、じて検討し
た。反応の強さは抗体の希釈倍率で表現した。

本発明の抗ヒト・ニューモシスチス・カリニ・Ｌツク［
」−ナル抗体Ｆ　Ｎ−２８はヒ１〜・ニューモシスチス
・カリニには強＜　（Ｘ１５６２５侶）反応づるが、ラ
ット及びマウス・ニューモシスチス・カリニにははと／
νど反応しなかった（Ｘ５．ｘ５倍）。

抗うッ１〜・二〕−シシスチス・カリニ・七ツクローフ
ル抗体（八ＲＰＣ−３４）はラット・ニューモシスチス
・カリニには強＜　（Ｘ　１５Ｇ２５倍）反応するが、
ヒト及びマウス・ニューモシスチス・カリニにはｔＪと
んど反応しなかった（−、Ｘ５倍）。抗マウス・二：１
−モシスチス・カリニ・モノクローナル抗体（ＡＨＰＣ
−ｌＮ２−８）ではマウス及びラット・ニューモシスチ
ス・カリニに強く反応（Ｘ　３＋２５倍）づるが、ヒ１
〜・ニューモシスチス・カリニには弱い反応（Ｘ５倍ン
しか見られなかった。

（４）ウェスタン・プロット・アツヒイ試料調製パーコ
ール密度勾配法によりじト、ラットおよびマウスのニュ
ーモシスチス・カリニのシストを分離精製した。これを
そのまま又はザイモリアーぎ（ｚｙｍｏｌｙａｓｃ　：
キリン麦酒社製）で処理したものを、０．０１％ブロモ
フェノールブルーを含有づる２％ＳＯ８，０，１Ｍジチ
オスレイト−ル［ＤＤＴ］、１０％グリセリン含右０．
ＩＩＶｌリス−塩酸緩衝液［ｐＨ６，８］中で１００℃
２分間加熱処理した。

乞Ｌ１久盗１上記で調製した試料の９％アクリルアミドゲルを用いる
ドデシルｋｌす１−リウムーポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、不連続ＳＤＳトリスー
グリシン緩衝液系を用いて行った［　Ｌａｅｍｍｌ　ｉ
、　ｕ、　Ｋ、　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．６８０
−６８５（１９７０）］。

イムノブロッティング雷気泳動的移行払［Ｔｏｗｂｉｎ、　１１、等　Ｐｒ０
Ｃ，Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（Ｕ、Ｓ、八、）　７６．４３５
０−４３５４（１９７９）］を用いＣ上記のＳ　Ｉ）　
Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅゲルからニトロセルロースへのプ
ロッティングを２０％メタノールを含む１−リス−グリ
シン緩衝液系で行った。二ｌヘロセルロース膜をＰ　［
３Ｓで洗浄模、ブロックエース（実印ｆｌ、業社製）を
用いてブロックした。ＰＢＳで洗浄した後、抗ヒト・ニ
ューモシスチス・カリニ抗体を２０％ブロックエースを
含むＰＢＳで１００侶に希釈して、〒温にて６０分間反
応した。０．０５％トウイー　ン２０　（Ｔｗｅｅｎ　
２０）を含むＰＢＳで４回洗浄した後、ヨード１′２５
で標識した抗マウスに鎖１ｇＧ（ヤギ）を２０％ブロッ
クエースを會むＰＢＳで２００倍に希釈して空温にて３
０分間反応した。０．０５％トウィーン２０を含むＰＢ
Ｓで洗浄した後、オートラジオグラフィーを行った。分
子量測定の基準マーカーは、レインボーマーカー（アマ
−ジャム社製）を用いた。

その結宋、抗ヒト・ニューモシスチス・カリニモノクロ
−プル抗体Ｆ　１４−２８は、ヒト・ニューモシスチス
・カリニ由来の試料に対しては約８０にの分子量に相当
する位置で反応したが、ラットおよびマウス・ニューモ
シスチス・カリニ由来の試料では反応しなかった。

抗ラット・ニューモシスチス・カリニ抗体ＡＲＰＣ−３
４は、ヒト・ニューモシスチス・カリニ由来の試料に反
応しなかったが、ラッｊ・ニューモシスチス・カリニ由
来で、ザイ［リアーゼ処理したムのに対しては約１００
Ｋ、約７５におよび約６１にの分子量に相当する位置で
反応し、ザイ七すアーゼ処Ｉ１１！ｌなしでは約１２０
におよび約５２にで反応した。また、マウス・ニューモ
シスチス・カリニ由来の試料に対しては、ザイモリアー
ゼ処理したものでは反応しなかったが、ザイモリアーゼ
処理なしでは、約１２５Ｋ、約７５におよび約５６にで
反応した。

抗マウス・ニューモシスチス・カリニ抗体へＮＰＣ−１
１Ｅ１２−８は、ヒト・ニューモシスチス・カリニ由来
の試料に反応しなかったが、ラット・ニューモシスチス
・カリニ由来の試料でザイモリアーゼ処理なしでは約６
２にで反応し、ザイモリアーゼ処理したものでは反応し
なかった。マウス・ニューモシスチス・カリニ由来の試
料で、ザイモリアーゼ処Ｉ１１！　＜ｔ　Ｌでは約１２
０におよび約５８にで反応し、ザイモリアーゼで処理し
たものでは、約７８におよび約６３にで反応した。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト・ニューモシスチス・カリニ由来抗原で免疫
した哺乳動物の免疫細胞と哺乳動物の骨髄腫細胞との融
合細胞により産生され、ヒト・ニューモシスチス・カリ
ニの栄養型膜抗原及び■子膜抗原に特異反応性を有する
ことを特徴とするモノクローナル抗体。
（２）前記哺乳動物がマウスであることを特徴とする請
求項１記載のモノクローナル抗体。
（３）前記ヒト・ニューモシスチス・カリニ由来抗原が
、ヒト・ニューモシスチス・カリニ感染ヒト肺よりシス
ト純化法に従い分離精製したシストであることを特徴と
する請求項１又は２のいずれか一項に記載のモノクロー
ナル抗体。
（４）前記融合細胞がＩ１−５であることを特徴とする
請求項１記載のモノクローナル抗体。
（５）前記融合細胞がＡ２０−１０であることを特徴と
する請求項１記載のモノクローナル抗体。
（６）前記融合細胞がＤ６−１であることを特徴とする
請求項１記載のモノクローナル抗体。
（７）前記融合細胞がＦ１１−２８であることを特徴と
する請求項１記載のモノクローナル抗体。