KR100979070B1 - 사람 기원의 병원성 프리온을 특이적으로 검출하는 항체및 당해 항체를 사용하여 수행되는 검출 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 기원의 병원성 프리온을 특이적으로 검출하는 항체 및 병원성 프리온을 검출하는 방법을 기재한다. 특히, 본 발명은 제1의 천연 비병원성 입체형태, 즉 PrP^c 및 제2의 병리학적 입체형태, 즉 PrP^Sc를 함유하는 PrP 단백질을 함유하는 체액 샘플 중에서 사람 기원의 프리온 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체에 대한 결합 친화성면에서 상이한 병원성 프리온 단백질을 검출하는 입체형태-의존성 면역검정법을 기술하며, 당해 검출 방법은 다음 단계를 포함한다:

a) 고체 지지체에 고정되어 있고 제1 프리온 단백질 입체형태에 대해 보다 높은 친화성을 나타내는 상기한 모노클로날 항체 중의 하나를 샘플의 제1 부분에 첨가하여, 제1 농도를 측정하는 단계;

b) 샘플의 제2 부분을 모노클로날 항체에 대한 프리온 단백질의 제2 입체형태의 결합 친화성이 증가되도록 처리하는 단계;

c) 모노클로날 항체를 조사할 샘플의 처리된 제2 부분에 첨가하여, 제2 농도를 측정하는 단계 및

d) 제1 프리온 단백질 농도를 제2 프리온 단백질 농도와 비교하여, 병원성 프리온 단백질 입체형태의 존재를 확인하는 단계.

사람 기원의 병원성 프리온, 입체형태-의존성 면역검정법, 모노클로날 항체, 고체 지지체, 결합 친화성

Description

사람 기원의 병원성 프리온을 특이적으로 검출하는 항체 및 당해 항체를 사용하여 수행되는 검출 방법{Antibodies for specifically detecting pathogenic prions of human origin, and detection methods carried out using these antibodies}

도 1: 사람 프리온-단백질에 대한 본 발명에 따르는 항체의 결합. 다양한 종의 균질화된 뇌를 SDS-PAGE로 분리하여, 나일론-막으로 전이시킨다. 다음, 모노클로날 항체 6H4(Prionics, 상단 도면) 및 이와 병행하여 본 발명의 항체 DSM ACC 2522(하단 도면)를 사용하여 웨스턴-블롯을 수행한다. 결합된 항체를 포스파타제 결합된 제2 항체에 의해 검출한다. 레인 1: 분자량 기준; 레인 2: 랫트; 레인 3: 사람; 레인 4: 아프리카 베르베트 원숭이; 레인 5: 시리아 골든 햄스터; 레인 6:소.

도 3: 사람 프리온-단백질에 대한 본 발명에 따르는 항체의 결합. 사람의 병원성 프리온-단백질 PrP^Sc를 변성시키고, 이를 미세역가 플레이트에 고정화시키기 전에, 이를 DTT의 첨가에 의해 환원시키고, 요오도아세트아미드로 메틸화시킨다. 또는, 이를 DTT의 첨가에 의해 환원시키고, 글루타치온으로 산화시키거나, DTT로 환원시키고, 공기(O₂)로 산화시킨다. 다음, 고정화된 프리온 단백질을 본 발명의 세포주 DSM ACC 2523의 항체와 함께 배양한다. 결합된 항체를 형광 표지된 제2 항체에 의해 검출한다. TRF: 시분해 형광(time-resolved fluorescence). 프리온-단백질 중의 디설파이드-가교를 환원시키는 것은 형광의 손실을 야기하며, 이는 항체 결합의 소실을 의미한다.

본 발명은 사람 기원의 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 및 병원성 프리온, 특히 해면상 뇌증의 병원체를 검출하는 방법에 관한 것이다.

프리온 질환, 예를 들어, 크로이츠펠트-야콥병(CJD: Creutzfeldt-Jakob disease)은 선천적인 유전자 결함의 결과로서 발병할 수 있거나, 아직까지 완전히 파악되지 않은 감염 경로에 의해 후천적으로 걸릴 수 있다. 또한, 이러한 질환들은 또한 프리온 단백질에 대한 유전자에서의 체세포 돌연변이가 원인이 되는 것으로 추정되는 특발성, 소위 산발성 형태로서 발생한다[참조: Prusiner, Proc. Natl. Acad. Scie U.S.A., 95, 13363-13383 (1998)]. 감염의 의원성 경로는, 예를 들어, 프리온-오염된 성장 호르몬 또는 성 호르몬으로의 처리 또는 각막 및 뇌막 이식의 결과로서 발생한다. 또한, 적합하게 멸균되지 않은 수술 기구의 사용은 감염의 가능한 원인을 구성한다.

크기가 33 내지 35kD인 프리온 단백질(PrP로 약기)은 천연의 생리학적 이소형태(PrP^c) 및 병리학적으로 감염성인 이소형태(PrP^Sc)로 나타나고, 감염성 이소형태는 2차 및 3차 구조의 재-폴딩(re-folding)의 결과로서 비감염성인 생리학적 형태로부터 생성된다. PrP^Sc는 아마도 프리온 질환의 전파 및 발병기전의 원인이 되는 프리온의 유일한 물리적 성분일 가능성이 매우 크다[참조: Prusiner, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 13363-13383 (1998)].

프리온 단백질이 부분적 단백질분해에 영향을 받는 것으로 문헌[참조: Prusiner et al., Cell 38, 127 (1984) 및 Biochemistry 21, 6942 (1982)]에 의해 이미 개시되어 있다. 이후, PrP^c가 거의 완전하게 단백질분해에 영향을 받는 반면, PrP^Sc는 단지 27 내지 30kD의 크기로 분해될 수 있는 있는 것으로 밝혀졌다. 추가의 단백질분해에 영향을 받지 않는 이러한 단백질 단편은 프로테아제-내성 코어, 즉 간단히 PrP^27-30으로 칭한다. 이는 NH₂ 말단에서의 약 67개 아미노산 분해의 결과로서 생성되고, 결과적으로 약 141개 아미노산으로 구성된다.

또한, 병리학적 프리온 이소형태를 검출하는 방법이 이미 기술되어 있다. 즉, 예를 들어, 문헌[참조: Barry and Prusiner J. Infect. Dis. 154, 518-521 (1986)]에는 항-프리온 단백질 모노클로날 항체(MAB) 13A5를 사용하는 웨스턴 블롯 검정이 기술되어 있다. 햄스터 PrP에 특이적인 이들 MAB는 이질-감염된 햄스터로부터 분리된 정제되고 변성된 PrP^27-30으로 면역화된 마우스로부터 수득된다.

MAB 13A5와 유사한 기타 항체는 PrP^c 및 PrP^Sc 둘 다에 대해 지시되나, 단 후자는 변성된 형태로 제공되며, 이들은 또한 이미 기술되어 있다[참조: 미국 특허 제4806627호]. 또한, 면역화는 문헌[참조: Zanusso et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 8812-8816 (1998)]에 기술된 바와 같이 세균내에서 발현된 재조합 프리온 단백질을 사용하여 수행되었다. 또한, 문헌[참조: Harmeyer et al., J. Gen. Virology, 79, 937-945 (1998)]에 기술된 바와 같은 펩타이드 면역화에 의해 및 문헌[참조: Krasemann et al., J. Biotechnology, 73, 119-129 (1999)]에 설명된 바와 같은 핵산 면역화에 의해 모노클로날 항체를 제조하는데 성공을 이루었다.

웨스턴 블롯팅 이외의 이들 항체의 또 다른 응용, 즉 ELISA(효소 결합 면역흡착 검정법)으로 불리는 것이 문헌[참조: Wisniewski et al., 미국 특허 제4806627호]에 언급되어 있다. 이러한 ELISA에 있어서, 미세역가 플레이트 상에 고정되어 있는 프리온을 MAB 3F4에 의해 결합시킨 다음, 상기 후자 항체를, 결합되어 있는 효소에 의해 염료 반응을 촉매화하는 제2 항체를 사용하여 검출한다.

이러한 모든 검출 방법에 있어서, 샘플을 효소 프로테이나제 K로 예비처리하여, 샘플 중에 존재하는 임의의 정상 프리온 단백질을 제거하고, 그 결과, 항체는 또한 물론 정상 프리온 단백질과도 고도의 친화성으로 결합할 수 있기 때문에, 검출된 것이 프로테아제-내성 병원성 프리온 단백질임을 확인한다.

그러나, 요구되는 노동 집약성 및 시간 집약성으로 인해, 전기영동 및 막, 특히 니트로셀룰로스 막 상에서의 고정화에 의한 분리, 및 항-PrP 항혈청을 이용한 후속적인 측정을 포함한 이전에 기술된 방법은 통상적인 시험을 위한 방법으로서 적합하지 않다. 따라서, 해면상 뇌증의 가능한 전파에 의해 집단에 많은 위협이 가해지기 때문에, 예를 들어, 사람 및 가축 진단학에서 체액 및 조직 샘플에서의 병리학적 프리온 이소형태를 정성적으로 및 정량적으로 검출할 수 있는, 프리온의 신속한 검출 방법이 강력하게 요구된다.

최종적으로, 샘플 중에서 프리온 단백질의 병원성 입체형태를 검출하는데 사용할 수 있는 검출 방법은 국제 특허 공개공보 제WO 98/37411호에 이미 개시되어 있다. 당해 방법에 있어서는, 샘플을 2개의 부분으로 분할하고, 제1 부분을 고체 지지체에 결합시킨 다음, 표지된 항체와 접촉시킨다. 이러한 항체는 비변성된 병원성 형태의 단백질에 결합하는 것보다 높은 친화성으로 비병원성 형태의 프리온 단백질에 결합한다. 다음, 샘플의 제2 부분을, 병원성 프리온 단백질의 입체형태를 변화시킴으로써 상기 표지된 항체에 대한 병원성 프리온 단백질의 접근가능성 및 결과적으로 친화성을 현저하게 증가시키는 처리에 적용시킨다. 다음, 이러한 방식으로 처리된 샘플의 제2 부분을 제2 지지체에 접촉시키고, 표지된 항체와 반응시킨다. 다음, 제1 부분 및 제2 부분에서 결합되어 있는 표지된 항체의 양을 측정하여, 서로 비교한다. 2개의 측정 결과 사이의 차이는 병원성 형태의 프리온 단백질이 샘플 중에 존재하는지의 여부를 지시한다. 이러한 검출 방법은 입체형태-의존성 면역검정법(CDI: conformation-dependent immunoassay)으로 칭한다. CDI의 감도는 샘플을 단백질분해 효소, 예를 들어, 프로테이나제 K 또는 디스파제(dispase)로 예비처리한 경우에 증가할 수 있다. 프로테아제로의 처리는 샘플 중의 PrP^c 및 무관한 단백질을 분해하고, 프로테아제-내성 PrP^27-30을 샘플 중에 잔류시킨다.

병원성 프리온 단백질의 존재에 대한 사람 혈장의 조사는 샘플 검사의 자동화를 또한 가능하게 하는 매우 민감하고 특이적인 검출 시스템을 요구한다. 프리온의 검출은 프리온의 병리학적 영향의 근거가 되는 생리학적 과정이 아직까지 공지되어 있지 않기 때문에 보다 더 어렵다. 또한, 병리학적 이소형태 PrP^Sc 및 정상 이소형태 PrP^c 사이를 직접적으로 감별하고, 통상적으로 매우 과량 존재하고, 지금까지 프리온의 검출에 사용되어온 다른 항체 모두와 상호 반응하는 진단 시약이 지금까지는 입수가능하지 않다.

병원성 프리온 단백질을 검출하는 이전에 공지된 방법 모두에서 공통적인 특성은 검출된 병원성 프리온 단백질이 사람 기원의 프리온 단백질인지 다른 종으로부터 유래된 프리온 단백질인지를 명백하게 감별할 수 없다는 점이다. 광범위하게 입수가능하고, 사람 프리온 질환을 진단하는데 사용되는 MAB 3F4도 또한 다른 포유동물 종의 프리온 단백질, 예를 들어, 햄스터 프리온 단백질과 반응한다. 이러한 감별은 인체내에서 발견된 병원성 프리온 단백질이 외부로부터 유래된 것인지 병원성 프리온이 인체에서 초기에 형성되었는지를 측정하는데 매우 중요할 것이다. 동물 프리온은 한편으로는 작업장, 예를 들어, 프리온을 취급하는 실험실 또는 동물 우리에서의 노출의 결과로서 사람에게 전파될 수 있으며, 다른 한편으로는 또한 프리온-오염된 식료품의 섭취에 의해 또는 가능하게는 심지어 오염된 화장품 또는 약품의 사용에 의해 전파될 수 있다. 감염원에 대한 정확한 정보는 유효한 보호책을 개발할 수 있도록 한다.

사람 기원의 프리온에서 발생하나 동시에 동물 기원에 프리온내에는 존재하지 않는 에피토프를 선택적으로 인식하기 위해 이전에 공지된 항체를 사용할 수 없다는 사실 때문에, 사람 기원의 병원성 프리온을 검출하는 고도로 특이적인 방법이 지금까지는 없었다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러, 사람 프리온 단백질에 특유하나 동물 기원의 프리온 단백질과는 반응하지 않는 에피토프를 인식하는 항체, 특히 모노클로날 항체를 발견할 수 있음이 밝혀졌다. 선택적 인식은 바람직하게는 웨스턴-블롯 기술을 이용함으로써 확인할 수 있다. 이러한 성질의 항체의 예는 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524에 의해 형성된 모노클로날 항체이다. 이러한 모노클로날 항체는 SDS-폴리아크릴아미드-겔에서 분리하고, 나일론-막에 전이시키고, 항체를 사용하여 검출하는 경우에, 아프리카 녹색 원숭이로부터의 PrP 또는 소, 햄스터, 랫트 또는 마우스 PrP와의 어떠한 교차반응성도 나타내지 않는다.

이러한 신규한 모노클로날 항체를 사용하여, 최초로 사람 기원의 프리온 단백질의 고선택도, 고감도 검출 방법, 예를 들어, 상기한 바와 같은 적합한 웨스턴 블롯팅 방법을 개발할 수 있음을 밝혀내었다.

체액 샘플 또는 생체 조직의 액화 샘플 중의 병원성 프리온 단백질을 검출하는 입체형태-의존성 면역검정법이 또한 특히 관심의 대상이다. 이전에 사용된 CDI는 단지 조사할 샘플을 화학적 가교결합에 의해 고체 지지체 상에 고정시킴을 포함하였다. 결과로서, 샘플 중에 함유되어 있는 프리온 단백질이 샘플로부터 선택적으로 농축되지 않았고, 대신에, 이들은 다수의 다른 무관한 단백질과 함께 지지체 기판에 부착되었다. 이는 샘플 중의 다수의 프리온 단백질이 지지체 물질 상에 전혀 결합되지 않기 때문에 감도 손실을 나타낸다. 이러한 간섭 효과는 특히 고단백질 함량을 갖는 샘플, 예를 들어, 혈장 중에서 현저하다. 또한, 이러한 간섭 효과는, 프로테이나제 처리의 생략이 샘플 중의 무관한 단백질의 이러한 간섭 효과를 한층 더 증가시키기 때문에, CDI, 즉 프로테이나제로의 임의의 예비처리의 부재하에 샘플 중의 프리온 함량의 측정의 추가 사용을 제한한다. 기탁된 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524에 의해 생산되는 모노클로날, 사람 PrP-특이적 항체는, 예를 들어, 이들 항체가 포획 항체로서 지지체 물질에 적용된 다음, 샘플 중에 존재하는 사람 프리온 단백질을 지지체 물질에 선택적으로 결합시킬 수 있기 때문에, 이러한 간섭 효과를 제거할 수 있다. 이러한 방법으로, 샘플 중의 상당히 많은 프리온 단백질을 지지체 물질 상에 결합시키고, 동시에 시험 감도를 10 내지 30배 증가시킨다(실시예 2, 도 2a). 이에 따라서, 무관한 단백질로 인한 어떠한 간섭 효과도 유의적이지 않게 되며, 고도의 시험 감도가 샘플을 프로테아제로 예비처리하지 않는 경우에도 달성된다(실시예 2, 도 2b): 이와 관련하여, 포획 항체의 사용은 시험 감도를 글루타르알데히드 가교결합법과 비교하여 100 내지 300배 증가시킨다. 단순화의 목적을 위해, 포획 항체를 지지체 상에 적용시키는 이러한 배치는 샌드위치 배치로 칭한다(도 2). 개선된 CDI 검출법은 다음 단계를 포함한다:

a) 고체 지지체에 결합되어 있고 프리온 단백질의 정상의 비병원성 입체형태에 대해 보다 높은 친화성을 나타내는 상기한 모노클로날 항체 중의 하나를 샘플의 제1 부분에 첨가하여, 프리온 단백질의 농도를 측정하는 단계;

b) 샘플의 제2 부분을, 모노클로날 항체에 대한 병원성 입체형태의 접근가능성이 증가되도록 처리하는 단계;

c) a)의 모노클로날 항체를 상기 방식으로 처리된 제2 부분에 첨가하여, 제2 농도를 측정하는 단계 및

d) 제1 농도를 제2 농도와 비교하여, 프리온 단백질의 병원성 입체형태의 존재를 검출하는 단계.

하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524에 의해 형성된 모노클로날 항체가 당해 검출법에 특히 적합하다. 면역검정 검출법에서 중요한 단계는 조사할 샘플의 특정 부분을 항체에 대한 접근가능성을 증가시키는 병원성 프리온 단백질의 병리학적 형태의 입체형태에서의 변화를 유도하는 물리적 또는 화학적 조건에 적용시키는 것으로 구성되어 있다. 입체형태에서의 변화는 열, 압력 또는 화학 물질의 작용에 의해 야기할 수 있다. 존재하는 병원성 프리온 단백질의 2% 이상이 모노클로날 항체에 대해 접근가능한 입체형태로 전환되는 조건이라면 충분하다.

프리온 단백질의 고정화에 적합한 지지체 물질은 통상적으로 사용되는 크로마토그래피 수지, 아가로스, 미세역가 플레이트, 니트로셀룰로스 막, 나일론 막 또는 자기 비드이다. 이들 지지체 물질에 결합되는 프리온 단백질은, 예를 들어, 제2의 표지된 항체를 고정화된 프리온 단백질과 결합시키는 ELISA 방법을 이용하여 검출한다. 모노클로날 항체 3F4는 제2의 표지된 모노클로날 항체로서 사용하기에 적합한 것으로 입증되었다. 이는 방사성 그룹, 효소 또는 형광 그룹으로 표지시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 면역검정 검출법의 이점은 프리온 단백질 검출의 감도가, 예를 들어, 국제 특허 공개공보 제WO 98/37411호에 개시되어 있는 공지된 입체형태-의존성 면역검정법의 감도와 비교하여 약 10 내지 300배 증가한다는 점이다. 이는 조사할 샘플로부터 프리온 단백질을 선택적으로 풍부화시킬 수 있는 본 발명에 따르는 모노클로날 항체를 사용하여 달성한다.

본 발명에 따르는 검출법의 신뢰도 및 감도는, 상당히 적은 양의 프리온을 10 내지 100개 혈장 샘플의 그룹에 첨가한 다음, 본 발명에 따르는 면역검정법을 이용하여, 모든 경우에 신뢰있게 프리온을 검출함으로써 입증할 수 있다. 이러한 입체형태-의존성 면역검정법은 흔히 발생하는 형태의 크로이츠펠트-야콥병(CJD)을 유발하는 프리온뿐만 아니라, 특히 환자의 림프 기관에서의 프리온의 출현을 특징으로 하는 신규한 변이형 CJD(vCJD)의 프리온을 검출한다. 이와 대조적으로, 미세한 백그라운드 시그널 이외에, 프리온이 첨가되지 않은 혈장 샘플 중 어느 것에서도 양성 반응이 발견되지 않았다. 이러한 결과는 고도로 정제된 프리온 단백질을 사용하고, 감염된 동물로부터 유래된 균질화된 뇌 샘플을 사용함으로써 성취할 수 있다. 심지어, 모든 이전 방법에서 요구되는 프로테아제로의 예비처리를 수행하지 않은 경우에도, 본 발명에 따르는 면역검정법은 프리온 단백질의 존재를 고도의 신뢰도로 입증하기 위해 여전히 사용할 수 있다.

본 발명에 따르는 모노클로날 항체의 특수한 특성은 이들이 사람 프리온 단백질만을 인식한다는 점이다. 이는 아마도 당해 모노클로날 항체가 다른 포유동물에 존재하지 않는 매우 특이적인 아미노산 서열을 사람 프리온 단백질에서 인식한다는 사실에 기인할 것이다.

이는 신규한 용도를 갖는 본 발명에 따르는 면역검정법을 초래한다. 따라서, 본 발명에 따르는 항체를 사용한 경우에 병리학적 프리온 단백질이 사람 체내에서 발견된다면, 이러한 PrP^Sc가 초기에 인체에서 형성되었다는 것이 명확하다. 반면에, 본 발명에 따르는 항체를 사용한 경우에는 어떠한 시그널도 발견되지 않으나, 이전에 공지된 항체, 예를 들어, 6H4 항체로 명명되는 항체(공급원: Prionics)를 사용할 때에 시그널이 발견된다면, 이러한 병리학적 프리온 단백질은 동물 기원의 것이다. 따라서, 이러한 경우에, 조사할 사람은 동물 기원의 프리온으로 접종함으로써 감염되었다 이러한 방법에 있어서, 미지 기원의 프리온 단백질을 동물 또는 사람 공급원으로 지정하고, 이에 의해 병리학적 프리온의 전파 경로를 해명할 수 있다.

본 발명에 따르는 모노클로날 항체에 대한 결합 부위, 즉 에피토프를 또한 특성 규명할 수 있다. 모노클로날 항체 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524에 대한 에피토프는 결정적으로 프리온 단백질내의 단일 디설파이드 가교에 의해 측정된다. 따라서, 디설파이드 가교는 그 자체가 에피토프의 일부여서 모노클로날 항체의 항원-결합 부위와 상호작용하거나, 디설파이드 가교는, 다른 상황에서는 서로 원거리에 존재하고, 황 가교로 인해 산화 조건하의 프리온 단백질내에만 존재하는 복합적 입체형태의 에피토프를 형성하는 단백질 영역과 함께 결합한다. 이는 실시예 4 및 도 3에서 명백해진다.

단백질의 항원성은 이들 각각의 항체, 폴리- 및 모노클로날-항체 둘 다에의 결합, 일본쇄 항체에의 결합 또는 파아지-디스플레이 시스템에서의 결합에 의해 특성 규명할 수 있다. 항체는 표적-단백질의 특이적 아미노산 구조인 에피토프에 결합한다. 이러한 특성의 규명은 당업자에게 공지되어 있는 기술, 예를 들어, 웨스턴-블롯, 표적-단백질 서열의 부분 서열(또는 핵산 서열 각각)과 중복되도록 합성된 펩타이드에의 항체의 결합, 고정화된 표적-단백질을 사용하는 ELISA, 단백질 A에 대한 항원/항체-복합체의 결합 또는 면역침전법에 의해 달성할 수 있다. 일반적으로는, 에피토프는 연속적(선형) 또는 비연속적(입체형태적)일 수 있어, 상이한 방법을 각각 이용할 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 분자내의 아미노산의 연속 서열로 구성되어 있고, 단백질의 공간 배열(2차, 3차 또는 4차 구조)은 이러한 에피토프 및 당해 에피토프에 대한 항체 결합에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 예를 들어, SDS 또는 카오트로픽제에 의한 단백질의 변성은 에피토프 및 당해 에피토프에 대한 항체의 결합에 영향을 미치지 않는다. 당해 에피토프는 ELISA에서의 표적-단백질의 중복 부분-서열에 이들이 결합하는지 여부로 특성 규명한다. 항체가 ELISA, 도트-블롯 검정법 또는 면역침전법에서 측정된 바와 같이 변성 전에는 표적-단백질에 결합하나, 변성 후에는 결합하지 않는 경우에는, 에피토프는 비연속적(또는 입체형태적)이고, 즉 에피토프를 포함하는 아미노산은 선형 서열로 존재하지 않고, 단백질의 별개의 부분 영역 상에 존재하고, 단백질의 3차원 배열로 인해 공간적으로 배열된다. 입체형태적 에피토프를 포함하는 아미노산의 이러한 배열은 상이한 분자 또는 동일한 단백질의 원격 도메인에 걸쳐있을 수 있다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러, 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524에 의해 분비된 모노클로날 항체의 결합 특성의 규명 동안에, 변성된 단백질은 웨스턴-블롯에서 항체와는 반응(선형 에피토프에 대한 지표)하나, 중복 펩타이드와는 반응(입체형태적 에피토프에 대한 지표)하지 않음이 밝혀졌다. 잠재적인 항체 결합 부위의 아미노산 서열을 분석한 결과, 이러한 영역내에 디설파이드 가교가 존재함이 밝혀졌다. 본 발명자들은 디설파이드-가교가 입체형태적(비연속적) 에피토프의 존재를 유도하는지의 여부를 분석하였다.

디설파이드-가교는 통상의 단백질-변성 조건에 의해 분해되지 않으므로, (SDS-PAGE 및 막으로의 후속적인 전이에서의 이들의 겉보기 크기에 의한 분리 후) 웨스턴-블롯에서 단백질을 1차 항체를 함유하는 수용액과 배양한 다음, 1차 항체에 대해 지시되는 표지된 2차 항체를 사용하여 검출할 것이다. 디설파이드 가교가 환원에 의해 파괴될 경우에, 에피토프도 또한 분해될 것이고, 항체는 더 이상 결합할 수 없다. 선형 에피토프를 동정하기 위해 당업자에 의해 사용되고 있고 웨스턴-블롯 기술을 이용하여 검출할 수 있는 중복 펩타이드의 사용은 하이브리도마 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524에 의해 분비된 항체의 에피토프의 특성 규명에서 성과를 산출하지 않았다. 이는 디설파이드-가교가 상기 펩타이드에서 발현될 수 없기 때문이다.

디설파이드-가교의 정확한 발생은 단백질의 성숙화 동안의 중요한 단계이다. 다수의 경우에 있어서, 디설파이드-가교는 단백질의 안정성 및 기능을 위해 최고로 중요하다. 본 발명이 구성되기 이전에, 이러한 디설파이드-가교의 정확한 발생을 검출하고 특성 규명하는 것이 불가능하였다.

이러한 놀라운 발견, 즉 디설파이드 가교를 기초로 하는 에피토프의 검출을, (산화 조건하에) 디설파이드-가교를 함유하는 단백질에 대한 항체 또는 고친화성 리간드를 제조함으로써 단백질의 특성 규명에 사용할 수 있다. 당업자는 디설파이드-가교를 갖는 단백질(산화 조건) 및 디설파이드-가교를 갖지 않는 단백질(환원 조건)에 대한 결합을 측정함으로써 적합한 리간드를 선택하는 방법을 인지하고 있다. 이러한 항체를 유도하기 위해, 이러한 디설파이드-가교를 함유하는 단백질로 동물을 면역화시킬 수 있다. 당해 단백질은, 예를 들어, 세균-, 효모-, 식물-, 곤충- 또는 포유동물 세포내에서 재조합적으로 생산할 수 있거나, 시험관내에서 발현시킬 수 있고, 당업자에게 공지되어 있는 통상의 분리 기술에 의해 분리할 수 있다. 당해 단백질은 또한 조직, 기관, 액체, 혼합물 또는 다른 공급원으로부터 과발현의 부재하에 분리할 수도 있다. 당해 단백질은 환원 또는 산화 상태로 면역화에 이용할 수 있다. 다른 고친화성 리간드, 예를 들어, 일본쇄 항체 또는 펩타이드-리간드를, 각각 환원 및 산화 형태의 표적-단백질을 스크리닝하는데 사용함으로써 소위 "파아지-디스플레이-라이브러리"에서 동정할 수 있다.

이러한 방법으로 생산된 항체를 사용하여, 특정한 방법(SMALES, 2002)으로 처리되거나 외부 유기체내에서 재조합적으로 발현된 단백질의 정확한 상태를 용이하게 분석할 수 있다.

본 발명에 따르는 검정법의 수행은 다음 실시예에 의해 예시된다:

실시예:

1. 다양한 종으로부터의 PrP ^c 를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출하기 위한, 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524로부터 유래된 모노클로날 항체의 사용

다양한 종으로부터의 PrP^c를 검출하기 위해, 사람 Prp를 발현시키는 아프리카 녹색 원숭이, 소, 시리아 골든 햄스터, 랫트 및 유전자전이된(transgenic) 마우스로부터의 등량(중량)의 뇌를 인산염-완충 식염수(PBS) 중에서 Ultra Turrax 조직 분쇄기를 이용하여 균질화시키고, 10%의 최종 농도(중량/용적)를 설정한다. 대형 조직 단편을 500×g 및 실온에서 15분 동안 원심분리하여 제거한다. 4% 사르코실을 함유하는 등용적의 PBS를 상등액에 첨가한다. 단백질의 분리를 위해, 이들 용해물을 겔 전기영동용 SDS 샘플 완충액과 혼합하여, 100℃에서 10분 동안 비등시킨다. 다음, 각각의 종의 뇌 용해물 20㎕를 10% SDS 폴리아크릴아미드 겔(Novex) 상에 로딩(loading)시키고, 단백질을 150볼트에서 45분에 걸쳐 전기영동시킴으로써 분리한다. 다음, 단백질을 전기전이에 의해 나일론 막(밀리포어)에 전이시킨다. 다음, 1% 소 혈청 알부민(BSA, Merck)을 함유하는 TBST(트리스-완충 식염수/0.1% Tween 20(Sigma))를 사용하여 실온에서 60분 동안 막을 차단시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 TBST 중에 1:5000배 희석된 모노클로날 항체 6H4(구입원: Prionics, Switzerland)와 함께, 또는 TBST 중에 1:1000배 희석시킨 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 또는 DSM ACC 2524로부터의 모노클로날 항체와 함께, 또는 TBST와 함께 진탕하에 배양한다. TBST로 3회 세척한 후, 막을, TBST 중에 1:5000배 희석시킨 알칼리 포스파타제(Amersham)와 접합시킨 염소 항-마우스 IgG 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 진탕하에 배양한다. TBST로 5회 세척한 다음, 막을 검출 시약(Amersham)과 함께 배양한다.

다양한 종으로부터의 뇌 단백질을 나일론 막 상에 블롯팅시키고, PrP-특이적 모노클로날 항체와 함께 배양하고, 다음 결과를 관찰한다:

세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524로부터 수득된 모노클로날 항체가 소, 햄스터 또는 랫트 PrP 또는 아프리카 녹색 원숭이로부터의 PrP와의 교차반응성을 갖지 않는 반면, 이들은 사람 프리온 단백질에는 명백하게 결합한다.

2. 결합 시약으로서 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524로부터의 모노클로날 항체를 사용하는 개선된 입체형태-의존성 면역검정법: 샌드위치 CDI

사람 PrP^c를 발현하며 산발형 크로이츠펠트-야콥병(sCJD)에 감염된 유전자전이된 마우스의 뇌를 프리온 질환의 제1 징후시, 즉 CJD로 인해 사망한 환자로부터의 뇌 균질물로의 뇌내 감염 후 약 150일째에 안락사시킨 마우스로부터 분리한다. 뇌를 실시예 1에 기술된 용해물 제조법을 이용하여 용해시킨다. 뇌 용해물을 2% 사르코실(중량/용적) 및 4% BSA(중량/용적)를 함유하는 PBS를 사용하여 0.5 log₁₀ 단계로 희석시킨다. 다음, 샘플을 최종 농도 250㎍/ml로 프로테이나제 K(PK; Roche)를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 처리한다. 프로테이나제 저해제인 PMSF(=페닐메틸설포닐 플루오라이드; Roche), 아프로니틴(Sigma) 및 로이펩틴(Sigma)을 각각의 경우에 최종 농도가 20㎍/ml가 되도록 첨가함으로써 분해를 중지시킨다. 인텅스텐산을 최종 농도 0.3%로 첨가하고, 염화마그네슘을 최종 농도 2.72mM로 첨가한다. 다음, 샘플을 37℃에서 16시간 동안 배양한 후, 14000rpm 및 실온에서 30분에 걸쳐 원심분리한다. 상등액을 제거하고, 펠렛을 프로테이나제 저해제인 로이펩틴 및 아프로티닌을 0.1㎍/ml의 양으로 함유하는 H₂O 50㎕에 재현탁시킨다. 샘플을 분할하고, 샘플의 절반을 8M 구아니디늄 하이드로클로라이드(Gdn-HCl; Merck) 25㎕를 첨가하고 80℃에서 5분 동안 가열함으로써 변성시킨다. 실온으로 냉각시킨 후, 프로테이나제 저해제인 로이펩틴 및 아프로티닌을 0.1㎍/ml의 양으로 함유하는 H₂O 950㎕를 첨가한다. 비처리된 샘플 절반을 동일한 프로테이나제 저해제 및 0.205M Gdn-HCl을 함유하는 H₂O 975㎕로 희석시킨다. 희석시킨 변성된 샘플 및 비변성된(천연) 샘플을 0.2% 글루타르알데히드를 함유하는 PBS로 실온에서 2시간 동안 재활성화시키거나 PBS 중에 최종 농도 10㎍/ml로 희석시킨 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 또는 DSM ACC 2524 모노클로날 항체로 피복시킨 96웰 시험 플레이트에 3중으로 전이시킨다(200㎕/웰). 샘플을 예비활성화된 플레이트 상에서 실온에서 2시간 동안 배양한 후, 웰을 세척 완충액(Wallac)으로 세척한다. 이후, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 5% BSA를 함유하는 TBS(TRIS-완충 식염수)로 차단시킨 다음, 세척 완충액(Wallac)으로 3회 세척한 후, 실온에서 2시간 동안 유로퓸-표지된 모노클로날 항체 3F4를 함유하는 시약 완충액(Wallac)과 함께 교반하에 배양한다. 다음, 플레이트를 세척 완충액으로 7회 세척한 후, 증강액(Wallac) 200㎕를 웰에 첨가한다. 실온에서 10분 동안 교반한 후에, 유로퓸-결합 모노클로날 항체 3F4로부터 유래하는 형광을 디스커버리(Discovery; Canberra Packard) 형광 분석기로 측정한다. 다음, 분석기가 변성된 샘플에서 측정한 형광 시그널의 수를 천연 샘플로부터 수득된 형광 시그널의 수로 나눈다. PBS/BSA/사르코실 희석 완충액에 대해 수득된 비보다 높은 변성/천연 비는 샘플 희석액 중의 프로테아제-내성 PrP^Sc의 존재를 지시한다(도 1A). 샌드위치 CDI는 통상의 글루타르알데히드 가교결합법과 비교한 바 감도에서 10 내지 30배 증가를 나타낸다.

3. 프로테이나제 K로의 처리 부재하의 개선된 입체형태-의존성 면역검정법

사람 프리온을 함유하는 뇌 용해물을 사람 혈장에 소량으로 첨가하고, 0.5-log₁₀ 단계로 사람 혈장 중에 희석시킨다. 다음, 희석액을 프로테이나제 K를 첨가하지 않는 것을 제외하고는 실시예 2에 기술된 바와 같이 처리한다(도 2b). 세포주 DSM ACC 2523으로부터 유래된 모노클로날 항체를 사용하는 샌드위치 배치는 글루타르알데히드 가교결합법과 비교한 바 시험 감도를 100 내지 300배 증가시킨다.

4. 프리온 단백질의 환원 후의 항체 결합의 억제

볼튼(Bolton DC, 1987)에 의해 기술된 방법에 의해 vCJD로 인해 사망한 사람의 뇌로부터 분리된 정제된 PrP^Sc를 2% 사르코실 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 인산염-완충 식염수에 재현탁시키고, 샘플을 분할하고, 1ml 분취액을 에펜도르프 튜브에 전이시키고, 65㎍/ml 농도의 프로테이나제 K로 37℃에서 1시간 동안 분해한다. 프로테아제 저해제를 당업자에게 공지된 농도로 첨가함으로써 반응을 중지시키고, NaCl을 최종 농도 30%(중량/용적)로 첨가함으로써 PrP^Sc를 침전시킨다. 샘플을 4℃에서 밤새 배양한 다음, 16000×g에서 30분 동안 원심분리한다. 당업자에게 공지된 농도의 프로테아제 저해제를 함유하는 증류수 50㎕ 중에 펠렛을 재현탁시킨 다음, 4M 구아니디늄 하이드로클로라이드로 변성시키고, 83℃에서 6분 동안 가열한다. PrP^Sc를 3.3mM 디티오트레이톨의 존재하에 동시에 환원시키는 것을 제외하고는 3종의 샘플을 병렬식으로 동일하게 처리한다. 3종의 환원된 샘플 중 1종을 10mM 요오도아세트아미드로 10분 동안 처리하여, 티올 그룹을 비가역적으로 메틸화시키고, 산화환원을 방지한다. 환원된 샘플 중 제2의 샘플을 0.2mM 산화된 글루타치온을 가함으로써 실온에서 2시간 동안 산화시킨다. 나머지 샘플을 글루타치온 비함유 완충액으로 보충하고, 또한 실온에서 2시간 동안 배양한다.

각각의 개별 샘플 웰로부터 3x200㎕ 분취액을 실시예 2에 기술된 바와 같이 글루타르알데히드로 예비처리된 미세역가 웰에 전이시키고, 실온에서 2시간 동안 진탕하에 배양한다. 웰의 차단 및 세척 후에, 모노클로날 항체 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 또는 DSM ACC 2524를 첨가한다. 실온에서 1.5시간 동안 배양 후에, 플레이트를 7회 세척함으로써 항체를 제거한다. 유로퓸 킬레이트 착체와 화학적으로 접합된 마우스 면역글로불린에 특이적인 제2 항체를 웰에 첨가한 다음, 실온에서 1.5시간 동안 진탕하에 배양한다. 플레이트를 7회 세척하여, 제2 항체를 제거한 후에, 증강 완충액(공급원: Wallac, Turku, Finland)을 사용하여 결합된 제2 항체로부터 유로퓸을 방출시킨다. 다음, 유로퓸 형광 시그널을 디스커버리 형광 분석기(Canberra, Packard, Darmstadt, Germany)를 이용하여 분석한다. 비환원된 PrP^Sc 분자는 환원된 PrP^Sc 분자보다 30배 높은 시그널을 생성시켰다(도 3). 이는 사람 프리온 단백질에 대한 항체 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524의 효율적인 결합을 위해서 디설파이드 가교가 존재하여야함을 의미한다. 이전에 환원된 PrP^Sc 분자에의 결합은 디설파이드 가교를 재구성함으로써 재생시킬 수 있다. 이는 도 3에 도시한다: 산화된 글루타치온 또는 산소를 산화제로서 사용하여 환원된 PrP^Sc 분자를 산화시킨 후에, 유로퓸 표지된 항체의 결합은 비환원된 샘플에 대해 수득된 시그널의 60% 정도에 달하였다.

참조문헌 목록

본 발명에 따라, 사람 기원의 병원성 프리온을 특이적으로 검출하는 항체 및 당해 항체를 사용하여 수행되는, 사람 기원의 프리온 단백질의 고선택도, 고감도 검출 방법을 제공할 수 있다.

Claims (24)

1. 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 또는 DSM ACC 2524 중의 하나에 의해 형성되는 하나 이상의 항체에 의해 인식되는 것으로서 사람 프리온 단백질에 대해 특이적이며 산화 조건 하에서의 프리온 단백질에만 존재하는 입체형태 에피토프에 특이적으로 결합함을 특징으로 하는, 모노클로날 항체.
2. 제1항에 있어서, 아프리카 베르베트 원숭이, 소, 시리아 골든 햄스터, 마우스 또는 랫트로부터의 프리온 단백질에는 결합하지 않음을 특징으로 하는, 모노클로날 항체.
3. 삭제
4. 제2항에 있어서, 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 및 DSM ACC 2524 중의 하나의 의해 형성됨을 특징으로 하는, 모노클로날 항체.
5. 제1항, 제2항 및 제4항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체를 사람 기원의 병원성 프리온 검출 방법에 사용함을 특징으로 하는, 사람 기원의 병원성 프리온 검출방법.
6. 제1항, 제2항 및 제4항 중의 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체에 대한 결합 친화성이 상이한, 제1의 천연 비병원성 입체형태인 PrP^c 및 제2의 병리학적 입체형태인 PrP^Sc를 취하는 PrP 단백질을 함유하는 사람 또는 동물 기원의 체액 샘플 중에서, 병원성 프리온 단백질을 검출하는 입체형태-의존성 면역검정법에 있어서,

   a) 고체 지지체에 고정되어 있고 제1 프리온 단백질 입체형태에 대해 보다 높은 친화성을 나타내는 상기한 모노클로날 항체 중의 하나를 샘플의 제1 부분에 첨가하여, 제1 농도를 측정하는 단계;

   b) 샘플의 제2 부분을, 상기한 모노클로날 항체에 대한 프리온 단백질의 제2 입체형태의 결합 친화성이 증가되도록 처리하는 단계;

   c) 상기한 모노클로날 항체를 조사할 샘플의 처리된 제2 부분에 첨가하여, 제2 농도를 측정하는 단계 및

   d) 제1 프리온 단백질 농도를 제2 프리온 단백질 농도와 비교하여, 병원성 프리온 단백질 입체형태의 존재를 확인하는 단계를 포함하는, 면역검정법.
7. 삭제
8. 제6항에 있어서, 샘플을 단백질분해 효소로 예비처리함을 특징으로 하는, 면역검정법.
9. 제8항에 있어서, 단백질분해 효소가 프로테이나제 K 또는 디스파제 (dispase)를 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 면역검정법.
10. 제6항에 있어서, 조사할 샘플을, 입체형태를 변화시킬 목적으로, 승온, 압력 또는 화학 시약에 노출시켜, 존재할 수도 있는 프리온 단백질의 2% 이상을 모노클로날 항체에 결합하는 형태로 전환시키는 처리에 적용시킴을 특징으로 하는, 면역검정법.
11. 제6항에 있어서, 고체 지지체에 부착되는 프리온 단백질의 양을 제2의 표지된 모노클로날 항체를 사용함으로써 측정함을 특징으로 하는, 면역검정법.
12. 제11항에 있어서, ATCC-HB 9222로 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 항체 3F4를 제2의 표지된 모노클로날 항체로서 사용함을 특징으로 하는, 면역검정법.
13. 제11항에 있어서, 모노클로날 항체가 방사성 그룹, 효소 그룹 또는 형광 그룹으로 표지됨을 특징으로 하는, 면역검정법.
14. 삭제
15. 삭제
16. 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2522, DSM ACC 2523 또는 DSM ACC 2524 중의 하나에 의해 형성되는 하나 이상의 항체에 의해 인식됨을 특징으로 하는, 사람 프리온 단백질에 대해 특이적이며 산화 조건 하에서의 프리온 단백질에만 존재하는 입체형태 에피토프.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제

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