JP2018503807A - 凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)本発明は、生試料(biosample)の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法、またはキットを提供する。
(b)本発明の方法は、生試料中の測定しようとする凝集形−形成ポリペプチドの凝集形(抗原)の量が非常に少ないか、その大きさが非常に小さくて、測定することが難しいか、あるいは人体内凝集形−形成ポリペプチドの凝集形(抗原)の量と生試料中の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形(抗原)の量が比例していない場合に、ポリペプチドの凝集形形成を抑制する防御システム(clearing system)、および/または疎水性相互作用(hydrophobic interaction)の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い(differentiation)を極大化した。
(c)本発明は、便利で迅速な方式で実施することができて、これは、生試料(biosample)の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法の自動化を可能にする。
まず、本発明の方法は、分析対象の生試料に、(i)前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型(オリゴマー型)、(ii)前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体(hydrophobic deleted derivative of aggregate−forming polypeptide)、または(iii)前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型(オリゴマー型)と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体とをスパイク(spiking)する段階を含む。
本発明の方法は、(b)前記段階(a)の結果物をインキュベーションし、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成させる段階を含む。
本発明の方法は、(c)前記段階(b)の結果物に、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させる段階を経る。
最後に、本発明の方法は、(d)前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出する段階を含む。
コーティングバッファー(Carbonate−Bicarbonate Buffer)、PBST、TBST及びPBSは、Sigma社から購入した。Block Aceは、Bio−rad社から購入した。バッファAは、TBSTにBlock Aceを0.4%に希釈して製造した。ブロッキング(blocking)バッファは、D.Wに1%Block Aceが希釈されるように製造した。6E10抗体は、Biolegend社から購入した。3B6抗体は、Novus Biologicals社から購入した。3B6−biotin抗体は、Novus Biologicals社から購入した抗体をPeoplebio社でビオチン化(biotinylation)した。ストレプトアビジン(streptavidin)−HRPは、Thermo Scientific社から購入した。HBR1は、Scantibodies Laboratory社から購入した。FF51−HRPは、(株)The H labから購入した。組換え(recombinant)Aβ1−42は、Biolegend社から購入した。組換えAβ9−42 biotinは、Anaspec社から購入した。組換えAβ9−42は、Anaspec社から購入した。組換えα−シヌクレインは、Milipore社から購入した。血漿(plasma)サンプルは、ブンダンソウル大学病院及び中央大学病院から入手した。ECL溶液は、Rockland社から購入した。プレートは、Nunc社から購入した。6E10及びFF51抗体に対するエピトープは、ヒトAβペプチド配列のそれぞれ、アミノ酸3−8と1−4からなるアミノ酸配列を有する。3B6及び3B6 biotin抗体に対するエピトープは、α−シヌクレインタンパク質配列の119−140からなる配列である。
6E10抗体(抗Aβタンパク質、Biolegend)30μgをコーティングバッファー(sigma)10mlに希釈して、プレート(Nunc)に100μlを各ウェルに分注した後、4℃の冷蔵庫で一日間反応した。前記プレートをPBSで3回洗浄し、D.Wに1%Block Aceが溶いてあるブロッキングバッファー240μlを分注した後、室温で2時間反応した。前記プレートは、PBSで3回洗浄し、室温で30分間乾燥した後、使用した。
3B6抗体(抗α−シヌクレインタンパク質、Novus Biologicals)20μgをコーティングバッファー(sigma)10mlに希釈して、プレート(Nunc)に100μlを各ウェルに分注後、4℃の冷蔵庫で一日間反応した。前記プレートをPBSで3回洗浄し、D.Wに1%Block Aceが溶いてあるブロッキングバッファー240μlを分注した後、室温で2時間反応した。前記プレートは、PBSで3回洗浄し、室温で30分間乾燥した後、使用した。
陽性対照群(positive control)は、組換えAβ1−42(rec.Aβ)(1μg/ml)10μlにPBST990μlを添加し、100μlを使用した。陽性対照群(positive control)は、組換えα−シヌクレイン(1mg/ml)10μlにPBST990μlを添加し、100μlを使用した。陰性対照群(negative control)は、PBS100μlを使用した。
サンプルは、2サンプルを基準にして準備した。凍結された血漿サンプルを、37℃ヒートブロック(heat block)に15分間解かした後、30秒間ボルテックス(vortexing)後使用した。rec.Aβ1−42 1ngがスパイク(spiking)されたサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 180μl、rec.Aβ1−42(1ng/10μl)20μlを混合して、全体228.08μlになるように準備した。rec.Aβ9−42ビオチン 1ngがスパイクされたサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 180μl、rec.Aβ9−42ビオチン(1ng/10μl)20μlを混合して、全体228.08μlになるように準備した。rec.Aβ9−42 1ngがスパイクされたサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 180μl、rec.Aβ9−42(1ng/10μl)20μlを混合して、全体228.08μlになるように準備した。組換えα−シヌクレイン1μgがスパイクされたサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 180μl、組換えα−シヌクレイン(1μg/10μl)20μlを混合して、全体228.08μlになるように準備した。また、組換えペプチドをスパイクしなかったサンプルは、血漿20μlにHBR1(0.123mg/ml)8.08μlとPBST 200μlを混合して、全体228.08μlになるように準備した。
前記実施例5でrec.Aβ1−42を処理して用意したサンプルは、37℃のインキュベーターで各4日と6日間インキュベーションした。前記実施例5でrec.Aβ1−42を処理して用意したサンプルは、37℃インキュベーターで各2日、3日、4日、5日間インキュベーションした。rec.Aβ1−42を処理しなかったサンプルは、37℃インキュベーターで各0日、5日間インキュベーションした。そして、前記実施例5でrec.Aβ9−42ビオチンを処理して用意したサンプルは、6日間インキュベーションした。前記実施例5でrec.Aβ9−42を処理して用意したサンプルは、各2日、3日、4日間インキュベーションした。また、前記実施例5で組換えα−シヌクレインを処理して用意したサンプルは、各0日、2日、4日、6日インキュベーションした。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に、陽性対照群、陰性対照群及びrec.Aβ1−42を処理して4日と6日間インキュベーションしたサンプルを、それぞれ100μlずつ分注した後、室温で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体を、バッファAに1/1000希釈して100μlずつ分注した後、室温で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄した後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応したプレートは、ルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、下記図1aのようである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に、陽性対照群、陰性対照群及びrec.Aβ1−42を処理して各2日、3日、4日、5日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ100μlずつ分注した後、27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに10ng/mlになるように製造後、100μlずつ分注した。前記プレートを27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応し、TBSTで3回洗浄した後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応したプレートは、ルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、下記図1cのようである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に、陽性対照群、陰性対照群及びrec.Aβ1−42を処理して5日間、rec.Aβ1−42を無処理して各0日、5日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ100μlずつ分注した後、27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに10ng/mlになるように製造後、100μlずつ分注した。前記プレートを27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応し、TBSTで3回洗浄した後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応したプレートは、ルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光(luminescent)シグナルを測定した。その結果は、下記図1dのようである。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に、陽性対照群、陰性対照群、rec.Aβ9−42ビオチンを処理して6日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ100μlずつ分注した後、室温で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに1/1000希釈し、100μlずつ分注した後、室温で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄した後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応したプレートは、ルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光シグナルを測定して、その結果は、下記図2aにまとめた。
6E10コーティングプレート(3μg/ml)に、陽性対照群、陰性対照群、rec.Aβ9−42を処理して2日、3日、4日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ100μlずつ分注した後、27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、FF51−HRP抗体をバッファAに10ng/mlになるようにように製造後、100μlずつ分注した。前記プレートを27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応し、TBSTで3回洗浄した後、ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応したプレートは、ルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光シグナルを測定して、その結果は、下記図2bにまとめた。
3B6コーティングプレート(2μg/ml)に、陽性対照群、陰性対照群、組換えα−シヌクレインを処理して0日、2日、4日、6日間インキュベーションしたサンプルを、それぞれ100μlずつ分注した後、27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応した。前記プレートをTBSTで3回洗浄し、3B6−biotin抗体をバッファAに2μg/mlになるように製造した後、100μlずつ分注した。前記プレートを27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応し、TBSTで3回洗浄した。ストレプトアビジン(streptavidin)−HRPをバッファAに1/5000倍に希釈し、100μlずつ分注した後、前記プレートを27℃インキュベーターで静置状態で1時間反応し、TBSTで3回洗浄した。 ECL溶液を100μl分注した。ECLと反応したプレートは、ルミノメーター機器(perkinelmer)に挿入し、発光シグナルを測定して、その結果は、下記図3にまとめた。
Claims (37)
- (a)分析対象の生試料に(i)凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型、(ii)前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体(hydrophobic deleted derivative of aggregate−forming polypeptide)、または(iii)前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体とをスパイク(spiking)する段階と、
(b)前記段階(a)の結果物をインキュベーションして前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成する段階(ここで、前記インキュベーションは、前記スパイクした(i)、(ii)または(iii)が前記生試料によってマルチマー化できるほど十分な時間行う)と、
(c)前記段階(b)の結果物に、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させる段階と、
(d)前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出する段階と、
を含む、生試料の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法。 - 前記スパイクした(i)、(ii)または(iii)をマルチマー化させる前記生試料は、前記凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型の係わった疾患を有する人間の生試料であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記生試料によってマルチマー化できるほど十分なインキュベーション時間は、凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型の係わった疾患を有する人間の生試料を利用して発生したシグナルを、正常の人間の生試料を利用して発生したシグナルより1.5〜20倍大きくするに十分な時間であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- 前記生試料は、血液であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料は、血漿であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドは、Aβペプチド、tauタンパク質、プリオン、α−シヌクレイン、Ig軽鎖、血清アミロイドA、トランスサイレチン、シスタチンC、β2−マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキシドディスムターゼ、セルピン及びアミリンからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドは、Aβペプチド、tauタンパク質またはα−シヌクレインであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型は、配列番号1のアミノ酸配列からなるAβペプチドまたは配列番号2のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体は、配列番号1のアミノ酸配列の37番目アミノ酸残基乃至42番目アミノ酸残基を含むAβdeleteペプチドであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記Aβdeleteペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列の29番目アミノ酸残基乃至42番目アミノ酸残基を含むペプチドであることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
- 前記Aβdeleteペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列の9番目アミノ酸残基乃至42番目アミノ酸残基を含むペプチドであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記段階(a)の結果物に緩衝液をさらに添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記緩衝液は、生試料に対して3〜15倍(v/v)に添加されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記緩衝液は、非イオン性界面活性剤含有リン酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記段階(b)の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の追加的な形成は、前記段階(a)の結果物を温度1〜50℃でインキュベーションして行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記段階(b)の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の追加的な形成は、前記段階(a)の結果物を1日〜12日間インキュベーションして行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記段階(c)及び(d)は、
(c−1)前記凝集形を捕獲(capturing)する前記凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に、前記段階(b)の結果物を接触させる段階と、
(c−2)前記凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する検出抗体に、前記捕獲された凝集形を接触させる段階と、
(c−3)凝集形−検出抗体複合体を検出する段階と、
を含む方法で行うことを特徴とする、請求項1に記載の方法。 - 前記検出抗体は、前記段階(c−1)のエピトープと同一なまたはオーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項17に記載の方法。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及びFRET標識であることを特徴とする、請求項20に記載の方法。
- (i)凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型、(ii)前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体(hydrophobic deleted derivative of aggregate−forming polypeptide)、または(iii)前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体と、を含む、生試料の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出するためのキット。
- 前記生試料は、血液であることを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 前記血液試料は、血漿であることを特徴とする、請求項23に記載のキット。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドは、Aβペプチド、tauタンパク質、プリオン、α−シヌクレイン、Ig軽鎖、血清アミロイドA、トランスサイレチン、シスタチンC、β2−マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキシドディスムターゼ、セルピン及びアミリンからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドは、Aβペプチド、tauタンパク質またはα−シヌクレインであることを特徴とする、請求項25に記載のキット。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型は、配列番号1のアミノ酸配列からなるAβペプチドであることを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体は、配列番号1のアミノ酸配列の37番目アミノ酸残基乃至42番目アミノ酸残基を含むAβdeleteペプチドであることを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 前記Aβdeleteペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列の29番目アミノ酸残基乃至42番目アミノ酸残基を含むペプチドであることを特徴とする、請求項28に記載のキット。
- 前記Aβdeleteペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列の9番目アミノ酸残基乃至42番目アミノ酸残基を含むペプチドであることを特徴とする、請求項29に記載のキット。
- 前記キットは、緩衝液をさらに含むことを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 前記緩衝液は、非イオン性界面活性剤含有リン酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項31に記載のキット。
- 前記キットは、凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体と、前記捕獲抗体が認識する前記エピトープを認識する検出抗体とをさらに含むことを特徴とする、請求項22に記載のキット。
- 前記検出抗体は、前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一なまたはオーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項33に記載のキット。
- 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項33に記載のキット。
- 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項33に記載のキット。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及びFRET標識であることを特徴とする、請求項36に記載のキット。
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