JP6107653B2 - 凝集促進剤 - Google Patents

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Description

免疫凝集測定法に用いられる凝集促進剤、並びにそれを用いた免疫凝集測定法に関する。
例えば血清、血漿、尿等の生体由来試料中の測定対象物質の有無又は濃度を測定するために、測定対象物質と反応する抗原又は抗体を固定化したラテックス等の不溶性担体を用いて、生ずる凝集の度合いから測定対象物質の有無を確認することや濃度を測定することは、免疫凝集測定法として従来よりなされている。
この免疫凝集法においては、感度の向上を目的として抗原抗体反応に基づく凝集をより生じさせやすくする免疫凝集促進剤が通常用いられる。該免疫凝集促進剤としては、ポリエチレングリコール（PEG）等がよく知られているが、PEGは、塩濃度の高い溶液中では塩析するため、ブランク値が高くなり測定精度が悪くなるという問題があった。
そこで、このような問題を解決する免疫凝集促進剤としてメタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（MPC）含有ポリマーを用いることが考案されている（特許文献１）。
特開2002-365296
現在、より高感度な測定を可能とする免疫凝集測定方法が求められており、該MPC含有ポリマーよりも強い凝集促進効果を示す免疫凝集促進剤の開発が望まれていた。上記状況に鑑み、本発明は、高感度な免疫凝集測定を可能とする、従来の免疫凝集促進剤よりも優れた凝集促進効果を示す凝集促進剤の提供を課題とする。
上記問題を解決するために本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、下記一般式[1]
Figure 0006107653
（式中、R1は水素原子又はメチル基を表し、R2及びR3はそれぞれ独立してメチル基又はエチル基を表し、Xは−NH−又は酸素原子を表し、nは1〜6の整数を表し、mは1〜3の整数を表す）で示されるモノマー単位を有するポリマーが、従来の免疫凝集促進剤よりも優れた凝集促進効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
「下記一般式[1]
Figure 0006107653
（式中、R1、R2、R3、X、n及びmは上記と同じ）で示されるモノマー単位を有するポリマーを含んでなる免疫凝集測定法用凝集促進剤、
上記ポリマーが、上記一般式[1]で示されるモノマー単位と下記一般式[2]
Figure 0006107653
（式中、R4は水素原子又はメチル基を表し、kは1〜10の整数を表す）で示されるモノマー単位を有するコポリマーである凝集促進剤を含んでなる免疫凝集測定法用試薬、並びに、上記免疫凝集測定法用凝集促進剤の共存下で、測定対象物質測定対象物質に対する抗体又は抗原を、測定対象物質と接触させて抗原抗体反応を行わせることを特徴とする免疫凝集測定方法」に関する。
本発明の免疫凝集促進剤は、従来の免疫凝集促進剤と比較して、より強い凝集促進効果を有する。よって、抗原若しくは抗体を固定化したラテックス粒子等の担体を用いて生じさせた抗原抗体反応生成物の凝集を利用した免疫比濁法、免疫比ろう法等の免疫凝集測定法において、本発明の免疫凝集促進剤を用いることにより、抗原抗体反応による凝集を生じやすくする。その結果、高感度な測定を可能とする。
本発明の免疫凝集測定法用凝集促進剤（以下、本発明の凝集促進剤と略記する場合がある）で用いられるポリマーとしては、一般式[1]で示されるモノマー単位を有するものであれば、ホモポリマーでもコポリマーでもよい。該コポリマーとしては、具体的には、例えば一般式[1]で示されるモノマー単位と一般式[2]で示されるモノマー単位とからなるものが挙げられる。
本発明の凝集促進剤で用いられるポリマーの重量平均分子量は、通常50,000〜3,000,000であり、100,000〜3,000,000が好ましく、200,000〜3,000,000がより好ましい。また、該凝集促進剤がコポリマーの場合、その重量平均分子量は、通常50,000〜3,000,000であり、100,000〜3,000,000が好ましく、200,000〜3,000,000がより好ましい。
（１）一般式[1]で示されるモノマー単位を有するホモポリマー
一般式[1]におけるR1としては、水素原子、メチル基等が挙げられるが、メチル基が好ましい。
一般式[1]におけるR2としては、メチル基、エチル基等が挙げられるが、メチル基が好ましい。
一般式[1]におけるR3としては、メチル基、エチル基等が挙げられるが、メチル基が好ましい。
一般式[1]におけるXとしては、−ＮＨ−又は酸素原子を表し、酸素原子が好ましい。
一般式[1]におけるnとしては、通常１〜６の整数を表し、２〜４の整数が好ましく、２〜３の整数がより好ましい。
一般式[1]におけるmとしては、通常１〜３の整数を表し、１〜２の整数が好ましく、１がより好ましい。
一般式[1]で示されるモノマー単位の好ましい具体例としては、例えば下記一般式［1-1］〜［1-8］が挙げられる。
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
Figure 0006107653
（式中、nは、１〜６の整数を表す）
中でも、一般式［1-1］〜［1-4］が好ましく、一般式［1-1］、一般式［1-3］、一般式［1-4］がより好ましく、一般式［1-1］が特に好ましい。より具体的には、下記［1-1-1］、［1-1-2］、［1-3-1］、［1-4-1］で示されるものが好ましい。
Figure 0006107653
、
Figure 0006107653
、
Figure 0006107653
、
Figure 0006107653
（２）一般式[1]で示されるモノマー単位を有するホモポリマーの製造方法
一般式[1]で示されるモノマー単位を有するホモポリマーは、例えば下記一般式[３]
Figure 0006107653
（式中、R1、R2、R3、X及びnは上記と同じ）で示される（メタ）アクリル酸誘導体と、例えば下記一般式[４]
X-(CH 2)m−COOH ［４］
（式中、Xはハロゲン原子を表し、mは上記と同じ）で示されるカルボン酸化合物とを、適当な溶媒中で反応させ、得られたモノマーを、更に自体公知の重合反応により重合することにより製造することができる。
一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体の具体例としては例えば、Ｎ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔５−（ジメチルアミノ）ペンチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔６−（ジメチルアミノ）ヘキシル〕メタアクリル酸；Ｎ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕アクリル酸、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕アクリル酸、Ｎ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕アクリル酸、Ｎ−〔５−（ジメチルアミノ）ペンチル〕アクリル酸、Ｎ−〔６−（ジメチルアミノ）ヘキシル〕アクリル酸；Ｎ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕アクリルアミド、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド、Ｎ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕アクリルアミド、Ｎ−〔５−（ジメチルアミノ）ペンチル〕アクリルアミド、Ｎ−〔６−（ジメチルアミノ）ヘキシル〕アクリルアミド；Ｎ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕メタクリルアミド、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタクリルアミド、Ｎ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕メタクリルアミド、Ｎ−〔５−（ジメチルアミノ）ペンチル〕メタクリルアミド、Ｎ−〔６−（ジメチルアミノ）ヘキシル〕メタクリルアミド；Ｎ−〔２−（エチルメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（エチルメチルアミノ）プロピル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔４−（エチルメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔５−（エチルメチルアミノ）ペンチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔６−（エチルメチルアミノ）ヘキシル〕メタアクリル酸；Ｎ−〔２−（ジエチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（ジエチルアミノ）プロピル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔４−（ジエチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔５−（ジエチルアミノ）ペンチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔６−（ジエチルアミノ）ヘキシル〕メタアクリル酸等が挙げられ、Ｎ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタクリルアミド、Ｎ−〔２−（ジエチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（ジエチルアミノ）プロピル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔４−（ジエチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（ジエチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド等が好ましく、中でも、Ｎ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド、Ｎ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタクリルアミド等が特に好ましい。尚、これら（メタ）アクリル酸誘導体は、市販品を用いてもよいし、（メタ）アクリル酸から常法等により適宜合成したものを用いてもよい。
一般式［４］におけるXで示されるハロゲン原子としては、例えばフッ素、塩素、臭素、ヨウ素等が挙げられ、塩素、臭素が特に好ましい。
一般式［４］で示されるカルボン酸化合物の具体例としては、例えばクロロ酢酸、フッ化酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロプロピオン酸、フッ化プロピオン酸、ブロモプロピオン酸、ヨードプロピオン酸、クロロブタン酸、フッ化ブタン酸、ブロモブタン酸、ヨードブタン酸等が挙げられるが、ブロモ酢酸、クロロプロピオン酸、クロロ酢酸が好ましく、中でもクロロ酢酸が特に好ましいものとして挙げられる。
一般式［４］で示されるカルボン酸化合物の使用量は、一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体の、通常０．５〜３倍モル、好ましくは１〜２倍モルとなるような量であればよい。
上記一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体と一般式[４]で示されるカルボン酸化合物又はその塩との反応時における反応溶媒としては、例えばトルエン、キシレン、ベンゼン、シクロヘキサン、ｎ-ヘキサン、ｎ-オクタン等の炭化水素類、例えばメタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、イソプロパノール、ｎ-ブタノール、イソタノール、tert-ブタノール等のアルコール類、ジメチルホルムアミド（DMF）、水等が挙げられるが、アルコール類が好ましく、中でもメタノール、エタノール、ｎ-プロパノール、イソプロパノール等が好ましい。尚、上記溶媒は２種以上を適宜混合して用いてもよい。用いられる反応溶媒の量は、一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体と一般式[４]で示されるカルボン酸化合物又はその塩の総量50ｇに対して、通常100〜300mLである。
上記一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体と一般式[４]で示されるカルボン酸化合物又はその塩との反応温度は、反応溶媒等に応じて適宜設定すればよいが、通常20〜120℃、好ましくは40〜80℃であり、反応時間は、通常１〜20時間、好ましくは5〜12時間である。
一般式[1]で示されるモノマー単位を有するポリマーの製造方法における重合反応としては、例えば溶液重合、塊状重合、乳化重合、懸濁重合など自体公知の方法によって行うことができる。重合開始剤としては、例えばアゾイソブチロニトリル、2、2'-アゾビス(2、4-ジメチルバレロニトリル)、2、2'-アゾビス(2-メチルプロピオン酸メチル)、2、2'-アゾビス(2-メチルブチロニトリル)等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、ペルオキソ二硫酸カリウム、ペルオキソ二硫酸アンモニウム等の過酸化物を用いることができるが、過酸化物が好ましく、中でもペルオキソ二硫酸アンモニウムが特に好ましい。重合開始剤の使用量は全モノマーの総重量に対して通常0.1〜3重量%である。該重合反応においては、例えば窒素、アルゴン等の不活性ガス雰囲気下で行うのが好ましく、重合温度は通常40〜120℃、好ましくは50〜70℃で、重合時間は1〜20時間、好ましくは0.5〜5時間行えばよい。ここで用いられる溶媒としては、上記一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体と一般式[４]で示されるカルボン酸化合物又はその塩との反応時における反応溶媒の具体例の他、水が挙げられ、中でも水が好ましい。用いられる溶媒の量は、ポリマーの総重量20ｇに対して、通常30〜360mLである。
一般式［１］で示されるモノマー単位を有するホモポリマーの具体的な製造方法としては、例えば、先ず、上記一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体１molと、上記一般式[４]で示されるカルボン酸化合物又はその塩１〜２molとを、エタノール500〜1000mL中で、40〜80℃で5〜12時間反応させてモノマーを得る。その後、得られたモノマー10gを水50〜100mLに溶解し、該溶液に1〜30mgの過酸化物を添加し、アルゴン雰囲気下、50〜70℃で1〜20時間重合反応させることによりなされる。
（３）一般式[1]で示されるモノマー単位と一般式[2]で示されるモノマー単位を有するコポリマー
該コポリマー中の一般式[1]で示されるモノマー単位の含有量は、通常50モル％以上100モル％未満であり、50〜95モル％が好ましく、50〜60モル％がより好ましい。また、該コポリマー中の一般式[2]で示されるモノマー単位の含有量は、通常0モル%超50モル％以下であり、5〜50モル％が好ましく、40〜50モル％がより好ましい。
一般式[1]で示されるモノマー単位の具体例は上記(1)の一般式[1]で示されるモノマー単位を有するホモポリマーの項で述べたものと同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
一般式[2]におけるR4としては、水素原子又はメチル基を表し、水素原子が好ましい。
一般式[2]におけるkとしては、通常１〜10であり、４〜８が好ましく、６〜８がより好ましい。
一般式[2]で示されるモノマー単位の具体例としては、例えば一般式［2-1］〜［2-2］が挙げられ、一般式[2-1]が好ましい。
Figure 0006107653
（式中、kは、上記と同じ。）
Figure 0006107653
（式中、kは、上記と同じ。）
中でも、下記[2-1-1]
Figure 0006107653
が好ましい。
一般式[1]で示されるモノマー単位と一般式[2]で示されるモノマー単位の組合せとしては、例えば
Figure 0006107653
が挙げられ、好ましい組合せとしては、
Figure 0006107653
であり、中でも、一般式[1]で示されるモノマー単位が、［1-1-1］、［1-1-2］、［1-3-1］又は［1-4-1］で示されるものであって、一般式[2]で示されるモノマー単位が[2-1-1]である組合せがより好ましく、一般式[1]で示されるモノマー単位が［1-1-1］であって、一般式[2]で示されるモノマー単位が[2-1-1]である組合せが特に好ましい。
（４）一般式[1]で示されるモノマー単位と一般式[2]で示されるモノマー単位を有するコポリマーの製造方法
一般式[1]で示されるモノマー単位と一般式[2]で示されるモノマー単位を有するコポリマーの製造方法としては、例えば下記一般式［１’］
Figure 0006107653
（式中、R1、R2、R3、X、n及びmは上記と同じ）で示されるモノマーと
一般式［２’］で示される
Figure 0006107653
（式中、R4は及びkは上記と同じ）ビニル化合物を、自体公知の、例えば特開昭52-27713号記載の方法に準じて重合反応により重合することにより製造することができる。
一般式［１’］で示されるモノマーの具体例及び好ましい具体例としては、上記一般式［１］で示されるモノマー単位に準じたものが挙げられる。また、一般式［１’］で示されるモノマーは、上記一般式[1]で示されるモノマー単位を有するホモポリマーの製造方法の項における、一般式［３］で示される（メタ）アクリル酸誘導体と一般式[４]で示されるカルボン酸化合物又はその塩との反応により得られる。
一般式［２’］で示されるビニル化合物の具体例としては、例えば４−ペンテン酸、５−ヘキセン酸、６−ヘプテン酸、７−オクテン酸、８−ノネン酸、９−デセン酸、１０−ウンデセン酸、４−メチル−４−ペンテン酸、５−メチル−５−ヘキセン酸、６−メチル−６−ヘプテン酸、７−メチル−７−オクテン酸、８−メチル−８−ノネン酸、９−メチル−９−デセン酸、１０−メチル−１０−ウンデセン酸等が挙げられるが、７−オクテン酸、８−ノネン酸、９−デセン酸、１０−ウンデセン酸等が好ましく、中でも１０−ウンデセン酸が好ましい。
これらビニル化合物は、市販品を用いてもよいし、ハロゲン化アルキル化合物から常法等により適宜合成したものを用いてもよい。
一般式［２’］で示されるビニル化合物の使用量は、一般式［１’］で示されるモノマーに対して通常1〜100mol%、好ましくは、3〜100mol%、より好ましくは、50〜100mol%である。
上記一般式［１’］で示されるモノマーと一般式［２’］で示されるビニル化合物との重合反応の態様としては、上記一般式[1]で示されるモノマー単位を有するポリマーの製造方法における重合反応と同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
一般式[１]で示されるモノマー単位と一般式[２]で示されるモノマー単位を有するコポリマーの製造方法としては、具体的には、一般式［１’］で示されるモノマー１molと、上記一般式[２’]で示されるビニル化合物0.01〜1molとを、水とDMFの混合溶液（容量比として1:2〜2:1）50〜100mLに溶解し、上記モノマーとビニル化合物の総重量に対して0.1〜3重量％の過酸化物を添加し、アルゴン雰囲気下、50〜70℃で1〜20時間重合反応させることによりなされる。
（５）本発明の凝集促進剤、免疫凝集測定方法、免疫凝集測定法用試薬
本発明の凝集促進剤は、上記の如き、一般式［１］で示されるモノマー単位を有するポリマーを含んでなるものであり、より具体的には、上記一般式［１］で示されるモノマー単位を有するホモポリマー、或いは、上記一般式［１］で示されるモノマー単位と一般式［２］で示されるモノマー単位を有するコポリマーを含んでなるものである。該凝集促進剤は、免疫凝集測定方法の中でも免疫比濁法で用いられる試薬に溶解させて用いられるのが好ましく、その中でもラテックスを担体に用いるラテックス凝集法用試薬に溶解させて用いられるのが特に好ましい。
本発明の免疫凝集測定方法においては、上記本発明の凝集促進剤を、反応液中の濃度として、通常0.1〜8w/v％、好ましくは0.1〜4w/v％、より好ましくは0.1〜2w/v％となるように添加して用いられる。また、該濃度は、測定対象物質により設定を変えるのが好ましく、例えば測定対象物質がCRPやFerの場合、通常0.1〜8w/v％、好ましくは0.1〜4w/v％、より好ましくは0.1〜1w/v％となるように添加して用いられ、例えば測定対象物質がPSAの場合、通常0.1〜7w/v％、好ましくは0.1〜4w/v％、より好ましくは0.1〜2w/v％となるように添加して用いられるのが好ましい。
本発明の免疫凝集測定方法は、抗原抗体反応を行わせる際に、本発明の凝集促進剤を共存させて行う以外は、抗原抗体反応に由来する凝集等に基づいて測定対象物質の測定を行う自体公知の免疫凝集測定方法（免疫比濁法、免疫比ろう法等）に於いて用いられる各種試薬を用い、自体公知の操作法に準じて行えばよい。例えば、上記本発明の凝集促進剤の共存下で、測定対象物質に対する抗体又は抗原を、測定対象物質と接触させて抗原抗体反応を行わせることによりなされればよく、より具体的には、例えば上記本発明凝集促進剤の共存下で、測定対象物質に対する抗体又は抗体を担持した担体を、或いは、測定対象物質に対する抗原又は抗原を担持した担体を、測定対象物質と接触させて抗原抗体反応を行わせることによりなされればよい。上記方法における本発明の凝集促進剤は、上記した如き反応液中の濃度で共存させればよい。上記本発明の凝集促進剤を共存させる以外の具体的な方法としては、例えば散乱光を測定する方法（比ろう法）を用いる場合には、例えば金原出版株式会社，臨床検査法提要，第30版,第2刷，p.851-853(1993)，等に記載された方法に準じて行えばよく、また、透過光を測定する方法（免疫比濁法）を用いる場合には、例えば同じく金原出版株式会社，臨床検査法提要，第30版,第2刷，p.853-854(1993)等に記載された方法に準じて行えばよい。更にまた、測定対象物質に対する抗体又は抗原を感作させたラテックスの凝集の程度を散乱光、透過光等の変化に基づいて測定しその結果に基づいて測定対象物質の測定を行うラテックス凝集法を用いる場合には、例えば免疫測定法の新しい活用事例と診断試薬・治療薬開発への応用（経営教育出版社）p.103-187等に記載された方法に準じて行えばよい。
本発明の免疫凝集測定方法の反応時に用いられる緩衝剤としては、具体的には例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等通常免疫比濁法、免疫比ろう法に用いられている緩衝剤は全て挙げられ、測定反応時のｐＨとしては抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されないが、通常６〜１０の範囲から好ましく選択される。
本発明の免疫凝集測定方法に於ける測定は、散乱光又は透過光を測定することによりなされ、その測定は、自動分析装置、分光光度計等の生化学汎用機や、レーザーネフェロメーター等の比ろう測定用専用機等を用いてなされればよい。
本発明の免疫凝集測定方法により測定可能な測定対象成分は、抗原抗体反応を利用して測定可能なものであればよいが、例えば血清、血漿、尿、リンパ、髄液等の生体由来試料中に含まれる、例えばＣ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンE（ＩｇE）ＡＳＯ（抗ストレプトリジンＯ価）、アルブミン、尿中微量アルブミン、プレアルブミン、補体Ｃ3、補体 Ｃ4、トランスフェリン、ハプトグロビン、リポプロテイン（ａ）（ＬＰ(a)）、アポリポ蛋白Ａ-Ｉ（ＡｐｏＡＩ）、アポリポ蛋白Ａ-II（ＡｐｏＡII）、アポリポ蛋白Ｂ（ＡｐｏＢ）、アポリポ蛋白Ｃ-II（ＡｐｏＣII）、アポリポ蛋白Ｃ-III（ＡｐｏＣIII）、アポリポ蛋白Ｅ（ＡｐｏＥ）、リウマチ因子（ＲＦ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、フェリチン（Ｆｅｒ）、β2マイクロアルブミン（β2ｍ）、ミオグロビン（Ｍｂ）、ペプシノゲン（ＰＧ）、ヒアルロン酸（ＨＡ）、クレアチンキナーゼＭＢアイソザイム（ＣＫ−ＭＢ）、梅毒ＴＰ抗体、梅毒脂質抗体、ヘリコバクターピロリ抗原・抗体、ＨＣＶ抗原・抗体、ＨＢｓ抗原・抗体、ＨＩＶ抗原・抗体、シスタチンＣ、マトリックスメタロプロティナーゼ-３（ＭＭＰ−３）、ＫＬ−６、α-フェトプロテイン（ＡＦＰ）、 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、インスリン、Ｃ-ペプタイド等が挙げられ、中でも、CRP、Fer、PSA又はCK-MB等が好ましい。尚、CK-MBを測定対象とする場合には、一般式[1]で示されるモノマー単位と下記一般式[2]で示されるモノマー単位を有するコポリマーを含んでなる凝集促進剤を用いるのが好ましい。
本発明の免疫凝集測定法用試薬は、上記本発明の凝集促進剤を含むものであればよいが、その含有量は、試薬中の濃度として、通常0.1〜10w/vW/V％、好ましくは0.1〜5w/v％、より好ましくは0.1〜2w/v％である。また、該濃度は、測定対象物質により変えるのが好ましく、例えば測定対象物質がCRPやFerの場合、通常0.1〜10w/v％、好ましくは0.1〜5w/v％、より好ましくは0.1〜1w/v％であり、例えば測定対象物質がPSAの場合、通常0.1〜10w/v％、好ましくは0.1〜5w/v％、より好ましくは0.1〜2w/v％である。該試薬においては、その他に、例えば、測定対象成分が抗原の場合は、抗体若しくは該抗体を担持した適当な担体（例えばラテックス等）を、測定対象成分が抗体の場合は、抗原若しくは該抗原を担持した適当な担体（例えばラテックス等）を含んでいてもよい。また、該反応試薬中には、緩衝剤（例えばトリス緩衝剤、リン酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッド緩衝剤等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、防腐剤（例えばサリチル酸、安息香酸、アジ化ナトリウム等）、その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬等の安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲で用いればよい。
本発明の免疫凝集測定法用試薬に於ける、測定対象としては、本発明の免疫凝集測定方法の項で記載したものと同じものが挙げられ、好ましいものも同じである。
以下実施例によって本発明を説明するが、本発明はこれによって限定されるものでない。
合成例１．ポリマー１〜３の合成
(1)Ｎ−〔２−（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸（モノマーＡ）の合成
297g(4.5mol)の水酸化カリウムを1.6Lのエタノールに溶解し、該溶液に426g(4.5mol)のクロロ酢酸（和光純薬工業(株)製）を添加した後、室温で２時間攪拌反応させた。次いで、反応により析出した結晶を濾取し、イソプロパノールで洗浄した。更に、洗浄した結晶を1Lのイソプロパノールに懸濁し、該懸濁液に475g(3.0mol)のＮ−〔２−（ジメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸（和光純薬工業(株)製)を添加した後、還流下で１２時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、該不溶物をイソプロパノールで洗浄し、該洗浄液を回収した。濾液と洗浄液を混合して減圧乾燥した後、得られた残渣にアセトンを添加して結晶を析出させた。その後、析出した結晶を濾取し、減圧乾燥して420ｇのＮ−〔２−（カルボキシメチルジメチルアミノ）エチル〕メタアクリル酸（以下、モノマーＡと略記する）を得た。
Figure 0006107653
(2)ポリマー１〜３の合成
上記(1)で得たモノマーＡ（11g〜22g）をイオン交換水（90mL〜180mL）に溶解した後、５〜30分間のアルゴンガス置換を行った。この溶液に2mLの10%-ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液を添加した後、50℃で１〜２時間攪拌反応させた。反応終了後、該反応液を透析チューブ［スペクトラポア２（分画分子量12K〜14K、Spectrum社製），イオン交換水；5L×3回］で精製した。上記操作を３回行い、得られたポリマー溶液をそれぞれ凍結乾燥し、9.4g〜14.8gのポリマー１〜３を得た。
ポリマー１〜３については、1H-NMRスペクトル分析により、メタクリル酸セグメント(0.84ppm〜1.32ppm)の存在を、IRスペクトル分析により、カルボニル基（-C=O）(1725cm-1)の存在をそれぞれ確認した。
ポリマー１〜３の物性について、GPC（SB-806M-HQ、Shodex社製）で測定した結果を下記表に示した。
Figure 0006107653
合成例２.ポリマー４の合成
(1)Ｎ−（４−ジメチルアミノ）ブチルメタアクリル酸の合成
23g(0.2mol)のＮ−（４−ジメチルアミノ）ブタノール（和光純薬工業(株)製）を200mLのクロロホルムに溶解し、氷冷下で該溶液に25g(0.24mol)のメタアクリル酸クロリド（和光純薬工業(株)製）を添加した後、室温で1.5時間攪拌しながら反応させた。次いで、得られた反応溶液を飽和重曹水及び飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。その後、硫酸マグネシウムを濾別し、得られた濾液を減圧濃縮して38gのＮ−〔４−（ジメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸を得た。
(2)Ｎ−〔４−（カルボキシメチルジメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸（モノマーＢ）の合成
12g(0.21mol)の水酸化カリウムを150mLのエタノールに溶解し、該溶液に20g(0.21mol)のクロロ酢酸（和光純薬工業(株)製）を添加した後、室温で２時間攪拌して反応させた。次いで、反応により析出した結晶を濾取し、エタノールで洗浄した。その後、洗浄した結晶を50mLのエタノールに懸濁し、上記(1)で得た38g(0.2mol)のＮ−（４−ジメチルアミノ）ブチルメタアクリル酸を添加した後、還流下で１２時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、エタノールで洗浄し、該洗浄液を回収した。濾液と洗浄液とを混合して減圧乾燥した後、得られた残渣にアセトンを添加して結晶を析出させた。その後、析出した不溶物を濾別し、減圧濃縮して26gのＮ−〔４−（カルボキシメチルジメチルアミノ）ブチル〕メタアクリル酸（以下モノマーＢと略記する）を得た。
Figure 0006107653
(3)ポリマー４の合成
上記(2)で得た25gのモノマーＢを90mLのイオン交換水に溶解し、30分間のアルゴンガス置換を行った。この溶液に2mLの10%-ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液を添加した後、50℃で２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブ［スペクトラポア２（分画分子量12K〜14K、Spectrum社製），イオン交換水；5L×3回］で精製した。精製後、得られたポリマー溶液を凍結乾燥し、17.2ｇのポリマー４を得た。
ポリマー４については、1H-NMRスペクトル分析により、メタクリル酸セグメント(0.84ppm〜1.45ppm)の存在を、IRスペクトル分析により、カルボニル基（-C=O）(1725cm-1)の存在をそれぞれ確認した。
ポリマー４の物性をGPC（SB-806M-HQ、Shodex社製）により測定した結果、重量平均分子量は807,920，分子量分布は3.895であった。
合成例３．ポリマー５の合成
(1)Ｎ−〔３−（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド（モノマーＣ）の合成
198g(3.0mol)の水酸化カリウムを1Lのエタノールに溶解し、284g(3.0mol)のクロロ酢酸（和光純薬工業（株）製）を添加した後、室温で２時間攪拌反応させた。次いで、反応により析出した結晶を濾取し、イソプロパノールで洗浄した。その後、洗浄した結晶を400mLのイソプロパノールに懸濁し、該懸濁液に511g(3.0mol)のＮ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド（和光純薬工業（株）製)を添加した後、還流下で１２時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、イソプロパノールで洗浄し、該洗浄液を回収した。濾液と洗浄液とを混合して減圧乾燥した後、得られた残渣にアセトンを添加して結晶を析出させた。その後、析出した結晶を濾取し、減圧乾燥して565ｇのＮ−〔３−（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕アクリルアミド〔以下モノマーＣと略記する〕を得た。
Figure 0006107653
(2)ポリマー５の合成
上記(1)で得た46gのモノマーＣを90mLのイオン交換水に溶解し、30分間のアルゴンガス置換を行った。次いで、この溶液に2mLの10%-ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液を添加した後、50℃で２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブ［スペクトラポア２（分画分子量12K〜14K、Spectrum社製），イオン交換水；5L×3回］で精製した。精製後、得られたポリマー溶液を凍結乾燥することで26.2ｇのポリマー５を得た。
ポリマー５については、1H-NMRスペクトル分析により、メタクリル酸セグメント(1.13ppm〜2.05ppm)の存在を、IRスペクトル分析により、アミド基（-NH-C=O）(1640cm-1,1540cm-1)の存在をそれぞれ確認した。
ポリマー５の物性をGPC（SB-806M-HQ、Shodex社製）により測定した結果、重量平均分子量は262,065、分子量分布は4.332であった。
合成例４．ポリマー６の合成
(1)Ｎ−〔３−（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕メタアクリルアミド（モノマーＤ）の合成
198g(3.0mol)の水酸化カリウムを1Lのエタノールに溶解し、284g(3.0mol)のクロロ酢酸（和光純薬工業（株）製）を添加した後、室温で２時間攪拌反応させた。次いで、反応により析出した結晶を濾取し、イソプロパノールで洗浄した。その後、洗浄した結晶を400mLのイソプロパノールに懸濁し、該懸濁液に511g(3.0mol)のＮ−〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕メタアクリルアミド（和光純薬工業（株）製)を添加した後、還流下で12時間攪拌反応させた。反応終了後、不溶物を濾別し、イソプロパノールで洗浄し、該洗浄液を回収した。濾液と洗浄液とを混合して減圧乾燥した後、得られた残渣にアセトンを添加して結晶を析出させた。その後、析出した結晶を濾取し、減圧乾燥して565ｇのＮ−〔３−（カルボキシメチルジメチルアミノ）プロピル〕メタアクリルアミド〔以下モノマーＤと略記する〕を得た。
Figure 0006107653
(2)ポリマー６の合成
上記(1)で得た21gのモノマーＤを90mLのイオン交換水に溶解し、30分間のアルゴンガス置換を行った。次いで、この溶液に2mLの10%-ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液を添加した後、50℃で２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブ［スペクトラポア２（分画分子量12K〜14K、Spectrum社製），イオン交換水；5L×3回］で精製した。精製後、得られたポリマー溶液を凍結乾燥することで。13.5ｇのポリマー６を得た。
ポリマー６については、1H-NMRスペクトル分析により、メタクリル酸セグメント(1.10ppm〜2.00ppm)の存在を、IRスペクトル分析により、アミド基（-NH-C=O）(1640cm-1,1540cm-1)の存在をそれぞれ確認した。
ポリマー６の物性をGPC（SB-806M-HQ、Shodex社製）により測定した結果、重量平均分子量は407,359、分子量分布は2.375であった。
合成例５．コポリマー１の合成
上記合成例１で得た22gのモノマーＡと1.8gの10-ウンデセン酸（和光純薬工業（株）製）を50mLのイオン交換水と40mLのＤＭＦとの混合溶媒に溶解し、30分間のアルゴンガス置換を行った。次いで、この溶液に2mLの10%-ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液を添加した後、50℃で２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブ［スペクトラポア２（分画分子量12K〜14K、Spectrum社製），イオン交換水；5L×3回］で精製した。精製後、得られたポリマー溶液を凍結乾燥することで16.2ｇのコポリマー１を得た。尚、コポリマー１はウンデセン酸由来のモノマー単位（以下、モノマー単位Ｅと略記する）を40モル％含む。
コポリマー１については、1H-NMRスペクトル分析により、メタクリル酸由来のモノマー単位 (1.10ppm〜2.00ppm)及びウンデセン酸由来のモノマー単位(1.03ppm)の存在を、IRスペクトル分析により、カルボニル基（-C=O）(1725cm-1)の存在をそれぞれ確認した。
コポリマー１の物性をGPC（SB-806M-HQ、Shodex社製）により測定した結果、重量平均分子量は658,206，分子量分布は2.216であった。
合成例６．コポリマー２の合成
上記合成例１で得た22gのモノマーＡと7.4gの１０−ウンデセン酸（和光純薬工業（株）製）を50mLのイオン交換水と40mLのＤＭＦとの混合溶媒に溶解し、30分間のアルゴンガス置換を行った。次いで、この溶液に2mLの10%-ペルオキソ二硫酸アンモニウム溶液を添加した後、50℃で２時間攪拌反応させた。反応終了後、反応液を透析チューブ［スペクトラポア２（分画分子量12K〜14K、Spectrum社製），イオン交換水；5L×3回］で精製した。精製後、得られたポリマー溶液を凍結乾燥することで19.4ｇのコポリマー２を得た。尚、コポリマー２は、モノマー単位Ｅを5モル％含む。
コポリマー２については、1H-NMRスペクトル分析により、メタクリル酸セグメント(1.10ppm〜2.00ppm)及びウンデセン酸セグメント(1.03ppm)の存在を、IRスペクトル分析により、カルボニル基（-C=O）(1725cm-1)の存在をそれぞれ確認した。
コポリマー２の物性をGPC（SB-806M-HQ、Shodex社製）により測定した結果、重量平均分子量は957,680，分子量分布は2.041であった。
実施例１ 分子量の異なるポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるCRPの測定
(1)抗ヒトCRP抗体感作(固定化)ラテックス試薬の調製
抗ヒトCRP山羊ポリクローナル抗体（オリエンタル酵母工業（株）製）1mg/mLを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 4.5mLと、粒径0.12μmのポリスチレンラテックス（日本ペイント(株）製）の10w/v％水溶液0.5mLとを混合し、７℃で一晩反応させた。その後、得られた懸濁液 5mLとウシ血清アルブミン（BSA）を2.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 5mLとを混合し、７℃で２時間反応させた。次いで、遠心分離（45,000g、30分）により分離したラテックス全量を50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 5mLで洗浄し、BSAを0.5W/V%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 12.5mLに懸濁させ、該懸濁液を抗ヒトCRP抗体感作ラテックス溶液1)とした。また、上記と同様にして粒径0.2μmのポリスチレンラテックス（日本ペイント(株）製）を用いて調製したものを、抗ヒトCRP抗体感作ラテックス溶液2)とした。
(2)試料
試薬盲検測定用試料（ブランク）には、生理食塩水（0.85%NaCl）を使用した。試料には、LT・CRP-HSキャリブレーターセットHO（和光純薬工業(株)製、CRP濃度がそれぞれ0.2 mg/dL、1.0 mg/dL、4.0 mg/dL、18.0 mg/dL、35.0mg/dLのもの）を使用した。
(3)試薬
第一試薬
合成例１で合成した、ポリマー１、ポリマー２又はポリマー３を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を調製し、３種類の第一試薬を準備した。
第二試薬
上記(1)で調製した抗ヒトCRP抗体感作ラテックス1) 12mL及び抗ヒトCRP抗体感作ラテックス2) 8mLを混合したものを第二試薬とした。
(4)測定方法
上記試料、上記第一試薬及び上記第二試薬を下記条件でBM-8形自動分析装置（日本電子(株)製）を用いて、試料中のCRP濃度を測定した。
試料 ： 7.5μL（生理食塩水で5倍希釈）
第一試薬 ： 100μL
第二試薬 ： 25μL
測定方法 ： 2ポイントエンド法（34-65）
主波長 ： 596nm
得られた結果を表１に示す。
比較例１ 従来の免疫凝集促進剤を用いたラテックス免疫凝集測定法によるCRPの測定
実施例１のポリマー１〜３の代わりにポリエチレングリコール6,000（PEG6,000、和光純薬工業(株)製）又はMPCポリマー（日油(株)製）を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1％BSA及び1％NaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例１と同様の方法によりCRPを測定した。その結果を、実施例１の結果と併せて表１に示す。
Figure 0006107653
表１の結果より、CRP測定系においてポリマー１、２及び３はいずれも、従来品である比較例１のPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことが判った。また、その効果はポリマーの分子量が高いほど優れた効果を示すことが判った。
実施例２ 分子量の異なるポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるFerの測定
(1)抗ヒトFer抗体感作(固定化)ラテックス試薬の調製
抗ヒトFer兎ポリクローナル抗体（Dako社製）0.6mg/mLを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 1mlと、粒径0.3μmのポリスチレンラテックス（積水化学工業(株）製）を2w/v％含むように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 1mlとを混合し、25℃で２時間反応させた。その後、得られた懸濁液 2mLとBSAを1.25w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 2mLとを混合し、７℃で２時間反応させた。次いで、遠心分離（45,000g、30分）により分離したラテックス全量を50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 4mLで洗浄し、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 20mLに懸濁したものを、抗ヒトFer抗体感作ラテックス溶液とした。
(2)試料
試薬盲検測定試料（ブランク）には、生理食塩水（0.85%NaCl）を使用した。試料には、フェリチンキャリブレーターセット（和光純薬工業(株)製、Fer濃度が、それぞれ30 ng/mL、100 ng/mL 、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mLのもの）を使用した。
(3)試薬
第一試薬
合成例１で合成した、ポリマー１、ポリマー２又はポリマー３を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1MHEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を調製し、３種類の第一試薬を準備した。
第二試薬
上記(1)で調製した抗ヒトFer抗体感作ラテックス溶液を第二試薬とした。
(4)測定方法
上記試料、上記第一試薬及び上記第二試薬を下記条件でBM-8形自動分析装置（日本電子(株)製）を用いて、試料中のFer濃度を測定した。
試料 ： 12.0μL（生理食塩水で2倍希釈）
第一試薬 ： 90μL
第二試薬 ： 30μL
測定方法 ： 2ポイントエンド法（35-59）
主波長 ： 694nm
得られた結果を表２に示す。
比較例２ 従来の免疫凝集促進剤を用いたラテックス免疫凝集測定法によるFerの測定
実施例２のポリマー１〜３の代わりにポリエチレングリコール6,000（PEG6,000, 和光純薬工業(株)製）又はMPCポリマー（日油(株)製）を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1MHEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例２と同様の方法によりFerを測定した。
その結果を、実施例２の結果と併せて表２に示す。
Figure 0006107653
表２の結果より、Fer測定系においてポリマー１、２及び３のいずれも、比較例２のPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことが判った。また、その効果はCRP測定系と同様に、ポリマーの分子量が高いほど優れていることが判った。
実施例３ 分子量の異なるポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるPSAの測定
(1)抗ヒトPSA抗体感作(固定化)ラテックス試薬の調製
抗ヒトPSAモノクローナル抗体（クローンNo.PSA10、和光純薬工業(株)製）0.6mg/mLを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.1) 1mlと、粒径0.28μmのポリスチレンラテックス（積水化学工業(株）製）を2w/v％含むように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.1) 1mlとを混合し、25℃で２時間反応させた。その後、該懸濁液から遠心分離（45,000g、30分）によりラテックス全量を分離し、50mMホウ酸緩衝液(pH7.1) 2mLで洗浄した。次いで、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.3) 2mLに懸濁したものを抗ヒトPSA抗体感作ラテックス溶液1)とした。
また、上記と同様にして抗ヒトPSAモノクローナル抗体（クローンNo.PSA14、和光純薬工業(株)製）1.4mgを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.1) 1mlと、粒径0.15μmのポリスチレンラテックス（積水化学工業(株）製）を2w/v％含むように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.1) 1mlとを混合して調製したものを、抗ヒトPSA抗体感作ラテックス溶液2)とした。
(2)試料
試薬盲検測定試料（ブランク）には、リン酸緩衝液（1w/v%BSA、0.85%NaCl含有10mMリン酸緩衝液）を使用した。試料には、PSAキャリブレーターセット（和光純薬工業(株)製、PSA濃度が、それぞれ5.0ng/mL、10.0ng/mL、39.8 ng/mL、69.3ng/mL、98.6ng/mLのもの）を使用した。
(3)試薬
第一試薬
合成例１で合成した、ポリマー１、ポリマー２又はポリマー３を0.75w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1MHEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を調製し、３種類の第一試薬を準備した。
第二試薬
上記(1)で調製した抗ヒトPSA抗体感作ラテックス1)および2)をそれぞれ2mLずつ、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 16mLに懸濁し混合したものを第二試薬とした。
(4)測定方法
上記試料、上記第一試薬及び上記第二試薬を下記条件でBM-8形自動分析装置（日本電子(株)製）を用いて、試料中のPSA濃度を測定した。得られた結果を表３に示す。
試料 ： 18.0μL（生理食塩水で2倍希釈）
第一試薬 ： 90μL
第二試薬 ： 30μL
測定方法 ： 2ポイントエンド法（37-65）
主波長 ： 694nm
比較例３ 従来の免疫凝集促進剤を用いたラテックス免疫凝集測定法によるPSAの測定
実施例３のポリマー１〜３の代わりにポリエチレングリコール6,000（PEG6,000, 和光純薬工業(株)製）又はMPCポリマー（日油(株)製）を凝集促進剤として0.75w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1MHEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例３と同様の方法によりPSAを測定した。
その結果を、実施例３の結果と併せて表３に示す。
Figure 0006107653
表３の結果より、PSA測定系においてポリマー１、２及び３のいずれも、比較例３のPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことが判った。また、その効果は、CRP測定系やFer測定系と同様、ポリマーの分子量が高いほど優れていることが判った。
実施例４ 各種ポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるCRPの測定
ポリマー１〜３の代わりにポリマー４〜６を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例１と同様の方法によりCRPを測定した。その結果を表４に示す。
Figure 0006107653
表４の結果より、CRP測定系においてポリマー４、５及び６はいずれも、ポリマー１〜３と同様、高い凝集促進効果を示すことが判った。また、従来品であるPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例５ 各種ポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるFerの測定
ポリマー１〜３の代わりにポリマー４〜６を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例２と同様の方法によりFerを測定した。その結果を表５に示す。
Figure 0006107653
表５の結果より、Fer測定系においてもポリマー４、５及び６はいずれも、ポリマー１〜３と同様、高い凝集促進効果を示すことが判った。また、従来品であるPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例６ 各種ポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるPSAの測定
ポリマー１〜３の代わりにポリマー４〜６を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1M HEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例３と同様の方法によりPSAを測定した。その結果を表６に示す。
Figure 0006107653
表６の結果より、PSA測定系においてもポリマー４、５及び６はいずれも、ポリマー１〜３と同様、高い凝集促進効果を示すことが判った。また、従来品であるPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例７ コポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるCRPの測定
ポリマー１〜３の代わりにコポリマー１又は２を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例１と同様の方法によりCRPを測定した。その結果を表７に示す。
Figure 0006107653
表７の結果より、CRP測定系においてコポリマー１および２はいずれも、ポリマー１〜６と同様に高い凝集促進効果を示すことが判った。また、従来品であるPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例８ コポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるFerの測定
ポリマー１〜３の代わりにコポリマー１又は２を凝集促進剤として0.4w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1MHEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例２と同様の方法によりFerを測定した。その結果を表８に示す。
Figure 0006107653
表８の結果より、Fer測定系においてもコポリマー１および２のいずれも、ポリマー１〜６と同様に高い凝集促進効果を示すことが判った。また、従来品であるPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例９ コポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるPSAの測定
ポリマー１〜３の代わりにコポリマー１又は２を凝集促進剤として0.75w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1MHEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例３と同様の方法によりPSAを測定した。その結果を表９に示す。
Figure 0006107653
 表９の結果より、PSA測定系においてもコポリマー１および２のいずれも、ポリマー１〜６と同様に高い凝集促進効果を示すことが判った。また、従来品であるPEG6,000やMPCよりも高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例１０ コポリマーを免疫凝集促進剤として用いたラテックス免疫凝集測定法によるCK-MBの測定
(1)抗ヒトCK-MB抗体感作(固定化)ラテックス試薬の調製
抗ヒトCK-MBモノクローナル抗体（クローンMAK〈CK-MB〉M-7.4.5-IgG、Roche社製）0.8mg/mLを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 1mlと、粒径0.4μmのポリスチレンラテックス（藤倉化成(株)製）を2w/v％含むように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 1mlとを混合し、25℃で2時間反応させた。その後、遠心分離（45,000g、30分）により分離したラテックス全量を50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 2mLで洗浄した。次いで、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 2mLに懸濁させ、抗ヒトCK-MB抗体感作ラテックス溶液1)とした。
また、上記と同様の方法により、抗ヒトCK-MBモノクローナル抗体（クローンMAK〈CK-MB〉M-6.12.47-IgG、Roche社製）0.8mgを含む50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 1mlと、粒径0.4μmのポリスチレンラテックス(藤倉化成(株）製）を2w/v％含むように懸濁させた50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 1mlとを混合して調製したものを、抗ヒトCK-MB抗体感作ラテックス溶液2)とした。
(2)試料
試薬盲検測定用試料（ブランク）には、生理食塩水（0.85%NaCl）を使用した。試料は、CK-MB抗原（ヒト由来CK-MB、Cliniqa社製）をリン酸緩衝液（10mMリン酸、1w/v%BSA、0.85%NaCl含有）で希釈し、濃度がそれぞれ5.2ng/mL、19.0ng/mL、47.9ng/mL、98.7ng/mL、204.3ng/mLとなるように調製したものを使用した。
(3)試薬
第一試薬
ポリマー１、コポリマー１又はコポリマー２を凝集促進剤として0.75w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1M HEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を調製し、３種類の第一試薬を準備した。
第二試薬
上記(1)で調製した抗ヒトCK-MB抗体感作ラテックス溶液1)および2)をそれぞれ2mLずつ、BSAを0.5w/v%含有する50mMホウ酸緩衝液(pH7.5) 16mLに懸濁し混合したものを第二試薬とした。
(4)測定方法
上記試料、上記第一試薬及び上記第二試薬を下記条件でBM-8形自動分析装置（日本電子(株)製）を用いて、試料中のCK-MB濃度を測定した。
試料 ： 12.0μL（生理食塩水で2倍希釈）
第一試薬 ： 90μL
第二試薬 ： 30μL
測定方法 ： 2ポイントエンド法（34-65）
主波長 ： 596nm
得られた結果を表１０に示す。
比較例４ 従来の免疫凝集促進剤を用いたラテックス免疫凝集測定法によるCK-MBの測定
ポリマー１、コポリマー１及びコポリマー２の代わりにポリエチレングリコール6,000（PEG6,000, 和光純薬工業(株)製）又はMPCポリマー（日油(株)製）を凝集促進剤として0.75％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1M HEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例１０と同様の方法によりCK-MBを測定した。その結果を、実施例１０の結果と併せて表１０に示す。
Figure 0006107653
表１０の結果より、CK-MB測定系においてポリマー２、コポリマー１および２のいずれにもこれらを添加することにより、比較例４のPEG6,000またはMPCよりも高い凝集促進効果を示すことが判った。更に、ホモポリマーであるポリマー２よりもコポリマーであるコポリマー１および２の方がより高い凝集促進効果を示すことも判った。
実施例１１ 免疫凝集促進剤の含量が異なるラテックス免疫凝集測定法によるCRPの測定
ポリマー１を0.24w/v％、0.32w/v％、0.56w/v％又は0.72w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1Mトリス緩衝液(pH8.0)を第一試薬として用いた以外は、実施例１と同様の方法によりCRPを測定した。その結果を表１１に示す。
Figure 0006107653
表１１の結果から明らかな様に、CRP測定系におけるポリマー１は、その添加量が多ければ多いほど、凝集促進効果が高くなることが判った。
実施例１２ 免疫凝集促進剤の含量が異なるラテックス免疫凝集測定法によるFerの測定
第一試薬として、ポリマー１を0.25w/v％、0.31w/v％、0.49w/v％又は0.61w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1M HEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を用いた以外は、実施例２と同様の方法によりFerを測定した。その結果を表１２に示す。
Figure 0006107653
表１２の結果から明らかな様に、Fer測定系におけるポリマー１は、その添加量が多ければ多いほど、凝集促進効果が高くなることが判った。
実施例１３ 免疫凝集促進剤の含量が異なるラテックス免疫凝集測定法によるPSAの測定
第一試薬として、ポリマー１を0.60w/v％、0.90w/v％、1.35w/v％又は1.50w/v％含有した、0.1%BSA及び1%NaClを含む0.1M HEPES-NaOH緩衝液(pH7.0)を用いた以外は、実施例３と同様の方法によりPSAを測定した。その結果を表１３に示す。
Figure 0006107653
表１３の結果から明らかな様に、PSA測定系におけるポリマー１は、その添加量が多ければ多いほど、凝集促進効果が高くなることが判った。

Claims (11)

  1. 下記一般式[1]
    Figure 0006107653
    （式中、R1は水素原子又はメチル基を表し、R2及びR3はそれぞれ独立してメチル基又はエチル基を表し、Xは−NH−又は酸素原子を表し、nは1〜6の整数を表し、mは1〜3の整数を表す）で示されるモノマー単位を有するポリマーを含んでなる免疫凝集測定法用凝集促進剤。
  2. 前記ポリマーが、下記一般式[1]
    Figure 0006107653
    （式中、R1は水素原子又はメチル基を表し、R2及びR3はそれぞれ独立してメチル基又はエチル基を表し、Xは−NH−又は酸素原子を表し、nは1〜6の整数を表し、mは1〜3の整数を表す）で示されるモノマー単位と下記一般式[2]
    Figure 0006107653
    （式中、R4は水素原子又はメチル基を表し、kは1〜10の整数を表す）で示されるモノマー単位を有するコポリマーである、請求項１記載の凝集促進剤。
  3. コポリマー中の一般式[1]で示されるモノマー単位の含有量が50モル％以上100モル％未満である、請求項２記載の凝集促進剤。
  4. ポリマーの重量平均分子量が、50,000〜3,000,000である、請求項１記載の凝集促進剤。
  5. 一般式[1]におけるR2及びR3がいずれもメチル基である、請求項１記載の凝集促進剤。
  6. 一般式[1]におけるnが2〜4であり、mが1である、請求項１記載の凝集促進剤。
  7. 一般式[2]におけるR4が水素原子であり、kが4〜8である、請求項２記載の凝集促進剤。
  8. 請求項１記載の凝集促進剤を含んでなる免疫凝集測定法用試薬。
  9. 試薬が、C反応性タンパク質（CRP）、血清フェリチン（Fer）、前立腺特異抗原（PSA）又はクレアチンキナーゼ−MB（CK-MB）測定用である、請求項８記載の免疫凝集測定法用試薬。
  10. 請求項１記載の免疫凝集測定法用凝集促進剤の共存下で、測定対象物質に対する抗体又は抗原を、測定対象物質と接触させて抗原抗体反応を行わせることを特徴とする、免疫凝集測定方法。
  11. 測定対象物質が、C反応性タンパク質（CRP）、血清フェリチン（Fer）、前立腺特異抗原（PSA）又はクレアチンキナーゼ−MB（CK-MB）である、請求項１０記載の免疫凝集測定方法。
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