KR20140043371A - 응집촉진제 - Google Patents

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KR20140043371A
KR20140043371A KR1020137032151A KR20137032151A KR20140043371A KR 20140043371 A KR20140043371 A KR 20140043371A KR 1020137032151 A KR1020137032151 A KR 1020137032151A KR 20137032151 A KR20137032151 A KR 20137032151A KR 20140043371 A KR20140043371 A KR 20140043371A
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polymer
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acid
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KR1020137032151A
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나오유키 야마모토
츠토무 마스다
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와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 종래의 면역응집촉진제보다도 뛰어난 응집촉진효과를 나타내는 응집촉진제의 제공을 과제로 하고, 하기 일반식[1] (식 중, R1는 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, R2 및 R3는 각각 독립하여 메틸기 또는 에틸기를 나타내며, X는 -NH－ 또는 산소원자를 나타내고, n은 1~6의 정수를 나타내며, m은 1~3의 정수를 나타낸다)로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머를 포함하여 이루어지는 면역응집 측정법용 응집촉진제, 및 상기 면역응집 측정법용 응집촉진제의 공존하에서, 측정대상 물질에 대한 항체 또는 항원을, 측정대상 물질과 접촉시켜 항원항체 반응을 실시하는 면역응집 측정방법에 관한다.

Description

응집촉진제{AGGLUTINATION ENHANCER}
면역응집 측정법에 이용되는 응집촉진제, 및 그것을 이용한 면역응집 측정법에 관한다.
예를 들면, 혈청, 혈장, 뇨 등의 생체 유래 시료 중의 측정대상 물질의 유무 또는 농도를 측정하기 위하여, 측정대상 물질과 반응하는 항원 또는 항체를 고정화시킨 라텍스 등의 불용성 담체를 이용하여, 발생하는 응집의 정도로부터 측정대상 물질의 유무를 확인하는 것이나 농도를 측정하는 것은, 면역응집 측정법으로서 종래부터 행해지고 있다.
이 면역응집법에서는, 감도의 향상을 목적으로 하여 항원항체 반응에 근거하는 응집을 보다 쉽게 발생하게 하는 면역응집촉진제가 통상 이용된다. 당해 면역응집촉진제로서는, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등이 잘 알려져 있지만, PEG는 염의 농도가 높은 용액 안에서는 염석하기 때문에, 공백값이 높아지고 측정 정밀도가 나빠지는 문제가 있었다.
거기서, 이러한 문제를 해결하는 면역응집촉진제로서 메타크릴로일옥시에틸포스포코올린(MPC) 함유의 폴리머를 이용하는 것이 고안되어 있다(특허문헌 1).
특허문헌 1 : 특개2002-365296
현재, 보다 고감도의 측정을 가능하게 하는 면역응집 측정방법이 요구되고 있고, 당해 MPC 함유의 폴리머보다 강한 응집촉진효과를 나타내는 면역응집촉진제의 개발이 기대되고 있었다. 본 발명은, 상기 상황을 감안하여 고감도의 면역응집 측정을 가능하게 하는, 종래의 면역응집촉진제보다 뛰어난 응집촉진효과를 나타내는 응집촉진제의 제공을 과제로 한다.
상기 문제를 해결하기 위해서 본 발명자들이 열심히 연구를 거듭한 결과, 하기 일반식[1]
Figure pct00001
(식 중, R1는 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, R2 및 R3는 각각 독립하여 메틸기 또는 에틸기를 나타내며, X는 -NH- 또는 산소원자를 나타내고, n은 1~6의 정수를 나타내며, m은 1~3의 정수를 나타낸다)로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머가, 종래의 면역응집촉진제보다 뛰어난 응집촉진효과를 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은,
「하기 일반식[1]
Figure pct00002
(식 중, R1, R2, R3, X, n 및 m은 상기와 같다)로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머를 포함하여 이루어지는 면역응집 측정법용 응집촉진제이고,
상기 폴리머가, 상기 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 하기 일반식[2]
Figure pct00003
(식 중, R4는 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, k는 1~10의 정수를 나타낸다)로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머인 응집촉진제를 포함하여 이루어지는 면역응집 측정법용 시약, 및 상기 면역응집 측정법용 응집촉진제의 공존하에서, 측정대상 물질에 대한 항체 또는 항원을 측정대상 물질과 접촉시켜 항원항체 반응을 시키는 것을 특징으로 하는 면역응집 측정방법」에 관한다.
본 발명의 면역응집촉진제는, 종래의 면역응집촉진제와 비교하여, 보다 강한 응집촉진효과를 가진다. 따라서, 항원 혹은 항체를 고정화시킨 라텍스 입자 등의 담체를 이용하여 발생시킨 항원항체 반응 생성물의 응집을 이용한 면역비탁법(turbidimetric immunoassay), 면역네펠로법(nephelometric immunoassay) 등의 면역응집 측정법에 있어서, 본 발명의 면역응집촉진제를 이용함에 따라, 항원항체 반응에 의한 응집이 쉽게 일어나도록 한다. 그 결과, 고감도의 측정을 가능하게 한다.
본 발명의 면역응집 측정법용 응집촉진제(이하, 본 발명의 응집촉진제로 약기하는 경우가 있다)로 이용되는 폴리머로서는, 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 것이면, 호모폴리머이어도 좋고, 코폴리머이어도 좋다. 당해 코폴리머로서는, 구체적으로는, 예를 들면 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위로 이루어지는 것을 들 수 있다.
본 발명의 응집촉진제로 이용되는 폴리머의 중량 평균 분자량은, 통상 50,000~3,000,000이고, 100,000~3,000,000이 바람직하며, 200,000~3,000,000이 보다 바람직하다. 또한, 당해 응집촉진제가 코폴리머인 경우, 그 중량 평균 분자량은, 통상 50,000~3,000,000이고, 100,000~3,000,000이 바람직하며, 200,000~3,000,000이 보다 바람직하다.
(1) 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머
일반식[1]에서의 R1로서는, 수소원자, 메틸기 등을 들 수 있지만, 메틸기가 바람직하다.
일반식[1]에서의 R2로서는, 메틸기, 에틸기 등을 들 수 있지만, 메틸기가 바람직하다.
일반식[1]에서의 R3로서는, 메틸기, 에틸기 등을 들 수 있지만, 메틸기가 바람직하다.
일반식[1]에서의 X로서는, －NH－ 또는 산소원자를 나타내고, 산소원자가 바람직하다.
일반식[1]에서의 n으로서는, 통상 1~6의 정수를 나타내고, 2~4의 정수가 바람직하며, 2~3의 정수가 보다 바람직하다.
일반식[1]에서의 m으로서는, 통상 1~3의 정수를 나타내고, 1~2의 정수가 바람직하며, 1이 보다 바람직하다.
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위의 바람직한 구체적인 예로서는, 예를 들면 하기 일반식[1-1]~[1-8]을 들 수 있다.
Figure pct00004
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00005
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00006
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00007
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00008
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00009
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00010
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
Figure pct00011
(식 중, n은 1~6의 정수를 나타낸다)
그 중에서도, 일반식[1-1]~[1-4]가 바람직하고, 일반식[1-1], 일반식[1-3], 일반식[1-4]이 보다 바람직하며, 일반식[1-1]이 특히 바람직하다. 보다 구체적으로는, 하기[1-1-1], [1-1-2], [1-3-1], [1-4-1]에 나타나는 것들이 바람직하다.
Figure pct00012
,
Figure pct00013
,
Figure pct00014
,
Figure pct00015
(2) 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머의 제조방법
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머는, 예를 들면 하기 일반식[3]
Figure pct00016
(식 중, R1, R2, R3, X 및 n은 상기와 같다)으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체와, 예를 들면 하기 일반식[4]
X-(CH2)m-COOH　　　[4]
(식 중, X는 할로겐 원자를 나타내고, m은 상기와 같다)로 나타나는 카르본산 화합물을 적당한 용매 안에서 반응시키고, 얻어진 모노머를 다시 자체 공지의 중합 반응에 의해 중합함으로써 제조할 수가 있다.
일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체의 구체적인 예로서는, 예를 들면, N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕메타아크릴산, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕메타아크릴산, N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕메타아크릴산, N－〔5－(디메틸아미노)펜틸〕메타아크릴산, N－〔6－(디메틸아미노)헥실〕메타아크릴산; N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕아크릴산, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕아크릴산, N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕아크릴산, N－〔5－(디메틸아미노)펜틸〕아크릴산, N－〔6－(디메틸아미노)헥실〕아크릴산; N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕아크릴아미드, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕아크릴아미드, N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕아크릴아미드, N－〔5－(디메틸아미노)펜틸〕아크릴아미드, N－〔6－(디메틸아미노)헥실〕아크릴아미드; N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕메타크릴아미드, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕메타크릴아미드, N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕메타크릴아미드, N－〔5－(디메틸아미노)펜틸〕메타크릴아미드, N－〔6－(디메틸아미노)헥실〕메타크릴아미드; N－〔2－(에틸메틸아미노)에틸〕메타아크릴산, N－〔3－(에틸메틸아미노)프로필〕메타아크릴산, N－〔4－(에틸메틸아미노)부틸〕메타아크릴산, N－〔5－(에틸메틸아미노)펜틸〕메타아크릴산, N－〔6－(에틸메틸아미노)헥실〕메타아크릴산; N－〔2－(디에틸아미노)에틸〕메타아크릴산, N－〔3－(디에틸아미노)프로필〕메타아크릴산, N－〔4－(디에틸아미노)부틸〕메타아크릴산, N－〔5－(디에틸아미노)펜틸〕메타아크릴산, N－〔6－(디에틸아미노)헥실〕메타아크릴산 등을 들 수 있고, N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕메타아크릴산, N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕메타아크릴산, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕아크릴아미드, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕메타크릴아미드, N－〔2－(디에틸아미노)에틸〕메타아크릴산, N－〔3－(디에틸아미노)프로필〕메타아크릴산, N－〔4－(디에틸아미노)부틸〕메타아크릴산, N－〔3－(디에틸아미노)프로필〕아크릴아미드 등이 바람직하며, 그 중에서도, N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕메타아크릴산, N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕메타아크릴산, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕아크릴아미드, N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕메타크릴아미드 등이 특히 바람직하다. 또한, 이들 (메타)아크릴산 유도체는, 시판품을 이용해도 좋고, (메타)아크릴산으로부터 상법 등에 의해 적절히 합성한 것을 이용해도 좋다.
일반식[4]에서의 X로 나타나는 할로겐 원자로서는, 예를 들면 불소, 염소, 브롬, 요오드 등을 들 수 있고, 염소, 브롬이 특히 바람직하다.
일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물의 구체적인 예로서는, 예를 들면 클로로 초산, 플루오르화 초산, 브로모 초산, 요오드 초산, 클로로 프로피온산, 플루오르화 프로피온산, 브로모 프로피온산, 요오드 프로피온산, 클로로 부탄산, 플루오르화 부탄산, 브로모 부탄산, 요오드 부탄산 등을 들 수 있지만, 브로모 초산, 클로로 프로피온산, 클로로 초산이 바람직하고, 그 중에서도 클로로 초산을 특히 바람직한 것으로 들 수 있다.
일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물의 사용량은, 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체의, 통상 0.5~3배몰(mole), 바람직하게는 1~2배몰이 되도록 하는 양이면 좋다.
상기 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체와 일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물 또는 그 염과의 반응시에 있어서의 반응 용매로서는, 예를 들면 톨루엔, 크실렌, 벤젠, 시클로헥산, n-헥산, n-옥탄 등의 탄화수소류, 예를 들면 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소타놀, tert-부탄올 등의 알코올류, 디메틸포름아미드(DMF), 물 등을 들 수 있지만, 알코올류가 바람직하고, 그 중에서도 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 등이 바람직하다. 또한, 상기 용매는 2종 이상을 적절히 혼합하여 이용해도 좋다. 이용되는 반응 용매의 양은, 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체와 일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물 또는 그 염의 총량 50g에 대해서, 통상 100~300mL이다.
상기 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체와 일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물 또는 그 염과의 반응 온도는, 반응용매 등에 따라서 적절히 설정하면 좋지만, 통상 20~120℃, 바람직하게는 40~80℃이고, 반응 시간은 통상 1~20시간, 바람직하게는 5~12시간이다.
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머의 제조방법에 있어서의 중합반응으로서는, 예를 들면 용액중합, 벌크중합, 유화중합, 현탁중합 등 자체 공지의 방법에 따라 실시할 수가 있다. 중합개시제로서는, 예를 들면 아조이소부티로니트릴, 2,2'-아조비스(2,4-디메틸발레로니트릴), 2,2'-아조비스(2-메틸 프로피온산메틸), 2,2'-아조비스(2-메틸부티로니트릴) 등의 아조화합물, 과산화벤조일, 과산화라우로일, 과산화이황산칼륨, 과산화이황산암모늄 등의 과산화물을 이용할 수 있지만, 과산화물이 바람직하고, 그 중에서도 과산화이황산암모늄이 특히 바람직하다. 중합개시제의 사용량은 전체 모노머의 총중량에 대해서 통상 0.1~3중량%이다. 당해 중합 반응에서는, 예를 들면 질소, 아르곤 등의 불활성 가스 분위기하에서 실시하는 것이 바람직하고, 중합온도는 통상 40~120℃, 바람직하게는 50~70℃로, 중합시간은 1~20시간, 바람직하게는 0.5~5시간 실시하면 좋다. 여기서 이용되는 용매로서는, 상기 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체와 일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물 또는 그 염과의 반응시에 있어서의 반응용매의 구체적인 예 외에 물을 들 수 있고, 그 중에서도 물이 바람직하다. 이용되는 용매의 양은 폴리머의 총중량 20g에 대해서, 통상 30~360mL이다.
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머의 구체적인 제조방법으로서는, 예를 들면, 먼저, 상기 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체 1mol과 상기 일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물 또는 그 염 1~2mol을 에탄올 500~1000mL 중에서, 40~80℃에서 5~12시간 반응시켜 모노머를 얻는다. 그 후, 얻어진 모노머 10g을 물 50~100mL에 용해하고, 당해 용액에 1~30mg의 과산화물을 첨가하여, 아르곤 분위기하에, 50~70℃에서 1~20시간 중합 반응시킴으로써 이루어진다.
(3) 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머
당해 코폴리머 중에서 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위의 함유량은, 통상 50몰% 이상, 100몰% 미만이고, 50~95몰%가 바람직하며, 50~60몰%가 보다 바람직하다. 또한, 당해 코폴리머 중에서 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위의 함유량은, 통상 0몰% 초과, 50몰% 이하이고, 5~50몰%가 바람직하며, 40~50몰%가 보다 바람직하다.
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위의 구체적인 예는 상기(1)의 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머의 항에서 말한 것과 같은 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 동일하다.
일반식[2]에 있어서의 R4로서는, 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, 수소원자가 바람직하다.
일반식[2]에 있어서의 k로서는, 통상 1~10이고, 4~8이 바람직하며, 6~8이 보다 바람직하다.
일반식[2]로 나타나는 모노머 단위의 구체적인 예로서는, 예를 들면 일반식[2-1]~[2-2]를 들 수 있고, 일반식[2-1]이 바람직하다.
Figure pct00017
(식 중, k는 상기와 같다.)
Figure pct00018
(식 중, k는 상기와 같다.)
그 중에서도, 하기[2-1-1]
Figure pct00019
이 바람직하다.
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위의 조합으로서는, 예를 들면
Figure pct00020
를 들 수 있고, 바람직한 조합으로서는,
Figure pct00021
이며, 그 중에서도, 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위가, [1-1-1], [1-1-2], [1-3-1] 또는 [1-4-1]로 나타나는 것이고, 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위가 [2-1-1]인 조합이 보다 바람직하며, 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위가 [1-1-1]이고, 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위가 [2-1-1]인 조합이 특히 바람직하다.
(4) 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머의 제조방법
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머의 제조방법으로서는, 예를 들면 하기 일반식[1＇]
Figure pct00022
(식 중, R1, R2, R3, X, n 및 m은 상기와 같다)로 나타나는 모노머와 일반식[2＇]로 나타나는
Figure pct00023
(식 중, R4 및 k는 상기와 같다) 비닐 화합물을 자체 공지의, 예를 들면 특개소52-27713호에 기재된 방법에 준하여 중합반응에 의해 중합함으로써 제조할 수 있다.
일반식[1＇]로 나타나는 모노머의 구체적인 예 및 바람직한 구체적인 예로서는, 상기 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위에 준한 것을 들 수 있다. 또한, 일반식[1＇]로 나타나는 모노머는, 상기 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머의 제조방법 항에서, 일반식[3]으로 나타나는 (메타)아크릴산 유도체와 일반식[4]로 나타나는 카르본산 화합물 또는 그 염과의 반응에 의해 얻어진다.
일반식[2＇]로 나타나는 비닐 화합물의 구체적인 예로서는, 예를 들면 4－펜텐산, 5－헥센산, 6－헵텐산, 7－옥텐산, 8－노넨산, 9－데센산, 10－운데센산, 4－메틸-4－펜텐산, 5－메틸-5－헥센산, 6－메틸-6－헵텐산, 7－메틸-7－옥텐산, 8－메틸-8－노넨산, 9－메틸-9－데센산, 10－메틸-10－운데센산 등을 들 수 있지만, 7－옥텐산, 8－노넨산, 9－데센산, 10－운데센산 등이 바람직하고, 그 중에서도 10－운데센산이 바람직하다.
이들 비닐 화합물은, 시판품을 이용해도 좋고, 할로겐화 알킬화합물로부터 상법 등에 의해 적절히 합성한 것을 이용해도 좋다.
일반식[2＇]로 나타나는 비닐 화합물의 사용량은, 일반식[1＇]로 나타나는 모노머에 대해서 통상 1~100mol%, 바람직하게는 3~100mol%, 보다 바람직하게는 50~100mol%이다.
상기 일반식[1＇]로 나타나는 모노머와 일반식[2＇]로 나타나는 비닐 화합물과의 중합반응의 형태로서는, 상기 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머의 제조방법에 있어서의 중합반응과 같은 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 같다.
일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머의 제조방법으로서는, 구체적으로는, 일반식[1＇]로 나타나는 모노머 1mol과 상기 일반식[2＇]로 나타나는 비닐 화합물 0.01~1mol을, 물과 DMF의 혼합용액(용량비로서 1:2~2:1) 50~100mL에 용해하고, 상기 모노머와 비닐 화합물의 총중량에 대해서 0.1~3중량%의 과산화물을 첨가하며, 아르곤 분위기하에, 50~70℃에서 1~20시간 중합반응을 시킴으로써 이루어진다.
(5) 본 발명의 응집촉진제, 면역응집 측정방법, 면역응집 측정법용 시약
본 발명의 응집촉진제는, 상기와 같이 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머를 포함하여 이루어지는 것이고, 보다 구체적으로는, 상기 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 호모폴리머, 혹은 상기 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머를 포함하여 이루어지는 것이다. 당해 응집촉진제는, 면역응집 측정방법 중에서도 면역비탁법에서 이용되는 시약에 용해시켜서 이용되는 것이 바람직하고, 그 중에서도 라텍스를 담체에 이용하는 라텍스 응집법용 시약에 용해시켜 이용되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 면역응집 측정방법에 있어서는, 상기 본 발명의 응집촉진제를 반응액 중의 농도로서 통상 0.1~8w/v%, 바람직하게는 0.1~4w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~2w/v%가 되도록 첨가하여 이용된다. 또한, 당해 농도는 측정대상 물질에 의해 설정을 바꾸는 것이 바람직하고, 예를 들면 측정대상 물질이 CRP나 Fer인 경우, 통상 0.1~8w/v%, 바람직하게는 0.1~4w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~1w/v%가 되도록 첨가하여 이용되고, 예를 들면 측정대상 물질이 PSA인 경우, 통상 0.1~7w/v%, 바람직하게는 0.1~4w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~2w/v%가 되도록 첨가하여 이용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역응집 측정방법은, 항원항체 반응을 실시할 때에, 본 발명의 응집촉진제를 공존시켜서 실시하는 외에는, 항원항체 반응에 유래하는 응집 등에 기초하여 측정대상 물질을 측정하는 자체 공지의 면역응집 측정방법(면역비탁법, 면역네펠로법 등)에 있어서 이용되는 각종 시약을 이용하고, 자체 공지의 조작법에 준하여 실시하면 좋다. 예를 들면, 상기 본 발명의 응집촉진제의 공존하에서, 측정대상 물질에 대한 항체 또는 항원을, 측정대상 물질과 접촉시켜서 항원항체 반응을 실시함으로써 이루어지면 좋고, 보다 구체적으로는, 예를 들면 상기 본 발명 응집촉진제의 공존하에서, 측정대상 물질에 대한 항체 또는 항체를 고정시킨 담체를, 혹은 측정대상 물질에 대한 항원 또는 항원을 고정시킨 담체를, 측정대상 물질과 접촉시켜 항원항체 반응을 실시하여 이루어지면 좋다. 상기 방법에 있어서의 본 발명의 응집촉진제는, 상기한 바와 같이 반응액 중의 농도에서 공존시키면 좋다. 상기 본 발명의 응집촉진제를 공존시키는 것 이외의 구체적인 방법으로서는, 예를 들면 산란광을 측정하는 방법(면역네펠로법)을 이용하는 경우에는, 예를 들면 카나하라 출판 주식회사, 임상 검사법제요, 제30판, 제2쇄, p.851-853(1993), 등에 기재된 방법에 준하여 실시하면 좋고, 또한, 투과광을 측정하는 방법(면역비탁법)을 이용하는 경우에는, 예를 들면 마찬가지로 카나하라 출판 주식회사, 임상 검사법제요, 제30판, 제2쇄, p.853-854(1993) 등에 기재된 방법에 준하여 실시하면 좋다. 또한, 측정대상 물질에 대한 항체 또는 항원을 감작(感作)시킨 라텍스의 응집 정도를 산란광, 투과광 등의 변화에 기초하여 측정하고, 그 결과에 기초하여 측정대상 물질을 측정하는 라텍스 응집법을 이용하는 경우에는, 예를 들면 면역 측정법의 새로운 활용 사례와 진단 시약·치료약 개발에의 응용(경영교육 출판사) p.103-187 등에 기재된 방법에 준하여 실시하면 좋다.
본 발명의 면역응집 측정방법의 반응시에 이용되는 완충제로서는, 구체적으로 예를 들면 트리스 완충제, 인산 완충제, 베로날 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등 통상 면역비탁법, 면역네펠로법에 이용되고 있는 완충제는 모두 들 수 있고, 측정 반응시의 pH로서는 항원항체 반응을 억제하지 않는 범위이면 특히 한정되지 않지만, 통상 6~10의 범위에서 바람직하게 선택된다.
본 발명의 면역응집 측정방법에서의 측정은, 산란광 또는 투과광을 측정함으로써 이루어지고, 그 측정은 자동 분석 장치, 분광 광도계 등의 생화학 범용기나, 레이저 혼탁계 등의 비탁측정용 전용기 등을 이용하여 이루어지면 좋다.
본 발명의 면역응집 측정방법에 의해 측정 가능한 측정대상 성분은, 항원항체 반응을 이용하여 측정 가능한 것이면 좋지만, 예를 들면 혈청, 혈장, 뇨, 림프, 수액(髓液) 등의 생체 유래의 시료 중에 포함된다. 예를 들면, C반응성 단백질(CRP), 면역글로블린G(IgG), 면역글로블린A(IgA), 면역글로블린M(IgM), 면역글로블린E(IgE) ASO(항스트렙토리신 O가), 알부민, 뇨 중 미량의 알부민, 프레알부민, 보체 C3, 보체 C4, 트랜스페린, 합토글로빈, 리포 단백질(a)(LP(a)), 아포리포단백 A-I(ApoAI), 아포리포단백 A-II(ApoAII), 아포리포단백 B(ApoB), 아포리포단백 C-II(ApoCII), 아포리포단백 C-III(ApoCIII), 아포리포단백 E(ApoE), 류머티즘 인자(RF), 전립선 특이 항원(PSA), 페리틴(Fer),β2 마이크로 알부민(β2m), 미오글로빈(Mb), 펩시노겐(PG), 히알루론산(HA), 크레아틴키나아제 MB 동질효소(CK－MB), 매독 TP항체, 매독 지질 항체, 헬리코박터 파일로리 항원·항체, HCV 항원·항체, HBs 항원·항체, HIV 항원·항체, 시스타틴 C, 매트릭스 메탈로프로테이나제-3(MMP－3), KL－6,α-태아 단백질(AFP), 암태아성 항원(CEA), 인슐린, C-펩티드 등을 들 수 있고, 그 중에서도, CRP, Fer, PSA 또는 CK-MB 등이 바람직하다. 또한, CK-MB를 측정대상으로 하는 경우에는, 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위와 하기 일반식[2]로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머를 포함하여 이루어지는 응집촉진제를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 면역응집 측정법용 시약은, 상기 본 발명의 응집촉진제를 포함하는 것이면 좋지만, 그 함유량은, 시약 중의 농도로서 통상 0.1~10w/vW/V%, 바람직하게는 0.1~5w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~2w/v%이다. 또한, 당해 농도는, 측정대상 물질에 의해 바꾸는 것이 바람직하고, 예를 들면 측정대상 물질이 CRP나 Fer인 경우, 통상 0.1~10w/v%, 바람직하게는 0.1~5w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~1w/v%이며, 예를 들면 측정대상 물질이 PSA인 경우, 통상 0.1~10w/v%, 바람직하게는 0.1~5w/v%, 보다 바람직하게는 0.1~2w/v%이다. 당해 시약에 있어서는, 그 외에, 예를 들면, 측정대상성분이 항원인 경우는, 항체 혹은 당해 항체를 고정한 적당한 담체(예를 들면 라텍스 등)를, 측정 대상 성분이 항체의 경우는, 항원 혹은 당해 항원을 고정한 적당한 담체(예를 들면 라텍스 등)를 포함하고 있어도 좋다. 또한, 당해 반응 시약 중에는, 완충제(예를 들면 트리스 완충제, 인산 완충제, 베로날 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등), 안정화제(예를 들면 알부민, 글로블린, 수용성 젤라틴, 계면활성제, 당류 등), 방부제(예를 들면 살리실산, 안식향산, 아지드화 나트륨 등), 그 외, 이 분야에서 이용되고 있는 것이고, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나, 항원항체 반응을 저해하지 않는 것을 가지고 있어도 좋다. 또한, 그 농도도 통상 이 분야에서 통상 이용되는 농도 범위에서 이용하면 좋다.
본 발명의 면역응집 측정법용 시약에 있어서의 측정 대상으로서는, 본 발명의 면역응집 측정방법의 항에서 기재한 것과 같은 것을 들 수 있고, 바람직한 것도 동일하다.
이하 실시예에 의해서 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이것에 의해 한정되는 것이 아니다.
<실시예>
합성예 1. 폴리머 1~3의 합성
(1) N－〔2－(카르복시메틸디메틸아미노)에틸〕메타아크릴산(모노머A)의 합성
297g(4.5mol)의 수산화칼륨을 1.6L의 에탄올에 용해하고, 당해 용액에 426g(4.5mol)의 클로로초산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 첨가한 후, 실온에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 그 다음에, 반응에 의해 석출된 결정을 여과하여 얻고, 이소프로판올로 세정하였다. 또한, 세정한 결정을 1L의 이소프로판올에 현탁시키고, 당해 현탁액에 475g(3.0mol)의 N－〔2－(디메틸아미노)에틸〕메타아크릴산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 첨가한 후, 환류하에서 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 불용물을 여과하여 구별하고, 당해 불용물을 이소프로판올로 세정하며, 당해 세정액을 회수하였다. 여과액과 세정액을 혼합하여 감압건조한 후, 얻어진 찌꺼기에 아세톤을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 그 후, 석출한 결정을 여과하여 얻고, 감압건조하여 420g의 N－〔2－(카르복시메틸디메틸아미노)에틸〕메타아크릴산(이하, 모노머 A로 약기한다)을 얻었다.
Figure pct00024
(2) 폴리머 1~3의 합성
상기(1)에서 얻은 모노머 A(11g~22g)를 이온 교환수(90mL~180mL)에 용해한 후, 5~30분 동안 아르곤가스의 치환을 실시하였다. 이 용액에 2mL의 10%-과산화이황산암모늄 용액을 첨가한 후, 50℃에서 1~2시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 당해 반응액을 투석 튜브[스펙트럼포아2(분획 분자량 12K~14K, Spectrum사 제), 이온 교환수; 5L×3회]로 정제하였다. 상기 조작을 3회 실시하고, 얻어진 폴리머 용액을 각각 동결건조하여, 9.4g~14.8g의 폴리머 1~3을 얻었다.
폴리머 1~3에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼 분석에 의해 메타크릴산 세그먼트(0.84ppm~1.32ppm)의 존재를, IR스펙트럼 분석에 의해 카르보닐기(-C=O)(1725cm-1)의 존재를 각각 확인하였다.
폴리머 1~3의 물성에 대해, GPC(SB-806M-HQ, Shodex사 제)로 측정한 결과를 하기 표에 나타내었다.
Figure pct00025
합성예 2. 폴리머 4의 합성
(1) N－(4－디메틸아미노)부틸메타아크릴산의 합성
23g(0.2mol)의 N－(4－디메틸아미노)부탄올(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 200mL의 클로로포름에 용해하고, 빙랭하에서 당해 용액에 25g(0.24mol)의 메타아크릴산염화물(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 첨가한 후, 실온에서 1.5시간 교반하면서 반응시켰다. 그 다음, 얻어진 반응 용액을 포화 중조수 및 포화 식염수로 세정한 후, 황산마그네슘으로 건조하였다. 그 후, 황산마그네슘을 여과하여 구별하고, 얻어진 여과액을 감압농축하여 38g의 N－〔4－(디메틸아미노)부틸〕메타아크릴산을 얻었다.
(2) N－〔4－(카르복시메틸디메틸아미노)부틸〕메타아크릴산(모노머 B)의 합성
12g(0.21mol)의 수산화칼륨을 150mL의 에탄올에 용해하고, 당해 용액에 20g(0.21mol)의 클로로초산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 첨가한 후, 실온에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 그 다음, 반응에 의해 석출한 결정을 여과하여 얻고, 에탄올로 세정하였다. 그 후, 세정한 결정을 50mL의 에탄올에 현탁시키고, 상기(1)에서 얻은 38g(0.2mol)의 N－(4－디메틸아미노)부틸메타아크릴산을 첨가한 후, 환류하에서 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 불용물을 여과하여 구별하고, 에탄올로 세정하여, 당해 세정액을 회수하였다. 여과액과 세정액을 혼합하여 감압건조한 후, 얻어진 찌꺼기에 아세톤을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 그 후, 석출한 불용물을 여과하여 구별하고, 감압농축하여 26g의 N－〔4－(카르복시메틸디메틸아미노)부틸〕메타아크릴산(이하, 모노머 B로 약기한다)을 얻었다.
Figure pct00026
(3) 폴리머 4의 합성
상기(2)에서 얻은 25g의 모노머 B를 90mL의 이온 교환수에 용해하고, 30분간 아르곤 가스 치환을 실시하였다. 이 용액에 2mL의 10%-과산화이황산암모늄 용액을 첨가한 후, 50℃에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 투석 튜브[스펙트럼포아 2(분획 분자량 12K~14K, Spectrum사 제), 이온 교환수; 5L×3회]로 정제하였다. 정제 후, 얻어진 폴리머 용액을 동결건조하여, 17.2g의 폴리머 4를 얻었다.
폴리머 4에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼 분석에 의해 메타크릴산세그먼트(0.84ppm~1.45ppm)의 존재를, IR스펙트럼 분석에 의해 카르보닐기(-C=O)(1725cm-1)의 존재를 각각 확인하였다.
폴리머 4의 물성을 GPC(SB-806 M-HQ, Shodex사 제)에 의해 측정한 결과, 중량 평균 분자량은 807,920, 분자량 분포는 3.895였다.
합성예 3. 폴리머 5의 합성
(1) N－〔3－(카르복시메틸디메틸아미노)프로필〕아크릴아미드(모노머 C)의 합성
198g(3.0mol)의 수산화칼륨을 1L의 에탄올에 용해하고, 284g(3.0mol)의 클로로초산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 첨가한 후, 실온에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 그 다음, 반응에 의해 석출한 결정을 여과하여 얻고, 이소프로판올로 세정하였다. 그 후, 세정한 결정을 400mL의 이소프로판올에 현탁시키고, 당해 현탁액에 511g(3.0mol)의 N－〔3－(디메틸아미노) 프로필〕아크릴아미드(와코쥰야쿠공업(주) 제)를 첨가한 후, 환류하에서 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 불용물을 여과하여 구별하고, 이소프로판올로 세정하여, 당해 세정액을 회수하였다. 여과액과 세정액을 혼합하여 감압건조한 후, 얻어진 찌꺼기에 아세톤을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 그 후, 석출한 결정을 여과하여 얻고, 감압건조하여 565g의 N－〔3－(카르복시메틸디메틸아미노)프로필〕아크릴아미드〔이하, 모노머 C로 약기한다〕를 얻었다.
Figure pct00027
(2) 폴리머 5의 합성
상기(1)에서 얻은 46g의 모노머 C를 90mL의 이온 교환수에 용해하고, 30분간 아르곤 가스 치환을 실시하였다. 그 다음, 이 용액에 2mL의 10%-과산화이황산암모늄 용액을 첨가한 후, 50℃에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 투석 튜브[스펙트럼포아 2(분획 분자량 12K~14K, Spectrum사 제), 이온 교환수; 5L×3회]로 정제하였다. 정제 후, 얻어진 폴리머 용액을 동결건조시킴으로써 26.2g의 폴리머 5를 얻었다.
폴리머 5에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼 분석에 의해 메타크릴산세그먼트(1.13ppm~2.05ppm)의 존재를, IR스펙트럼 분석에 의해 아미드기(-NH-C=O)(1640cm-1, 1540cm-1)의 존재를 각각 확인하였다.
폴리머 5의 물성을 GPC(SB-806 M-HQ, Shodex사 제)에 의해 측정한 결과, 중량 평균 분자량은 262,065, 분자량 분포는 4.332였다.
합성예 4. 폴리머 6의 합성
(1) N－〔3－(카르복시메틸디메틸아미노)프로필〕메타아크릴아미드(모노머 D)의 합성
198g(3.0mol)의 수산화칼륨을 1L의 에탄올에 용해하고, 284g(3.0mol)의 클로로초산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 첨가한 후, 실온에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 그 다음, 반응에 의해 석출한 결정을 여과하여 얻고, 이소프로판올로 세정하였다. 그 후, 세정한 결정을 400mL의 이소프로판올에 현탁시키고, 당해 현탁액에 511g(3.0mol)의 N－〔3－(디메틸아미노)프로필〕메타아크릴아미드(와코쥰야쿠공업(주) 제)를 첨가한 후, 환류하에서 12시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 불용물을 여과하고 구별하여, 이소프로판올로 세정하고, 당해 세정액을 회수하였다. 여과액과 세정액을 혼합하여 감압건조한 후, 얻어진 찌꺼기에 아세톤을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 그 후, 석출한 결정을 여과하여 얻고, 감압건조하여 565g의 N－〔3－(카르복시메틸디메틸아미노)프로필〕메타아크릴아미드〔이하, 모노머 D로 약기한다〕를 얻었다.
Figure pct00028
(2) 폴리머 6의 합성
상기(1)에서 얻은 21g의 모노머 D를 90mL의 이온 교환수에 용해하고, 30분간 아르곤 가스 치환을 실시하였다. 그 다음, 이 용액에 2mL의 10%-과산화이황산암모늄 용액을 첨가한 후, 50℃에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 투석 튜브[스펙트럼포아 2(분획 분자량 12K~14K, Spectrum사 제), 이온 교환수; 5L×3회]로 정제하였다. 정제 후, 얻어진 폴리머 용액을 동결건조 함으로써 13.5g의 폴리머 6을 얻었다.
폴리머 6에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼 분석에 의해 메타크릴산세그먼트(1.10ppm~2.00ppm)의 존재를, IR스펙트럼 분석에 의해 아미드기(-NH-C=O)(1640cm-1, 1540cm-1)의 존재를 각각 확인하였다.
폴리머 6의 물성을 GPC(SB-806M-HQ, Shodex사 제)에 의해 측정한 결과, 중량 평균 분자량은 407,359, 분자량 분포는 2.375였다.
합성예 5. 코폴리머 1의 합성
상기 합성예 1에서 얻은 22g의 모노머 A와 1.8g의 10-운데센산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 50mL의 이온 교환수와 40mL의 DMF의 혼합 용매에 용해하고, 30분간 아르곤 가스 치환을 실시하였다. 그 다음, 이 용액에 2mL의 10%-과산화이황산암모늄 용액을 첨가한 후, 50℃에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 투석 튜브[스펙트럼포아 2(분획 분자량 12K~14K, Spectrum사 제), 이온 교환수; 5L×3회]로 정제하였다. 정제 후, 얻어진 폴리머 용액을 동결건조시킴으로써 16.2g의 코폴리머 1을 얻었다. 또한, 코폴리머 1은 운데센산 유래의 모노머 단위(이하, 모노머 단위 E로 약기한다)를 40몰% 포함한다.
코폴리머 1에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼 분석에 의해 메타크릴산 유래의 모노머 단위(1.10ppm~2.00ppm) 및 운데센산 유래의 모노머 단위(1.03ppm)의 존재를, IR스펙트럼 분석에 의해 카르보닐기(-C=O)(1725cm-1)의 존재를 각각 확인하였다.
코폴리머 1의 물성을 GPC(SB-806M-HQ, Shodex사 제)에 의해 측정한 결과, 중량 평균 분자량은 658,206, 분자량 분포는 2.216이었다.
합성예 6. 코폴리머 2의 합성
상기 합성예 1에서 얻은 22g의 모노머 A와 7.4g의 10-운데센산(와코쥰야쿠공업(주) 제)을 50mL의 이온 교환수와 40mL의 DMF의 혼합 용매에 용해하고, 30분간 아르곤 가스 치환을 실시하였다. 그 다음, 이 용액에 2mL의 10%-과산화이황산암모늄 용액을 첨가한 후, 50℃에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액을 투석 튜브[스펙트럼포아 2(분획 분자량 12K~14K, Spectrum사 제), 이온 교환수; 5L×3회]로 정제하였다. 정제 후, 얻어진 폴리머 용액을 동결건조함으로써 19.4g의 코폴리머 2를 얻었다. 또한, 코폴리머 2는 모노머 단위 E를 5몰% 포함한다.
코폴리머 2에 대해서는, 1H-NMR 스펙트럼 분석에 의해 메타크릴산세그먼트(1.10ppm~2.00ppm) 및 운데센산세그먼트(1.03ppm)의 존재를, IR스펙트럼 분석에 의해 카르보닐기(-C=O)(1725cm-1)의 존재를 각각 확인하였다.
코폴리머 2의 물성을 GPC(SB-806M-HQ, Shodex사 제)에 의해 측정한 결과, 중량 평균 분자량은 957,680, 분자량 분포는 2.041이었다.
실시예 1 분자량이 다른 폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 따른 CRP 의 측정
(1) 항인간 CRP 항체 감작(고정화) 라텍스 시약의 조제
항인간 CRP 산양 다중클론성 항체(오리엔탈 효모공업(주) 제) 1mg/mL를 포함하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 4.5mL와 입자지름 0.12μm의 폴리스티렌라텍스(일본 페인트(주) 제)의 10w/v% 수용액 0.5mL를 혼합하고, 7℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후, 얻어진 현탁액 5mL와 소 혈청알부민(BSA)을 2.5w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 5mL를 혼합하고, 7℃에서 2시간 반응시켰다. 그 다음, 원심분리(45,000g, 30분)에 의하여 분리한 라텍스 전량을 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 5mL로 세정하고, BSA를 0.5W/V% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 12.5mL에 현탁시키며, 당해 현탁액을 항인간 CRP 항체 감작 라텍스 용액1)로 하였다. 또한, 상기와 같이 입자지름 0.2μm의 폴리스티렌라텍스(일본 페인트(주) 제)를 이용하여 조제한 것을, 항인간 CRP 항체 감작 라텍스 용액2)로 하였다.
(2) 시료
시약맹검(盲檢)측정용 시료(공백)에는 생리 식염수(0.85% NaCl)를 사용하였다. 시료에는 LT·CRP-HS 캐리브레이타세트 HO(와코쥰야쿠공업(주) 제, CRP 농도가 각각 0.2mg/dL, 1.0mg/dL, 4.0mg/dL, 18.0mg/dL, 35.0mg/dL인 것)을 사용하였다.
(3) 시약
제1시약
합성예 1에서 합성한 폴리머 1, 폴리머 2 또는 폴리머 3을 응집촉진제로 하여 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH8.0)을 조제하고, 3 종류의 제1시약을 준비하였다.
제2시약
상기(1)에서 조제한 항인간 CRP 항체 감작 라텍스1) 12mL 및 항인간 CRP 항체 감작 라텍스2) 8mL를 혼합한 것을 제2시약으로 하였다.
(4) 측정방법
상기 시료, 상기 제1시약 및 상기 제2시약을 하기 조건에서 BM-8형 자동분석장치(일본전자(주) 제)를 이용하여 시료 중의 CRP 농도를 측정하였다.
시료　　：　7.5μL(생리 식염수로 5배 희석)
제1시약 ：　100μL
제2시약 ：　25μL
측정방법 ：　2포인트 엔드법(34-65)
주파장　 ：　596nm
얻어진 결과를 표 1에 나타낸다.
비교예 1 종래의 면역응집촉진제를 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 CRP 측정
실시예 1의 폴리머 1~3 대신에 폴리에틸렌글리콜 6,000(PEG6,000, 와코쥰야쿠공업(주) 제) 또는 MPC 폴리머(일유(주) 제)를 응집촉진제로 하여 0.4w/v% 함유 한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH8.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 1과 같은 방법에 의해 CRP를 측정하였다. 그 결과를 실시예 1의 결과와 더불어 표 1에 나타낸다.
Figure pct00029
표 1의 결과로부터, CRP 측정계에서 폴리머 1, 2 및 3은 모두, 종래품인 비교예 1의 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 그 효과는 폴리머의 분자량이 많을수록 뛰어난 효과를 나타내는 것을 알았다.
실시예 2 분자량이 다른 폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 따른 Fer 의 측정
(1) 항인간 Fer 항체 감작(고정화) 라텍스 시약의 조제
항인간 Fer 토끼 다중클론성 항체(Dako사 제) 0.6mg/mL를 포함하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 1ml와, 입경 0.3μm의 폴리스티렌라텍스(세키스이화학공업(주) 제)를 2w/v% 포함하도록 현탁시킨 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 1ml를 혼합하고, 25℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 얻어진 현탁액 2mL와 BSA를 1.25w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 2mL를 혼합하여, 7℃에서 2시간 반응시켰다. 그 다음, 원심분리(45,000g, 30분)에 의해 분리한 라텍스 전량을 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 4mL로 세정하고, BSA를 0.5w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 20mL에 현탁시킨 것을 항인간 Fer 항체 감작 라텍스 용액으로 하였다.
(2) 시료
시약맹검측정 시료(공백)에는 생리 식염수(0.85% NaCl)를 사용하였다. 시료에는, 페리틴캐리브레이타세트(와코쥰야쿠공업(주) 제, Fer 농도가 각각 30ng/mL, 100ng/mL , 200ng/mL, 500ng/mL, 1000ng/mL의 것)를 사용하였다.
(3) 시약
제1시약
합성예 1에서 합성한 폴리머 1, 폴리머 2 또는 폴리머 3을 응집촉진제로서 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1MHEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 조제하고, 3종류의 제1시약을 준비하였다.
제2시약
상기(1)에서 조제한 항인간 Fer 항체 감작 라텍스 용액을 제2시약으로 하였다.
(4) 측정방법
상기 시료, 상기 제1시약 및 상기 제2시약을 하기 조건에서 BM-8형 자동 분석 장치(일본전자(주) 제)를 이용하여, 시료 중의 Fer 농도를 측정하였다.
시료　　　：　12.0μL(생리 식염수로 2배 희석)
제1시약 ：　90μL
제2시약　：　30μL
측정방법　：　2포인트 엔드법(35-59)
주파장　　：　694nm
얻어진 결과를 표 2에 나타낸다.
비교예 2 종래의 면역응집촉진제를 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 따른 Fer의 측정
실시예 2의 폴리머 1~3 대신에 폴리에틸렌글리콜 6,000(PEG6,000, 와코쥰야쿠공업(주) 제) 또는 MPC 폴리머(일유(주) 제)를 응집촉진제로 하여 0.4w/v% 함유 한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1MHEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 2와 같은 방법으로 Fer를 측정하였다.
그 결과를 실시예 2의 결과와 더불어 표 2에 나타낸다.
Figure pct00030
표 2의 결과로부터, Fer 측정계에 있어서 폴리머 1, 2 및 3 모두, 비교예 2의 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 그 효과는 CRP 측정계와 마찬가지로, 폴리머의 분자량이 많을수록 우수한 것을 알았다.
실시예 3 분자량이 다른 폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 따른 PSA 의 측정
(1) 항인간 PSA 항체 감작(고정화) 라텍스 시약의 조제　　　　　　　
항인간 PSA 단일 클론 항체(클론 No.PSA10, 와코쥰야쿠공업(주) 제) 0.6mg/mL를 포함하는 50mM 붕산 완충액(pH7.1) 1ml와 입자지름 0.28μm의 폴리스티렌라텍스(세키스이화학공업(주) 제)를 2w/v% 포함하도록 현탁시킨 50mM 붕산 완충액(pH7.1) 1ml를 혼합하고, 25℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 당해 현탁액으로부터 원심분리(45,000g, 30분)에 의해 라텍스 전량을 분리하고, 50mM 붕산 완충액(pH7.1) 2mL로 세정하였다. 그 다음, BSA를 0.5w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.3) 2mL에 현탁한 것을 항인간 PSA 항체 감작 라텍스 용액1)로 하였다.
또한, 상기와 마찬가지로 하여 항인간 PSA 단일 클론 항체(클론 No.PSA14, 와코쥰야쿠공업(주) 제) 1.4mg를 포함하는 50mM 붕산 완충액(pH7.1) 1ml와 입자지름 0.15μm의 폴리스티렌라텍스(세키스이화학공업(주) 제)를 2w/v% 포함하도록 현탁시킨 50mM 붕산 완충액(pH7.1) 1ml를 혼합하여 조제한 것을, 항인간 PSA 항체 감작 라텍스 용액2)로 하였다.
(2) 시료
시약맹검측정시료(공백)에는, 인산 완충액(1w/v% BSA, 0.85% NaCl 함유 10mM 인산 완충액)을 사용하였다. 시료에는, PSA 캐리브레이타세트(와코쥰야쿠공업(주) 제, PSA 농도가 각각 5.0ng/mL, 10.0ng/mL, 39.8ng/mL, 69.3ng/mL, 98.6ng/mL인 것)을 사용하였다.
(3) 시약
제1시약
합성예 1에서 합성한 폴리머 1, 폴리머 2 또는 폴리머 3을 0.75w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1MHEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 조제하여, 3종류의 제1시약을 준비하였다.
제2시약
상기(1)에서 조제한 항인간 PSA 항체 감작 라텍스1) 및 2)를 각각 2mL씩, BSA를 0.5w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 16mL에 현탁시키고 혼합한 것을 제2시약으로 하였다.
(4) 측정방법
상기 시료, 상기 제1시약 및 상기 제2시약을 하기 조건에서 BM-8형 자동 분석 장치(일본전자(주) 제)를 이용하여, 시료 중의 PSA 농도를 측정하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
시료　　 ：　18.0μL(생리 식염수로 2배 희석)
제1시약　：　90μL
제2시약　：　30μL
측정방법 ：　2포인트 엔드법(37-65)
주파장　 ：　694nm
비교예 3 종래의 면역응집촉진제를 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 PSA의 측정
실시예 3의 폴리머 1~3 대신에 폴리에틸렌글리콜 6,000(PEG6,000, 와코쥰야쿠공업(주) 제) 또는 MPC 폴리머(일유(주) 제)를 응집촉진제로 하여 0.75w/v% 함유 한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1MHEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 3과 같은 방법으로 PSA를 측정하였다.
그 결과를 실시예 3의 결과와 더불어 표 3에 나타낸다.
Figure pct00031
표 3의 결과로부터, PSA 측정계에 있어서 폴리머 1, 2 및 3 모두, 비교예 3의 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 그 효과는 CRP 측정계나 Fer 측정계와 같이, 폴리머의 분자량이 많을수록 우수한 것을 알았다.
실시예 4 각종 폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 CRP 의 측정
폴리머 1~3 대신에 폴리머 4~6을 응집촉진제로서 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH8.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 CRP를 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure pct00032
표 4의 결과로부터 CRP 측정계에 있어서 폴리머 4, 5 및 6 모두, 폴리머 1~3과 같이, 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 종래품인 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 5 각종 폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 Fer 의 측정
폴리머 1~3 대신 폴리머 4~6을 응집촉진제로서 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH8.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 2와 같은 방법으로 Fer를 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다.
Figure pct00033
표 5의 결과로부터, Fer 측정계에 있어서도 폴리머 4, 5 및 6은 모두, 폴리머 1~3과 같이, 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 종래품인 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 6 각종 폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 PSA 의 측정
폴리머 1~3 대신 폴리머 4~6을 응집촉진제로서 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 3과 같은 방법으로 PSA를 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure pct00034
표 6의 결과로부터, PSA 측정계에 있어서도 폴리머 4, 5 및 6은 모두, 폴리머 1~3과 마찬가지로, 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 종래품인 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 7 코폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 CRP 의 측정
폴리머 1~3 대신 코폴리머 1 또는 2를 응집촉진제로서 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH8.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 CRP를 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure pct00035
표 7의 결과로부터, CRP 측정계에 있어서 코폴리머 1 및 2는 모두, 폴리머 1~6과 마찬가지로 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 종래품인 PEG6,000이나 MPC보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 8 코폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 Fer 의 측정
폴리머 1~3 대신 코폴리머 1 또는 2를 응집촉진제로서 0.4w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 2와 같은 방법으로 Fer를 측정하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00036
표 8의 결과로부터, Fer 측정계에 있어서도 코폴리머 1 및 2 모두, 폴리머 1~6과 같이 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 종래품인 PEG6,000이나 MPC보다도 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 9 코폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 PSA 의 측정
폴리머 1~3 대신 코폴리머 1 또는 2를 응집촉진제로서 0.75w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 3과 같은 방법으로 PSA를 측정하였다. 그 결과를 표 9에 나타낸다.
Figure pct00037
표 9의 결과로부터, PSA 측정계에 있어서도 코폴리머 1 및 2 모두, 폴리머 1~6과 같이 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 종래품인 PEG6,000이나 MPC보다도 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 10 코폴리머를 면역응집촉진제로서 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 CK - MB 의 측정
(1) 항인간 CK-MB 항체 감작(고정화) 라텍스 시약의 조제
항인간 CK-MB 단일 클론 항체(클론 MAK〈CK-MB〉M-7.4.5-IgG, Roche사 제) 0.8mg/mL를 포함한 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 1ml와 입자지름 0.4μm의 폴리스티렌라텍스(후지쿠라화성(주) 제)를 2w/v% 포함하도록 현탁시킨 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 1ml를 혼합하여, 25℃에서 2시간 반응시켰다. 그 후, 원심분리(45,000g, 30분)에 의해 분리한 라텍스 전량을 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 2mL로 세정하였다. 그 다음, BSA를 0.5w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 2mL에 현탁시키고, 항인간 CK-MB 항체 감작 라텍스 용액1)로 하였다.
또한, 상기와 같은 방법에 의하여, 항인 CK-MB 단일 클론 항체(클론 MAK〈CK-MB〉M-6.12.47-IgG, Roche사 제) 0.8mg를 포함하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 1ml와 입자지름 0.4μm의 폴리스티렌라텍스(후지쿠라화성(주) 제)를 2w/v% 포함하도록 현탁시킨 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 1ml를 혼합하여 조제한 것을, 항인 CK-MB항체 감작 라텍스 용액2)로 하였다.
(2) 시료
시약맹검측정용 시료(공백)에는, 생리 식염수(0.85% NaCl)를 사용하였다. 시료는 CK-MB 항원(인간 유래의 CK-MB, Cliniqa사 제)을 인산 완충액(10mM 인산, 1 w/v% BSA, 0.85% NaCl 함유)으로 희석하고, 농도가 각각 5.2ng/mL, 19.0ng/mL, 47.9ng/mL, 98.7ng/mL, 204.3ng/mL가 되도록 조제한 것을 사용하였다.
(3) 시약
제1시약
폴리머 1, 코폴리머 1 또는 코폴리머 2를 응집촉진제로 하여 0.75w/v% 함유 한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 조제하고, 3종류의 제1시약을 준비하였다.
제2시약
상기(1)에서 조제한 항인간 CK-MB 항체 감작 라텍스 용액1) 및 2)를 각각 2 mL씩, BSA를 0.5w/v% 함유하는 50mM 붕산 완충액(pH7.5) 16mL에 현탁시키고 혼합한 것을 제2시약으로 하였다.
(4) 측정방법
상기 시료, 상기 제1시약 및 상기 제2시약을 하기 조건으로 BM-8형 자동 분석 장치(일본전자(주) 제)를 이용하여, 시료 중의 CK-MB 농도를 측정하였다.
시료　　 ：　12.0μL(생리 식염수로 2배 희석)
제1시약　：　90μL
제2시약　：　30μL
측정방법 ：　2포인트 엔드법(34-65)
주파장　 ：　596nm
얻어진 결과를 표 10에 나타낸다.
비교예 4 종래의 면역응집촉진제를 이용한 라텍스 면역응집 측정법에 의한 CK-MB의 측정
폴리머 1, 코폴리머 1 및 코폴리머 2 대신 폴리에틸렌글리콜 6,000(PEG6,000, 와코쥰야쿠공업(주) 제) 또는 MPC 폴리머(일유(주) 제)를 응집촉진제로서 0.75% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 10과 같은 방법에 의해 CK-MB를 측정하였다. 그 결과를, 실시예 10의 결과와 더불어 표 10에 나타낸다.
Figure pct00038
표 10의 결과로부터, CK-MB 측정계에 있어서 폴리머 2, 코폴리머 1 및 2의 어느 것에도 이들을 첨가함으로써, 비교예 4의 PEG6, 000 또는 MPC보다도 높은 응집촉진효과를 나타내는 것을 알았다. 또한, 호모폴리머인 폴리머 2보다도 코폴리머인 코폴리머 1 및 2가 보다 높은 응집촉진효과를 나타내는 것도 알았다.
실시예 11 면역응집촉진제의 함량이 다른 라텍스 면역응집 측정법에 의한 CRP의 측정
폴리머 1을 0.24w/v%, 0.32w/v%, 0.56w/v% 또는 0.72w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M 트리스 완충액(pH8.0)을 제1시약으로서 이용한 것 외에는, 실시예 1과 같은 방법으로 CRP를 측정하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.
Figure pct00039
표 11의 결과로부터 분명한 것처럼, CRP 측정계에 있어서의 폴리머 1은, 그 첨가량이 많으면 많을수록 응집촉진효과가 높아지는 것을 알았다.
실시예 12 면역응집촉진제의 함량이 다른 라텍스 면역응집 측정법에 의한 Fer의 측정
제1시약으로서, 폴리머 1을 0.25w/v%, 0.31w/v%, 0.49w/v% 또는 0.61w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 이용한 것 외에는, 실시예 2와 같은 방법으로 Fer를 측정하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
Figure pct00040
표 12의 결과로부터 분명한 것처럼, Fer 측정계에 있어서의 폴리머 1은, 그 첨가량이 많으면 많을수록 응집촉진효과가 높아지는 것을 알았다.
실시예 13 면역응집촉진제의 함량이 다른 라텍스 면역응집 측정법에 의한 PSA의 측정
제1시약으로서, 폴리머 1을 0.60w/v%, 0.90w/v%, 1.35w/v% 또는 1.50w/v% 함유한, 0.1% BSA 및 1% NaCl를 포함하는 0.1M HEPES-NaOH 완충액(pH7.0)을 이용한 것 외에는, 실시예 3과 같은 방법으로 PSA를 측정하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.
Figure pct00041
표 13의 결과로부터 분명한 것처럼, PSA 측정계에 있어서의 폴리머 1은, 그 첨가량이 많으면 많을수록 응집촉진효과가 높아지는 것을 알았다.

Claims (11)

  1. 하기 일반식[1]
    Figure pct00042

    (식 중, R1는 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, R2 및 R3는 각각 독립하여 메틸기 또는 에틸기를 나타내며, X는 -NH－ 또는 산소원자를 나타내고, n은 1~6의 정수를 나타내며, m은 1~3의 정수를 나타낸다)로 나타나는 모노머 단위를 가지는 폴리머를 포함하여 이루어지는 면역응집 측정법용 응집촉진제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머가, 하기 일반식[1]
    Figure pct00043

    (식 중, R1는 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, R2 및 R3는 각각 독립하여 메틸기 또는 에틸기를 나타내며, X는 -NH－ 또는 산소원자를 나타내고, n은 1~6의 정수를 나타내며, m은 1~3의 정수를 나타낸다)로 나타나는 모노머 단위와 하기 일반식[2]
    Figure pct00044

    (식 중, R4는 수소원자 또는 메틸기를 나타내고, k는 1~10의 정수를 나타낸다)로 나타나는 모노머 단위를 가지는 코폴리머인 응집촉진제.
  3. 제2항에 있어서,
    코폴리머 중 일반식[1]로 나타나는 모노머 단위의 함유량이 50몰% 이상 100 몰% 미만인 응집촉진제.
  4. 제1항에 있어서,
    폴리머의 중량 평균 분자량이 50,000~3,000,000인 응집촉진제.
  5. 제1항에 있어서,
    일반식[1]에 있어서의 R2 및 R3가 모두 메틸기인 응집촉진제.
  6. 제1항에 있어서,
    일반식[1]에 있어서의 n이 2~4이고, m이 1인 응집촉진제.
  7. 제2항에 있어서,
    일반식[2]에 있어서의 R4가 수소원자이고, k가 4~8인 응집촉진제.
  8. 제1항 기재의 응집촉진제를 포함하여 이루어지는 면역응집 측정법용 시약.
  9. 제8항에 있어서,
    시약이 C반응성 단백질(CRP), 혈청 페리틴(Fer), 전립선 특이 항원(PSA) 또는 크레아틴 키나아제 MB(CK-MB) 측정용인 면역응집 측정법용 시약.
  10. 제1항 기재의 면역응집 측정법용 응집촉진제의 공존하에서, 측정대상 물질에 대한 항체 또는 항원을, 측정대상 물질과 접촉시켜 항원항체 반응을 실시하는 것을 특징으로 하는 면역응집 측정방법.
  11. 제9항에 있어서,
    측정대상 물질이 C반응성 단백질(CRP), 혈청 페리틴(Fer), 전립선 특이 항원(PSA) 또는 크레아틴 키나아제 MB(CK-MB) 측정용인 면역응집 측정방법.
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