WO2016088999A1 - 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 - Google Patents

응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method or kit for detecting an aggregate of an aggregate-forming polypeptide of a biosample.
  • the polypeptide constituting the protein may form a multimer to form a functional protein, but in a normal state, it exists as a monomer, but when an abnormal state (for example, it is converted to misfolding type) forms a multimer, It often causes disease (Massimo Stefani, et al., J. Mol. Med. 81: 678-699 (2003); and Radford SE, et al., Cell. 97: 291-298 (1999)).
  • diseases or disorders associated with abnormal pooling or misfolding of proteins include Alzheimer's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Spongiform encephalopathies, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis , Serpin deficiency, emphysema, cirrhosis ⁇ Type II diabetes, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis, frontal temporal dementias, elderly systemic amyloidosis, familial amyloid multiple Neuropathy (familial amyloid polyneuropathy), hereditary cerebral amyloid angiopathy and hemodialysis-related amyloidosis.
  • the amount of antigen in the sample is very small or the size of the antigen is too small to measure, or the amount of antigen in the body is not proportional to the amount of antigen in the sample.
  • a ⁇ amphiphil-beta
  • a ⁇ oligomer levels are higher in abnormal subjects than in normal subjects, it may be difficult to detect A ⁇ oligomer levels in blood samples or when atypically present A ⁇ oligomers in blood samples.
  • the present inventors have conducted extensive research to develop novel methods for detecting aggregates of swollen-forming polypeptides, and as a result, a clearing system that inhibits aggregated formation of polypeptides.
  • a method for agglutination detection of aggregated-forming polypeptides that maximizes the difference in diagnostic signals between patients and normal persons using differences in hydrophobic interacting ions. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for detecting aggregates of swollen-forming polypeptides in biosamples.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting a coarse form of an aggregate-forming polypeptide of a biosample.
  • the present invention provides a method for detecting a colon of a sample-forming polypeptide of a biosample comprising the following steps: (a) a biosample of an analyte ( i) a monomeric or multimeric form of the globular-forming polypeptide, (ii) a hydrophobic deleted derivative of aggregate-forming polypeptide, or (iii) the aggregated-forming polypeptide.
  • step (b) incubating the resultant of step (a) to further form a male form of the male form-forming polypeptide; (c) contacting the resultant of step (b) with a binder-labeled signal-generating label to a binder that binds to the aggregated form of the globular-forming polypeptide; And (d) detecting a signal generated from a binder-label bound to the aggregated form of the aggregated-forming polypeptide, wherein the incubation of step (b) comprises the spiked (i), (iii) Or (iii) for a time sufficient to multimerize the raw sample.
  • the present invention provides a cohesive-forming polymorph that maximizes the difference in diagnostic signals between a patient and a normal person by using a difference between a clearing system or a hydrophobic interaction that inhibits coagulation of the pulley peptides.
  • the present invention relates to a method for detecting a peptide of a peptide.
  • the term “cognate-forming polypeptide” refers to a polypeptide that can form a multimer (oligomeric) or can form an aggregate by hydrophobic interaction with monomers. In particular, the following structural changes cause various diseases.
  • Examples include Alzheimer's disease, Creutzfeldt-Jakob disease, Spongiform encephalopathies, Parkinson's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, Serpin deficiency, Emphysema, Emphysema Cirrhosis, type II diabetes mellitus, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis, frontal-temporal dementias, elderly systemic amyloidosis, familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloid vasculitis hereditary cerebral amyloid angiopathy) and hemodialysis-related amyloidosis.
  • the non-aggregated form of the swollen-forming polypeptide is normal and the swollen type causes diseases, in particular neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Creutzfeldt-Jakob disease or Parkinson's disease.
  • the raw sample subject to the multimerization of the spiked (i), (ii) or (iii) is a human having a disease involving the multimer of the aggregated-forming polypeptide.
  • the incubation time which is a raw sample of, and more preferably can be multimerized by the raw sample, is a signal generated using a raw sample of a human having a disease involving a multimer of a globular-forming polypeptide. It is enough time to make 1.5-20 times larger than the signal generated using this normal human raw sample.
  • a detailed step-by-step description of the method of the present invention for detecting the aggregate of the aggregate-forming polypeptide of the biosample is as follows: (a) Spike
  • the method of the present invention comprises (i) a monomeric or multimeric (oligomeric) form of the aggregated-forming polypeptide, and (ii) a hydrophobic deletion of the aggregated-forming polypeptide in a raw sample to be analyzed. deleted derivative of aggregate-forming polypeptide), or (iii) spiking the monomeric or multimeric (oligomeric) form of the swollen monoform polypeptide and the hydrophobic deletion of the aggregated-forming polypeptide. Steps.
  • sample refers to the organism-derived sample to be analyzed.
  • the raw sample means a cell, tissue, or biological fluid of a biological source, or other medium that can be analyzed according to the present invention, which means that a sample taken from a human, a sample taken from an animal, a human or an animal It includes a sample taken from food for.
  • Raw samples to be analyzed include blood, serum, plasma, lymph, milk, urine, feces, tears, saliva, semen, brain extracts (e.g. brain homogenate), spinal fluid (SCF), layered water, spleen and tonsil tissue extracts. Is a fluid sample. More preferably, the raw sample is blood, most preferably plasma.
  • the aggregate-forming polypeptide is ⁇ peptide involved in Alzheimer's disease, tau protein, Creutzfeldt-Jakob disease, and ⁇ involved in Parkinson's disease, which is involved in sponge brain disease.
  • the aggregated-forming polypeptide is involved in A ⁇ peptides or tau proteins involved in Alzheimer's disease, or Parkinson's disease.
  • ⁇ -synuclein most preferably A ⁇ peptide or ⁇ -synuclein.
  • spikeking refers to the addition of or after addition of the hydrophobic deletion of the monomeric (or multimeric) and / or swung-forming polypeptide of the aggregated-forming polypeptide to the raw sample of analysis. It means a process of mixing.
  • multimer is formed by combining two or more monomers, including oligomers.
  • the patient's raw sample is Low level of clearing system promotes coarse formation of aggregated-forming polypeptides, whereas high levels of clearing system of normal samples result in high levels of clearing system. The difference is maximized by the difference in diagnostic signals.
  • the monomeric form of the aggregate-forming polypeptide is an ⁇ peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence S of the SEQ ID NO: 2 sequence.
  • the hydrophobic is hydrophobic.
  • Deletions form large amounts of aggregates by hydrophobic interactions, but aggregate-forming polys present in the normal sample
  • Hydrophobic deletions of the monomeric and aggregated-forming lipopeptides of the tide form a bulloid by hydrophobic interactions, but less than in patients, maximizing the difference in diagnostic signals between the patient and the normal. .
  • hydrophobic deleted derivative of aggregate-forming polypeptide refers to agglomeration by hydrophobic interaction with monomeric or multimeric (oligomeric) monomer-formed polypeptides. Mold can be formed Derivatives wherein the amino acid residues are deleted so as to include a large number of hydrophobic amino acid residues in the amino acid sequence of the aggregated-forming polypeptide.
  • Hydrophobic deletions of the swollen-forming polypeptide can be selected taking into account length (molecular weight) and / or hydrophobic amino acid residues for hydrophobic interaction with monomeric or multimeric (oligomeric) forms of the aggregated-forming polypeptide.
  • the hydrophobic deletion (hydnsphobi c deleted der ivat ive of aggregate-forming polypept ide) of the swollen-forming polypeptide comprises 37th to 42nd amino acid residues in the amino acid sequence of the first sequence.
  • the Ai3 delete peptide is a peptide comprising the 29th amino acid residue to the 42nd amino acid residue of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence, even more preferably the Ai3 delete peptide is a sequence Amino acid residues 17 to 42 of the amino acid sequence of the first sequence of list And the peptide containing amino acid residues, and most preferably the 3 A delete peptide is peptide comprising the 9 amino acid residues to 42 amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the spiking (spiking) a hydrophobic result the substance of the formed polypeptide, - according to the 'invention, the raw sample of analyte (iii) the aggregation type-forming polyester monomer type or multi meohyeong and the aggregated form of the peptide
  • the aim of this study is to maximize the difference in diagnostic signals between patients and normal individuals by using differences between the clearing system and the hydrophobic interaction ion that inhibit the formation of vesicles.
  • step (a) additionally adding a buffer to the result of step (a). More preferably, the complete layer is added 3-15 times (v / v) relative to the raw sample, even more preferably 5-13 It is added in 10-fold (v / v) - fold (v / v) is added, the more even more preferably 7-11 times (v / v) is added to, and even more even more preferably eight.
  • the complete liquid used in the present invention may be used a variety of complete liquid known in the art, preferably, the complete liquid is a nonionic surfactant-containing phosphate complete liquid.
  • nonionic surfactant contained in the phosphate complete solution used in the present invention various nonionic surfactants known in the art may be used, and preferably, alkoxylated alkyl ethers, alkoxylated alkyl esters, and alkyl polyglycosides.
  • Polyglyceryl ester polysorbates and sugar esters. More preferably, Tween-20 or Tr i ton X-100 is used, and most preferably Tween-20 is used.
  • the method of the present invention then comprises the step of (b) incubating the result of step (a) to further form a male form of the male form-forming polypeptide.
  • the amount of aggregate (antigen) of the aggregate-forming polypeptide to be measured in the raw sample is very small or the size of the aggregate (antigen) of the bulb-forming polypeptide is very small. If it is difficult to measure or if the amount of aggregate (antigen) of the aggregate-forming polypeptide in the human body is not proportional to the amount of aggregate (antigen) of the aggregate-forming polypeptide in the raw sample, the above-mentioned (i A monomeric or multimeric form of the aggregated-forming polypeptide, ( ⁇ ) a hydrophobic deletion of the swollen-formed polypeptide, or (iii) the male form.
  • step (b) further formation of the aggregate of the aggregated-forming polypeptide of step (b) is carried out by incubating the result of step (a) at a temperature of 1-50 ° C. More preferably, incubated at a temperature of 25-5 CTC, more preferably at a temperature of 25-45 ° C., even more preferably at a temperature of 25-40 ° C. , Even more preferably at a temperature of 25-38 ° C.
  • the incubation of step (b) is carried out for a time period in which the spiked (i), (ii) or (iii) can be multimerized by the raw sample, more preferably the
  • the incubation time that can be multimerized by raw samples is that the signal generated by using a human raw sample having a disease involving multimer form of a swollen-forming polypeptide is generated using a normal human sample. It is enough time to make 1.5-20 times larger than the generated signal.
  • the signal generated using the human raw sample is carried out for a time sufficient to be 1.5- 20 times larger than the signal generated using the normal human raw sample.
  • Further formation of the aggregated-forming polypeptide of step (b) is carried out by incubating the result of step (a) for 1 to 12 days, more preferably 30 hours (hr). ) For 10 days, even more preferably for 2 to 8 days, even more preferably for 2 to 6 days, even more preferably for 3 to 6 days And most preferably for 4 to 6 days, and most preferably for 5 to 6 days.
  • the term "incubation” means to stand or shake a raw sample of analyte at a predetermined temperature for a predetermined time, and in the case of shaking, preferably mild shaking (mi ld shaking).
  • Another of the greatest features of the present invention is the monomeric (or multimer) form of the spiked aggregated-forming polypeptide present in the raw sample by standing (ie, incubating) the raw sample at a predetermined temperature for a period of time and / Or above
  • the hydrophobic deletion of the swollen-forming polypeptide and the swollen-forming polypeptide are well aggregated with each other to maximize the difference in diagnostic signals between the patient and the normal person.
  • (c) contacting the resultant of step (b) with a binder-label that binds to the aggregate of the aggregated-forming polypeptide.
  • the method of the present invention is then subjected to the step of contacting the resultant of step (b) with a binding agent-labeled signal-binding label to a binding agent that binds to the agglutinant of the aggregated-forming polypeptide.
  • the binding agent that binds to the male form of the male-forming polypeptide is an antibody, peptide aptamer, adnectin, affibody (af f ibody, U.S. Pat.No. 5,831,012), avimer (Avimer, Silverman). , J. et al, Nature Biotechnology 23 (12): 1556 (2005)) or Kunis domain, Arnoux B et al., Acta Crystal logr.D Biol.Crystal logr. 58 (Pt 7): 12524 ( 2002), and Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & developmen 9 (2): 2618 (2006)).
  • the signaling marker bound to the binding agent binding to the aggregated-forming polypeptide is a compound label (eg, biotin), an enzyme label (eg, alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ - Galactosidase and ⁇ -glucosidase), radiolabels (eg I 125 and C 14 ), fluorescent labels (eg fluorescein), luminescent labels, chemiluminescent labels and FRET (fluorescence resonance energy transfer; fluorescence resonance energy transfer) labels, including but not limited to. (d) detection of signals generated from the binder-label bound to the aggregated form of the aggregated-forming polypeptide
  • an enzyme label eg, alkaline phosphatase, peroxidase, ⁇ - Galactosidase and ⁇ -glucosidase
  • radiolabels eg I 125 and C 14
  • fluorescent labels eg fluorescein
  • luminescent labels eg chemiluminescent labels
  • the method of the present invention comprises the step of (d) detecting a signal generated from the binder-label bound to the male of the male-forming polypeptide.
  • the detection of the signal generated from the binder-label bound to the male form of the male form-forming lipopeptide is carried out by various methods known in the art. For example, using immunoassays related to antigen-antibody reactions.
  • said steps (C) and (d) are carried out in a method comprising the following steps: (c-1) said puddle-forming capturing said aggregate Contacting the result of step (b) with a capture antibody that recognizes an epitope on the polypeptide; (c-2) contacting the captured aggregate with a detection antibody that recognizes an epitope on the aggregated-forming polypeptide; And (c-3) detecting the aggregated-detecting antibody complex.
  • This detection method utilizes two types of antibodies, capture antibodies and detection antibodies.
  • capture antibody refers to an antibody capable of binding to a male-forming polypeptide to be detected in a raw sample.
  • detecting antibody refers to an antibody capable of binding to the aggregate-forming polypeptide captured by the capture antibody.
  • Antibody means an immunoglobulin protein capable of binding an antigen.
  • Antibodies as used herein include antibody fragments (eg, F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv) as well as whole antibodies capable of binding epitopes, antigens or antigen fragments to be detected.
  • the detection method uses a set of capture antibodies and detection antibodies that specifically recognize epitopes on aggregated-forming polypeptides, wherein the epitopes that the capture antibodies and detection antibodies specifically recognize are the same or overlap each other. have.
  • overlapped wi th used while referring to epitopes for capture antibodies and detection antibodies, encompasses epitopes comprising amino acid sequences that are fully or partially overlapped.
  • epitopes for 6E10 and W02 antibodies have amino acid sequences consisting of amino acids 3-8 and 4-10, respectively, of human ⁇ peptide sequences
  • epitopes for 6E10 and FF51 antibodies respectively, amino acids of human A peptide sequences.
  • Having an amino acid sequence consisting of 3-8 and 1-4, and epitopes for 1E11 and W02 antibodies were amino acids 1-8 and 4-10 of the human ⁇ peptide sequence, respectively.
  • the epitope for the 1E11 and FF51 antibodies has an amino acid sequence consisting of amino acids 1-8 and 1-4 of the human A ⁇ peptide sequence, respectively. Such epitopes can be described as fully overlapped epitopes.
  • epitope for 3 ⁇ 6 and 3 ⁇ 6 biot in antibodies is a sequence consisting of 119-140 of the ⁇ -synuclein protein sequence.
  • the epitope when expressing while referring to a human ⁇ peptide sequence, the epitope has an amino acid sequence consisting of amino acids 1-8, 3-8, 1-4 or 4-10, ⁇ -synuclein When expressed with reference to a protein sequence, the epitope has an amino acid sequence consisting of amino acids 119-140.
  • the epitope recognized by the capture antibody is a sequence which is not repeated in the swung-forming polypeptide, and the epitope recognized by the detection antibody is not repeated in the aggregated-formed polypeptide. Not sequence.
  • the male-forming polypeptide bound to the capture antibody can no longer bind to the detection antibody because there is no additional epitope recognized by the detection antibody.
  • the capture antibody and the detection antibody are identical to each other. In other words, the epitope specifically bound to the capture antibody and the detection antibody is preferably the same.
  • the capture antibody is bound to a solid substrate.
  • Known materials of this type include hydrocarbon polymers such as polystyrene and polypropylene, glass, metals, and gels.
  • the solid substrate may be in the form of dipsticks, microtiter plates, particles (eg beads), affinity columns and immunoblot membranes (eg polyvinylidene fluoride membranes). See US Pat. No. 5,143. , 825, 5, 374, 530, 4,908, 305 and 5,498, 551).
  • the detection antibody has a label which generates a detectable signal.
  • the label may be a compound label (eg biotin), an enzyme label (eg alkaline phosphatase, peroxidase, IB
  • an antibody capable of binding to an aggregate-forming polypeptide is fused (Kohler and Mil stein, European Journal of Immunology, 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA method (US Pat. No. 4,816, 56) or phage antibody libraries (Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991); and Marks, et al, J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991))
  • it can be prepared using the epitope previously described as an immunogen.
  • General methods for preparing such antibodies are described in Harlow, E. and Lane, D., Antibodies ' .
  • Preparation of hybridoma cell lines for monoclonal antibody preparation is carried out by the fusion of i ⁇ ortal cell lines and lymphocytes producing antibodies.
  • the preparation of the monoclonal antibody can be carried out using techniques known in the art.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by injecting the antigens described above into a suitable animal, collecting antisera containing the antibodies, and then separating the antibodies by known affinity techniques.
  • Detection of the globular-detection antibody complex can be carried out by various methods known in the art. Formation of aggregated-detecting antibody complexes indicates the presence of aggregated forms in the raw sample. The step is carried out according to a conventional method, for example, Enzyme Immunoassay, ET Maggio, ed. , CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980 and Harlow and Lane, eds. Antibodies ' -A Laboratory Manua J (l9 & 8) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Likewise, various detectable label / substrate pairs can be used to perform quantitatively or qualitatively.
  • the detection antibody When the detection antibody is labeled with alkaline phosphatase, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT) and ECF can be used as a substrate for color reaction.
  • BCIP bromochloroindolyl phosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium
  • ECF can be used as a substrate for color reaction.
  • horse radish peroxidase chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether as substrates Luminol, Amplex red reagent (10-acetyl-3, 7-dihydroxyphenoxazine;), TMB (3, 3, 5, 5-tetramethylbenzidine), enhanced chemi luminescence (ECL) and ABTS (2) , 2-azine
  • a signal generated using a human raw sample having a disease involving a multimer type of a wedge-forming polypeptide can be 1.5-20 times larger than a signal generated using a normal human raw sample. More preferably, it is 1.5-10 times, More preferably, it can make 1.6 times -10 times larger.
  • the present invention provides a kit for detecting agglutinates of a male-formed polypeptide of a biosample comprising: (i) of the agglomerate-forming polypeptide Monomeric or multimeric, (ii) a hydrophobic deletion of the aggregated-forming polypeptide (hydnsphobi c deleted der ivat ive of aggr egat e to f orm i ng polypept ide), or (iii) the aggregated-formed poly A monomeric or multimer form of a peptide and a hydrophobic deletion of said aggregated-forming polypeptide.
  • the kit of the present invention utilizes the above-described method of detecting the aggregate form of the aggregate-forming polypeptide of the biosample of the present invention, which is common between the two to avoid excessive complexity of the specification according to the repetitive description. For that reason, the description is omitted.
  • the kit comprises a capture antibody that recognizes an epitope on the aggregated-forming polypeptide; And a detection antibody that recognizes the epitope recognized by the capture antibody.
  • the present invention provides a method or kit for detecting agglomerates of swollen-forming polypeptides of a biosample.
  • the method of the present invention is determined because the amount of aggregated (antigen) of the bore-forming polypeptide to be measured in the raw sample is very small or the size of the bulbous (antigen) of the aggregated-forming polypeptide is very small.
  • the amount of aggregated (antigen) of the aggregated-forming polypeptide in the human body is not proportional to the amount of the aggregated (antigen) of the aggregated-forming polypeptide in the raw sample. Differences in diagnostic signals (di f ferent at ion) between patients and normal subjects were maximized using differences in the clearing system and / or hydrophobic interactions that inhibit formation.
  • the present invention can be carried out in a convenient and rapid manner, which allows for the automation of the method of detecting the coarse form of the aggregate-forming polypeptide of the biosample.
  • La shows changes in A ⁇ oligomer followed by 4 days incubation time after rec.Ap l-42 spiking.
  • Lb shows the change of A ⁇ oligomer with 6 days incubation time after rec.Ap i-42 spiking.
  • Figure lc shows the change of A ⁇ oligomer with incubation time for 2 days, 3 days, 4 days, 5 days after rec .A
  • Id is rec. 5 days incubation after A ⁇ 1-42 spiking, rec. Changes in A ⁇ oligomers are shown after 0 and 5 days of incubation without adding A ⁇ 1-42.
  • FIG. 2A shows changes in A ⁇ oligomers after 6 days of incubation following spikes of rec.A
  • 2B shows changes in A ⁇ oligomers after spiking rec.AP 9-42 that binds to A ⁇ and then incubated for 2 days, 3 days and 4 days.
  • Coated buffers (Carbonate-Bi carbonate Buf fer), PBST, TBST and PBS were purchased from Sigma.
  • Block Ace was purchased from Bio-rad.
  • Buffer A was prepared by diluting 0.4% of Block Ace in TBST.
  • the blocking buffer was prepared so that 1% Block Ace was dilute in the DW.
  • 6E10 antibody was purchased from Biolegend. 3B6 Antibodies ' Novus
  • FF51-HRP was purchased from The H ab.
  • Recombinant A ⁇ 1-42 was purchased from Biolegend.
  • Recombinant A ⁇ 9-42 biot in was purchased from Anaspec.
  • Recombinant A ⁇ 9-42 was purchased from Anaspec.
  • Recombinant ⁇ -synuclein was purchased from Mi l ipore. Plasma samples were obtained from Seoul National University Bundang Hospital and Chung-Ang University Hospital. ECL solution was purchased from Rockland. Plates were purchased from Nunc.
  • Epitopes for 6E10 and FF51 antibodies have amino acid sequences consisting of amino acids 3-8 and 1-4 of the human A ⁇ peptide sequence, respectively.
  • Epitopes for 3 ⁇ 6 and 3 ⁇ 6 biotin antibodies are sequences consisting of 119-140 of the ⁇ -synuclein protein sequence.
  • Example 2 6E10 Plate Preparation
  • the positive control was 100 ⁇ 1 by adding PBST 990 ⁇ 1 to 10 ⁇ 1 of recombinant Ai31-42 (rec. A ⁇ ) (1 yg / ml).
  • PBST 990 ⁇ 1 was added to 10 ⁇ l of synuclein (1 mg / ml) to use 100 ⁇ 1.
  • Negative control PBS 100 ⁇ l was used.
  • Example 5 Sample Preparation
  • sample without spiked recombinant peptide was prepared to mix HBRK 0.123 mg / ml) 8.08 ⁇ 1 and PBST 200 ⁇ 1 in 20 ⁇ 1 plasma to make the total 228.08 ⁇ .
  • Example 6 Incubation
  • Rec. Samples prepared by treatment with A ⁇ 1-42 were incubated in a 37 ° C. incubator each for 4 days and 6 days.
  • 31-42 in Example 5 were incubated in a 37 ° C. incubator each for 2 days, 3 days, 4 days, and 5 days.
  • rec. Samples not treated with A ⁇ 1-42 were incubated in a 37 ° C. incubator each for 0 and 5 days.
  • the sample prepared by treatment with rec.AP 9-42 biotin in Example 5 was incubated for 6 days.
  • the sample prepared by rec.AP 9-42 was incubated for 2 days, 3 days and 4 days, respectively.
  • Example 7 A ⁇ oligomer detection using a mul timer detection system (MDS) in samples incubated for 4 and 6 days after treatment with rec.Api-42
  • MDS mul timer detection system
  • the FF51-HRP antibody was diluted 1/1000 with buffer A and dispensed 100 ⁇ l each, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
  • the plate was washed three times with TBST and 100 ⁇ l of ECL solution was dispensed.
  • the full rate reacted with ECL was inserted into a luminometer instrument (perkinelmer) and the luminescent signal was measured. The result is shown in Figure la below.
  • La and lb are rec.
  • the incubation time after A ⁇ 1-42 addition increased the signal of the AD sample compared to the signal of the non AD sample.
  • La and lb show that the signal of A ⁇ oligomer in the AD patient sample is higher than that in the Non AD patient sample, indicating that the defense system that inhibits A ⁇ oligomer formation in the AD patient sample is less active than in Non AD patient. It is judged.
  • Example 8 rec. A ⁇ oligomer detection using multimer detection system (MDS) in samples incubated for 2, 3, 4, 5 days after treatment with A ⁇ 1-42
  • 6E10 coated plates (3 yg / ml) were treated with positive control, negative control and rec.Ap i-42 to dispense 100 ⁇ each of incubated samples for 2, 3, 4 and 5 days, respectively. Incubate for 1 hour in a stationary state at 27 ° C incubator. The plate was washed three times with TBST and FF51-HRP antibody was prepared to be 10 ng / ml in buffer A, and then aliquoted at 100 ul: The plate was allowed to stand for 1 hour in a 27 ° C incubator and ⁇ 3 with TBST. After washing twice, the ECL solution was dispensed in 100 ⁇ . The plate reacted with ECL was inserted into a luminometer instrument (perkinelmer) and the luminescent signal was measured. The result is shown in FIG.
  • Lc rec. After incubation for 2 days, 3 days, 4 days, and 5 days after the addition of ⁇ 3 1-42, the signal of the AD sample was 1.15 times, 1.34 times, 1.65 times, and 1.84 times higher than that of the non AD sample. Incubation As the number of days increases, the difference between AD and Non AD gradually increases.
  • Example 9 A ⁇ oligomer (ol igomer) using MDS tnulUtner detect ion system in samples incubated 5 days after treatment with rec.Ap i-42, 0 days after treatment without rec.Ap i-42 detection
  • Figure 1d shows that the high signal of A ⁇ oligomer in the sample of AD patients, the defense system that inhibits the formation of A ⁇ oligomer in the AD patient sample is judged to be less active than in Non AD patients, A ⁇ 1-42 When spiked, it is believed to show an effect on the defense system that inhibits A ⁇ oligomer formation.
  • Example 10 A ⁇ oligomer detection using MDSOmiltimer detection system in samples incubated for 6 days after treatment with ⁇ . ⁇ 9-42 biotin
  • 6E10 coating plate (3 yg / ml) was treated with a positive control, a negative control, rec.A ⁇ 9-42 biotin was incubated for 6 days each sample 100 ⁇ 1 and reacted for 1 hour at room temperature.
  • the poolate was washed three times with TBST and FF51-HRP antibody was diluted 1/1000 with Buffer A and dispensed by 100 ⁇ l, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
  • the poolate was washed three times with TBST and then 100 ⁇ divided into ECL solutions.
  • the folate reacted with ECL was inserted into a luminometer instrument (perkinelmer) and the luminescence signal was measured.
  • FIG. 2A The results are summarized in FIG. 2A below.
  • Figure 2a shows that the signal of the AD patient group was higher than the normal group signal when incubated for 6 days with swipe 3 ⁇ 4 rec.AP9-42 biotin binding to A ⁇ .
  • Example 11 A ⁇ oligomer detection using MDSOmiltimer detection system in samples incubated for 2 days, 3 days, 4 days after treatment with ⁇ . ⁇ 9-42 biotin
  • 6E10 coated folate (3 pg / ml) was treated with positive control, negative control, rec.Ap9-42 to dispense 100 ⁇ each of the incubated samples for 2, 3 and 4 days and then in a 27 ° C incubator. The reaction was allowed to stand for 1 hour. The poolate was washed three times with TBST, and FF51—HRP antibody was prepared in buffer A at 10 ng / ml, and then aliquoted at 100 ul. The plate was reacted for 1 hour in a stationary state in a 27 ° C. incubator, washed three times with TBST, and 100 ⁇ l of ECL solution was dispensed for 1 min.
  • Figure 2b shows that the AD patient group's signal is 1.1 times, 1.52 times, 1.84 as time increases when spiked with rec.A
  • 3 ⁇ 6 coated plates (2 yg / ml) were treated with positive control, negative control, and recombinant ⁇ -synuclein to incubate samples incubated for 100 days after incubation for 0, 2, 4 and 6 days, respectively, at 27 °.
  • the reaction was allowed to stand for 1 hour in a C incubator.
  • the plate was washed three times with TBST, and 3B6-biot in antibody was prepared in buffer A at 2 ⁇ g / ml and then aliquoted at 100 ul.
  • the folate was reacted in stationary state in a 27 ° C. incubator for 1 hour and washed three times with TBST.
  • Strepptavidin-HRP was diluted 1/5000 times in buffer A and dispensed in 100 ul portions, and then the plate was stirred for 1 hour in a 27 ° C. incubator and washed three times with TBST. ECL solution was dispensed in 100 ⁇ l. Folate reacted with ECL was inserted into a luminometer device (perkinelmer) and the luminescence signal was measured and the results are summarized in FIG. 3 below.
  • FIG. 3 is a data showing the signal change of the PD sample and the signal of the non-PD sample as time increases during incubation 0 days, 2 days, 4 days, 6 days after the addition of recombinant ⁇ -synuclein Non, when 0 days
  • the rat rat io of the PD sample showed 0.92 fold increase compared to the PD signal, which showed 1.34 fold, 1.76 fold, and 1.78 fold increase in 2 days, 4 days, and 6 days of incubation.

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Abstract

본 발명은 (a) 분석대상의 생시료에 (i) 상기 응집형-형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형, (ii) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydrophobic deleted derivative of aggregate- forming polypeptide), 또는 (iii) 상기 응집형-형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 스파이킹 (spiking)하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 인큐베이션 시켜 상기 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 추가적으로 형성시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 상기 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합하는 결합제에 시그널발생 표지가 결합된 결합제-표지를 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합된 결합제-표지로부터 발생되는 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 생시료 (biosample)의 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

【명세세
【발명의 명칭】
웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형을 검출하는 방법 【기술 분야】
본 특허출원은 2014년 12월 02일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0170608호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 생시료 (biosample)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 또는 키트에 관한 것이다.
【배경 기술】
우선， 단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 멀티머를 형성하여 기능적인 단백질을 이루는 경우도 있지만， 정상적인 상태에서는 모노머로 존재하다가 비정상적인 상태 (예컨대， 미스폴딩형으로 전환)가 되면 멀티머를 형성하여 웅집되어 질병을 유발하는 경우가 많다 (Massimo Stefani , et al . , J. Mol. Med. 81:678-699(2003); and Radford SE, et al .， Cell. 97:291-298(1999)).
예를 들어， 단백질의 비정상적인 웅집 또는 미스폴딩과 관련된 질환 또는 질병은 알츠하이머 질환， 크로이츠펠트-야콥병， 스폰지품 뇌질환 (Spongiform encephalopathies), 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환， 근위축성 측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis) , 서핀 결핍증 (Serpin deficiency), 폐기종 (emphysema )， 경변증 (cirrhosis)ᅳ 제 II 형 당뇨병， 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증， 전두측두엽성 치매 (Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증， 가족성 아밀로이드 다발신경병 (familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병 (hereditary cerebral amyloid angiopathy) 및 혈투석- 관련 아밀로이드증을 포함 한다.
이러한 질환 또는 질병의 유무 또는 진행 정도를 측정하는데 있어， 항원의 양이 시료 속에 매우 적거나 항원의 크기가 매우 작아서 측정하기 어렵거나， 혹은 몸 속의 항원의 양과 시료 속의 항원의 양이 비례하지 않는 경우에, 예컨대， 알츠하이머 질환에 관여하는 Αβ(아밀로이드-베타)도 정상인에 비해 비정상인에서 Αβ 올리고머 레벨이 높은 것으로 알려져 있지만, 혈액시료 내 Αβ 올리고머 양의 검출이 어렵거나 혈액 시료 내에 비정형적으로 Αβ 올리고머가존재할 때 진단이 어려을수 있다.
또한, 측정하고자 하는 항원이 너무 작거나 양이 적어서 sandwi ch ELISA를 통한 질환의 진단이 쉽지 않는 경우가 있다. 이에， 본 발명자들은 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (di f ferent i at ion)를 극대화한 응집형-형성 폴리펩타이드의 응집형 검출 방법의 개발 필요성을 인식하였다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
상기 배경 하에서, 본 발명자들은 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 신규 방법을 개발하기 위하여 폭넓은 연구를 해왔고， 그 결과， 폴리펩타이드의 응집형 형성을 억제하는 방어 시스템 (clear ing system) 또는 소수성 상호 작용 (hydrophobic interact ion)의 차이를 이용하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (di f ferent i at ion)를 극대화한응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 검출 방법을 개발하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 생시료 (biosample)의 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 생시료 (biosample)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형을 검출하기 위한 키트를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생시료 (biosample)의 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형을 검출하는 방법올 제공한다: (a) 분석대상의 생시료에 ( i ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형， (ii) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydrophobic deleted derivative of aggregate-forming polypeptide) , 또는 (iii) 상기 응집형—형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 스파이킹 (spiking)하는 단계 ; (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 인큐베이션 시켜 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형을 추가적으로 형성시키는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합하는 결합제에 시그널발생 표지가 결합된 결합제-표지를 접촉시키는 단계; 및 (d) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합된 결합제 -표지로부터 발생되는 시그널을 검출하는 단계， 여기서， 상기 단계 (b)의 인큐베이션은 상기 스파이킹한 (i), (ϋ) 또는 (iii)이 상기 생시료에 의해 멀티머화 할 수 있는 충분한 시간 동안 실시한다 . 본 발명은 풀리펩타이드의 응집형 형성을 억제하는 방어 시스템 (clearing system) 또는 소수성 상호 작용 (hydrophobic interaction)의 차이를 이용하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (differentiation)를 극대화한 응집형—형성 폴리펩타이드의 웅집형 검출 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 용어 "웅집형 -형성 폴리펩타이드" 는 멀티머형 (올리고머형 )을 형성할 수 있거나 모노머와의 소수성 상호작용에 의한 응집형을 형성할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히， 하기 구조적 변화는 다양한 질환을 유발한다. 예컨대, 알츠하이머 질환, 크로이츠펠트-야콥병， 스폰지품 뇌질환 (Spongiform encephalopathies), 파킨슨 질환， 헌팅톤 질환， 근위축성 측삭경화증 (Amyotrophic lateral sclerosis) , 서핀 결핍증 (Serpin deficiency) , 폐기종 (emphysema) , 경변증 (cirrhosis), 제 II 형 당뇨병， 일차 전신성 아밀로이드증， 이차 전신성 아밀로이드증， 전두측두엽성 치매 (Fronto-temporal dementias), 노인 전신성 아밀로이드증， 가족성 아밀로이드 다발신경병 (familial amyloid polyneuropathy), 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병 (hereditary cerebral amyloid angiopathy) 및 혈투석 -관련 아밀로이드증을포함한다. 일반적으로， 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 비-응집형은 정상이고 웅집형은 질환， 특히 알츠하이머 질환, 크로이츠펠트—야콥병 또는 파킨슨 질환과 같은 신경 퇴행성 질환을유발한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 스파이킹한 (i), (ii) 또는 (iii)의 멀티머화를 시키는 상기 생시료는 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 멀티머형이 관여된 질환을 갖는 인간의 생시료이고， 보다 바람직하게는 상기 생시료에 의해 멀티머화 할 수 있는 층분한 인큐베이션 시간은, 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 멀티머형이 관여된 질환을 갖는 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널이 정상의 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널보다 1.5-20배 크게 하는데 층분한 시간이다. 이하, 생시료 (biosample)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하기 위한 본 발명의 방법을 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다: (a) 스파이킹 (spiking)하는 단계
우선, 본 발명의 방법은 분석대상의 생시료에 ( i ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 (올리고머형), (ii) 상기 응집형- 형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydrophobic deleted derivative of aggregate-forming polypeptide) , 또는 (iii) 상기 웅집형一형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 (올리고머형)과 상기 상기 응집형- 형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 스파이킹 (spiking)하는 단계를 포함한다.
본 명세서에서， 용어 "생시료 (biosample)" 는 분석하고자 하는 유기체 -유래 시료를 의미한다. 상기 생시료는 생물원의 세포， 조직， 또는 생체액, 또는 본 발명에 따라 분석될 수 있는 다른 미디엄 (medium)을 의미하고， 이는 인간으로부터 채취한 시료， 동물로부터 채취한 시료， 인간 또는 동물을 위한 식품으로부터 채취한 시료를 포함한다. 바람직하게는， 분석 대상의 생시료는 혈액， 혈청， 혈장， 림프액， 우유， 소변, 대변， 눈물， 타액， 정액， 뇌 추출물 (예컨대， 뇌 균질액)， 척수액 (SCF) , 층수, 비장 및 편도 조직 추출물을 포함하는 체내 유체 시료이다. 보다 바람직하게는, 상기 생시료는 혈액이고, 가장 바람직하게는, 혈장이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Αβ 펩타이드와 tau 단백질， 크로이츠펠트- 야콥병 및 스폰지품 뇌질환에 관여하는 프라이온， 파킨슨 질환에 관여하는 α -시누클레인， 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사술， 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A , 전두측두엽성 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴， 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴， 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C , 혈투석 -관련 아밀로이드증에 관여하는 β 2-마이크로글로블린， 헌팅톤 병에 관여하는 헌팅틴, 근위축성 측삭 경화증에 관여하는 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 서핀 결핍증, 폐기종， 및 경변증에 관여하는 서핀, 및 제 I I 형 당뇨병에 관여하는 아밀린을 포함한다ᅳ 보다 바람직하게는, 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Αβ 펩타이드 또는 tau 단백질， 또는 파킨슨 질환에 관여하는 α -시누클레인이고， 가장 바람직하게는 Αβ 펩타이드 또는 α -시누클레인이다. 본 명세서에서 용어 "스파이킹 (spiking) " 은 분석대상의 생시료에 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 (또는 멀티머형 ) 및 /또는 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 첨가 또는 첨가 후 흔합하는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "멀티머" 는 둘 이상의 모노머가 결합되어 형성되는 것으로서， 이에는 올리고머도 포함한다.
본 발명에 따르면， 분석대상의 생시료에 ( i ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형을 스파이킹 (spiking)하는 경우는， 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 형성을 억제시키는 방어시스템 (cl ear ing system) 차이를 이용하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (di f ferent i at ion)를 극대화 하고자, 즉 환자의 생시료는 방어시스템 (clearing system)의 정도가 낮아 응집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형 형성이 촉진되는데 반해 정상인의 생시료에서는 방어시스템 (clearing system)의 정도가 높아 응집형—형성 폴리펩타이드의 응집형 형성이 감소되어 진단 시그널의 차이 (differentiation)가 극대화 된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열로 이루어진 Αβ 펩타이드 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열 S 이루어진 α-시누클레인이다. 본 발명에 따르면， 분석대상의 생시료에 (ii) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydrophobic deleted derivative of aggregate-forming polypeptide)를 스파이 ¾ (spiking)하는 경우는， 소수성 (hydrophobic)을 가지는 아미노산 잔기를 포함하는 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체와 생시료에 존재하는 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 (올리고머형)과 소수성 상호 작용 (hydrophobic interact ion)의 차이를 이용하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (differentiation)를 극대화 하고자， 즉 환자의 생시료에 존재하는 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 (올리고머형 )과 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체는 소수성 상호작용에 의해 응집형을 다량 형성하나, 정상인의 생시료에 존재하는 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형과 응집형 -형성 풀리펩타이드의 소수성 결실체는 소수성 상호작용에 의해 웅집형을 형성하기는 하나 환자의 경우 보다는 적게 형성하여， 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (differentiation)가 극대화 된다. 본 명세서에서， 용어 "응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 ¾ (hydrophobic deleted derivative of aggregate-forming polypeptide)" 는 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 (올리고머형)과 소수성 상호작용에 의해 응집형이 형성될 수 있도록 응집형 -형성 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 소수성 아미노산 잔기를 다수 포함하도록 아미노산 잔기를 결실시킨 유도체이다.
웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체는 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 (올리고머형)과 소수성 상호작용을 위해 길이 (분자량) 및 /또는 소수성 아미노산 잔기를 고려하여 선택할 수 있으며， 바람직하게는 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydnsphobi c deleted der ivat ive of aggregate- forming polypept ide)는 서열목톡 제 1 서열의 아미노산 서열 중 37 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 A 3 delete 펩타이드이며, 보다 바람직하게는 상기 Ai3 delete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 29 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드이고， 보다 더 바람직하게는 상기 Ai3 delete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 17 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드이고， 가장 바람직하게는 상기 A 3 delete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 잔기 내지 42번째 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드이다. 본 '발명에 따르면， 분석대상의 생시료에 ( iii ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 스파이킹 (spiking)하는 경우는, 상술한 ( i ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형 및 ( ii ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 각각 스파이킹하여 달성되는 효과를 모두 이용하고자， 즉 폴리펩타이드의 웅집형 형성을 억제하는 방어 시스템 (clearing system) 및 소수성 상호 작용 (hydrophobi c interact ion)의 차이를 이용하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (di f ferent iat ion)를 극대화 하고자하는 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 단계 (a)의 결과물에 완충액을 추가적으로 첨가한다. 보다 바람직하게는, 상기 완층액은 생시료에 대하여 3-15 배 (v/v)로 첨가되고, 보다 더 바람직하게는 5-13 배 (v/v)로 첨가되며， 보다 더욱 더 바람직하게는 7-11 배 (v/v)로 첨가되고， 보다 더 더욱 더 바람직하게는 8-10 배 (v/v)로 첨가된다.
본 발명에 이용되는 완층액은 당업계에 공지된 다양한 완층액을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 완층액은 비이온성 계면활성제 -함유 인산염 완층액이다.
본 발명에 이용되는 인산염 완층액에 함유되는 비이온성 계면활성제는 당업계에 공지된 다양한 비이온성 계면활성제를 이용할 수 있고， 바람직하게는 알콕시레이티드알킬에테르， 알콕시레이티드알킬에스테르, 알킬폴리글리코사이드, 폴리글리세릴에스테르 폴리솔베이트류 및 슈가에스테르를 포함한다. 보다 바람직하게는 Tween- 20 또는 Tr i ton X-100 이 사용되며， 가장 바람직하게는 Tween-20 이 사용된다.
(b) 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을추가적으로 형성시키는 단계
그 다음, 본 발명의 방법은 (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 인큐베이션 시켜 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형을 추가적으로 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 생시료 속에 측정하고자 하는 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 양이 매우 적거나 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 크기가 매우 작아서 측정하기 어렵거나， 또는 인체 내 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 양과 생시료 속의 응집형—형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 양이 비례하지 않은 경우에， 상술한 ( i ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형, ( Π ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydnDphobi c deleted derivat ive of aggr egate-forming polypept ide) , 또는 ( iii ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 생시료에 스파이킹 (spiking)하여 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 추가적으로 형성시킴으로써， 질병 또는 질환의 유무 또는 진행 정도를 측정할 수 있다는 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형의 추가적인 형성은 상기 단계 (a)의 결과물을 온도 1-50°C에서 인큐베이션 ( incubat ion)시켜 실시하고， 보다 바람직하게는 온도 25-5CTC에서 인큐베이션 ( incubat ion)시켜 실시하며, 보다 더 바람직하게는 온도 25-45°C에서 실시하며, 보다 더욱 더 바람직하게는 온도 25-40°C에서 실시하고， 보다 더 더욱 더 바람직하게는온도 25-38 °C에서 실시한다.
본 발명에서， 상기 단계 (b)의 인큐베이션은 상기 스파이킹한 ( i ) , ( i i ) 또는 ( i i i )이 상기 생시료에 의해 멀티머화 할 수 있는 층분한 시간 동안 실시하고, 보다 바람직하게는 상기 생시료에 의해 멀티머화 할 수 있는 층분한 인큐베이션 시간은， 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 멀티머형이 관여된 질환을 갖는 인간의 생시료를 아용하여 발생된 시그널이 정상의 인간의ᅳ생시료를 이용하여 발생된 시그널보다 1.5-20배 크게 하는데 충분한 시간이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널이 정상의 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널보다 1. 5- 20 배 크게 하는데 충분한 시간동안 실시하기 위한， 상기 단계 (b)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형의 추가적인 형성은 상기 단계 (a)의 결과물을 1 일 내지 12 일 동안 인큐베이션 ( incubat i on)시켜 실시하고， 보다 바람직하게는 30시간 (hr) 내지 10 일 동안 실시하며, 보다 더 바람직하게는 2 일 내지 8 일 동안 실시하고, 보다 더욱 더 바람직하게는 2 일 내지 6 일 동안 실시하며, 보다 더 더욱 더 바람직하게는 3 일 내지 6 일 동안 실시하고， 가장 바람직하게는 4 일 내지 6 일 동안 실시하며， 가장 더 바람직하게는 5일 내지 6일 동안실시한다. 본 명세서에서 용어 "인큐베이션" 은 분석대상의 생시료를 소정의 온도에서 일정기간 동안 스탠딩 하는 것 (kept to stand) 또는 쉐이킹 (shaking) 하는 것을 의미하고， 쉐이킹 하는 경우에는 바람직하게는 마일드 쉐이킹 (mi ld shaking) 하는 것을 의미한다.
본 발명의 가장 큰 특징 중 다른 하나는 생시료를 소정의 온도에서 일정 기간 스탠딩 (즉, 인큐베이션) 함으로써， 생시료에 존재하는 스파이킹 된 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 (또는 멀티머형 ) 및 /또는 상기 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체와 웅집형 -형성 폴리펩타이드가 서로 잘 웅집 (aggregation)되도록 하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (differentiation)를 극대화하였다는 점이다. (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 상기 응집형—형성 폴리펩타이드의 웅집형에 결합하는 결합제-표지의 접촉
그리고， 본 발명의 방법은 (c) 상기 단계 (b)의 결과물에 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합하는 결합제에 시그널발생 표지가 결합된 결합제-표지를 접촉시키는 단계를 거친다.
본 발명에서 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형에 결합하는 결합제는 항체， 펩타이드 앱타머 , 어드넥틴 (AdNectin), 어피바디 (af f ibody, 미국 특허 제 5,831,012 호)， 아비머 (Avimer, Silverman, J. et al, Nature Biotechnology 23(12)： 1556(2005)) 또는 쿠니 S 도메인 (Kunitz domain, Arnoux B et al . , Acta Crystal logr . D Biol . Crystal logr . 58(Pt 7) :12524(2002)), 및 Nixon, AE, Current opinion in drug discovery & developmen 9 ( 2 ) : 2618 ( 2006 ) )이다.
본 발명에서 상기 응집형—형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합하는 결합제에 결합되는 시그널발생 표지는 화합물 표지 (예컨대， 바이오틴)， 효소 표지 (예컨대， 알카린 포스파타아제， 페록시다아제 , β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지 (예컨대， I125 및 C14), 형광 표지 (예컨대， 플루오레세인)， 발광 표지， 화학발광 표지 및 FRET (형광 공명 에너지 전달; fluorescence resonance energy transfer) 표지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. (d) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합된 결합제 -표지로부터 발생되는 시그널의 검출
마지막으로， 본 발명의 방법은 (d) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형에 결합된 결합제 -표지로부터 발생되는 시그널을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 웅집형 -형성 ¾리펩타이드의 웅집형에 결합된 결합제- 표지로부터 발생되는 시그널의 검출은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있으며， 예컨대 항원 -항체 반웅과 관련된 면역분석법을 이용하여 실시할수 있다ᅳ
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면， 상기 단계 (C) 및 (d)는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 실시된다: (c-1) 상기 응집형을 포획 (capturing)하는 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드상의 에피토프를 인식하는 포획 항체에 상기 단계 (b)의 결과물을 접촉시키는 단계; (c-2) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드상의 에피토프를 인식하는 검출 항체에 상기 포획된 응집형을 접촉시키는 단계; 및 (c-3) 응집형 -검출 항체 복합체를 검출하는 단계 .
이러한 검출 방법은 두 가지 형태의 항체, 즉 포획 항체 및 검출 항체를 이용한다. 본 명세서에서 용어， "포획 항체" 는 생시료에서 검출하고자 하는 웅집형 -형성 폴리펩타이드에 결합 할 수 있는 항체를 의미한다. 용어， "검출 항체" 는 상기 포획 항체에 의해 포획된 응집형- 형성 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. "항체" 는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본 명세서에 이용된 항체는 검출 하고자 하는 에피토프， 항원 또는 항원 단편에 결합할 수 있는 전체 항체뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, F(ab' )2， Fab' , Fab, Fv)을포함한다. 상기 검출 방법은 응집형 -형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 특이적으로 인식하는 한 세트의 포획 항체 및 검출 항체를 이용하는 것으로서， 상기 포획 항체 및 검출 항체가 특이적으로 인식하는 상기 에피토프는 서로 동일하거나오버래핑 되어 있다.
포획 항체 및 검출 항체에 대한 에피토프를 언급하면서 사용되는 용어， "오버래핑 (over lapped wi th)" 은 완전히 또는 부분적으로 오버래핑된 아미노산 서열을 포함하는 에피토프를 포괄한다. 예를 들어， 6E10 및 W02 항체에 대한 에피토프는 인간 Αβ 펩타이드 서열의 각각， 아미노산 3-8 및 4-10으로 이루어진 아미노산 서열을 가지고， 6E10 및 FF51 항체에 대한 에피토프는 인간 Α 펩타이드 서열의 각각， 아미노산 3-8 및 1-4 로 이루어진 아미노산 서열을 가지며， 1E11 및 W02 항체에 대한 에피토프는 인간 Αβ 펩타이드 서열의 각각， 아미노산 1-8 및 4-10 으로 이루어진 아미노산 서열을 가지고， 1E11 및 FF51 항체에 대한 에피토프는 인간 Αβ 펩타이드 서열의 각각, 아미노산 1-8 및 1-4로 이루어진 아미노산 서열을 가진다. 이러한 에피토프는 완전히 오버래핑된 에피토프로 설명될 수 있다.
또한， 3Β6 및 3Β6 biot in 항체에 대한 에피토프는 α -시누클레인 단백질 서열의 119-140로 이루어진 서열이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 인간 Αβ 펩타이드 서열을 언급하면서 표현하는 경우， 상기 에피토프는 아미노산 1-8， 3-8, 1-4 또는 4-10 으로 이루어진 아미노산 서열을 가지고, α -시누클레인 단백질 서열을 언급하면서 표현하는 경우， 상기 에피토프는 아미노산 119-140 으로 이루어진 아미노산서열을 가진다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 포획 항체가 인식하는 에피토프는 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이고， 상기 검출 항체가 인식하는 에피토프는 상기 응집형 -형성 풀리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이다. 본 발명의 검출 방법에 따르면， 포획 항체에 결합된 웅집형 -형성 폴리펩타이드는 검출 항체와 더 이상 결합 할 수 없고, 이는 검출 항체가 인식하는 추가적인 에피토프가 존재하지 않기 때문이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 포획 항체 및 검출 항체는 서로 동일하다. 즉， 포획 항체 및 검출 항체에 특이적으로 결합되는 에피토프는 동일한 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 포획 항체는 고체 기질에 결합된다. 이러한 형태의 공지의 물질은 폴리스티렌 및 폴리프로필렌， 유리, 금속, 및 젤과 같은 탄화수소 중합체를 포함한다. 상기 고체 기질은 딥스틱， 마이크로티터 플레이트， 입자 (예컨대, 비드)， 친화성 컬럼 및 이뮤노블롯 멤브레인 (예컨대， 폴리비닐리덴 플로라이드 멤브레인) 형태로 있을 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5, 143, 825 호， 제 5, 374 , 530 호， 제 4，908，305호 및 제 5，498，551호) .
본 발명의 다른 구현예에 따르면， 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지를 가진다. 상기 표지는 화합물 표지 (예컨대 , 바이오틴) , 효소 표지 (예컨대， 알카린 포스파타아제， 페록시다아제， IB
IS 갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제)， 방사능 표지 (예컨대， I125 및 C14), 형광 표지 (예컨대， 플루오레세인)， 발광 표지， 화학발광 표지 및 FRET (형광 공명 에너지 전달; fluorescence resonance energy transfer) 표지를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체를 표지하기 위한 다양한 표지 및 방법은 당업계에 공지되어 있다 (Harlow and Lane, eds. Ant i bodies'- A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y. ) .
본 발명에서， 응집형 -형성 폴리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 융합 (Kohler and Mil stein, European Journal of Immunology, 6:511- 519(1976)), 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제 4，816,56 호) 또는 파지 항체 도서관 (Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991); 및 Marks, et al, J. Mol. Biol. , 222:58， 1-597(1991))과 같은 종래 기술에 따라 면역원으로 종전에 기재된 에피토프를 이용하여 준비할 수 있다. 상기 항체 제조를 위한 일반적인 방법은 Harlow, E. and Lane, D. , Antibodies'. A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1988； Zola, H. , Monoclonal Ant i bodies'- A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. , Boca Raton, Florida, 1984； 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley /Greene, NY, 1991에 기재되어 있다.
단일클론 항체 제조를 위한 하이브리도마 세포주의 준비는 블멸 세포주 (i圍 ortal cell line) 및 항체를 생산하는 임파구의 융합으로 실시된다. 상기 단일클론 항체의 제조는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 다클론 항체는， 상술한 항원을 적합한 동물에 주입하고， 항체를 포함하는 항혈청을 수집한 다음, 공지된 친화성 기술에 의해 항체를 분리하는 방법에 따라 제조될 수 있다.
웅집형 -검출 항체 복합체의 검출은 당업계의 공지된 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 응집형 -검출 항체 복합체의 형성은 생시료에 응집형의 존재를 나타낸다. 상기 단계는 종래의 방법에 따라， 예컨대， Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed. , CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980 및 Harlow and Lane, eds . Antibodies'- A Laboratory ManuaJ(l9&8) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y 에 기재된 바와 같이 다양한 검출할 수 있는 표지 /기질 쌍을 이용하여， 정량적으로 또는 정성적으로 실시 할수 있다.
상기 검출 항체를 알카린 포스파타아제로 표지하는 경우에는， 브로모클로로인돌일 포스페이트 (BCIP) , 니트로 블루 테트라졸리움 (NBT) 및 ECF 를 발색 반웅을 위한 기질로서 이용할 수 있다; 호스 래디쉬 페록시다아제로 표지하는 경우, 기질로서 클로로나프톨， 아미노에틸카바졸， 디아미노벤지딘， D-루시페린, 루시게닌 (비스 -N-메틸아크리딘이움 나이트레이트)， 레소루핀 벤질 에테르， 루미놀, 암플렉스 레드 시약 ( 10- 아세틸 -3， 7-디하이드록시페녹사진；)， TMB(3， 3， 5 , 5-테트라메틸벤즈이딘)， ECL( enhanced chemi luminescence) 및 ABTS(2 ,2-아진-디 [3—에틸벤즈티아졸린 술포네이트] ) 등이 이용된다. 이러한 방법으로 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 멀티머형이 관여된 질환을 갖는 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널이 정상의 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널보다 1.5-20 배 크게 할 수 있고, 보다 바람직하게는 1.5-10 배， 보다 더 바람직하게는 1.6 배 -10 배 크게 할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음올 포함하는 생시료 (biosample)의 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하기 위한 키트를 제공한다: ( i ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형, ( ii ) 상기 응집형 -형성 플리펩타이드의 소수성 결실체 (hydnsphobi c deleted der ivat ive of aggr egat e~f orm i ng polypept ide) , 또는 ( iii ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 생시료 (biosample)의 응집형- 형성 폴리펩타이드의 옹집형을 검출하는 방법을 이용하는 것으로서， 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트는 응집형—형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체; 및 상기 포획 항체가 인식하는 상기 에피토프를 인식하는 검출항체를 추가적으로 포함한다. 【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 생시료 (biosample)의 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하는 방법 또는 키트를 제공한다.
(b) 본 발명의 방법은 생시료 속에 측정하고자 하는 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 양이 매우 적거나 응집형—형성 폴리펩타이드의 웅집형 (항원)의 크기가 매우 작아서 측정하기 어렵거나， 또는 인체 내 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 양과 생시료 속의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형 (항원)의 양이 비례하지 않은 경우에 , 폴리펩타이드의 응집형 형성을 억제하는 방어 시스템 (clear ing system) 및 /또는 소수성 상호 작용 (hydrophobi c interact ion)의 차이를 이용하여 환자와 정상인 간의 진단 시그널의 차이 (di f ferent at ion)를 극대화 하였다.
(c) 본 발명은 편리하고 신속한 방식으로 실시할 수 있으며， 이는 생시료 (biosample)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형을 검출하는 방법의 자동화를 가능하게 한다.
【도면의 간단한 설명】
도 la는 rec .Ap l-42 스파이킹 후 4 일 인큐베이션 시간에 따론 Αβ 올리고머의 변화를 보여준다.
도 lb 는 rec .Ap i-42 스파이킹 후 6 일 인큐베이션 시간에 따른 Αβ 올리고머의 변화를 보여준다.
도 lc 는 rec .A|3 1-42 스파이킹 후 2 일, 3 일， 4 일, 5 일 동안 인큐베이션 시간에 따른 Αβ 올리고머의 변화를 보여준다.
도 Id 는 rec . A β 1-42 스파이킹 후 5 일 인큐베이션， rec . Αβ 1- 42 를 첨가하지 않고 0 일， 5 일 인큐베이션 후 Αβ 올리고머의 변화를 보여준다. 도 2a는 rec .A|3 9-42 바이오틴을 스파이킹 한 다음 6일 인큐베이션 후 Αβ 올리고머의 변화를 보여준다ᅳ
도 2b 는 Αβ와 바인딩하는 rec .AP 9-42를 스파이킹 한 다음 2 일， 3일， 4일간 인큐베이션 후 Αβ 올리고머의 변화를 보여준다.
도 3 은 재조합 α -시누클레인을 스파이킹한 후 인큐베이션 0 일，
2 일, 4 일， 6 일동안 시간이 증가함에 따른 α -시누클레인 올리고머의 변화를 보여준다.
【발명을 실시하기 위한구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1: 실험재료의 준비
코팅버퍼 (Carbonate-Bi carbonate Buf fer) , PBST, TBST 및 PBS 는 s igma 사로부터 구입하였다. Block Ace 는 Bio-rad사로부터 구입하였다. 버퍼 A 는 TBST 에 Block Ace 를 0.4%로 희석하여 제조하였다. 블록킹 (blocking) 버퍼는 D.W 에 1% Block Ace 가 회석되도록 제조하였다. 6E10 항체는 Biolegend 사로부터 구입하였다. 3B6 항체는 ' Novus
Biologicals 사로부터 구입하였다. 3B6-biot in 항체는 Novus Biologi cals 사로부터 구입한 항체를 Peopl ebio 사에서 바이오틴화 (biot inyl at m)하였다. 스트렙타비딘 (streptavidin)— HRP 는 Thermo Scient i f ic 사로부터 구입하였다. HBR1 은 Scant i bodies
Laboratory 사에서 구입하였다. FF51-HRP 는 (주) The H l ab 에서 구입하였다. 재조합 (recombinant ) A β 1-42 는 Biolegend 사로부터 구입하였다. 재조합 Αβ 9-42 biot in 은 Anaspec 사에서 구입하였다. 재조합 Αβ 9-42 는 Anaspec 사에서 구입하였다. 재조합 α -시누클레인은 Mi l ipore 사에서 구입하였다. 혈장 (plasma) 샘풀은 분당 서울대병원 및 중앙대 병원에서 제공받았다. ECL 용액은 Rockland 사로부터 구입하였다. 플레이트는 Nunc 사로부터 구입하였다. 6E10 및 FF51 항체에 대한 에피토프는 인간 Αβ 펩타이드 서열의 각각， 아미노산 3-8 및 1-4 로 이루어진 아미노산 서열을 가진다. 3Β6 및 3Β6 biotin 항체에 대한 에피토프는 α-시누클레인 단백질 서열의 119-140로 이루어진 서열이다. 실시예 2: 6E10플레이트 제조
6E10 항체 (항 Αβ 단백질， Biolegend) 30 yg 을 코팅 버퍼 (signa) 10 ml 에 회석하고 플레이트 (Nunc)에 100 μ 1 를 각 웰에 분주 후 4°C 넁장고에 하루 동안 반웅 시켰다. 상기 플레이트를 PBS 에 3 번 세척하고 D.W 에 1% Block Ace 가 녹여진 블록킹 버퍼 240 μ 1 를 분주 후 실온에서
2 시간 반응 시켰다. 상기 플레이트는 PBS 로 3 번 세척하고 실온에 30분간 건조 시킨 뒤 사용하였다. 실시예 3: 3Β6플레이트 제조
3Β6 항체 (항 α-시누클레인 단백질， Novus Biologicals) 20 Ug 을 코팅 버퍼 (sigma) 10 ml 에 회석하고 플레이트 (Nunc)에 100 μΐ 를 각 웰에 분주 후 4°C 냉장고에 하루 동안 반응 시켰다. 상기 플레이트를 PBS 에
3 번 세척하고 D.W에 1% Block Ace가녹여진 블록킹 버퍼 240 를 분주 후 실온에서 2 시간 반웅 시켰다. 상기 플레이트는 PBS 로 3 번 세척하고 실온에 30분간 건조 시킨 뒤 사용하였다. 실시예 4: 대조군 준비
양성 대조군 (positive control)은 재조합 Ai31-42(rec. Αβ)(1 y g/ml) 10 μ 1에 PBST 990 μ 1를 첨가하여 100 μ 1를사용하였다ᅳ 양성 대조군 (positive control)은 재조합 α -시누클레인 (1 mg/ml ) 10 μΐ 에 PBST 990 μ 1 를 첨가하여 100 μ 1 를 사용하였다. 음성 대조군 (negative control)은 PBS 100 μ 1를사용하였다. 실시예 5: 샘플준비
샘플은 2 샘플을 기준으로 하여 준비하였다. 얼려진 혈장 샘폴을
37 °C 히트 블록 (heat block)에 15 분간 녹인 후 30 초간 볼텍성 (vortexing) 후사용 하였다. rec. A β 1-42 1 ng이 스파이킹 (spiking)된 샘플은， 혈장 20 μΐ 에 HBRK0.123 rag/ml) 8.08 μ 1 와 PBST 180 y 1, rec. Αβ 1-42(1 ng/10 μΐ) 20 μΐ 를 혼합하여 전체 228.08 μ 1 가 되도록 준비하였다. rec. Α β 9-42 바이오틴 1 ng 이 스파이킹된 샘플은, 혈장 20 μ 1 에 HBRK 0.123 mg/ml) 8.08 μ 1 와 PBST 180 y 1, rec-Αβ 9-42 biotin(l ng/10 μ ΐ) 20 μ ΐ 를 흔합하여 전체 228.08 μ 1 가 되도록 준비하였다. rec. A β 9-42 1 ng 이 스파이킹된 샘플은， 혈장 20 μ 1 에 HBRK0.123 mg/ml) 8.08 μ 1 와 PBST 180 μ 1, rec.A|3 9-42(1 ng/10 μΐ) 20 μ ΐ 를 흔합하여 전체 228.08 μΐ 가 되도록 준비하였다. 재조합 α-시누클레인 1 μ g 이 스파이킹된 샘플은， 혈장 20 μ 1 에 HBR 0.123 mg/ml) 8.08 μ 1 와 PBST 180 μ 1, 재조합 α-시누클레인 (1 g/lO μ 1) 20 μ 1 를 흔합하여 전체 228.08 μ 1 가 되도록 준비하였다. 또한， 재조합 펩타이드를 스파이킹하지 않은 샘풀은 혈장 20 μ 1에 HBRK0.123 mg/ml) 8.08 μ 1와 PBST 200 μ 1를 흔합하여 전체 228.08 μ ΐ가되도록 준비하였다. 실시예 6: 인큐베이션 (incubation)
상기 실시예 5 에서 rec. Αβ 1-42 가 처리되어 준비된 샘플은 37°C 인큐베이터에서 각 4 일과 6 일간 인큐베이션 시켰다. 상기 실시예 5 에서 rec.A|31-42가 처리되어 준비된 샘플은 37°C 인큐베이터에서 각 2일， 3일， 4 일, 5 일간 인큐베이션 시켰다. rec. Αβ 1-42 가 처리되지 않은 샘플은 37 °C 인큐베이터에서 각 0 일， 5 일간 인큐베이션 시켰다. 그리고, 상기 실시예 5 에서 rec.AP 9-42 biotin 이 처리되어 준비된 샘플은 6 일 동안 인큐베이션 시켰다. 상기 실시예 5 에서 rec.AP 9-42 가 처리되어 준비된 샘폴은 각 2 일， 3 일， 4 일간 인큐베이션 시켰다. 또한， 상기 실시예 5에서 재조합 α-시누클레인이 처리되어 준비된 샘플은 각 0일， ' 2일， 4일 6일간 인큐베이션 시켰다. 실시예 7: rec.Api-42 를 처리한 후 4 일과 6 일 동안 인큐베이션된 샘풀에서 MDS(mul timer detection system)을 이용한 Αβ 올리고머 (ol igomer) 검출 6E10 코팅 플레이트 (3 y g/ml )에 양성 대조군， 음성 대조군 및 rec .A|3 1-42 가 처리되어 4 일과 6 일 동안 인큐베이션된 샘플을 각각 100 μ 1씩 분주 한후실온에서 1시간 반웅 시켰다. 상기 폴레이트를 TBST로
3 번 세척하고 FF51-HRP 항체를 버퍼 Α 에 1/1000 회석하여 100 μ 1 씩 분주한 후 실온에서 1 시간 반응 시켰다. 상기 플레이트를 TBST 로 3 번 세척 후 ECL 용액을 100 μ 1 분주 하였다. ECL 과 반응된 풀레이트는 루미노미터 기기 (perkinelmer)에 삽입하고 발광 ( luminescent ) 시그널을 측정하였다. 그 결과는 아래 도 la와 같다.
도 la 및 lb 는 rec . A β 1-42 첨가 후 인큐베이션 시간에 따라 AD 샘플의 시그널이 Non AD 샘플의 시그널에 비해 증가 되는 것을 보여준다.
4일과 6일 인큐베이션 된 각조건에서 AD와 Non AD간에 차이를 보여준다.
도 la 및 lb 를 통해서 보건대 Non AD 환자 샘플과 비교시 AD 환자의 샘플에서의 Αβ 올리고머의 시그널이 높게 나오는 것은， AD 환자 샘플에서 Αβ 올리고머 형성을 억제시키는 방어 시스템이 Non AD 환자에서 보다 덜 활성화되는 것으로 판단되어진다. 실시예 8: rec . Αβ 1-42 를 처리한 후 각 2 일， 3 일, 4 일, 5 일 동안 인큐베이션된 샘풀에서 MDS(multimer detection system)을 이용한 Αβ 올리고머 (ol igomer) 검출
6E10 코팅 플레이트 (3 y g/ml )에 양성 대조군, 음성 대조군 및 rec .Ap i-42 가 처리되어 각 2 일, 3 일, 4 일， 5 일 동안 인큐베이션된 샘플을 각각 100 μ ΐ 씩 분주 한 후 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반웅 시켰다. 상기 플레이트를 TBST 로 3 번 세척하고 FF51-HRP 항체를 버퍼 A에 10 ng/ml이 되도록 제조 후 100 ul씩 분주하였다: 상기 플레이트를 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반응 시키고ᅤ TBST로 3 번 세척 후 ECL용액을 100 μ ΐ 분주 하였다. ECL과 반응된 플레이트는 루미노미터 기기 (perkinelmer)에 삽입하고 발광 ( luminescent ) 시그널을 측정하였다. 그 결과는 아래 도 lc와 같다.
도 lc 는 rec . Αί3 1-42 첨가 후 2 일， 3 일， 4 일， 5 일 동안 인큐베이션 시간에 따라 AD 샘플의 시그널이 Non AD 샘플의 시그널에 비해 1.15배, 1.34배， 1.65배, 1.84배 중가 되는 것을보여준다. 인큐베이션 일 수가 늘어남에 따라 AD 와 Non AD 간에 차이가 점점 벌어지는 것을 보여준다.
도 lc 를 통해서 보건대， Non AD 환자 샘플과 비교시 AD 환자의 샘플에서의 Αβ 올리고머의 시그널이 높게 나오는 것은, AD 환자 샘플에서 Αβ 올리고머 형성을 억제시키는 방어 시스템이 Non AD 환자에서 보다 덜 활성화되는 것으로 판단되어진다. 실시예 9: rec .Ap i-42를 처리한후 5일， rec.Ap i-42를무 처리한후 0일 5 일 동안 인큐베이션된 샘플에서 MDS tnulUtner detect ion system)을 이용한 Αβ 올리고머 (ol igomer) 검출
6E10 코팅 플레이트 (3 y g/ml )에 양성 대조군， 음성 대조군 및 rec .A|3 1— 42 가 처리된 5 일, rec .A|3 1-42 가 처리되지 않은 각 0 일, 5 일 동안 인큐베이션된 샘플을 각각 100 μ ΐ 씩 분주 한후 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반웅 시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 3번 세척하고 FF51-HRP 항체를 버퍼 A 에 10 ng/ml 이 되도톡 제조 후 100 ul 씩 분주하였다. 상기 플레이트를 27 °C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반웅 시키고， TBST 로 3 번 세척 후 ECL 용액을 100 μ 1 분주 하였다. ECL 과 반웅된 플레이트는 루미노미터 기기 (perkinelmer)에 삽입하고 발광 ( luminescent ) 시그널을측정하였다. 그 결과는 아래 도 Id와 같다. 도 Id 는 rec . Αβ ΐ— 42 첨가 후 5 일 인큐베이션， rec . A ]3 1-42 를 첨가하지 않고 0 일， 5 일간 인큐베이션 된 샘폴에서 Αβ 을리고머를 측정한 데이터로서， Αβ 1-42 를 스파이킹 (spiking) 하였을 때와 스파이킹하지 않았을 때， 시간에 따라 AD 샘플의 시그널이 Non AD 샘플의 시그널의 증가 상태를 보여준 것으로 rec . A β 1-42 첨가 후 5 일 인큐베이션된 샘풀에서만 AD와 Non AD간에 차이를 보여준다.
도 Id 를 통해서 보건대， AD 환자의 샘플에서 Αβ 올리고머의 시그널이 높게 나오는 것은， AD 환자 샘플에서 Αβ 올리고머 형성을 억제시키는 방어 시스템이 Non AD 환자에서 보다 덜 활성화되는 것으로 판단되어지며， Αβ 1-42 를 스파이킹하였을 때 Αβ 올리고머 형성을 억제시키는 방어 시스템에 대한 효과를 보여주는 것으로 판단된다. 실시예 10: Γβο.Αβ9-42 바이오틴을 처리한 후 6 일 동안 인큐베이션된 샘폴에서 MDSOmiltimer detection system)을 이용한 Αβ 올리고머 검출
6E10 코팅 플레이트 (3 yg/ml)에 양성 대조군， 음성 대조군， rec.A^9-42 바이오틴이 처리되어 6일 동안 인큐베이션 된 샘플을 각각 100 μ 1씩 분주 한후 실온에서 1시간 반응 시켰다. 상기 풀레이트를 TBST로 3 번 세척하고 FF51-HRP 항체를 버퍼 A 에 1/1000 회석하여 100 μ 1 씩 분주한 후 실온에서 1 시간 반웅 시켰다. 상기 풀레이트를 TBST 로 3 번 세척 후 ECL 용액을 100 μΐ 분주 하였다. ECL 과 반응된 폴레이트는 루미노미터 기기 (perkinelmer)에 삽입하고 발광 시그널을 측정하였고 , 그 결과는 아래 도 2a에 정리하였다.
도 2a 는 Αβ와 바인딩하는 rec.AP9-42 바이오틴을 스과이 ¾하여 6 일간 인큐베이션 하였을 때 AD 환자군의 시그널이 정상군 시그널 보다 높은 것을 보여준다.
도 2a 를 통해서 보건대， rec.A|39-42 바이오틴이 Αβ에 바인딩하여 웅집 (aggregat ion)을 촉진 시켜 항원의 양적인 부분과 크기적인 부분의 변화에 의해 구분이 되는 것으로 판단되었다. 실시예 11: Γβο.Αβ9-42 바이오틴을 처리한 후 2 일， 3 일， 4 일 동안 인큐베이션된 샘플에서 MDSOmiltimer detection system)을 이용한 Αβ 올리고머 검출
6E10 코팅 폴레이트 (3 pg/ml)에 양성 대조군， 음성 대조군， rec.Ap9-42 가 처리되어 2 일, 3 일， 4 일 동안 인큐베이션 된 샘플을 각각 100 μΐ 씩 분주 한 후 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반응 시켰다. 상기 풀레이트를 TBST 로 3 번 세척하고 FF51— HRP 항체를 버퍼 A에 10 ng/ml 이 되도록 제조 후 100 ul 씩 분주하였다. 상기 플레이트를 27 °C 인큐베이터에서 정치 상태로 1시간 반웅 시키고, TBST로 3번 세척 후 ECL 용액올 100 μ 1 분주 하였다. ECL 과 반웅된 플레이트는 루미노미터 기기 (perkinelmer)에 삽입하고 발광 시그널을 측정하였고， 그 결과는 아래 도 2b에 정리하였다. 도 2b는 Αβ와 바인딩하는 rec .A|39-42를 스파이킹하여 2일, 3일， 4 일간 인큐베이션 하였을 때 시간이 증가함에 따라 AD 환자군의 시그널이 정상군 시그널 보다 1.1배， 1.52배， 1.84배 높아지는 것을 보여준다.
도 2b 를 통해서 보건대 , rec .A|3 9-42 바이오틴이 Αβ에 바인딩하여 응집 (aggregat ion)을 촉진 시켜 항원의 양적인 부분과 크기적인 부분의 변화에 의해 구분이 되는 것으로 판단되었다. 실시예 12: 재조합 α -시누클레인을 처리한후 0 일, 2 일, 4 일, 6 일 동안 인큐베이션된 샘플에서 MDSOnult imer detect ion system)을 이용한 α - 시누클레인 올리고머 검출
3Β6 코팅 플레이트 (2 y g/ml )에 양성 대조군， 음성 대조군, 재조합 α -시누클레인이 처리되어 0 일, 2 일， 4 일， 6 일 동안 인큐베이션 된 샘플을 각각 100 μ ΐ 씩 분주 한 후 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반응 시켰다. 상기 플레이트를 TBST로 3 번 세척하고 3B6-biot in 항체를 버퍼 A에 2 ^ g/ml 이 되도록 제조후 100 ul씩 분주하였다. 상기 폴레이트를 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1 시간 반웅 시키고， TBST로 3 번 세척 하였다. 스트랩타비딘 (streptavidin)-HRP 를 버퍼 A 에 1/5000 배 희석하여 100 ul 씩 분주한 후 상기 플레이트를 27°C 인큐베이터에서 정치 상태로 1시간 반웅 시키고, TBST로 3번 세척 하였다. ECL 용액을 100 μ 1 분주 하였다. ECL 과 반응된 폴레이트는 루미노미터 기기 (perkinelmer)에 삽입하고 발광 시그널을 측정하였고 그 결과는 아래 도 3에 정리하였다.
도 3은 재조합 α -시누클레인을 첨가후 인큐베이션 0일， 2일， 4일， 6 일동안 시간이 증가함에 따라 PD 샘폴의 시그널과 Non PD 샘플의 시그널변화를 보여준 데이터로써 0 일 이었을 때， Non PD 시그널 대비 PD 샘플의 시그널 rat i o 가 0.92 배를 보여주던 것이 2 일， 4 일, 6 일 인큐베이션 시 1.34배， 1.76배， 1.78배 증가 되는 것을보여주었다.
도 3 을 통해서 보건대， Non PD 환자 샘플과 비 5ί시 PD 환자의 샘플에서 α -시누클레인의 시그널이 높게 나오는 것은, PD 환자 샘폴에서 α -시누클레인 올리고머 형성을 억제시키는 방어 시스템이 Non PD 환자에서 보다 덜 활성화되는 것으로 판단되어진다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 생시료 (biosample)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형올 검출하는 방법:
(a) 분석대상의 생시료에 ( i ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형， (Π) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydrophobic deleted derivative of aggr egat e-f orm i ng polypeptide), 또는 (iii) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체를 스파이킹 (spiking)하는 단계 ;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물을 인큐베이션 시켜 상기 웅집형—형성 폴리펩타이드의 웅집형을 추가적으로 형성시키는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합하는 결합제에 시그널발생 표지가 결합된 결합제-표지를 접촉시키는 단계; 및
(d) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형에 결합된 결합제- 표지로부터 발생되는 시그널을 검출하는 단계，
여기서， 상기 단계 (b)의 인큐베이션은 상기 스파이킹한 (i), (ii) 또는 (iii)이 상기 생시료에 의해 멀티머화 할 수 있는 층분한 시간 동안 실시한다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 스파이킹한 (i), (ii) 또는 (iii)의 멀티머화를 시키는 상기 생시료는 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 멀티머형이 관여된 질환을 갖는 인간의 생시료인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 3]
제 2 항에 있어서， 상기 생시료에 의해 멀티머화 할 수 있는 층분한 인큐베이션 시간은， 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 멀티머형이 관여된 질환을 갖는 인간의 생시료를 이용하여 발생된 시그널이 정상의 인간의 생시료를 하는데 층분한 시간인
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 생시료 (bi osample)는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5】
제 4 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 혈장 (plasma)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드는 Α β 펩타이드, tau 단백질, 프라이은, α -시누클레인， Ig 경사슬, 혈청 아밀로이드 A , 트랜스티레틴, 시스타틴 C, β 2-마이크로글로블린， 헌팅틴， 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제， 서핀 및 아밀린으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드는 Αβ 펩타이드， tau단백질 또는 α -시누클레인 인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】 "
제 1 항에 있어서, 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드꾀 모노머형은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열로 이루어진 Αβ 펩타이드 또는 서열목록 제 2 서열의 아미노산 서열로 이루아진 α -시누클레인 인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 9】
제 1 항에 있어서, 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydrophobi c deleted der ivat ive of aggregate- forming polypept ide)는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 37 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 Ap delete 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10】
제 9 항에 있어서 , 상기 Ap delete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 29 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 11】
제 10 항에 있어서， 상기 A delete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 템타이드인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 12】
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 결과물에 완층액을 추가적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 13]
제 12 항에 있어서， 상기 완층액은 생시료에 대하여 3—15 배 (v/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 14】
제 12 항에 있어서 , 상기 완층액은 비이온성 계면활성제 -함유 인산염 완충액인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 응집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형의 추가적인 형성은 상기 단계 (a)의 결과물을 온도 1-5CTC에서 인큐베이션 ( incubat i on)시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 16]
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 웅집형의 추가적인 형성은 상기 단계 (a)의 결과물을 1 일 내지 12 일 동안 인큐베이션 ( incubat i on)시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 17】
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (c) 및 (d)는 다음의 단계를 포함하는 방법으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법:
(c-1) 상기 응집형을 포획 (captur ing)하는 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드상의 에피토프를 인식하는 포획 항체에 상기 단계 (b)의 결과물을 접촉시키는 단계 ;
(c-2) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드상의 에피토프를 인식하는 검출 항체에 상기 포획된 응집형을 접촉시키는 단계; 및
(c-3) 응집형 -검출 항체 복합체를 검출하는 단계.
【청구항 18】
제 17항에 있어서， 상기 검출 항체는 상기 단계 (c-1)의 에피토프와 동일한 또는 오버래큉된 에피토프를 인식하는 검출 항체인 것을 특징으로 하는 방법ᅳ
【청구항 19]
제 17 항에 있어서， 상기 포획 항체는 고체 기질에 결합된 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 20】
제 17 항에 있어서, 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 21】 제 20 항에 있어서， 상기 검출 항체에 결합된 표지는 화합물 표지， 효소 표지， 방사능 표지， 형광 표지， 발광 표지 , 화학발광 표지 및 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 22]
다음을 포함하는 생시료 (biosample)의 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 응집형을 검출하기 위한 키트: ( i ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형， ( ii ) 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydn plK bi c deleted der ivat ive of aggregate一 forming polypept ide) , 또는 ( iii ) 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형 또는 멀티머형과상기 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체.
【청구항 23】
제 22 항에 있어서 상기 생시료 (biosample)는 혈액인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 24]
제 23 항에 있어서， 상기 혈액 시료는 혈장 (plasma)인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 25】
제 22 항에 있어서， 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드는 Αβ 펩타이드， tau 단백질， 프라이온, a -시누클레인， Ig 경사슬， 혈청 아밀로이드 A, 트랜스티레틴 , 시스타틴 C, β 2-마이크로글로블린， 헌팅틴， 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제, 서핀 및 아밀린으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 26】
제 25 항에 있어서， 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드는 Αβ 펩타이드， tau 단백질 또는 α -시누클레인 인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 27]
제 22 항에 있어서， 상기 웅집형 -형성 폴리펩타이드의 모노머형은 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열로 이루어진 Αβ 펩타이드인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 28】
제 22 항에 있어서， 상기 응집형 -형성 폴리펩타이드의 소수성 결실체 (hydn^phobic deleted derivative of aggr egate-forming polypeptide)는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 37 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 A|3delete 펩타이드인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 29】
제 28 항에 있어서， 상기 Aedelete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열와 아미노산 서열 중 29 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 30]
제 29 항에 있어서， 상기 Apdelete 펩타이드는 서열목록 제 1 서열의 아미노산 서열 중 9 번째 아미노산 잔기 내지 42 번째 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 31】
제 22 항에 있어서， 상기 키트는 완층액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 32】
제 31 항에 있어서， 상기 완층액은 비이온성 계면활성제 -함유 인산염 완층액인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 33] 제 22 항에 있어서， 상기 키트는 응집형 -형성 폴리펩타이드 상의 에피토프를 인식하는 포획 항체; 및 상기 포획 항체가 인식하는 상기 에피토프를 인식하는 검출항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 34】
제 33 항에 있어서， 상기 검출 항체는 상기 포획 항체가 인식하는 상기 에피토프와 동일한 또는 오버래핑된 에피토프를 인식하는 검출항체인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 35】
제 33 항에 있어서， 상기 포획 항체는 고체 기질에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 36]
제 33 항에 있어서， 상기 검출 항체는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 37]
제 36 항에 있어서, 상기 검출 항체에 결합된 표지는 화합물 표지 , 효소 표지 , 방사능 표지 , 형광 표지 , 발광 표지 , 화학발광 표지 및 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
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