KR20060025296A - 정상형 프라이온에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

정상형 프라이온에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에피토프로서 프라이온 단백질의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하며, PrPc와 특이적으로 결합을 하지만 PrPsc와는 실질적으로 결합하지 않는 결합 특성을 갖는 PrPc에 대한 항체, 그를 이용한 PrPsc 검출 방법 및 PrPsc 진단 키트에 관한 것이다.
프라이온, 정상형, 이질형, 항체, 광우병

Description

정상형 프라이온에 대한 항체 및 그의 용도{Antibodies against Cellular Form of Prion and Uses thereof}
도 1은 본 발명의 항체가 정상형 프라이온 대한 특이성을 갖는다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 항체의 PrPc에 대한 특이성을 자성 비드로 확인한 실험 결과를 보여주는 그래프이다.
본 발명은 PrPc에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 PrPc에 특이적으로 결합하는 항체, 그를 이용한 PrPsc 검출 방법 및 PrPsc 진단 키트에 관한 것이다.
사람에 있어서 산재성 및 가족성 크로이츠펠드-야곱 증후군, 쿠루 및 게르스 트만-샤잉커 증후군, 염소와 양에서의 이질, 그리고 소의 스폼지폼 뇌증은 치명적인 퇴행성 신경질환으로서, 이들은 전염성 스폰지폼 뇌질환(transmissible spongiform encephalopathies: TSE)에 기인한다(Prusiner S.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 568-57(2000)).
프라이온 단백질의 비정상적 동형체 및 이질형(scrapie form)(PrPsc) 및 이의 축적은 TSE의 주 요인으로 강력하게 제안되고 있다(Caughey B. Trends Biochem. Sci. 26:235-42(2001)).
프라이온 단백질의 정상형(PrPc)은 α-사슬 및 유연하게 비정돈된 부위를 포함하며(Zahn, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:145-150(2000)), 이질형(PrPsc)은 많은 β-쉬트 구조를 갖고 있다(Caughey, B., et al., J. Biol. Chem. 273:32230-35(1998)). 질병 진행 과정에서 α-사슬 구조는 β-쉬트 구조로 변화되며, 이와 같은 구조의 변화는 그의 신경질환 병리에 관련이 있는 것으로 추측된다.
상기 PrPc는 프로테아제 민감성을 나타내지만(PrPsen), PrPsc는 단백질 분해에 대하여 부분적으로 내성을 나타내고(PrPres) 고분자 응집체를 형성하는 경향이 있다 (Bolton D. C. Lancet, 358:164-5 (2001)). 후자와 같은 특징은 PrPres의 구조를 초래하는 구조적 변이를 분석하거나 PrPres 자체를 동정하는 것을 난이하게 만든다.
한편, 프로테아제 K 절단(digestion)은 PrPc만을 절단하고 PrP의 이질형은 상기 프로테아제에 대하여 내성을 가지기 때문에, 프로테아제 K 절단 방법은 이질형을 검출하는 데 이용되고 있다. 그러나, 프로테아제 K 절단 방법은 그 정확성의 문제가 제기되고 있다. 예컨대, 프라이온 단백질의 프로테아제 K에 대한 민감성은 PrP의 구조(conformation)와 농도, 절단 시간 및 완충액 조건 등에 의해 영향을 받기 때문에, 프로테아제 K 절단 방법을 통하여 얻은 데이터의 신뢰성이 떨어지고 있다.
따라서, 이질형 프라이온을 보다 높은 신뢰도로 검출할 수 있는 방법에 대한 요구가 당업계에 대두되어 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 PrPc에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하고자 예의 연구 노 력한 결과, 프라이온 단백질의 C-말단 부위를 에피토프로 하여 제작된 항체가 PrPc항원에 대하여 높은 특이성 및 민감도를 나타낸다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 PrPc-특이 항체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 PrPsc 검출 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 PrPsc 검출용 면역분석 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 에피토프로서 프라이온 단백질의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하며, PrPc와 특이적으로 결합을 하지만 PrPsc와는 실질적으로 결합하지 않는 결합 특성을 갖는 PrPc에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명의 항체는 PrPc와 특이적으로 결합을 하지만 PrPsc와는 실질적으로 결 합하지 않는다. 문구 "실질적으로 결합하지 않는다"는 것은 이질형 프라이온과의 면역반응성이 정상형 프라이온과의 면역반응성 보다 구별될 수 있을 정도로 낮은 것을 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체는 PrPc와는 특이적으로 결합하지만, PrPsc와는 거의 완전하게 결합하지 않는 결합 특성을 갖는다.
본 명세서에서 용어 항체는 폴리클로날 항체, 친화성 정제된 폴리클로날 항체, 단일클론 항체 및 F(ab), F(ab)2, Fv 및 (Fv)2와 같은 항원-결합 단편을 포함한다. 항원-결합 단편은, 통상적인 방법에 따라 파파인 또는 펩신으로 본 발명의 항체를 절단하여 용이하게 수득할 수 있다.
본 발명의 항체는 항원(면역원)으로서 프라이온 단백질의 C-말단 부위를 이용하여 제조될 수 있다.
바람직하게는, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 170-225, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 171-226, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 181-236, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 173-228이다. 보다 바람직하게는, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 175-190 또는 210-225, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 176-191, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 186-201 또는 221-236, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 178-193이다.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 184의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 219의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 185의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 195의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 230의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 187의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열이다. 보다 바람직하게는, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 184의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 219의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 185의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 195의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 230의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 187의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열이다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 서열목록 제1서열의 마우스 프라 이온의 아미노산 서열 위치 178-185 또는 214-220, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 179-186, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 189-196 또는 225-231, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 181-188이다.
본 발명에 있어서, 프라이온 단백질의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하는 항체는 상술한 C-말단 부위에 해당하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 항원으로 이용하여, 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법에 의해 용이하게 제조할 수 있다 (Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991).
단일클론 항체의 제조를 위한 하이브리도마 세포주의 제조는 불멸 세포와 항체 생성 림포사이트를 융합하여 실시할 수 있다. 이는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 실시될 수 있다.
본 발명의 폴리클로날 항체는 당업계에 공지된 방법에 따라 상술한 항원을 적합한 동물에 주입하고, 상기 동물로부터 항체를 함유하는 생시료를 수집한 다음, 특정 항체를 분리하여 제조된다. 바람직하게는, 상기 동물은 닭이고, 상기 항체(즉, IgYs)를 함유하는 생시료는 난이다.
본 발명의 항체는 높은 특이성 및 민감도로 PrPc와 특이적으로 결합을 하며, 이는 결국 PrPc를 시료로부터 필터링 아웃할 수 있는 결과를 초래한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료내의 PrPsc의 존재 또는 양을 분석하는 방법을 제공한다: (a) 시료를 PrPc에 특이적인 상기 본 발명의 제1차 항체와 접촉시켜 시료 내의 PrPc를 필터링 아웃시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 시료를 PrPsc에 특이적이거나 PrPsc와 PrPc에 모두 특이적으로 결합하는 제2차 항체와 접촉시키는 단계; 및 (c) PrPsc에 결합한 상기 제2차 항체의 존재 또는 양을 결정하는 단계.
본 발명의 방법은 기본적으로, 항원-항체 반응을 이용하는 면역분석 (immunoassay) 방법 (예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌드위치 분석)에 따라 정량적으로 또는 정성적으로 실시된다(참조: Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; 및 Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984).
예를 들어, 방사능 면역분석 방법을 따르는 경우에는, 방사능동위원소 (예: P32, S35)로 표지된 본 발명의 항체를 이용하여, 시료 (인간, 소, 마우스 및 양과 같 은 포유동물로부터 유래된) 내의 항원, 즉 PrPsc와 결합하여 형성된 면역 복합체의 생성을 측정하여, 시료 내의 PrPsc를 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다.
발색, 혈광, 발광 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소는, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 시토크롬 P450 및 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌 (bis-N-methylacridinium nitrate), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약 (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine) and ABTS (2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 등이 이용된다.
본 발명에 적용되는 시료는 인간, 소, 양, 염소, 토끼, 햄스터, 마우스, 말, 돼지, 개, 닭, 밍크, 엘크, 사슴, 상어, 물고기 및 고양이와 같은 객체로부터 분리된 어떠한 시료도 가능하다. 바람직하게는, 상기 시료는 상기 객체로부터 분리된 조직이다. 본 발명에 유용한 조직 시료는 림포이드 조직, 뇌 검시 조직, 림프절 생검 또는 검시 조직, 그리고 비장 생검 또는 검시 조직을 포함한다.
본 발명의 검출 방법에 따르면, 높은 특이성 및 민감도로 시료 내의 PrPsc를 쉽게 정량적 또는 정성적으로 분석할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체를 포함하는 PrPsc 검출용 면역분석 키트를 제공한다.
본 발명의 키트가 방사능 면역분석용으로 제작된 경우에는, 본 발명의 항체는 방사선동위원소로 표지된 것이 바람직하다. 본 발명의 키트가 ELISA 용으로 개발되는 경우에는, 플레이트, 완충용액, 발색효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 재료
Lys-플라스미노겐은 Haematological Technology Inc (USA)으로부터 구입하였고, 플라스민 기질 (S-2251, H-D-Val-Leu-Lys-pNAㅇ2HCl)은 Chromogenicx Inc. (Italy)로부터 구입하였다. 말레이미드-활성화 플레이트, 블롯킹 완충액은 Pierce Inc. (USA)으로부터 구입하였으며, 조직-타입 플라스미노겐 활성자는 Calbiochem Inc. (USA)으로부터 구입하였다. SIGMA Inc. (USA)으로부터 구입한 프 리메이드 Tris 및 PBS 완충액을 이용하였다.
실시예 1: 세포 프라이온으로부터 선택된 펩타이드의 디자인 및 제조
프라이온 단백질의 C-말단 부분에 있는 서열을 중심으로 하여 본 발명의 항체를 제조하는 데 이용될 7-9 mer 길이의 펩타이드를 선택하였다. 펩타이드는 W. M. Keck Biotechnology Resource Center (예일 대학교)에서 합성하였다. 각각의 펩타이드는, 플레이트상에 고정화시키기 위하여 시스테인 잔기를 N-말단에 갖도록 하였다. 라이신 잔기는 내부에 위치하도록 하였고, 이는 C-말단 잔기는 라이신이 아님을 의미한다. 모든 펩타이드는 그들의 N-말단 및 C-말단 각각에 아세틸화 및 아미드화 되어있다. 다음과 같은 서열의 펩타이드가 합성되었다: ac-CVTTTTKG-NH2 (Lys 194), ac-CTETDVKM-NH2 (Lys 204), ac-CVNITIKQ-NH2 (Lys 185) 및 ac-CVTQYQKE-NH2 (Lys 220).
실시예 2: 프라이온 펩타이드에 대한 IgY의 제조
상기 펩타이드 Ac-CVNITIKQ-NH2 (이하, "펩타이드 1"이라 한다), Acc-CVTQYQKE-NH2 (이하, "펩타이드 2"라 한다), Ac-CVTTTTKG-NH2 (이하, "펩타이드 3"이라 한다) 및 Ac-CTETDVKM-NH2 (이하, "펩타이드 4"라 한다) 각각 2 mg을 DMSO (500 ㎕)에 현탁하고, PBS 내에서 말레이미드-활성화 BSA (6 mg)와 하룻밤동안 4℃ 에서 항온처리하여 접합시켰다. BSA 내의 미반응 말레이드 자리를 1 mM β-머르캅토에탄올로 블롯킹하였다. BSA 접합 펩타이드를 농충 및 냉동건조하여, 각각 약 7 m g의 펩타이드를 얻었다. 결과물을 완전 프로이드 아쥬번트의 동일 부피와 혼합하여 최종 3 ㎖을 수득하였다.
펩타이드-BSA 200 ㎕를 3마리의 닭에게 피부 경로로 1차 투여를 하였다. 1차 투여 후, 8, 15, 22 및 50일째에 1차 투여시 이용된 펩타이드 항원의 동일양을 부스팅 주입 하였다. 각각의 닭으로부터 계란을 수집하고, 각각의 계란으로부터 난황을 분리하였다.
Eggcellent IgY 정제 키트 (Pierce Inc)를 이용하여 난황으로부터 IgY를 정제하였다. 각각의 계란의 내용물을 50 ㎖ 튜브에 붓고 이의 부피를 측정하였다. 계란 내용물 부피의 5배의 지질제거 완충액을 계란 내용물과 혼합하고, 20분 동안 천천히 교반하였다. 이어, 혼합물을 4℃에서 하룻밤동안 항온 처리하였다. 그 다음날, 혼합물을 12,000 rpm에서 12분 동안 원심분리하였다. 상층액을 수집하고 침전물을 제거하였다. IgY 침전 완충액 및 상기 상층액의 동일 부피를 첨가하고, 15분 동안 부드럽게 교반한 다음, 4℃에서 하룻밤동안 항온처리 하였다. 크루드 IgY를 용액으로부터 침전시켰다. 침전된 IgY 및 용액을 12,000 rpm으로 12분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. PBS를 첨가하여 침전된 IgY를 용해하였다. 최종적으로 펩타이드 1로부터 IgY 147-149, 펩타이드 2로부터 150-152, 펩타이드 3으로부터 153-155 및 펩타이드 4로부터 156-158을 얻었다.
실시예 3: 본 발명의 IgYs의 결합 특이성 연구
상기 실시예 2에서 수득한 IgY(IgYs 147, 151, 154 및 157)를 세파로스 비드(Amersham Inc.)에 다음과 같이 결합시켰다: 비드의 제조를 위하여, 냉동건조된 에폭시-활성화 세파로스 6B 2.3 g을 증류수에 현탁시키고 500 ㎖ 증류수로 1시간 동안 세척하였다. 이어, IgY 147(100.14 μM), IgY 151(89.89 μM), IgY 154(166.97 μM) 또는 IgY 157(66.31 μM) 4 ㎖을 겔 2 ㎖과 혼합하고 24시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그런 다음, PBS(pH 9.0) 4 ㎖로 과량의 IgYs를 3회 세척한 다음, 겔을 1 M 에탄올아민(pH 8.0) 4 ㎖에 옮기고, 4시간 동안 45℃에서 반응시켰다. 그리고 나서, 교체 pH 사이클(0.5 M NaCl을 포함하는 0.1 M 아세테이트 완충액(pH 4.0) 8 ㎖에 의한 세척, 그런 다음, 0.5 M NaCl을 포함하는 0.1 M Tris-HCl완충액(pH 8.0) 8 ㎖에 의한 세척)의 최소 3 사이클로 산물을 세척하였다. 최종적으로 산물을 PBS 10 ㎖로 세척하였다.
햄스터 뇌 (정상 또는 이질형 프라이온으로 감염된 뇌) 균질액 (1:100) 150 ㎕를 항체-표지 비드 50 ㎕에 실온에서 30분 동안 흡착시켰다. 이어, 상기 비드를 2000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상층액 50 ㎕를 시험에 사용하였다. 프로테아제 K(이하, "PK"라 한다) 처리를 위하여, 상층액 50 ㎕를 50 ㎍/㎖ PK로 37℃에서 10분 동안 처리한 다음, 시료를 100℃에서 10분 동안 놓았다. PK 처리 후, 시료를 1:100의 희석 농도에서 ELISA를 하였고, 이어 연속적으로 희석시켜 ELISA를 하였다.
한편, 햄스터 뇌 (정상 또는 이질형 프라이온으로 감염된 뇌) 균질액을 50 ㎍/㎖ PK로 37℃에서 30분 동안 처리하거나 비처리 하였다. PK 처리 후, 시료를 연속적으로 희석시킨 다음 ELISA를 하였다.
ELISA 과정은 다음과 같다: 우선, 플레이트를 소듐 바이카보네이트 내의 7A12 단일클론항체(10 ㎍/㎖, M-S Sy, Case Western University)로 실온에서 1.5시간 동안 코팅하였다. 이어, 블록킹 완충액 및 Stabilguard(Surmodics Inc.)의 1:2 혼합물로 실온에서 30분 동안 블록킹하였다. 그런 다음, 상기 시료를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS로 세척하였다. 그리고 나서, 바이오틴이 결합된 3F4 단일클론항체(2.5 ㎍/㎖, Abcam Inc.)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, PBS로 세척하고, 스트렙타비딘-HRP(2.5 ㎍/㎖, Sigma)와 반응시킨 다음 PBS로 세척하였다. 최종적으로 HRP 기질, 3,3,5,5-테르라메틸벤지딘(TMB, Sigma)를 첨가하여 10분 동안 반응시킨 다음, 2 N HCl를 첨가하여 5분 동안 반응을 정지시켰다. 발색 시그널은 450 nm에서 시료의 흡광도를 측정하여 검출하였다. 실험 결과는 표 1a-1f에 정리되어 있다.
시료 희석비율 OD450
블랭크 - 0.105
정상 뇌 균질액 1:100 1.881
1:500 0.602
1:1000 0.286
이질형 감염 뇌 균질액 1:100 out
1:500 3.963
1:1000 2.717
1:10000 0.438
시료 희석비율 OD450
블랭크 - 0.108
PK 처리된 정상 뇌 균질액 1:100 0.072
1:500 0.073
1:1000 0.089
PK 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 3.580
1:500 3.344
1:1000 1.714
1:10000 0.266
시료 희석비율 OD450
IgY 147 처리된 정상뇌 균질액 1:100 0.222
1:500 0.183
IgY 147 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 3.422
1:500 2.001
IgY 147 및 PK 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.068
1:500 0.063
IgY 147 처리된 햄스터 재조합 PrP(50 ng/㎖) - 0.076
햄스터 재조합 PrP (50 ng/㎖) - 3.774
시료 희석비율 OD450
IgY 151 처리된 정상뇌 균질액 1:100 0.106
1:500 0.132
IgY 151 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.854
1:500 1.037
IgY 151 및 PK 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.071
1:500 0.067
IgY 151 처리된 햄스터 재조합 PrP(50 ng/㎖) - 0.080
햄스터 재조합 PrP (5 ng/㎖) - 0.748
시료 희석비율 OD450
IgY 154 처리된 정상뇌 균질액 1:100 0.083
1:500 0.106
IgY 154 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.561
1:500 0.697
IgY 154 및 PK 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.085
1:500 0.088
IgY 154 처리된 햄스터 재조합 PrP(0.5 ng/㎖) - 0.066
햄스터 재조합 PrP (0.5 ng/㎖) - 0.137
시료 희석비율 OD450
IgY 157 처리된 정상뇌 균질액 1:100 0.113
1:500 0.132
IgY 157 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.778
1:500 0.916
IgY 157 및 PK 처리된 이질형 감염 뇌 균질액 1:100 0.088
1:500 0.088
IgY 157 처리된 햄스터 재조합 PrP(0.05 ng/㎖) - 0.075
햄스터 재조합 PrP (0.05 ng/㎖) - 0.068
표 1에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 항체는 정상형의 프라이온 단백질에 대하여 매우 특이적으로 반응을 하며, 병원성이 없는 것으로 알려진 재조합 프라이온 단백질에 대하여도 매우 특이적으로 결합을 한다는 것을 알 수 있다. 한편, 이질형 프라이온으로 감염된 뇌 균질액을 이용한 실험에서, 본 발명의 항체를 처리한 경우 상당량의 시그널이 잔존하고 있는 데, 이는 본 발명의 항체가 이질형 프라이온에 대하여 결합 특이성이 없는 것을 보여준다. 또한, 이질형 프라이온으로 감염된 뇌 균질액을 이용한 실험에서, 본 발명의 항체를 처리한 경우 어느 정도의 시그널이 감소하는 데, 이는 실험 과정의 원심분리에 의한 효과일 것으로 판단된 다.
실시예 4: 본 발명의 IgYs의 정상형 프라이온에 대한 특이성 검증
상기 실시예 2에서 수득한 IgYs 147(18 mg/㎖), 151(16 mg/㎖), 154(30 mg/㎖) 및 157(12 mg/㎖)를 에폭시 세파로스 비드(Amersham Inc.) 2 ㎖에 다음과 같이 결합시켰다: 비드의 제조를 위하여, 냉동건조된 에폭시-활성화 세파로스 6B 2.3 g을 증류수에 현탁시키고 500 ㎖ 증류수로 1시간 동안 세척하였다. 이어, IgY 147(100.14 μM), IgY 151(89.89 μM), IgY 154(166.97 μM) 또는 IgY 157(66.31 μM) 4 ㎖을 겔 2 ㎖과 혼합하고 24시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그런 다음, PBS(pH 9.0) 4 ㎖로 과량의 IgYs를 3회 세척한 다음, 겔을 1 M 에탄올아민(pH 8.0) 4 ㎖에 옮기고, 4시간 동안 45℃에서 반응시켰다. 그리고 나서, 교체 pH 사이클(0.5 M NaCl을 포함하는 0.1 M 아세테이트 완충액(pH 4.0) 8 ㎖에 의한 세척, 그런 다음, 0.5 M NaCl을 포함하는 0.1 M Tris-HCl완충액(pH 8.0) 8 ㎖에 의한 세척)의 최소 3 사이클로 산물을 세척하였다. 최종적으로 IgY-세파로스를 PBS에 보관하였다.
정상의 소 뇌 균질액(1:200 희석) 100 ㎕를 IgY-비드 100 ㎕에 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 상기 비드를 2000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액 100 ㎕를 ELISA 플레이트에 옮겨 PrPc를 정량화하였다. 본 실험에 사용된 ELISA 플레이트는 MA1-750 항체(Bioreagents)가 2 ㎍/㎖의 농도로 코팅된 것이고, 검출용 항체로는 HRP-접합 IgY-133(1 ㎍/㎖, PeopleBio Inc.)를 사용하였다. 기타 다른 과정은 실시예 3의 ELISA 과정과 동일하다.
실험 결과, 본 발명의 항체를 이용하여 필터링한 경우에는, 뇌 균질액에서 PrPc가 크게 제거됨을 알 수 있었다(참조: 도 1).
실시예 5: 자성 비드를 이용한 본 발명의 IgYs의 정상형 프라이온에 대한 특이성 검증
상기 실시예 2에서 수득한 IgYs 147(18 mg/㎖)를 카복시-말단 자성 비드 (Bioclon Inc.) 2 ㎖에 다음과 같이 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(EDC) 반응으로 결합시켰다: 0.15 M NaCl을 포함하는 10 mM 포타슘 포스페이트(pH 5.5)을 커플링 완충액으로 이용하였다. 미리 제조한 EDC (0.057%)를 커플링제로 이용하였다. 자성 비드를 세척액으로 세척하였다(10 mM Tris base, 0.15 M NaCl, 1 mM EDTA pH 7.5). IgY 147 용액(2.5 mg/㎖) 2 ㎖을 EDC 커플링제 용액 0.8 ㎖과 자성 비드 2 ㎖과 혼합하고 pH 5.5에서 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 자성 분리기를 이용하여 커플링 안된 IgY를 자성 비드로부터 분리하고 세척 완충액으로 4회 세척하였다.
정상의 소 뇌 균질액(1:200 희석) 100 ㎕를 IgY-Mag-비드 50 ㎕에 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어, 상기 비드를 자석으로 5분 동안 자기분리하고, 상층액 100 ㎕를 ELISA 플레이트에 옮겨 PrPc를 정량화하였다. 본 실험에 사용된 ELISA 플레이트는 MA1-750 항체(Bioreagents Inc.)가 2 ㎍/㎖의 농도로 코팅된 것이고, 검출용 항체로는 HRP-접합 IgY-133(1 ㎍/㎖, PeopleBio Inc.)를 사용하였다. 기타 다른 과정은 실시예 3의 ELISA 과정과 동일하다.
실험 결과, 본 발명의 항체를 이용하여 필터링한 경우에는, 뇌 균질액에서 PrPc가 크게 제거됨을 알 수 있었다(참조: 도 2).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 PrPsc의 플라스미노겐 결합 위치에 특이적으로 결합하는 항체, 이를 이용한 PrPsc 검출 방법, 및 PrPsc 검출용 면역분석 키트를 제공한다. 본 발명의 항체는 이질형의 PrPsc에 대해 높은 특이성으로 결합하는 능력을 갖으며, 따라서, 시료 내의 PrPsc를 검출하는 데 매우 효과적이다.
<110> PeopleBio, Inc. Cornell Research Foundation, Inc. <120> Antibodies against Cellular Form of Prion and Uses thereof <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 254 <212> PRT <213> mouse <400> 1 Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp 50 55 60 Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Ser Trp 65 70 75 80 Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Asn 85 90 95 Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Val Ala 100 105 110 Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met 115 120 125 Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met Ile His Phe Gly Asn Asp Trp 130 135 140 Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val 145 150 155 160 Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His 165 170 175 Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg Val 195 200 205 Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr 210 215 220 Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro 225 230 235 240 Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Ala Asn Leu Gly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp 1 5 10 15 Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 60 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 65 70 75 80 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 95 Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Met 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Ile Ile His Phe Gly Ser Asp 130 135 140 Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln 145 150 155 160 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val 165 170 175 His Asp Cys Val Asn Ile Thr Ile Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Glu Arg Glu Ser Gln Ala 210 215 220 Tyr Tyr Gln Arg Gly Ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val 225 230 235 240 Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 <210> 3 <211> 263 <212> PRT <213> bovine <400> 3 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala 1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly 35 40 45 Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro 100 105 110 Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met 130 135 140 Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val 165 170 175 Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile 180 185 190 Thr Val Lys Glu His Thr Val Thr Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe 195 200 205 Thr Glu Thr Asp Ile Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys 210 215 220 Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr Tyr Asp Gln Gly Ala 225 230 235 240 Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe 245 250 255 Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 260 <210> 4 <211> 255 <212> PRT <213> sheep <400> 4 Met Val Lys Ser His Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala 1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly 35 40 45 Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly 85 90 95 Ser His Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys 100 105 110 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly 115 120 125 Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu Ile His Phe Gly 130 135 140 Asn Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro 145 150 155 160 Asn Gln Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn 165 170 175 Phe Val His Asp Cys Val Asn Ile Thr Val Lys Gln His Thr Val Thr 180 185 190 Thr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Ile Lys Ile Met 195 200 205 Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys Ile Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser 210 215 220 Gln Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val Ile Leu Phe Ser Ser Pro 225 230 235 240 Pro Val Ile Leu Leu Ile Ser Phe Leu Ile Phe Leu Ile Val Gly 245 250 255

Claims (9)

  1. 에피토프로서 프라이온 단백질의 C-말단 부위에 특이적으로 결합하며, PrPc와 특이적으로 결합을 하지만 PrPsc와는 실질적으로 결합하지 않는 결합 특성을 갖는 PrPc에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 170-225, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 171-226, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 181-236, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 173-228인 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 175-190 또는 210-225, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 176-191, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 186-201 또는 221-236, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 178-193인 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 184의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 219의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 185의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 195의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 230의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 187의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-30개의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항체.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 184의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 219의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 185의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 195의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열 또는 아미노산 서열 위치 230의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 187의 Lys 잔기를 내부 잔기로 포함하는 5-10개의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 프라이온 단백질의 C-말단 부위는 서열목록 제1서열의 마우스 프라이온의 아미노산 서열 위치 178-185 또는 214-220, 서열목록 제2서열의 인간 프라이온의 아미노산 서열 위치 179-186, 서열목록 제3서열의 소 프라이온의 아미노산 서열 위치 189-196 또는 225-231, 또는 서열목록 제4서열의 양 프라이온의 아미노산 서열 위치 181-188인 것을 특징으로 하는 항체.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 항체는 폴리클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
  8. 다음의 단계를 포함하는 시료내의 PrPsc의 존재 또는 양을 분석하는 방법:
    (a) 시료를 PrPc에 특이적인 상기 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제1차 항체와 접촉시켜 시료 내의 PrPc를 필터링 아웃시키는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 시료를 PrPsc에 특이적이거나 PrPsc와 PrPc에 모두 특이적으로 결합하는 제2차 항체와 접촉시키는 단계; 및
    (c) PrPsc에 결합한 상기 제2차 항체의 존재 또는 양을 결정하는 단계.
  9. 상기 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 PrPsc 검출용 면역분석 키트.
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