ES2309003T3 - Procedimientos de deteccion de proteinas amiloidogenicas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para determinar una conformación de agregación de un polipéptido amiloide, cuyo procedimiento comprende comparar: (a) una propiedad espectroscópica de un complejo de una sonda espectroscópica específica de amiloide complejada con un polipéptido amiloide que presenta una conformación de agregación indeterminada; y (b) una propiedad espectroscópica predeterminada de la sonda espectroscópica específica de amiloide complejada con un polipéptido amiloide que presenta una conformación de agregación conocida, en el que la conformación de agregación del polipéptido amiloide que presenta la conformación de agregación desconocida se determina mediante dicha comparación.
Description
Procedimientos de detección de proteínas
amiloidogénicas.
La presente invención se refiere a
procedimientos para evaluar formas agregadas de polipéptidos
amiloides. La invención se refiere además a procedimientos para
ensayar inhibidores potenciales de amiloidosis in vitro o
in vivo a efectos de desarrollar nuevas terapias para
enfermedades o desórdenes asociados con la amiloidosis, tales como
la enfermedad de Alzheimer.
\vskip1.000000\baselineskip
La enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la
presencia de placas amiloides cerebrales depositadas alrededor de
las células nerviosas, lo que termina erosionando y destruyendo los
procesos normales del cerebro. El componente proteínico principal
de dichas placas es la forma agregada de las isoformas de la
proteína \beta-amiloide (A\beta) con 39 a 43
residuos. El suceso patogénico principal en la enfermedad de
Alzheimer es la formación de estas placas amiloides fibrilares en
el parénquima y la vasculatura cerebrales. Se ha demostrado que la
deposición de agregados fibrilares de estos polipéptidos amiloides
es debida a la autoagregación de los polipéptidos en estructuras
macromoleculares que consisten en una conformación en hoja \beta
cruzada que resulta tóxica para las células neuronales
cultivadas.
Uno de los objetivos en el tratamiento de la
enfermedad de Alzheimer es la prevención de la formación de
agregados y/o la administración terapéutica de un inhibidor de la
formación de agregados después de haber sido diagnosticada la
enfermedad, a efectos de invertir los efectos tóxicos de la
proteína. De este modo, los agentes que bloquean la formación de
agregados macromoleculares pueden actuar potencialmente inhibiendo
la citotoxicidad, y tienen interés farmacéutico porque pueden
actuar potencialmente como fármacos contra el Alzheimer. Entre las
diversas moléculas pequeñas que se han indicado como inhibidores de
la agregación, se indica el rojo del Congo, un colorante diazo
sulfonado de bifenilo, como compuesto neuroprotector (Pollack y
otros, Neurosci. Lett., 1995, 197:211-214; Lorenzo
et al, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 1994,
91:12243-12247; y Burgevin et al,
NeuroReport, 1994, 5:2429-2432). La solicitud PCT
PCT/US93/06637 (designada "solicitud '637") describe la
utilización del rojo del Congo y sus sales farmacéuticamente
aceptables, o de derivados de los mismos, para tratar las
enfermedades amiloidogénicas, entre ellas la enfermedad de
Alzheimer. Se ha indicado que el rojo del Congo interfiere con la
amiloidosis o desestabiliza las estructuras amiloides ya formadas.
Estas propiedades establecen una base para la solicitud '637 de
cara a defender la administración de rojo del Congo para el
tratamiento de condiciones asociadas con la deposición de proteínas
amiloidogénicas en forma de placas. El rojo del Congo, como agente
terapéutico, se puede administrar in vivo en una cantidad
suficiente para interferir con la formación de proteínas
amiloidogénicas o desestabilizar amiloides ya formados. De este
modo, se indica que el rojo del Congo no sólo se enlaza a las
placas amiloides, sino que también puede inhibir la acumulación de
proteína amiloidogénica.
El valor y la eficacia del rojo del Congo como
tratamiento posible para la enfermedad de Alzheimer requieren un
examen adicional, ya que el rojo del Congo no puede atravesar la
barrera hematoencefálica. Los derivados, análogos, sales, etc., del
rojo del Congo pueden tener el mismo modo de acción sobre los
péptidos \beta-amiloides que el rojo del Congo,
es decir que dichos derivados también pueden ser
neuroprotectores.
Actualmente, se están utilizando métodos basados
en anticuerpos y métodos por fluorescencia que utilizan tioflavina
T para detectar péptidos agregados para el cribado de agentes contra
el Alzheimer. Se ha utilizado un método de espectroscopia de
correlación por fluorescencia para determinar la polimerización de
un péptido amiloide (Tjernberg et al, Chemistry &
Biology, 1999, 6:53-62). Sin embargo, estas técnicas
no diferencian las diferentes formas conformacionales de los
polipéptidos agregados.
En la técnica anterior no se da a conocer ningún
ensayo para la detección de formas conformacionales alternativas de
polipéptidos amiloides agregados. Dichos ensayos se pueden utilizar
óptimamente para evaluar rápidamente el estado de agregación del
polipéptido, particularmente en presencia de inhibidores de la
fibrilogenesis.
De este modo, existe una necesidad en la técnica
de métodos para el sondaje de amiloidosis y placas amiloides, que a
su vez considera la necesidad de estudiar el proceso mediante el
cual las proteínas amiloidogénicas causan la enfermedad de
Alzheimer. Específicamente, existe una necesidad de desarrollar
ensayos que impliquen métodos biofísicos y analíticos para
caracterizar la conformación y el estado de agregación de los
agregados de polipéptidos amiloides y para discriminar el efecto de
los inhibidores potenciales de amiloidosis, específicamente en la
enfermedad de Alzheimer. Dado que se conoce muy poco sobre la
naturaleza de los agregados tóxicos en la enfermedad de Alzheimer y
el mecanismo de formación de dichos agregados en el cerebro, se
requiere una combinación de ensayos para determinar si los
inhibidores potenciales están produciendo el efecto deseado en
sistemas de ensayo in vitro. Asimismo, se requieren ensayos
para determinar el efecto de los compuestos ensayados sobre la
conformación de los polipéptidos amiloides en los fluidos corporales
tales como plasma o fluido cefalorraquídeo.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención da a conocer métodos para
detectar diversas formas agregadas de polipéptidos amiloides, por
ejemplo utilizando colorantes específicos de los amiloides, tales
como el rojo del Congo y otros compuestos análogos relacionados con
el mismo, o péptidos amiloides marcados con un fluoróforo. Los
métodos resultan útiles a la hora de determinar el estado de
agregación de los polipéptidos, así como para ensayar moduladores
de agregación en modelos in vitro. Los métodos se pueden
utilizar para determinar la etapa en la que la intervención en el
proceso de agregación reduce la toxicidad, por ejemplo, del péptido
A\beta hacia las células neuronales. Los métodos también se
pueden utilizar para determinar los efectos de un agente inhibidor
o anti-Alzheimer para el tratamiento terapéutico o
profiláctico de la amiloidosis u otras enfermedades
relacionadas.
De este modo, en uno de sus aspectos, la
presente invención da a conocer un método para determinar la
conformación de agregación de un polipéptido amiloide. Este método
comprende correlacionar una propiedad espectroscópica de un
complejo de una sonda espectroscópica específica de amiloide, tal
como un colorante diazo sulfonado o un péptido amiloide marcado con
un fluoróforo, que se pone en contacto con el polipéptido amiloide
en condiciones que permiten la agregación de dicho polipéptido, con
una propiedad espectroscópica predeterminada de un complejo de la
sonda específica del amiloide con un polipéptido amiloide agregado
de conformación conocida.
En otro aspecto, la invención da a conocer un
método para detectar el efecto de un compuesto ensayado para la
inhibición, disrupción o desagregación de la formación amiloide.
Dicho método comprende la correlación de las propiedades
espectroscópicas de (a) un complejo de una sonda espectroscópica
específica de amiloide, tal como un colorante diazo sulfonado o un
péptido amiloide marcado con un fluoróforo, que se pone en contacto
con un polipéptido amiloide y un compuesto de ensayo en condiciones
que permiten la agregación del polipéptido, y (b) un complejo de la
sonda espectroscópica específica de amiloide que se pone en contacto
con el polipéptido amiloide en condiciones que permiten la
agregación (control). La sonda espectroscópica se puede poner en
contacto con la muestra antes de la agregación o, si se trata de un
colorante específico de amiloide, después de la agregación. Si la
sonda espectroscópica es un péptido marcado con un fluoróforo, se
debe permitir la agregación con el polipéptido amiloide. El
compuesto de ensayo se puede añadir antes o después de la
agregación. Una diferencia en las propiedades espectroscópicas
indica que el compuesto de ensayo tiene un efecto sobre la
formación de amiloide.
Este y otros aspectos de la invención se
comprenderán mejor haciendo referencia a los dibujos, la descripción
detallada de la invención y los ejemplos.
Figura 1 (color): efecto del rojo del Congo en
la conformación de A\beta(1-40). Los
espectros CD en el UV lejano de complejos de rojo del Congo con
péptidos envejecidos y nuevos se compararon con espectros CD en el
UV lejano de coagregados a efectos de determinar las diferencias en
la conformación del agregado peptídico. Verde/diamante: coagregados
a 14,3 \muM de rojo del Congo; púrpura/cuadrado abierto:
coagregados a 21 \muM de rojo del Congo; rojo/triángulo:
coagregados a 47 \muM de rojo del Congo; azul/triángulo
invertido: péptido amiloide envejecido; naranja/cuadrado: péptido
nuevo con 21 \muM de rojo del Congo; naranja diluido/círculo:
péptido envejecido con 21 \muM de rojo del Congo.
Figura 2: espectros CD en el UV cercano de
complejos de rojo del Congo con agregados preformados (cuadrado
abierto) y coagregados de péptido amiloide (círculo abierto).
Figura 3: espectros de absorción de UV de
complejos de rojo del Congo con agregados preformados (círculo
abierto) y coagregados (cuadrado abierto). Los espectros de
absorción se midieron frente a péptidos envejecidos.
Figura 4: espectros diferenciales de complejos
de rojo del Congo con agregados preformados (círculo abierto) y
coagregados (cuadrado abierto) de \betaAP 1-40.
Los espectros de absorción se midieron frente a rojo del Congo.
La presente invención describe unos ensayos que
se pueden utilizar para detectar diferencias de conformación en
diversas formas agregadas de polipéptidos amiloides. La invención se
basa, en parte, en observaciones del efecto del rojo del Congo, una
sonda espectroscópica específica de amiloide fluorescente, sobre la
agregación. Los efectos se determinaron añadiendo rojo del Congo a
la solución de polipéptido amiloide (péptido A\beta) al inicio de
la agregación en un experimento, y a agregados preformados en otro
experimento. Se descubrió que el rojo del Congo forma como mínimo
dos complejos distintos con \beta-amiloide in
vitro. El rojo del Congo combinado con el péptido A\beta
antes de la agregación del péptido en hojas \beta presentaba
diferentes propiedades espectrales que cuando se combinaba con el
péptido A\beta después de haberse agregado en hojas \beta (el
llamado péptido fibrilar). El rojo del Congo actuó impidiendo la
formación de agregados fibrilares del péptido A\beta, y también
redujo los efectos tóxicos del péptido ya agregado. Aunque se puso
de manifiesto que los complejos resultantes de coagregados y
complejos de rojo del Congo con formas fibrilares eran diferentes
mediante análisis espectroscópico, en los dos casos los efectos
tóxicos del péptido se redujeron mediante la adición de rojo del
Congo.
Los resultados experimentales indican que los
mecanismos moleculares que conducen a la reducción de la toxicidad
son significativamente diferentes en los dos casos. La aplicación de
estos resultados facilita la determinación de la etapa en la que la
intervención en el proceso de agregación reduce óptimamente la
toxicidad, por ejemplo, hacia las células nerviosas. Los métodos
también se pueden utilizar para identificar los diversos complejos
proteínicos que resultan de diferentes polipéptidos en combinación
con una pequeña molécula inhibidora prototipo. Se describen ensayos
que pueden ser utilizados para evaluar rápidamente el estado de
agregación del polipéptido amiloide en presencia de inhibidores
potenciales de fibrilogenesis.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se conoce el hecho de que el péptido A\beta
transmite toxicidad y se cree que esta implicado en la muerte
neuronal en la enfermedad de Alzheimer. Actualmente existe un gran
interés en identificar proteínas que medien la neurotoxicidad del
péptido A\beta. Los métodos descritos en la presente memoria se
pueden utilizar para caracterizar las interacciones del péptido
A\beta en su forma o formas agregadas con las proteínas y también
para determinar si los compuestos de ensayo potenciales interrumpen
dichas interacciones. La aplicación de los métodos también
proporciona detalles adicionales sobre los mecanismos moleculares de
la enfermedad de Alzheimer, que son actualmente la base de los
esfuerzos de descubrimiento de fármacos en el campo de la
neurodegeneración. Estos descubrimientos se pueden aplicar para
evaluar también otros polipéptidos amiloides.
Se implementaron tres técnicas diferentes como
herramientas para determinar el alcance de la agregación del
polipéptido, en presencia y en ausencia de rojo del Congo. También
se examinaron el efecto que los inhibidores tienen sobre la
autoagregación del polipéptido amiloide y el efecto coincidente
sobre la citotoxicidad.
- 1.
- Se implementó espectroscopia de dicroísmo circular (CD) a efectos de identificar y diferenciar las conformaciones del polipéptido amiloide que se envejeció en presencia o en ausencia de rojo del Congo. El método se basa en los cambios de absorción CD del polipéptido amiloide en el UV lejano y el rojo del Congo o en el UV cercano. Se registraron los espectros de UV lejano y de UV cercano de los complejos agregados. Los espectros CD de UV lejano fueron útiles para determinar la estructura secundaria del polipéptido amiloide. Los espectros CD de UV cercano fueron útiles para diferenciar los complejos de rojo del Congo. El polipéptido amiloide individual en tampón y rojo del Congo libre no produjo una señal de absorción CD apreciable en la región de UV cercano. Dado que el rojo del Congo no tiene un espectro CD intrínseco en estado libre, los cambios espectrales inducidos tras el enlace con las proteínas amiloides resultan útiles para identificar diversas formas de proteínas amiloidogénicas. Los efectos de absorción CD inducidos son significativamente diferentes para coagregados de rojo del Congo con polipéptidos amiloides y complejos de rojo del Congo con agregados preformados o formas fibrilares de polipéptido. Sin intención de constreñirse a ninguna teoría en particular, se cree que los cambios en el espectro CD en el UV cercano del rojo del Congo son debidos a la inducción de un entorno quiral después del enlazamiento hacia una forma fibrilar ordenada de la proteína.
- Se puso de manifiesto que el espectro CD en el UV cercano de los coagregados (de polipéptido amiloide y rojo del Congo) es significativamente diferente que el de los complejos fibrilares preformados en contacto con rojo del Congo. Las diferencias observadas en los espectros de los complejos eran debidas a la formación de diferentes estados de complejación del rojo del Congo. Los espectros CD acoplados a excitón de fibrilos preformados indicaban la complejación de rojo del Congo con una conformación en hoja \beta ordenada del péptido (es decir, debido a la formación de estructuras en hoja \beta enroscadas; Woody, R.W., "The Circular Dichroism of Biopolymers", Proc. F.E.C.S. Int. Conf. Circ. Dichroism, 1987 (fecha de la reunión 1985), págs. 270-295), mientras que el espectro de los coagregados era consistente con la complejación del rojo del Congo con estructuras agregadas intermedias.
- El espectro CD del polipéptido amiloide agregado se registró en varios puntos temporales a efectos de correlacionar la formación de conjuntos macromoleculares enlazantes de tioflavina (agregados) con la aparición de la conformación en hoja \beta. Se utilizó espectroscopia de fluorescencia utilizando enlace de tioflavina (ThT) para confirmar la formación de hojas \beta en el polipéptido. La fluorescencia inducida debido a la tioflavina es específica para los fibrilos amiloides plegados en \beta, pero no para otras estructuras en hoja \beta o para las formas oligoméricas solubles del polipéptido.
- 2.
- Se utilizó espectroscopia UV para diferenciar los espectros de absorción de rojo del Congo de los dos complejos de fibrilos preformados y coagregados. Se determinaron los cambios en los espectros de absorción del rojo del Congo en presencia y en ausencia de polipéptido amiloide, así como los cambios en el entorno del rojo del Congo después del enlazamiento a complejos fibrilares, no fibrilares y otras formas alternativas de dichos complejos.
- 3.
- Se utilizó espectroscopia de fluorescencia para diferenciar los complejos de rojo del Congo. El rojo del Congo se enlaza a fibrilos preformados, así como a formas agregadas intermedias del polipéptido amiloide. La fluorescencia intrínseca del rojo del Congo aumenta significativamente cuando se enlaza a la forma agregada. El espectro de excitación por fluorescencia del rojo del Congo en el estado enlazado a agregado también es rojo desplazado en relación con la forma libre del polipéptido. Los cambios en las propiedades de fluorescencia del rojo del Congo dependen del estado de agregación del rojo del Congo. Las diferencias en las características espectrales observadas de los coagregados y los complejos del polipéptido fibrilar con rojo del Congo son debidos a las diferencias en la hidrofobia relativa de los lugares de enlace y al número de moléculas de rojo del Congo enlazadas en los complejos con fibrilos preformados y coagregados.
En la presente invención, se ha puesto de
manifiesto que el rojo del Congo favorece la formación de un
intermedio estable en una conformación en hoja \beta cuando se
coagrega con un polipéptido amiloide. Aunque el rojo del Congo se
enlaza a fibrilos preformados así como a formas agregadas
intermedias del polipéptido amiloide, no existía ninguna evidencia
de interacción con el polipéptido en un estado helicoidal aleatorio.
Los resultados muestran que el espectro de fluorescencia del rojo
del Congo cuando está coagregado con el polipéptido amiloide
aumenta ocho veces en comparación con la forma libre. También se ha
puesto de manifiesto que los fibrilos preformados se enlazan al
rojo del Congo, pero el aumento de fluorescencia del complejo entre
fibrilos preformados y rojo del Congo sólo es de dos veces en
comparación con la forma libre de rojo del Congo. De este modo,
utilizando técnicas de fluorescencia, el presente estudio pone de
manifiesto que el rojo del Congo tiene un modo dual de interacción
con la proteína amiloide \beta 1-40. Dado que las
isoformas de A\beta_{39-43} también se
convierten de hélice aleatoria a una forma en hoja \beta, las
interacciones de rojo del Congo deben ser similares para todas las
isoformas del péptido A\beta.
Los resultados espectroscópicos descritos en la
presente invención han puesto de manifiesto que los inhibidores,
tal como el rojo del Congo, forman como mínimo dos complejos
distintos con los polipéptidos amiloides. Se ha puesto de
manifiesto que tanto los fibrilos preformados como los coagregados
forman sustancias de elevado peso molecular cuando se enlazan a
rojo del Congo (aproximadamente 50 kD o mayor). Aunque el rojo del
Congo se enlaza a los agregados intermedios del péptido A\beta, y
en consecuencia atenúa la toxicidad del péptido fibrilar, la
formación de complejos "insolubles" en los coagregados todavía
puede tener lugar, sugiriendo que los compuestos de ensayo que
producen dichos efectos en la agregación requieren una investigación
en términos de su adecuación para una acción terapéutica o
profiláctica en la enfermedad de Alzheimer.
Según estas observaciones específicas, que a
continuación se describen con mayor detalle en los ejemplos, se ha
descubierto la capacidad general de una sonda fluorescente, es decir
un colorante diazo sulfonado o un péptido amiloide marcado con un
fluoróforo, para sondar la forma de agregación del polipéptido
amiloide agregado. Esta herramienta analítica proporciona una base
para diversas técnicas de evaluación de la capacidad de los
compuestos de ensayo para inhibir o invertir la amiloidosis.
En la presente memoria se describen diversas
formas de realización y aspectos de la presente invención. Los
títulos (en negrita y subrayados) y subtítulos (en negrita, cursiva
y subrayados) específicos se proporcionan a efectos de facilitar la
comprensión de la invención, y no se deben considerar a título
limitativo.
Las expresiones "amiloide", "placa
amiloide" y "fibrilo amiloide" se refieren generalmente a
sustancias proteináceas insolubles con características físicas
particulares independientes de la composición de las proteínas u
otras moléculas presentes en la sustancia. El amiloide se puede
identificar por su estructura amorfa, tinción eosinofílica, cambios
en la fluorescencia de tioflavina y aspecto homogéneo. Los
componentes proteínicos o peptídicos del amiloide se designan en la
presente memoria "polipéptidos amiloides", e incluyen, sin
limitarse a los mismos, péptido \beta-amiloide
(A\beta), incluyendo los \betaAP sintéticos correspondientes a
los primeros 28, 40 ó 42 aminoácidos de A\beta, es decir
A\beta(1-28),
A\beta(1-40),
A\beta(1-42), respectivamente, así como un
\betaAP correspondiente a los aminoácidos 25-35 de
A\beta, i.e., A\beta25-35; precursor de
proteína "scrapie" o prión; Inmunoglobulina, incluyendo cadenas
\kappa o \lambda ligeras o pesadas, o fragmentos de las mismas,
producidas por mielomas; amiloide de suero A; microglobulina
\beta_{2}; apoA1; gelsolina; cistatina C;
(pro)calcitonina, factor atrial natriurético; polipéptido
amiloide de los islotes, también conocido como amilina (véase
Westerinark et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,
84:3881-85; Westermark et al, Am. J.
Physiol., 1987, 127:414-417; Cooper et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:8628-32;
Cooper et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988,
85:7763-66; Amiel, Lancet, 1993,
341:1249-50); y similares. Para los propósitos de
la presente memoria, el polipéptido amiloide se puede agregar
espontáneamente por inducción, por ejemplo con una semilla, en
condiciones que permitan la agregación. Debe indicarse que, aunque
la amilina humana se agrega espontáneamente in vitro, la
amilina de rata, que difiere de la amilina humana en seis residuos
aminoácidos, es no amiloidogénica y no forma fibrilos (véase Lorenzo
et al, Nature, 1994, 368:756-760). En un
aspecto específico, el término "amiloide" se utiliza en la
presente memoria para hacer referencia a sustancias que contienen
A\beta. "Amiloidosis" se refiere a la deposición o agregación
in vivo de proteínas para formar placas o fibrilos de
amiloide.
La expresión "sonda espectroscópica específica
de amiloide" se refiere a un compuesto colorante enlazante de
amiloide o un conjugado péptido-fluoróforo que
interactúa con las formas agregadas del amiloide, y da lugar a
diferentes propiedades espectroscópicas dependiendo de la
conformación del agregado. Naturalmente, como el experto en la
materia podrá apreciar fácilmente, un fluoróforo actuará
necesariamente como un cromóforo, es decir que presentará un
espectro de absorción específico. Además, cuando esté constreñido en
un amiloide agregado, probablemente presentará un espectro CD
inducido. La sonda puede afectar, y preferentemente afecta, a la
amiloidogénesis. Los colorantes diazo sulfonados y los péptidos
amiloides marcados con fluoróforo son ejemplos de sondas
espectroscópicas específicas de amiloide.
Un "péptido amiloide marcado con
fluoróforo" es un péptido amiloide derivado del polipéptido, tal
como A\beta, conjugado con un fluoróforo (molécula fluorescente).
Los péptidos amiloides pueden ser polipéptidos amiloides, o partes
de los mismos capaces de coagregarse con polipéptidos amiloides. Sin
embargo, los péptidos amiloides marcados con fluoróforo no
necesitan ser capaces de agregarse de por sí. Los ejemplos de
fluoróforos para la marcación del péptido amiloide incluyen, sin
limitarse a los mismos, fluoresceína, rojo de Texas, complejos de
rutenio \beta-piridilo y rodamina. Los fluoróforos
también presentan espectros de absorción útiles en el UV, y pueden
presentar también propiedades de espectro IR útiles.
Preferentemente, el péptido amiloide marcado con fluoróforo
representa aproximadamente el 10% o menos, más preferentemente de
aproximadamente el 1% o menos, y de la forma más preferente
aproximadamente el 0,1% o menos de péptido total en la muestra.
En su sentido más amplio, un colorante
"enlazante de amiloide" es un cromóforo que tiene propensión a
asociarse con el amiloide. Preferentemente, el colorante también es
un fluoróforo, es decir, es capaz de fluorescencia en condiciones
específicas. Para los propósitos de la presente invención, y en el
estudio de la amiloidosis, el colorante paradigmático es un
colorante diazo sulfonado, y más particularmente el rojo del Congo
(véanse, por ejemplo, las patentes US nº 5.276.059 y
PCT/US93/06637). Sin embargo, se contemplan dentro del alcance de
la invención los compuestos relacionados con o equivalentes al rojo
del Congo, tal como crisamina G, que es un análogo carboxilado del
rojo del Congo. A continuación se muestran las estructuras del rojo
del Congo y de la crisamina G:
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones que permiten la agregación son
el pH, la fuerza iónica, la temperatura y concentraciones bajas,
preferentemente nulas, o por lo menos no detectables, de cualquier
reactivo caotrópico o liotrópico, de tal modo que un polipéptido
amiloide se puede agregar. La presencia de una "semilla"
amiloide incrementa la propensión del polipéptido a agregarse.
La expresión "complejo de agregación" se
refiere al complejo formado por la interacción de una sonda
espectroscópica específica de amiloide, tal como el rojo del Congo,
con un polipéptido amiloide agregado. Este complejo se puede formar
como resultado de una coagregación, es decir, estando presente la
sonda espectroscópica específica de amiloide con el polipéptido
amiloide antes de la inducción de la agregación. Alternativamente,
el complejo se puede formar como resultado de la interacción del
colorante con un agregado de polipéptido amiloide preformado.
La expresión "forma de agregación" se
utiliza en la presente memoria para referirse a la estructura o
conformación adoptada por el polipéptido amiloide en su estado
agregado. Por ejemplo, el A\beta agregado puede dar lugar a una
forma en hoja \beta o en hoja \beta enroscada. Desde el punto de
vista práctico, la conformación secundaria y cuaternaria
(péptido-péptido) se representa mediante diferencias
en las propiedades espectroscópicas. Dicho de otro modo, sin
conocer con precisión la estructura del polipéptido amiloide
agregado, detectando diferencias en las propiedades
espectroscópicas del polipéptido o de la sonda espectroscópica
específica de amiloide, se pueden detectar diferencias
estructurales. Estas diferencias, a su vez, se pueden evaluar in
vitro o in vivo para determinar su efecto sobre la
toxicidad celular o la patogenicidad asociada a amiloidosis.
Las expresiones "agregado de polipéptido" o
"agregado" se refiere a especies de polipéptidos autoasociadas
que dan lugar a formas fibrilares o no fibrilares y a aquellas que
son tóxicas o no tóxicas para los cultivos neuronales.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "propiedad espectroscópica" se refiere a la cantidad
de radiación absorbida por el complejo agregado, o de energía
radiada por el complejo agregado excitado por la absorción de
radiación. En una forma de realización específica, se obtienen
espectros de dicroísmo circular (CD) en el ultravioleta (UV) en las
regiones de UV lejano y UV cercano del espectro. En otra forma de
realización, se obtienen espectros de absorción de UV. En otra
forma de realización, se obtienen espectros de emisión de
fluorescencia. En otra forma de realización, se obtienen espectros
de infrarrojo (IR). Generalmente, los espectros se obtienen
midiendo la diferencia entre la cantidad de luz transmitida o
absorbida a una longitud de onda determinada en una muestra que
contiene el complejo agregado frente a una muestra de referencia.
Los espectros de fluorescencia se obtienen detectando la intensidad
de emisión a una longitud de onda de luz de excitación determinada.
Los espectros de excitación de fluorescencia se pueden obtener
evaluando la intensidad de la fluorescencia como función de la
longitud de onda de absorción. Estos conceptos son bien conocidos en
la técnica (véase, por ejemplo, Cantor y Schimmel, Biophysical
Chemistry, W.H. Freeman and Company: San Francisco, 1980;
Silverstein et al, Spectrometric Identification of Organic
Compounds, John Wiley & Sons: Nueva York, 1981).
Una enfermedad o desorden están asociados con
amiloidosis cuando se detectan depósitos de amiloide o placas de
amiloide en los tejidos afectados por dicha enfermedad o en sus
proximidades, o bien cuando la enfermedad se caracteriza por la
sobreproducción de una proteína que es o puede volverse insoluble.
Las placas de amiloide pueden provocar efectos patológicos directa
o indirectamente, a través de mecanismos conocidos o desconocidos.
Los ejemplos de enfermedades amiloides incluyen, sin limitarse a las
mismas, enfermedades sistémicas tales como enfermedades
inflamatorias crónicas, mieloma múltiple, macroglobulinemia,
polineuropatía amiloide familiar (portuguesa) y cardiomiopatía
(danesa), amiloidosis senil sistémica, polinefropatía amiloide
familiar (Iowa), amiloidosis familiar (finlandesa), síndrome de
Gerstmann-Straussler-Scheinker,
nefropatía amiloide familiar con urticaria y sordera (síndrome de
Muckle-Wells), carcinoma medular del tiroides,
amiloide atrial aislado y amiloidosis asociada a hemodiálisis
(HAA); y enfermedades neurodegenerativas.
La diabetes de tipo II está asociada a fibrilos
o depósitos amiloides del páncreas, particularmente en las células
de islotes que producen insulina. Como en las placas amiloides de la
enfermedad de Alzheimer, las placas o fibrilos de amiloide de la
diabetes de tipo II provocan efectos patológicos. Particularmente,
las concentraciones de amilina humana en las que se forman los
fibrilos son tóxicas para las células \beta productoras de
insulina de islotes pancreáticos humanos y de rata (Lorenzo et
al, 1994, Nature 368:758-760).
Correspondientemente, en una forma de realización específica, la
invención se refiere a amiloidosis diabética de tipo II.
Las enfermedades inflamatorias crónicas, tales
como fiebre mediterránea familiar idiopática, síndrome de
Muckle-Wells, infección por malaria crónica y
similares, pueden dar lugar a la expresión del amiloide sérico A,
una proteína de fase aguda que puede sufrir un procesamiento
posterior y formar depósitos y placas de amiloide. Por ejemplo, en
el tercer mundo la malaria crónica puede provocar amiloidosis del
bazo y/o el hígado de un individuo. La insuficiencia resultante del
órgano puede llevar en último término a la muerte. El mieloma
múltiple está asociado con la sobreproducción de inmunoglobulinas,
pudiendo formar dichas inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas
depósitos y placas de amiloide en órganos o tejidos que están en
contacto con el sistema circulatorio. La deposición de
transtiretina puede provocar polineuropatía amiloide familiar
(portuguesa), cardiomiopatía amiloide familiar (danesa), o
amiloidosis senil sistémica. La amiloidosis asociada con
hemodiálisis es una complicación que aparece en pacientes de
hemodiálisis a largo término, en la que la microglobulina
\beta_{2} es un constituyente proteínico principal de los
fibrilos de amiloide (Drüeke, 1991, Miner. Electroyte Metab.
17:261-272; Geyjo y otros, 1985, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 129:701-706; Gorevic y otros, 1986,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7908-12; Shirahama y
otros, 1985, Lab. Invest. 53:705-709).
Tal como se ha indicado anteriormente, además de
las amiloidosis sistémicas, la presente invención se refiere
particularmente a enfermedades neurodegenerativas que implican
amiloidosis. El término "enfermedad neurodegenerativa" se
refiere a una enfermedad o desorden del sistema nervioso,
particularmente del cerebro, que se manifiesta a través de síntomas
característicos de una disfunción cerebral o nerviosa, por ejemplo
lapsos o ausencia de memoria de corto término o de largo término,
demencia, efectos cognitivos, problemas de equilibrio y coordinación
y deficiencias emocionales y de comportamiento. Estas enfermedades
están "asociadas con amiloidosis" cuando muestras
histopatológicas (biopsia) de tejido cerebral de sujetos que
muestran dichos síntomas revelan la formación de placas de
amiloide. Dado que las muestras de biopsia del cerebro,
particularmente del cerebro humano, se obtienen con grandes
dificultades en sujetos vivos o pueden no estar disponibles en
absoluto, frecuentemente la asociación de un síntoma o síntomas de
enfermedad neurodegenerativa con amiloidosis se basa en criterios
distintos de la presencia de depósitos de amiloide, tal como placas
o fibrilos, en una muestra de biopsia.
En una forma de realización específica, según la
presente invención, la enfermedad neurodegenerativa asociada con
amiloidosis es la enfermedad de Alzheimer (AD). En otras formas de
realización, la enfermedad puede ser la rara enfermedad sueca
caracterizada por una doble mutación KM a NL en la proteína
precursora de amiloide (APP) cerca del terminal amino de la parte
\betaAP de APP (Levy et al, 1990, Science
248:1124-26). Otra enfermedad de este tipo es la
hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis (HCHA o HCHWA) tipo
holandés (Rozemuller y otros, 1993, Am. J. Pathol.
142:1449-57; Roos y otros, 1991, Ann. N.Y. Acad.
Sci. 640:155-60; Timmers y otros, 1990, Neurosci.
Lett. 118:223-6; Haan y otros, 1990, Arch. Neurol.
47:965-7). Otras enfermedades de este tipo
conocidas en la técnica y que entran dentro del alcance de la
presente invención incluyen, sin imitarse a las mismas, angiopatía
amiloide cerebral esporádica, angiopatía amiloide cerebral
hereditaria, síndrome de Down, Parkinson-demencia
de Guam y angiopatía amiloide asintomática relacionada con la edad
(véase, por ejemplo, Haan y Roos, 1990, Clin. Neurol. Neurosurg.
92: 305-310; Glenner y Murphy, 1989, N. Neurol. Sci.
94:1-28; Frangione, 1989, Ann. Med.
21:69-72; Haan y otros, 1992, Clin. Neuro.
Neurosurg. 94:317-8; Fraser y otros, 1992, Biochem.
31:10716-23; Coria y otros, 1988, Lab. Invest.
58:454-8). La composición y el tamaño reales de los
aminoácios de ßAP implicados en cada una de dichas
enfermedades puede variar, tal como es conocido en la técnica
(véase anteriormente, y Wisniewski et al., 1991, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 179: 1247-54 y 1991, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 180:1528 [errata publicada];
Prelli et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 301-307; Levy et al., 1990, Science 248: 1124-26).
Prelli et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 301-307; Levy et al., 1990, Science 248: 1124-26).
En otro aspecto, la enfermedad neurodegenerativa
es una encefalopatía espongiforme subaguda, tal como, aunque sin
limitarse a las mismas, "scrapie", enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de
Gerstmann-Sträussler, kuru, caquexia crónica de
ciervos y wapitíes, encefalopatía espongiforme bovina del ganado y
encefalopatía transmisible del visón.
La presente invención contempla la evaluación de
la forma de agregación de un polipéptido amiloidogénico de
cualquier animal, y más preferentemente un mamífero, incluyendo los
humanos, así como mamíferos tales como perros, gatos, caballos,
vacas, cerdos, cobayas, ratones y ratas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "alrededor de" o "aproximadamente" significa
dentro del 50% de un determinado valor, preferentemente dentro del
20%, más preferentemente dentro del 10%, aún más preferentemente
dentro del 5%, y de la forma más preferente dentro del 1% de un
determinado valor. Alternativamente, la expresión "alrededor
de" o "aproximadamente" significan que un valor puede estar
dentro de un intervalo de error científicamente aceptable para ese
tipo de valor, que dependerá de hasta qué punto puede ser
cualitativa la medición teniendo en cuenta las herramientas
disponibles. "Alrededor de" o "aproximadamente" puede
definir una distribución alrededor de un valor promedio más que un
valor individual.
En general, la agregación de un polipéptido
amiloide es un acontecimiento que depende de la concentración y el
tiempo. El polipéptido amiloide se disuelve en un tampón apropiado,
preferentemente en una solución tampón con una fuerza iónica
comparable a las condiciones fisiológicas, tal como solución salina
tamponada con fosfato (PBS), tampón TRIS^{TM}, tampón
HEPES^{TM} o medio NEUROBASAL^{TM}. El polipéptido amiloide
agregado se detecta mediante métodos rutinarios, por ejemplo, tal
como se describe a continuación.
Un colorante que se enlaza a amiloide se puede
poner en contacto con el polipéptido amiloide antes de la agregación
o después de la misma a efectos de evaluar la forma de agregación.
La sonda espectroscópica específica de amiloide se puede
proporcionar aproximadamente en la misma concentración
(concentración molar) que el polipéptido amiloide, o
aproximadamente de un orden de magnitud mayor o menor, siempre que
(a) la señal espectroscópica procedente del colorante se pueda
detectar en los espectrómetros disponibles y (b) la señal procedente
del colorante complejado con el agregado de polipéptido sea
detectable por encima de la señal procedente del colorante no
complejado. Estos factores son fáciles de determinar
experimentalmente.
Agregación de A\beta. Después de un periodo de
demora que depende de la concentración durante las incubaciones
in vitro, las preparaciones solubles de A\beta sintético
forman lentamente agregados fibrilares que se parecen al amiloide
natural y se pueden medir por sedimentación o fluorescencia basada
en tioflavina T. La velocidad de agregación del A\beta soluble en
estos ensayos in vitro aumenta por la adición de pequeñas
cantidades de material "semilla" amiloide \beta
preagregado.
En una forma de realización específica, el
A\beta(1-40) disuelto en
hexafluoroisopropanol al 100% a 200 ó 400 \muM se seca bajo un
flujo de nitrógeno. Inicialmente, el hexafluoroisopropanol convierte
la conformación del péptido a un estado de hélice aleatoria. La
película de péptido se disuelve en tampón PBS, pH 7,4, hasta una
concentración final de 50 \muM con sonicación breve, de entre
aproximadamente cinco y cuarenta segundos, y breve efecto de
vórtice, durante cinco segundos o menos. A continuación, esta
solución se envejece para permitir la agregación.
Alternativamente, se pueden obtener péptidos
sintéticos, purificados por HPLC, que representan los primeros 28
(A\beta 1-28) y los primeros 40 aminoácidos
(A\beta 1-40) del A\beta de 42 aminoácidos a
través de Bachem (Torrance, CA, EE.UU.). La agregación de A\beta
1-28 ó A\beta 1-40 soluble a
diferentes concentraciones se puede iniciar por adición de acetato
de sodio 0,1 M (NaOAc) a un pH comprendido entre 4,7 y 7,5. La
formación cuantitativa de agregado con concentraciones
submilimolares de A\beta se puede detectar utilizando el
procedimiento de LeVine (Protein Science, 1992,
2:404-410). En resumen, la fluorescencia de
agregados añadidos a 10 \muM tioflavina T (Aldrich)/50 mM de
tampón de fosfato de potasio, pH 6,0, se miden mediante la
excitación a 450 \pm 5 nm y la detección de la emisión a 482
\pm 10 nm en un espectrofluorímetro Perkin Elmer
LS-50B.
La agregación de A\beta a concentraciones más
bajas (fisiológicas) se puede cuantificar mediante el método de
Burdick y otros (J. Biol. Chem., 1992, 267:546-554).
Las preparaciones sintéticas de A\beta se pueden diluir a 5 nM de
concentración final, preferentemente en presencia de
"semillas". Después de diversos periodos de incubación a 37ºC
se pueden evaluar las reacciones de agregación.
Agregación de amilina. Después de un
periodo de demora dependiente de la concentración durante las
incubaciones in vitro, las preparaciones solubles de amilina
sintética forman lentamente agregados fibrilares que se parecen al
amiloide natural (Lorenzo y otros, Nature, 1994,
368:756-760) y se pueden medir mediante microscopia
electrónica o por birrefringencia de rojo del Congo bajo luz
polarizada (Fraser y otros, Biophys. J., 1991,
90:1194-1201). Se espera que la agregación de la
amilina soluble en estos ensayos in vitro aumente por la
adición de pequeñas cantidades de material "semilla" de amilina
preagregado.
En una forma de realización particular se pueden
obtener péptidos sintéticos purificados por HPLC que representan el
polipéptido o amilina amiloides de islotes humanos o de rata de 37
aminoácidos utilizando métodos estándar de síntesis de péptidos o
de procedencia comercial, tal como Bachem (Torrance, CA) o Peninsula
Laboratories. La formación cuantitativa de agregados con
concentraciones de amilina submilimolares se pueden detectar
utilizando el procedimiento de LeVine (Protein Science, 1992,
2:404-410). En resumen, la fluorescencia de
agregados añadidos a 10 \muM de tioflavina T (Aldrich)/50 mM de
tampón de fosfato de potasio, pH 6,0, se miden mediante la
excitación a 450 \pm 5 nm y la detección de la
emisión a 482 \pm 10 nm en un espectrofluorímetro Perkin Elmer
LS-50B. Alternativamente, se puede utilizar
birrefringencia de rojo del Congo bajo luz polarizada a efectos de
detectar la agregación (Fraser y otros, supra). Se pueden
añadir pequeñas cantidades de agregados preformados o "semillas
de nucleación" a la amilina soluble e iniciar la agregación, por
ejemplo, con acetato de sodio 0,1 M. La amilina soluble (250
\muM) y el tampón de fosfato de sodio 0,2 M, a pH 7,5, se pueden
incubar a 37ºC a efectos de generar agregados preformados,
designados "semilla de amilina". Tras la incubación, se miden
concentraciones proteínicas de preparaciones de semillas y se
ajustan con tampón hasta una concentración final de 150 \muM.
La agregación de amilina a concentraciones más
bajas (fisiológicas) se puede cuantificar mediante el método de
Burdick et al. (J. Biol. Chem. 267:546-554,
1992). Las preparaciones sintéticas de amilina se diluyen hasta la
concentración final de 5 nM, preferentemente en presencia de
diversas "semillas". Después de diversos periodos de
incubación a 37ºC, se pueden evaluar las reacciones de
agregación.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez que se ha formado un complejo de la
sonda espectroscópica específica de amiloide con el amiloide, el
mismo se puede evaluar espectrofotométricamente. Las propiedades
espectroscópicas del polipéptido o del colorante se pueden
analizar, aunque para el polipéptido la información más importante
se detecta mediante espectroscopia CD en el UV lejano.
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros CD en el UV lejano del polipéptido
libre y de los complejos de la sonda espectroscópica específica de
amiloide con el polipéptido agregado, por ejemplo, desde
aproximadamente 200 nm a aproximadamente 260 nm, proporcionan
información sobre la conformación del polipéptido. De hecho, este
espectro mide la absorción dicroica del polipéptido. Sin embargo,
mientras que datos experimentales anteriores han demostrado que el
A\beta adopta una conformación secundaria en hoja \beta cuando
se agrega, por primera vez se han observado diferencias en la
estructura de agregado en tres diferentes formas de agregados, y las
mismas se pueden evaluar.
La siguiente tabla proporciona información sobre
la conformación de A\beta agregado complejado con rojo del Congo,
un colorante diazo sulfonado típico, a partir de los espectros CD en
el UV lejano:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los espectros CD en el UV cercano, por ejemplo
desde aproximadamente 300 nm a aproximadamente 700 nm, miden la
absorbancia del colorante y en consecuencia pueden ser utilizados
para evaluar diferentes estructuras de un complejo del colorante y
el amiloide. El polipéptido solo, y el rojo del Congo, no producen
una señal CD apreciable en la región del UV cercano. Las
diferencias en los espectros CD de los complejos del colorante y
los agregados de polipéptido son evidentes en la intensidad y la
longitud de onda de la señal máxima.
La siguiente tabla, así como la figura 2,
ilustra algunas de las diferencias conformacionales del A\beta
complejado con rojo del Congo, un colorante diazo sulfonado típico,
a partir de los espectros CD en el UV cercano:
El análisis de espectros UV puede diferenciar
los espectros de absorción de complejos del colorante con diferentes
formas de agregación. Por ejemplo, el rojo del Congo presenta una
absorción en el UV diferente y diferentes propiedades espectrales
dependiendo de si está complejado con preagregados o coagregados de
polipéptido. Resulta preferente restar los espectros del
polipéptido amiloide agregado a los espectros de complejación a
efectos de sondar específicamente las propiedades de absorción del
colorante.
Alternativamente, los espectros diferenciales de
absorbancia en UV del colorante se pueden obtener restando la
absorbancia normal del colorante a la absorbancia del colorante
complejado con el polipéptido amiloide agregado.
Los espectros de absorción UV se pueden obtener
entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 700 nm;
preferentemente entre aproximadamente 250 nm y aproximadamente 700
nm. La diferencia en los espectros (véase figura 4) de los
complejos de rojo del Congo con péptido amiloide obtenidos frente a
rojo del Congo libre muestran que los complejos son hipercrómicos,
con una absorbancia aumentada alrededor de 550 nm, en relación con
la absorción de la forma libre. Los espectros de absorción de los
dos complejos, rojo del Congo enlazado a agregados preformados y
coagregados, muestran una absorción negativa alrededor de 480 nm en
el espectro diferencial. El origen de las diferencias espectrales
se encuentra en la conversión del rojo del Congo libre en su forma
enlazada, produciéndose un desplazamiento batocrómico en su
espectro de absorción. La inspección de los espectros en las figuras
3 y 4 también sugiere que el aumento de absorción entre 500 nm y
550 nm es mayor en el caso de complejos de rojo del Congo con
agregados preformados que en los coagregados. La complejación del
rojo del Congo con péptido amiloide provoca una disminución de la
absorción de luz alrededor de 480 nm debido a la forma libre del
compuesto, y un aumento concurrente de absorción de luz entre el
intervalo espectral de 500 a 550 nm, debido a la complejación.
Los espectros de fluorescencia de emisión o
excitación del colorante, por ejemplo rojo del Congo, se pueden
utilizar para sondar la forma de agregación del amiloide. Los
espectros de fluorescencia de los complejos de rojo del Congo con
polipéptido amiloide están desplazados a longitudes de onda
ligeramente más larga (desplazamiento al rojo) en comparación con
los espectros de emisión de la forma libre de rojo del Congo. Los
espectros de emisión de rojo del Congo se registraron utilizando
una longitud de onda de excitación de 500 nm. El máximo de emisión
de los complejos de rojo del Congo está centrado aproximadamente a
605 nm. Los espectros de emisión de rojo del Congo libre y rojo del
Congo en presencia de polipéptido fresco (péptido monomérico) están
centrados alrededor de 620 nm. Los espectros de excitación de las
formas libre y enlazada de rojo del Congo también difieren
significativamente. El máximo de excitación de la forma enlazada de
rojo del Congo en los coagregados y en los complejos de agregados
preformados está centrado alrededor de 525 nm. En consecuencia,
estos espectros están significativamente desplazados hacia el rojo
en relación con la forma libre de rojo del Congo. Las diferencias
en los espectros de fluorescencia son debidas a cambios en el
microentorno del rojo del Congo tras enlazarse con el polipéptido
amiloide.
Además de las mediciones basadas en la
intensidad, otras técnicas de fluorescencia, tales como (i) métodos
de anisotropía de fluorescencia, y (ii) mediciones de emisión de
fluorescencia resuelta en tiempo, a efectos de identificar y
resolver los tiempos de desintegración de rojo del Congo en
presencia de complejos de coagregados y agregados preformados,
pueden ser útiles para diferenciar estructuras amiloides.
La polarización o anisotropía de los fluoróforos
tiene lugar debido al desplazamiento angular del fluoróforo entre
la absorción y la emisión de luz. El desplazamiento angular depende
de la velocidad y el alcance de la difusión rotativa durante la
vida del estado excitado del fluoróforo (Lakowicz, J.R., Principles
of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, Nueva York, 1983). Los
movimientos de difusión dependen de diversos parámetros, siendo el
más importante para la presente aplicación el cambio de tamaño y
forma moleculares de la proteína amiloide. Los métodos de
anisotropía de fluorescencia se pueden utilizar para determinar el
aumento del tamaño molecular de la proteína amiloide debido a
interacciones proteína-proteína después de la
agregación en ausencia y presencia de compuestos de ensayo. Más
específicamente, las mediciones de polarización se basan en el
principio de que las moléculas pequeñas son "isotrópicas"; es
decir, que rotan libremente en solución. Cuando están enlazadas o
fijadas a una macromolécula, los movimientos de rotación y volteo
son más lentos, haciendo que la emisión sea anisotrópica. Cuando se
utilizan pequeñas moléculas autofluorescentes como sondas, la
emisión de la molécula se vuelve "polarizada" (Lee, Y.C., J.
Biochem., 1997, 121 (5):818-825) después de
enlazarse a una macromolécula. Los cambios en las propiedades de
fluorescencia se pueden utilizar de dos modos. En un primer modo,
los cambios en la anisotropía de fluorescencia de moléculas
pequeñas, tales como rojo del Congo, se pueden utilizar para
determinar si los tamaños moleculares de los complejos de la
proteína son diferentes. En el segundo método, el polipéptido
amiloide se puede marcar directamente con un fluoróforo a efectos de
determinar los tamaños moleculares de la proteína en los dos casos
diferentes.
En el primer caso, en un experimento típico, se
mediría la polarización de fluorescencia del rojo del Congo libre
en ausencia de proteína amiloide. A continuación se puede utilizar
el aumento en el valor de anisotropía de la forma enlazada de rojo
del Congo en los complejos de los coagregados de compuestos de
ensayo en relación con su forma libre para estimar las diferencias
en tamaño y forma de la proteína amiloide como medio para
determinar los efectos de los compuestos de ensayo sobre la
agregación del polipéptido.
En el segundo caso, un péptido amiloide marcado
con un fluoróforo se puede utilizar para diferenciar agregados
formados en presencia de rojo del Congo o de compuesto de ensayo.
Los fluoróforos tales como complejos de rutenio y bipiridilo,
fluoresceína, y rodamina son sondas útiles en ensayos de
anisotropía. Los complejos de ligando rutenio son particularmente
adecuados para diferenciar el tamaño molecular de proteínas de
elevado peso molecular. Los complejos de rutenio y bipiridilo
presentan tiempos largos de descomposición, del orden de 400 ns, en
comparación con otros fluoróforos, tales como grupos de fluoresceína
o rodamina, cuyo tiempo de vida de fluorescencia es normalmente del
orden de 10 nanosegundos. Los tiempos de descomposición más
prolongados de los complejos de rutenio son adecuados para sondar
el peso molecular de moléculas proteínicas mayores que se voltean
en una escala temporal mucho más lenta en solución. Los fluoróforos
tales como la fluoresceína, en cambio, son útiles para diferenciar
oligómeros más pequeños del péptido A\beta dentro de un peso
molecular y un tamaño correspondientes a 50.000 Daltons.
En un experimento típico, el compuesto de ensayo
o rojo del Congo se agregan en presencia de proteína amiloide. El
péptido A\beta se puede conjugar con fluoróforos tales como
fluoresceína, rodamina o rutenio utilizando química estándar de
acoplamiento de ésteres de succinimidilo y grupos isotiocianato a
efectos de obtener un péptido marcado (Szmacinski y otros, Biophys.
Chem., 1996, 62:109-120). En un experimento inicial
se determina la anisotropía de estado estacionario del fluoróforo
libre. El valor de anisotropía del péptido marcado deberá ser
pequeño debido a los rápidos movimientos de volteo de las moléculas.
El envejecimiento del péptido fluorescente en presencia de proteína
amiloide deberá incrementar el valor de anisotropía del fluoróforo
debido a un aumento del tamaño molecular y un cambio en la forma de
la proteína amiloide. Dado que el péptido marcado se utiliza
principalmente como una sonda de fluorescencia, su concentración
será típicamente de entre aproximadamente 10 y aproximadamente
1.000 veces menor que la concentración de proteína amiloide.
En un segundo experimento, se determina el valor
de anisotropía de fluorescencia del péptido marcado que se ha
puesto en contacto con la proteína amiloide y el compuesto de ensayo
durante el envejecimiento. El aumento en la anisotropía es debido a
un aumento del tamaño molecular de la proteína. Alternativamente, el
aumento en los valores de anisotropía se puede utilizar para
determinar la velocidad de formación de agregados de mayor peso
molecular a efectos de identificar los efectos de los compuestos de
ensayo.
La cinética de descomposición fluorescente de
los fluoróforos, tal como el rojo del Congo o el péptido marcado
con fluorescencia (descrito en el método de anisotropía de
fluorescencia) se puede utilizar para identificar y diferenciar los
complejos del compuesto de ensayo con las proteínas amiloides. Este
método se basa en la premisa de que el tiempo de vida de la
fluorescencia se ve alterada después del enlazamiento a una proteína
debido a los cambios en las velocidades de descomposición radiante
y no radiante de las formas enlazada y libre del inhibidor. El
tiempo de vida de fluorescencia del rojo del Congo se puede medir
utilizando un instrumento de dominio de frecuencia o de dominio de
tiempo. Por ejemplo, se puede estimar un parámetro, el tiempo de
vida promedio, del rojo del Congo o los péptidos marcados con
fluorescencia. El tiempo de vida promedio es una función de los
tiempos de vida y concentraciones de las formas enlazada y libre del
fluoróforo. Alternativamente, un enfoque basado en el tiempo de
vida también se puede aplicar a cultivos neuronales vivos. Se puede
estimar una distribución de tiempos de vida para las formas libre y
complejada de rojo del Congo utilizando imagen por fluorescencia de
la célula. Este método de imagen bidimensional (FLIM o imagen de
tiempo de vida de fluorescencia) proporciona una distribución de
rojo del Congo en una base célula a célula a medida que pasan a
través de un rayo láser utilizando un citómetro de flujo de fase.
Las formas secretada y extracelular de las proteínas amiloides se
pueden identificar utilizando el método FLIM. El enfoque FLIM
resulta muy útil para detectar proteína amiloide secretada al medio
en cultivos celulares o en muestras de tejido.
Los espectros de absorción de infrarrojo de
proteína amiloide son una herramienta útil para determinar la
estructura de la proteína amiloide en los agregados cuando están
complejados con los compuestos de ensayo o con rojo del Congo. La
frecuencia de la banda de amida I, que representa la vibración de
estiramiento del carbonilo del enlace péptido, es sensible a la
conformación del esqueleto del péptido y, en consecuencia, a la
estructura secundaria del polipéptido. La banda de amida I de las
estructuras en hoja \beta absorbe a entre 1.620 y 1.640
cm^{-1}, y más débilmente a una frecuencia mayor de entre 1.680 y
1.695 cm^{-1}. Los cambios en la conformación del polipéptido
amiloide cuando dicho polipéptido se agrega en ausencia y presencia
de compuestos de ensayo o colorantes sulfonados se puede interpretar
sobre la base de las diferencias en la banda de absorción de amida
I.
La RMN es similarmente útil a la hora de obtener
información estructural sobre la proteína cuando se agrega en
ausencia y presencia de compuestos de ensayo o rojo del Congo. La
estructura del polipéptido amiloide se puede determinar utilizando
desplazamientos químicos, preferentemente de protones u otros
núcleos tales como ^{13}C o ^{15}N. El desplazamiento químico
de protones se utiliza más comúnmente para las asignaciones
estructurales. Está bien documentado en la bibliografía que las
regiones en hoja \beta muestran desplazamientos a campo más bajo
para la resonancia de ^{\alpha}H. Por otro lado, las regiones
helicoidales muestran desplazamientos a campo más alto. Sobre la
base de un conjunto de datos que contiene 5.000 protones de amida y
desplazamientos ^{\alpha}H, las posiciones promedio de
^{\alpha}H en hélices y hojas difieren aproximadamente en 0,8 ppm
con muy poca superposición entre las dos distribuciones (Methods in
Enzymology, vol. 239, Part C. págs. 363-392
(1994)). Esta tendencia general se mantiene también para los
protones de amida, pudiéndose identificar la forma en hoja \beta.
Los protones de amida en el terminal N de las hélices tienden a
desplazarse a campo más bajo en comparación con los del terminal C.
Estos desplazamientos químicos en las resonancias de protón se
pueden utilizar para asignar diferencias estructurales del
polipéptido en monómeros y en estados agregados en ausencia y
presencia de compuestos de ensayo.
En conjunción con los métodos espectroscópicos,
los métodos de ultracentrifugación analítica son útiles para
determinar el peso molecular de la solución y para evaluar el grado
de homogeneidad molecular del polipéptido amiloide. Los métodos de
sedimentación se pueden utilizar para determinar rápidamente si los
agregados de polipéptido amiloide existen en solución y si el
agregado es reversible o irreversible en su naturaleza. Existen
esencialmente dos métodos de sedimentación: velocidad de
sedimentación y equilibrio de sedimentación. El primer método
proporciona un medio rápido para estimar el tamaño, la forma y el
peso molecular del polipéptido agregado. El segundo método es útil
para determinar el peso molecular del polipéptido. La diferencia en
el peso molecular promedio del polipéptido agregado en ausencia y
presencia de compuestos de ensayo se puede determinar utilizando
métodos de velocidad y equilibrio de sedimentación. La aplicación de
estos métodos ayuda a diferenciar el tamaño de la naturaleza de
agregados tales como los formados en presencia de rojo del Congo u
otros compuestos de ensayo, y también para evaluar la eficacia de
los compuestos de ensayo a la hora de detener la agregación del
polipéptido en la etapa de nucleación o más tarde durante la etapa
de alargamiento. Esta información complementa la información
estructural obtenida por métodos espectroscópicos.
Una o más de las anteriores técnicas
espectroscópicas, opcionalmente en conjunción con una técnica no
espectroscópica tal como la ultracentrifugación, se pueden utilizar
para determinar el efecto de un compuesto de ensayo del que se
evalúa su capacidad de inhibir o invertir la amiloidosis in
vitro. De hecho, combinando la información procedente de los
resultados de más de una técnica espectroscópica descrita en la
presente solicitud, y preferentemente de todas ellas, será posible
determinar con un cierto nivel de detalle y certeza cómo afecta el
compuesto de ensayo a la formación de amiloide. Estos datos tienen
implicaciones muy importantes a la hora de cribar y ensayar
compuestos para tratar enfermedades o desórdenes asociados con la
amiloidosis, particularmente la enfermedad de Alzheimer.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "compuesto" se refiere a cualquier molécula o complejo
de más de una molécula que influye sobre la amiloidosis. La presente
invención contempla cribados para agentes sintéticos de molécula
pequeña, compuestos químicos, complejos químicos y sales de los
mismos, así como cribados para productos naturales, tales como
extractos vegetales o materiales obtenidos de caldos de
fermentación. Otras moléculas que se pueden identificar utilizando
los cribados según la invención incluyen proteínas y fragmentos
peptídicos, péptidos, ácidos nucleicos y oligonucleótidos, hidratos
de carbono, fosfolípidos y otros derivados lipídicos, esteroides y
derivados esteroides, prostaglandinas y derivados del ácido
araquidónico relacionados, etc.
En una forma de realización, el compuesto de
ensayo se incuba con el polipéptido amiloide soluble en condiciones
que conducen a la agregación, es decir, a la formación de amiloides
o amiloidosis. El material resultante, que puede ser o no un
agregado, se pone en contacto con la sonda espectroscópica
específica de amiloide y se obtienen uno o más espectros. En otra
forma de realización, el compuesto de ensayo se elimina del
polipéptido antes de añadir el colorante.
En otra forma de realización, el colorante está
presente con el compuesto de ensayo y la forma soluble del
polipéptido amiloide antes de inducir la agregación.
En otra forma de realización, un agregado
preformado del polipéptido amiloide se trata con un compuesto de
ensayo a efectos de determinar qué efecto tiene, si tiene alguno, el
compuesto de ensayo sobre el agregado. Este efecto puede evaluarse
poniendo en contacto el agregado con el colorante después de
incubarlo con el compuesto de ensayo.
En otra forma de realización, el propio
compuesto de ensayo puede ser una sonda espectroscópica específica
de amiloide o una molécula relacionada con propiedades cromofóricas,
y preferentemente fluorofóricas. De este modo, el compuesto de
ensayo se puede utilizar para sondar la forma agregada así como para
romper o inhibir la forma agregada.
Las técnicas espectroscópicas de UV y de
fluorescencia se pueden adaptar fácilmente a cribados de gran
volumen de información, dado que se pueden modificar de tal modo
que se basen en una única lectura para una información estructural
inmediata. Sin embargo, utilizando todas las técnicas a lo largo de
todo el espectro relevante es posible identificar cambios más
sutiles en la forma agregada que ayudarán a identificar los
compuestos prometedores de entre una colección de compuestos de
ensayo candidatos.
Aunque los ensayos se llevan a cabo in
vitro a efectos de permitir los análisis espectroscópicos, es
posible utilizar un polipéptido amiloide de cualquier fuente, es
decir, polipéptidos naturales o sintéticos. Por ejemplo, se puede
someter a ensayo fluido cefalorraquídeo, que puede contener
A\beta. En otra forma de realización se puede someter a ensayo
sangre, suero o plasma, que pueden contener uno de los diferentes
polipéptidos de amiloide. En otra forma de realización, el
polipéptido amiloide procedente de una o más de estas fuentes se
pueden aislar y ensayar en un tampón estándar, ya que los fluidos
corporales, tales como el fluido cefalorraquídeo y la sangre o los
productos sanguíneos, pueden interferir a la hora de obtener
espectros nítidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se comprenderá mejor
haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan
a título ilustrativo no limitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Existe un interés continuado para determinar el
efecto de inhibidores de molécula pequeña en la autoagregación de
péptidos amiloidogénicos y el efecto coincidente sobre la
citotoxicidad. Con este objetivo se implementaron métodos
cuantitativos de fluorescencia y métodos CD a efectos de determinar
el alcance de la fibrilación del péptido en presencia y ausencia de
rojo del Congo. Estos trabajos muestran (i) la evaluación simultánea
de la formación de la conformación en hoja \beta enroscada
utilizando cambios en la fluorescencia de tioflavina T y
espectroscopia CD; (ii) el efecto del medio en la velocidad de
agregación del péptido; (iii) la toxicidad del péptido agregado en
cultivos de células del hipocampo utilizando la liberación de LDH
como indicador; y (iv) la interacción de rojo del Congo con el
péptido en presencia de tioflavina.
\vskip1.000000\baselineskip
Espectroscopia de fluorescencia. La
tioflavina se enlaza con los fibrilos amiloides a efectos de inducir
un desplazamiento de fluorescencia hipercrómica característico en
el espectro (LeVine, J. Exp. Clin. Invest., 2:1-6,
1995). La fluorescencia inducida debida a la tioflavina es
específica para los fibrilos amiloides plegados en \beta, pero no
para otras estructuras en hoja \beta o para las formas
oligoméricas solubles del péptido. La tioflavina libre es un
fluoróforo débil con un máximo de excitación en 330 nm. Después de
enlazarse con los fibrilos amiloides, la fluorescencia de la
tioflavina aumenta con un desplazamiento hacia el rojo en el
espectro de excitación de 100 nm, en relación con la forma libre.
Hemos utilizado el aumento en la intensidad de fluorescencia para
longitudes de onda de excitación y emisión de 440 nm y 485 nm,
respectivamente, para caracterizar el acontecimiento de
agregación.
Se determinó que la fluorescencia inducida de
tioflavina se ve significativamente apagada en presencia de rojo
del Congo. En estos experimentos, la tioflavina se complejó con el
péptido agregado antes de la valoración con cantidades crecientes
de rojo del Congo. La disminución resultante de la intensidad de
fluorescencia es debida a la transferencia de energía de la emisión
de fluorescencia de la tioflavina al rojo del Congo. En
consecuencia, los ensayos que se basan sólo en la tioflavina son
propensos a generar falsos positivos en ensayos primarios, mientras
que los ensayos espectroscópicos descritos en la presente invención
pueden identificar los inhibidores más prometedores de la
amiloidogénesis.
Espectroscopia de dicroísmo circular. El
cambio conformacional del péptido desde la forma de hélice aleatoria
a la forma de hoja \beta durante el envejecimiento se controló
utilizando cambios en la elipticidad molar del péptido a 200, 218 ó
225 nm. Este ensayo también se utilizó para determinar si los
cambios en los espectros CD ocurrían concurrentemente con los
cambios en los espectros de fluorescencia de tioflavina. El espectro
CD del péptido se registró en varios puntos temporales a efectos de
correlacionar la formación de conjuntos macromoleculares enlazados
a tioflavina con la aparición de la conformación en hoja
\beta.
Ensayos espectroscópicos. A efectos de
determinar el alcance de la agregación, se extrajeron alícuotas del
péptido en diversos intervalos de tiempo (hasta nueve horas) y se
diluyeron en tioflavina 10 \muM que contenía tampón PBS. Las
concentraciones finales de péptido y tioflavina en el ensayo de
fluorescencia fueron de 10 \muM. Las intensidades de
fluorescencia del complejo péptido-tioflavina se
midieron para longitudes de onda de excitación y emisión de 435 y
485 nm respectivamente, después de que la reacción se había
equilibrado durante cinco minutos. Se llevaron a cabo barridos
espectrales de fluorescencia utilizando longitudes de onda de
excitación a 435 nm y de emisión a 485 nm utilizando un
espectrofluorímetro SPEX^{TM} fluorolog-2
(Instruments S.A.®, Jobin Yvon-Spex, Edison, New
Jersey). Para los experimentos con rojo del Congo, el complejo
péptido-tioflavina se valoró con concentraciones
crecientes de rojo del Congo desde concentraciones micromolares de
0,1 a 3,5. Los cambios en la intensidad de fluorescencia se
midieron para las longitudes de onda de espectro mencionadas
anteriormente. Cuando las intensidades de fluorescencia se midieron
en un lector de placa, el péptido se diluyó en tioflavina 10 \muM
que contenía tampón PBS hasta un volumen final de 100 \mul.
Se registraron los espectros CD en un
espectropolarímetro JASCO^{TM} modelo J715 (Jasco, Easton,
Maryland) a temperatura ambiente en una celda de 0,1 cm de
recorrido. Típicamente, se extrajeron de las muestras de péptido
alícuotas en diversos intervalos de tiempo para medir la
fluorescencia y los espectros CD se registraron utilizando la
solución restante. Los espectros CD del péptido se registraron en el
UV lejano entre 190 y 260 nm. Los resultados espectrales se
expresan como deg.cm^{3}.dmor^{-1}.
Ensayo de neurotoxicidad. Se agregó
péptido de acuerdo con los puntos finales determinados en los
ensayos CD y de fluorescencia y se aplicó a cultivos primarios de
células neuronales a efectos de evaluar la citotoxicidad del
péptido agregado. La liberación de LDH se utilizó para controlar la
viabilidad celular en presencia de A\beta y rojo del Congo.
Se evaluó la toxicidad de
A\beta(1-40) utilizando cultivos de ocho
días in vitro (DIV) de hipocampo fetal de rata (E18). Las
células se cultivaron en platos de 48 pocillos previamente
recubiertos con 500 \mul/pocillo de 0,1 mg/ml de
poli-L-lisina (100 \mul/pocillo)
y, subsiguientemente, con 100 \mul/pocillo de 5 \mug/ml de
laminina de ratón. Las células se sembraron a una densidad de 92.300
células/pocillo en un volumen total de 500 \mul de medio
NEUROBASAL^{TM} que contenía suplemento 1XB27, 15% de suero bovino
fetal inactivado por calor y calificado, glutamina 0,5 mM, 50
\mu/ml de penicilina y 0,05 mg/ml de estreptomicina, y se
colocaron inicialmente en CO_{2} humidificado al 5% en aire. Tras
24 horas, el medio se sustituyó por medio fresco con ausencia de la
penicilina, la estreptomicina y el suero bovino fetal, y los
cultivos se mantuvieron en aire con un 5% de CO_{2} y un 9% de
O_{2}. Se sustituyó el medio fresco en cada pocillo al quinto día.
Al séptimo día in vitro, el medio se sustituyó con medio
suplementado con B27 libre de antioxidante con ausencia de la
penicilina, la estreptomicina y el suero bovino fetal. El ensayo de
toxicidad se inició al octavo día in vitro sustituyendo en
cada pocillo 500 \mul del medio utilizado en el séptimo día (como
tratamiento de control) o una solución experimental preparada con el
medio final (control). Cada solución experimental se ensayó en
cultivos contenidos en cinco pocillos. La toxicidad se evaluó al
undécimo día in vitro utilizando el ensayo de deshidrogenasa
de ácido láctico (LDH; Sigma 340-UV). El péptido
agregado se diluyó cinco veces hasta una concentración final de 10
\muM para los ensayos de toxicidad. Los complejos de rojo del
Congo con agregados preformados y los formados en coagregados se
ensayaron en los ensayos celulares junto con el péptido agregado en
controles de vehículo.
Preparación del péptido amiloide. Se
adquirió A\beta(1-40) de Anaspec (San Jose,
California) y se verificó su pureza química utilizando HPLC de fase
inversa, ESI-MS y métodos de secuenciación de
proteínas. El péptido liofilizado se disolvió en
hexafluoroisopropanol (HFIP) para favorecer la desagregación del
péptido. El péptido en HFIP se guardó a -80ºC. Antes de su
utilización, la solución de péptido se descongeló y el disolvente
se evaporó bajo un flujo de nitrógeno. El péptido se disolvió en
tampón a efectos de obtener una concentración de 50 \muM, se
sonicó aproximadamente durante veinte a cuarenta segundos, se
sometió a breve efecto de vórtice, durante aproximadamente cinco
segundos o menos, para favorecer la disolución del péptido. Para
determinar los efectos del medio en las velocidades de agregación,
se disolvió el péptido en uno de los siguientes tampones: PBS, 50
mM HEPES^{TM} o en medio NEUROBASAL^{TM}. Las soluciones de
péptido se introdujeron en placas de microtitulación a una
concentración final de 45 \muM en 100 \mul. La agregación se
inició agitando continuamente las placas en un agitador
rotativo.
\vskip1.000000\baselineskip
La aparición de estructuras enlazantes de
tioflavina es concurrente con la formación de la conformación en
hoja \beta del péptido. Un pH y una fuerza iónica más elevados
favorecen la agregación del péptido (tabla 3).
Cada valor es un promedio de tres
determinaciones. ++ Indica que los agregados se formaron pero no se
cuantificaron porque no se alcanzó el punto final. El porcentaje de
agregación se calculó en relación con la fluorescencia de
tioflavina/A\beta a 0 y 4 h. El péptido se agitó en un agitador
rotativo a una velocidad de 500 rpm en este experimento. *Las
velocidades relativas de agregación son muy sensibles a la velocidad
de agitación.
El péptido amiloide cambia desde una forma de
hélice aleatoria hasta una conformación alterada en hoja \beta
después de envejecer en PBS durante nueve horas. La conformación
alterada presenta una banda de absorción CD con un amplio extremo
negativo a 225 nm. El espectro CD desplazado al rojo es debido
probablemente a la formación de estructuras en hoja \beta
plegada.
La emisión de fluorescencia de la tioflavina se
ve significativamente apagada por concentraciones nanomolares de
rojo del Congo. El alcance de este apagamiento se niveló a
concentraciones micromolares de rojo del Congo, lo que indica que
un lugar inicial del péptido está saturado. La fluorescencia de
tioflavina enlazada a péptido se vio apagada en más de un orden de
magnitud por el rojo del Congo, mientras que el efecto de
apagamiento fue únicamente del 50% en el caso de tioflavina libre.
La observación de que la intensidad de fluorescencia se vea apagada
por el rojo del Congo es consistente con la colocalización de rojo
del Congo y tioflavina en el péptido agregado.
El rojo del Congo es neuroprotector para
cultivos celulares expuestos a A\beta. El rojo del Congo
complejado con agregados preformados y en coagregados atenúa la
toxicidad de A\beta. El péptido agregado (muestras envejecidas
durante cuatro horas) es tóxico para los cultivos neuronales,
mientras que el péptido fresco no es tóxico, en 72 horas de ensayos
de toxicidad.
El ejemplo anterior ha puesto de manifiesto que
la conversión de este una hélice aleatoria a una conformación en
hoja \beta tiene lugar concurrentemente con la formación de
estructuras oligoméricas enlazantes de tioflavina del péptido. El
rojo del Congo y la tioflavina se enlazan no competitivamente con el
péptido agregado.
El péptido amiloide (A\beta) se envejeció en
ausencia y en presencia de rojo del Congo tal como se describe a
continuación: se disolvió A\beta(1-40) en
hexafluoroisopropanol 100% para producir una concentración final de
200 a 400 \muM. Para favorecer la disolución del péptido, la
solución se sonicó brevemente, durante aproximadamente cinco
segundos. Un volumen apropiado de la solución de péptido se
transfirió a un vial de ámbar y el disolvente se evaporó bajo un
flujo de nitrógeno. La película de péptido se disolvió en tampón
PBS, a pH 7,4, hasta una concentración final de 50 \muM. La
solución de péptido se sonicó durante 20 segundos y a continuación
se sometió a vórtice durante cinco segundos. Para preparar
coagregados del péptido con rojo del Congo, se añadió el colorante
al péptido hasta una concentración final de 10 \mug/ml, 20
\mug/ml ó 30 \mug/ml. Las soluciones stock del péptido (péptido
en control de vehículo y péptido más rojo del Congo) se introdujeron
en alícuotas en placas de microtitulación hasta un volumen final de
100 \mul por pocillo. La agregación se inició agitando las placas
a 500 rpm.
Para determinar el alcance de la fibrilización,
se extrajo una alícuota de las muestras que péptido y se diluyó
cinco veces en tampón PBS que contenía 10 \muM del fluoróforo
tioflavina T. La concentración final de péptido en las muestras fue
de 10 \muM. Los espectros de emisión de fluorescencia de la
tioflavina libre y de complejos péptido-tioflavina
se registraron utilizando un fluorímetro, en este caso un
fluorímetro SPEX^{TM}. El aumento de la fluorescencia de la
tioflavina T para una longitud de onda de excitación de 450 nm
(monocromador de emisión a 485 nm) indicó la formación de péptido
fibrilar. Alternativamente, se utiliza también un fluorímetro de
placa en algunos experimentos a efectos de medir el alcance de la
fibrilización. En estos experimentos, la fluorescencia de la
tioflavina T se midió en un fluorímetro TECAN^{TM} Plate (Tecan
U.S. Inc., Research Triangle Park, North Carolina) utilizando un
filtro de excitación de 440 nm y un filtro de emisión de 490
nm.
Se utilizó espectroscopia CD para determinar el
desarrollo temporal de la agregación en presencia de rojo del Congo
y la conversión del péptido desde una forma de hélice aleatoria en
el estado recién preparado hasta una forma en hoja \beta en el
estado envejecido. El envejecimiento del péptido durante nueve horas
produjo un espectro de hoja \beta desplazado al rojo, quizás
debido a la formación de estructuras en hoja \beta enroscada.
Para preparar complejos de rojo del Congo con
fibrilos preformados, el péptido envejecido se combinó con rojo del
Congo hasta concentraciones finales de 10 \mug/ml, 20 \mug/ml y
30 \mug/ml.
Se registraron espectros CD en el UV lejano de
los complejos de rojo del Congo con péptido de agregado y
coagregados de péptido, entre 200 nm y 260 nm (figura 1). El
extremo negativo a 200 nm indica una conformación de hélice
aleatoria del péptido fresco.
El envejecimiento indujo un cambio
conformacional a una forma en hoja \beta. El espectro CD del
péptido envejecido en ausencia de rojo del Congo consistió en un
extremo negativo a 225 nm y un extremo positivo a 205 nm. Esta
absorción negativa desplazada al rojo a 225 nm es debida
probablemente a la formación de estructuras en hoja \beta
enroscada. Este espectro CD desplazado al rojo de los agregados
preformados del péptido no se vio alterado por la complejación con
rojo del Congo.
En contraste con el espectro CD de los agregados
preformados, el espectro CD del péptido envejecido en presencia de
rojo del Congo (coagregados) consistió en una banda de absorción CD
negativa alrededor de 218 nm debido al plegado del péptido en una
conformación en hoja \beta típica. El espectro CD también puso de
manifiesto contribuciones crecientes desde la forma de hélice
aleatoria en los coagregados, lo que sugirió que la velocidad de
agregación se ralentizó en presencia de rojo del Congo. Las
diferencias en el espectro CD de las dos formas del péptido eran
debidas a un aumento de la forma de hélice aleatoria en los
coagregados y también a la formación de estados alterados de
agregación del péptido.
Los espectros CD en el UV cercano de las
muestras de péptido se registraron entre 700 y 300 nm. Esta región
resulta útil en la diferenciación de los complejos de rojo del
Congo. El péptido solo en tampón y rojo del Congo no produjo
ninguna señal CD apreciable en la región del UV cercano. Las
diferencias en los espectros CD de los coagregados y los agregados
preformados fueron evidentes en la intensidad y la longitud de onda
de absorción máxima; el espectro CD de los coagregados fue más débil
que el espectro CD de los agregados preformados (figura 2; véase
tabla 2). El espectro CD de los complejos preagregados del péptido
con rojo del Congo consistieron en una absorción negativa a 580 nm
y una banda de absorción positiva a 516 nm. La intensidad de las
bandas CD fue proporcional a la concentración de los complejos. El
espectro CD de los coagregados consistió en una banda positiva
centrada en 545 nm. Las diferencias en los espectros de los
complejos son debidas a la formación de diferentes estados de
complejación del rojo del Congo. Los espectros CD acoplados a
excitón indican la complejación del rojo del Congo con una
conformación ordenada en hoja \beta del péptido.
Se utilizó análisis espectral de UV para
diferenciar los espectros de absorción de los dos complejos de
péptido de agregado y coagregados con rojo del Congo.
La figura 3 muestra la diferencia en los
espectros de los complejos de rojo del Congo con polipéptido medidos
frente a péptido envejecido, siendo dichos complejos en el primer
caso coagregados de péptido amiloide con rojo del Congo y, en el
segundo, rojo del Congo complejado con un agregado de polipéptido
preformado. Dado que la concentración total de rojo del Congo es la
misma en los dos complejos, las diferencias en las intensidades de
absorción sugieren que el complejo con un agregado preformado es
hipercrómico con respecto al coagregado.
La figura 4 muestra que la diferencia en los
espectros de los complejos de rojo del Congo, coagregado y agregado
preformado medidos frente a una concentración equivalente de rojo
del Congo libre está centrada alrededor de 480 nm, mientras que los
máximos de absorción de las formas complejadas están desplazadas a
longitudes de onda ligeramente más elevadas. En consecuencia, el
pico de absorción negativa de la figura 4 centrado alrededor de 480
nm es debido al agotamiento del rojo del Congo debido a su
enlazamiento al polipéptido amiloide. De forma similar, un pico de
absorción positiva centrado alrededor de 530 nm, particularmente en
el caso del complejo de rojo del Congo con agregado preformado, es
debido a un cambio en la propiedad de absorción del rojo del Congo
tras la complejación. Este complejo tiene un máximo de absorción
centrado en 530 nm, mientras que el máximo de absorción del
coagregado alcanza un máximo en 530 nm y mantiene la propiedad de
absorción más allá de 530 nm. Los espectros de absorción de los
coagregados y los complejos preformados diferencian por lo tanto
las propiedades intrínsecas de absorción del rojo del Congo en los
coagregados y los complejos preformados con respecto al estado
libre. Las diferencias en los espectros de absorción son debidas a
los cambios en el entorno del estado enlazado a péptido del rojo
del Congo en relación con el estado no complejado. Estos cambios
espectrales en el rojo del Congo están inducidos probablemente por
los cambios en el estado electrónico o las propiedades electrónicas
del rojo del Congo.
Los espectros de emisión de fluorescencia de los
complejos de rojo del Congo se obtuvieron después de diluir el
péptido cinco veces en una solución tamponada. Se añadió rojo del
Congo a péptido fibrilar recién diluido y se registró el espectro
de fluorescencia hasta una concentración final de 10 \muM de
péptido. Las concentraciones de péptido y rojo del Congo en el
ensayo de fluorescencia fueron de 10 \muM y 8,6 \muM
respectivamente. Las diferencias en las intensidades de
fluorescencia y las longitudes de onda de emisión de los coagregados
y los complejos agregados preformados fueron debidas a las
diferencias relativas en la hidrofobia de los lugares de enlace en
los dos casos.
Los resultados espectroscópicos descritos en
este ejemplo ponen de manifiesto que los inhibidores de amiloide
tales como el rojo del Congo forman diferentes complejos con el
péptido amiloide. Mientras que estos complejos atenúan la
neurotoxicidad del péptido, la utilización médica de estas
sustancias se debe evaluar de acuerdo con el estadio de la
enfermedad. Los resultados descritos han puesto de manifiesto que el
rojo del Congo se enlaza al péptido agregado y en consecuencia
atenúa su toxicidad.
Mientras que el rojo del Congo no inhibe
completamente la conversión desde la forma de hélice aleatoria del
péptido a la forma en hoja \beta, los resultados descritos
anteriormente han puesto de manifiesto que el rojo del Congo
estabiliza una forma agregada intermedia del péptido amiloide. Los
inhibidores que producen estos efectos se deben evaluar
cuidadosamente en cuanto a su actividad in vitro en modelos
de enfermedad de Alzheimer a efectos de determinar si dichas
sustancias pueden ser administradas para una acción terapéutica o
profiláctica. Los métodos espectroscópicos descritos en la presente
memoria se pueden utilizar para identificar y diferenciar
inhibidores de amiloidogénesis y para determinar el mecanismo de
acción molecular de los inhibidores antiagregación que se avanzarán
como agentes contra el Alzheimer en los programas de desarrollo de
fármacos, así como otros inhibidores potenciales de la
fibrilogenesis amiloidogénica asociada con otras enfermedades o
desórdenes.
La presente invención no se debe considerar
limitada en su alcance por las formas de realización específicas
descritas en la presente memoria. De hecho, diversas modificaciones
de la presente invención, además de las descritas en la presente
memoria, se pondrán de manifiesto para los expertos en la materia a
partir de la anterior descripción y de las figuras adjuntas. Dichas
modificaciones se consideran dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
Se debe entender asimismo que todos los valores
de tamaños de bases o tamaños de aminoácidos y todos los valores de
pesos moleculares o masas moleculares son aproximados y se indican
únicamente a título descriptivo.
Claims (25)
1. Procedimiento para determinar una
conformación de agregación de un polipéptido amiloide, cuyo
procedimiento comprende comparar:
- (a)
- una propiedad espectroscópica de un complejo de una sonda espectroscópica específica de amiloide complejada con un polipéptido amiloide que presenta una conformación de agregación indeterminada; y
- (b)
- una propiedad espectroscópica predeterminada de la sonda espectroscópica específica de amiloide complejada con un polipéptido amiloide que presenta una conformación de agregación conocida,
en el que la conformación de agregación del
polipéptido amiloide que presenta la conformación de agregación
desconocida se determina mediante dicha comparación.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la sonda espectroscópica específica de amiloide es un
colorante que se enlaza a amiloide.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el colorante que se enlaza a amiloide es un colorante diazo
sulfonado o un análogo del mismo.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, en
el que el colorante diazo sulfonado es rojo del Congo.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la sonda espectroscópica específica de amiloide es un
péptido marcado con un fluoróforo.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido amiloide es un péptido
\beta-amiloide (A\beta).
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia de dicroismo circular (CD) en el ultravioleta lejano
(UV) del polipéptido amiloide.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en el ultravioleta cercano
(UV) del colorante diazo sulfonado.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia en el ultravioleta (UV).
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia de fluorescencia.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido amiloide se agrega en una forma fibrilar.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido amiloide se coagrega con la sonda
espectroscópica específica de amiloide.
13. Procedimiento para detectar el efecto de un
compuesto de ensayo sobre la inhibición, la disrupción o la
desagregación de un amiloide, cuyo procedimiento comprende la
correlación de una propiedad espectroscópica de (a) un complejo de
una sonda espectroscópica específica de amiloide y un polipéptido
amiloide agregado puesto en contacto con un compuesto de ensayo y
(b) con una propiedad espectroscópica predeterminada de un complejo
de la sonda espectroscópica específica de amiloide en ausencia de
compuesto de ensayo, indicando una diferencia en las propiedades
espectroscópicas que el compuesto de ensayo tiene un efecto sobre la
formación o la estabilidad del amiloide.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que la sonda espectroscópica específica de amiloide se pone en
contacto con un agregado de polipéptido amiloide preformado.
15. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que la sonda espectroscópica específica de amiloide se coagrega
con el polipéptido amiloide.
16. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que la sonda espectroscópica específica de amiloide es un
colorante que se enlaza a amiloide.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en
el que el colorante que se enlaza a amiloide es un colorante diazo
sulfonado o un análogo o del mismo.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que el colorante diazo sulfonado es rojo del Congo.
19. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que la sonda espectroscópica específica de amiloide es un
péptido marcado con un fluoróforo.
20. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que el polipéptido amiloide es un péptido
\beta-amiloide (A\beta).
21. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia de dicroismo circular (CD) en el ultravioleta lejano
(UV) del polipéptido amiloide.
22. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia de dicroísmo circular (CD) en el ultravioleta cercano
(UV) del colorante diazo sulfonado.
23. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia en el ultravioleta (UV).
24. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que las propiedades espectroscópicas se evalúan utilizando
espectroscopia de fluorescencia.
25. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que el polipéptido amiloide se agrega en una forma fibrilar.
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