ES2893322T3 - Biosensor para el análisis de conformación y estructura secundaria - Google Patents
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Abstract
Elemento sensor de infrarrojos para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad, en el que dicho elemento sensor de infrarrojos comprende un elemento de reflexión interna de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo, que proporciona más de un paso de la luz infrarroja a través del elemento de reflexión, en el que el elemento de reflexión interna de germanio es transparente en el infrarrojo con una relación señal- ruido suficiente para detectar la banda de amida I de las diferentes conformaciones en un fluido complejo, y al menos un receptor para la proteína biomarcadora que es un anticuerpo que puede unirse específicamente a la proteína biomarcadora candidata independientemente de la conformación de la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata, en el que el anticuerpo se injerta directamente a al menos una superficie de dicho elemento de reflexión interna de germanio mediante silanización con grupos de unión de silano o mediante tiolación con grupos de unión de tiol, haciendo reaccionar grupos amina accesibles libremente de dicho al menos un receptor con grupos reactivos con amina en los grupos de unión de silano/tiol, y bloqueando los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de silano/tiol con caseína, en el que dichos grupos de unión de silano o grupos de unión de tiol tienen una longitud de cadena de no más de 20 átomos, en el que la proteína biomarcadora candidata es el péptido beta-amiloide y el anticuerpo puede unirse específicamente y de manera conformacionalmente independiente al epítopo central del péptido beta-amiloide, o la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína y el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al péptido alfa-sinucleína sin especificidad conformacional.
Description
DESCRIPCIÓN
Biosensor para el análisis de conformación y estructura secundaria
La invención proporciona un biosensor para el análisis de conformación y estructura secundaria, en particular para el análisis directo, no invasivo, cualitativo de la estructura secundaria de una proteína seleccionada individual dentro de una mezcla compleja, tal como por ejemplo un fluido corporal, mediante métodos espectroscópicos vibracionales. Para el análisis no se requiere que la sustancia seleccionada se aísle, se concentre o se pretrate mediante un procedimiento preparativo especial. La invención proporciona además métodos para la preparación del biosensor de la invención y usa los mismos. La invención proporciona además métodos para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata.
Antecedentes de la invención
Los métodos cuantitativos para la detección de moléculas candidatas de biomarcador en fluidos corporales son los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), la espectroscopía de resonancia de plasmón superficial (SPR), el análisis de distribución de intensidad de fluorescencia de superficie (sFIDA) o las técnicas de espectroscopía de masas. Estas técnicas no proporcionan información directa sobre la estructura secundaria de los analitos. Los métodos basados en anticuerpos como ELISA o SPR pueden complementarse con anticuerpos sensibles a la conformación, de modo que pueda derivarse indirectamente la información de estructura de una conformación en particular. (I. Morgado et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 109(31): 12503-12508 (2012); Venkataramani et al., JAD 29(2):361-371 (2012)). Usando estos anticuerpos sensibles a la conformación, los estudios han demostrado que sólo se detectaba la estructura secundaria específica. Por tanto, no es posible una discriminación de la muestra basándose en la composición estructural específica de un compuesto analizado; todas las conformaciones detectables están presentes en muestras naturales, pero la composición varía por ejemplo en una enfermedad. La discriminación descrita más adelante requiere un anticuerpo independiente de la estructura, porque la señal registrada tiene que reflejar diferencias de concentración de las estructuras observadas. sFIDA detecta dímeros u oligómeros biomarcadores candidatos mediante el uso de anticuerpos de inmovilización y detección idénticos. Sin embargo, sFIDA no detecta información de estructura (S. Funke et al., Rejuvenation Res., 13(2-3):206-209 (2010)). Se han descrito con frecuencia el análisis de la estructura secundaria de proteínas mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR-) y el análisis de proteínas recombinantes o purificadas después de la inmovilización en superficies de sensores de reflexión total atenuada (ATR-) particulares (J. Ollesch et al., Appl. Spectrosc., 61(10): 1025-1031 (2007); K. Elfrink, J. Ollesch et al., Proc Natl Acad Sci, 105(31):10815-10819 (2008); Frost et al., J. Biol. Chem., 284(6):3546-3551 (2009); S. Funke et al., J. Biol. Chem., 280(10):8912-7 (2005)). Ya se han publicado el análisis de la estructura secundaria mediante espectroscopía FTIR de ácidos nucleicos como el ARN. (E. Brauns y R. B. Dyer, Biophys. J., 89(5):3523-3530 (2005)). En el estado actual de conocimiento científico y técnico, hasta la fecha no se ha informado de ningún análisis de estructura secundaria de componentes a partir de fluidos complejos como suero, plasma sanguíneo o líquido cefalorraquídeo sin aislamiento previo. La detección selectiva de componentes específicos de un fluido corporal complejo mediante la aplicación de un sensor de flujo continuo de ATR constituye un nuevo desarrollo innovador. Hasta ahora, esta técnica sólo se aplicaba a proteínas aisladas. Los elementos de reflexión interna (IRE) de los sensores de ATR consisten normalmente en materiales permeables al infrarrojo con un alto índice de refracción. Estos incluyen seleniuro de cinc, silicio, germanio o diamante. Las proteínas se inmovilizan en estas superficies a través de lípidos unidos (K. Elfrink, L. Nagel-Steger y D. Riesner, Biol. Chem., 388(1):79-89 (2007); K. Elfrink, J. Ollesch et al., PNAS 2008; J. Guldenhaupt et al., The FEBS Journal, 275(23):5910-5918 (2008); C. Kotting et al., Chemical Physics, 396:72-83 (2012); P. Pinkerneil et al., Chemphyschem, 13(11):2649-2653 (2012)), química de tiol en superficies de oro aisladas químicamente o depositadas en fase de vapor (Ataka et al., J. Am. Chem. Soci., 126(49):16199-16206 (2004); A. Badura et al., Photochem. and Photobiol., 82(5): 1385-1390 (2006)) o silanos (B. M. Smith et al., Langmuir, 20(4): 1184-1188 (2004); S. Devouge et al., Bioorg. & Med. Chem. Lett., 15(13): 13252-13256 (2005); P. W. Loscutoff y S. F. Bent, Ann. Rev. Physical Chemistry, 57(1):467-495 (2006); J. Matijasevic et al., Langmuir, 24(6):2588-2596 (2008); S. Devouge et al., Journal of Colloid and Interface Science, 332(2):408-415 (2009); J. Schartner et al., J. Am. Chem. Soci., 135(10):4079-4087 (2013); documento EP 2490029; A. Vab Cauwenberge et al., Science for sustainable development, documento XP055130416, páginas 1 - 111 (2012); E. Kleiren, These université libre de bruxe (2013)). En este proceso, se ha descrito la inmovilización de anticuerpos u otras proteínas en otros semiconductores distintos del germanio (P. Hofer y Fringeli, Biophysics of Structure and Mechanism, 6(1):67-80 (1979); S. Lofas y B. Johnsson, J. Chem. Soc., Chem. Comm. (21): 1526 (1990); B. Byrne et al., Sensors (Basilea, Suiza), 9(6):4407-4445 (2009); M. Punzet et al., Nanoscale, 4(7):2431 (2012)). Los inventores han sintetizado reactivos relevantes para la invención. Se publicaron los silanos básicos (J. Schartner et al., J. Am. Chem. Soc., 135(10):4079-4087 (2013)), pero la aplicación principal, la inmovilización de anticuerpos a través de residuos de lisina libres y trietoxisilanos de cadena corta, no se ha descrito hasta ahora. Se ha informado de la inmovilización de anticuerpos a través de lisinas proteinogénicas en otro éster de succinimidilo (S. Lofas y B. Johnsson, J. Chem. Soci., Chem. Comm. (21):1526 (1990); documentos EP-B-1214594 y W02000070345). Sin embargo, no se realizó el análisis mediante espectroscopía IR, por lo que no se realizó el análisis de la estructura secundaria de proteínas. No se ha informado del uso de trialcoxisilanos de cadena corta funcionalizados (tal
como el éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido N-(4,4,4-trietoxisilanbutil)succinámico) para la inmovilización covalente de proteínas.
En un enfoque adicional, los ATR-IRE se silanizaron y se acoplaron con biotina dando como resultado un sensor de avidina/estreptavidina sin ningún análisis de estructura secundaria (M. Voue et al., Langmuir, 23(2):949-955 (2007)). En este caso, la superficie del sensor se modificó en un flujo de trabajo más complejo y a través de productos químicos agresivos, que pueden influir y cambiar la estructura secundaria del analito. Se demostró que la preparación presentada no es apropiada para generar el sensor propuesto para el análisis de una proteína seleccionada en un fluido corporal complejo en condiciones fisiológicas (Kleiren et al., Spectroscopy-An International Journal, 24 (1-2, SI): 61-66. (2010)). Además de Voue (M. Voue et al., Langmuir, 23(2):949-955 (2007); S. Devouge et al., Journal of Colloid and Interface Science, 332(2):408-415 (2009)), los documentos 02/056018 y EP-A-1806574 dan a conocer un elemento óptico adecuado para el análisis de interacciones ligando-receptor.
El documento WO 02/056018 se refiere explícitamente a un dispositivo para la investigación de interacciones de ligando con un receptor, que consiste en un elemento de reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y del cual al menos una superficie se activa químicamente por oxidación, hidroxilación o reducción y se injerta covalentemente con un derivado de silano de cadena larga que puede inmovilizar el receptor. El elemento de reflexión interna total atenuada está compuesto por un material seleccionado de germanio, silicio, ZnSe, ZnS y AM-TIR. El dispositivo es adecuado para estudiar interacciones ligando-receptor. Además, el documento WO 02/001202 menciona la combinación de ATR-espectroscopía de IR con radiación polarizada y mediciones refractométricas. El documento EP-A-1806574 da a conocer un dispositivo adecuado para la investigación de interacciones ligando-receptor, en particular para la investigación de una interacción analito-diana, tal como moléculas biológicas y químicas y componentes orgánicos y su interacción con superficies, que consiste en un elemento de reflexión interna total atenuada, transparente en el infrarrojo y del cual al menos una superficie está reducida e injertada covalentemente con un alqueno que puede inmovilizar el receptor, en el que dicho alqueno está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados de alquilo, haloalquilo, halo, alquenilo, ciano, epoxi, tio, amino, hidroxilo, isociano, isotiociano, carboxilo, polialcoxilo, alquilarilsulfoxi-polialcoxilo o heteroariloxi-carbonilaquil-polialcoxilo. El elemento de reflexión interna total atenuada está compuesto por germanio, en particular un cristal que tiene una geometría trapezoidal, semicilíndrica, en forma de fibra o varilla, o forma poliédrica. El dispositivo es adecuado para estudiar interacciones ligando-receptor, en particular moléculas biológicas o componentes orgánicos o sus interacciones o complejaciones o reacciones con moléculas biológicas o componentes orgánicos o moléculas solubles en agua en o en la molécula orgánica injertada.
Los documentos WO 02/001202 y US2012/0309943 dan a conocer la generación principal de un soporte de anticuerpo, por ejemplo, mediante silanos.
El documento WO 07/131997 se refiere a una configuración de medición de ATR-IR, en la que la muestra se sostiene a una distancia específica de la superficie de ATR sin contacto directo. Se utiliza como espaciador un medio espectroscópicamente inerte.
La espectroscopía convencional requiere una preparación de múltiples etapas de muestras complejas, para aislar el analito individual en una alta concentración para el análisis. Las estructuras secundarias pueden cambiar durante la preparación.
Los métodos de SPR y ELISA cuantifican componentes específicos con alta sensibilidad en medios complejos, pero no pueden recopilar información de estructura secundaria. Se trata de métodos altamente sensibles, pero puramente cuantitativos. Los anticuerpos conformacionalmente sensibles (lo que implica especificidad conformacional) generalmente son insensibles a los estados de transición de la estructura del analito (S. A. Funke, International Journal of Alzheimer's Disease, 2011: 1-8 (2011); K. A. Bruggink et al., Analytical Biochemistry, 433 (2): 112-120 (2013)), que sin embargo son relevantes para una enfermedad (I. Benilova et al., Nature Neuroscience, 15 (3): 349-357 (2012)).
Los materiales compatibles con IR indicados para la unión de anticuerpos comprenden silicio, diamante y germanio. El silicio absorbe la radiación IR en el rango de huellas espectrales analizadas. El diamante es un material caro que impide la realización de áreas de detección más grandes para una mayor sensibilidad. Los índices de refracción del silicio y el diamante son más bajos que los del germanio, lo que se refleja en una menor relación señal/ruido en comparación con este último.
Mediante la selección de anticuerpos idénticos para la captura y detección, sFIDA es sensible a agregados di- u oligoméricos (L. Wang-Dietrich et al., JAD, 34(4): 985-994 (2013)). La estructura secundaria no se analiza directamente.
El análisis de estructura secundaria de las proteínas es una aplicación convencional de una serie de técnicas (espectroscopía de dicroísmo circular UV/Vis, espectroscopía IR, espectroscopía de RMN). En conjunto, se requieren proteínas altamente puras y concentradas para el análisis.
En los documentos EP-A-1806574 y WO 02/056018 se dan a conocer la inmovilización de proteínas por medio de silanos para el análisis de interacciones receptor-ligando exclusivamente. Por tanto, se consideraron las reacciones de y con la proteína unida. No se consideró el análisis de la estructura secundaria de ligandos adicionales de las proteínas unidas.
Un diagnóstico fiable de la enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas más relevante conocida, el Alzheimer, requiere en la actualidad un estado avanzado de la enfermedad. El análisis de biomarcadores actual se basa en ELISA cuantitativo. Se cree que la transición estructural de por ejemplo el péptido beta-amiloide (Ap) durante la progresión de la enfermedad se inicia mucho antes que los síntomas clínicos del paciente. Teniendo esto en cuenta, el análisis estructural del candidato de biomarcador no sólo ofrece potencial para complementar los diagnósticos establecidos, sino que, lo que es aún más importante, puede permitir un momento más temprano para el diagnóstico. Por tanto, una terapia puede comenzar antes, garantizando una calidad de vida más prolongada.
Breve descripción de la invención
El alcance de la invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención proporciona un análisis directo de la estructura secundaria de componentes selectivos a partir de un fluido corporal complejo sin aislamiento o concentración previos. Se basa en un elemento sensor que tiene anticuerpos inmovilizados directamente sobre el mismo por medio de grupos de unión cortos de silano o tiol, en particular una superficie de germanio donde el anticuerpos se unen covalentemente por medio de un enlace peptídico a grupos de unión inmovilizados de trietoxisilano o tiol. La unión inmunológica hace que la superficie de germanio sea altamente específica para sustancias selectivas, de manera similar a los métodos de ELISA. Las sustancias capturadas se analizan mediante espectroscopía infrarroja para la estructura secundaria particular. Puede cuantificarse el plegamiento incorrecto potencialmente de pronóstico. Con el método, puede especificarse la estructura secundaria del biomarcador dentro de un fluido corporal complejo. El diseño del sensor permite un control paralelo con una técnica espectroscópica alternativa, por ejemplo espectroscopía de fluorescencia. La alta especificidad determinada inmunológicamente para una sustancia permite el análisis directo de la estructura secundaria de biomarcadores seleccionados de fluidos complejos, como por ejemplo líquido cefalorraquídeo (LCR) o sangre, sin pretratamiento.
La invención por tanto proporciona:
(1) Un elemento sensor de infrarrojos para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad, en el que dicho elemento sensor de infrarrojos comprende un elemento de reflexión interna de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo, que proporciona más de un paso de la luz infrarroja a través del elemento de reflexión,
en el que el elemento de reflexión interna de germanio es transparente en el infrarrojo con una relación señalruido suficiente para detectar la banda de amida I de las diferentes conformaciones en un fluido complejo, y al menos un receptor para la proteína biomarcadora que es un anticuerpo que puede unirse específicamente a la proteína biomarcadora candidata independientemente de la conformación de la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata,
en el que el anticuerpo se injerta directamente a al menos una superficie de dicho elemento de reflexión interna de germanio mediante silanización con grupos de unión de silano o mediante tiolación con grupos de unión de tiol, haciendo reaccionar grupos amina accesibles libremente de dicho al menos un receptor con grupos reactivos con amina en los grupos de unión de silano/tiol, y bloqueando los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de silano/tiol con caseína, en el que dichos grupos de unión de silano o grupos de unión de tiol tienen una longitud de cadena de no más de 20 átomos, en el que la proteína biomarcadora candidata es el péptido beta-amiloide y el anticuerpo puede unirse específicamente y de manera conformacionalmente independiente al epítopo central del péptido beta-amiloide, o la proteína biomarcadora candidata es alfasinucleína y el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al péptido alfa-sinucleína sin especificidad conformacional.
(2) La invención proporciona además un dispositivo para el análisis directo de la cantidad y la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad, comprendiendo dicho dispositivo el sensor de infrarrojos de la invención.
(3) La invención proporciona además un método para la preparación del elemento sensor de infrarrojos de la invención con un grupo de unión de silano que comprende las etapas de:
(a) activación de superficie de al menos una superficie del elemento de reflexión interna de germanio en forma de trapezoide o paralelogramo mediante oxidación,
(b) injertar grupos de unión de silano a la superficie activada obtenida en la etapa (a),
(c) acoplar covalentemente el anticuerpo al elemento de reflexión interna de germanio por medio del grupo reactivo con amina de los grupos de unión de silano, y
(d) bloquear los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de silano con caseína.
(4) La invención proporciona además un método para la preparación del elemento sensor de infrarrojos de la invención con grupos de unión de tiol que comprende las etapas de:
(a) activación de superficie de al menos una superficie del elemento de reflexión interna de germanio en forma de trapezoide o paralelogramo mediante la reacción con HF,
(b) injertar grupos de unión de tiol a la superficie activada obtenida en la etapa (a), y
(c) acoplar covalentemente el anticuerpo al elemento de reflexión interna de germanio por medio del grupo reactivo con amina de los grupos de unión de tiol, y
(d) bloquear los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de tiol con caseína.
(5) La invención proporciona además un uso del elemento sensor de infrarrojos de la invención, o el dispositivo de la invención para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad en un fluido complejo, en el que un desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la progresión de la enfermedad,
en el que la proteína biomarcadora candidata es beta-amiloide y el desplazamiento del máximo de la banda de amida I del péptido beta-amiloide a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm-1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Alzheimer, o en el que la proteína biomarcadora candidata es alfasinucleína y en el que un desplazamiento descendente del máximo de la banda de amida I del péptido alfasinucleína a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm-1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
(6) La invención proporciona además un método para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad en un fluido complejo, que comprende las etapas de
(a) conducir, en una celda de IR que comprende el elemento sensor de infrarrojos de la invención, un flujo de proteínas biomarcadoras candidatas potenciales para el receptor en la superficie de dicho sensor de infrarrojos; (b) enviar un haz de IR a través de dicha celda y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo en el que el espectro obtenido tiene una relación señal-ruido suficiente para resolver la banda de amida I; y
(c) analizar el desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora para determinar una composición de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de
la proteína biomarcadora candidata, en el que un desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la progresión de la enfermedad, en el que la proteína biomarcadora candidata es beta-amiloide y el desplazamiento del máximo de la banda de amida I del péptido beta-amiloide a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm-1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Alzheimer, o
en el que la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína y en el que un desplazamiento descendente del máximo de la banda de amida I del péptido alfa-sinucleína a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm_1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
El elemento sensorial óptico de la invención permite el análisis directo de sustancias específicas, particularmente la estructura secundaria de proteínas, con al menos espectroscopía infrarroja y opcionalmente de fluorescencia, sin necesidad de aislar o concentrar la sustancia/proteína. Esto implica que especialmente los candidatos de biomarcador de enfermedad se analizan no sólo cuantitativamente, sino en particular con respecto a la estructura secundaria. Considerando las enfermedades de proteína de plegamiento incorrecto de proteínas como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o corea de Huntington, esta información está relacionada de manera crucial con la progresión de enfermedad.
La ventaja del método de la invención es la detección directa de la estructura secundaria de moléculas candidatas de biomarcador a partir de fluidos complejos no procesados, particularmente fluidos corporales nativos. No es necesario el aislamiento y la concentración de las sustancias que van a detectarse, es parte del sensor y de la técnica de detección. En cambio, los anticuerpos sensibles a la conformación usados en otras técnicas no pueden determinar cuantitativamente la composición de la estructura secundaria. Además, tienen una menor especificidad frente a elementos de estructura secundaria individuales. El elemento sensor de la invención es adecuado para experimentos de control paralelo, por ejemplo con técnicas de fluorescencia.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Vista esquemática del dispositivo sensor en la cámara de muestra de un espectrómetro IR (A), vista detallada de la cámara de muestra (B), y esquemas del flujo a través de la cubeta (C).
Figura 2: Flujo optimizado a través de la cubeta en detalle. El dispositivo está preparado para un análisis paralelo con técnica óptica alternativa a través de una ventana de cuarzo en la cubierta. Los elementos de la junta de estanqueidad, los puertos de entrada y salida se optimizaron con respecto a la estabilidad y el flujo.
Figura 3: Se unió covalentemente trietoxisilano de cadena corta (éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido N-(4,4,4-trietoxisilanbutil)succinámico) al germanio (A). El éster de succinimidilo reacciona con aminas libres de por ejemplo lisinas proteinogénicas, lo que conduce a una unión estable de la proteína deseada, por ejemplo, un anticuerpo, del cual se muestra la cadena lateral de lisina unida (B). Como grupo de unión alternativo, el éster de NHS del ácido 12-mercaptododecanoico también se unió covalentemente al germanio (C). El éster de NHS reacciona con aminas libres de por ejemplo lisinas proteinogénicas, formando también un enlace covalente (D). Figura 4: Análisis microscópico de fluorescencia del experimento. En el silano reactivo (A), no se detectó fluorescencia (B), pero se unieron anticuerpos 8G7-FITC (C). La unión del anticuerpo de detección 1E8 (D) no aumenta la fluorescencia (E). La superficie bloqueada con caseína (F) no muestra fluorescencia (G) ni se une al anticuerpo de detección 8G7-FITC (H). Sólo el péptido Ap inmovilizado específicamente (en este caso: AP1-42, I) captura el anticuerpo 8G7-FITC (J).
Figura 5: Las bandas marcadoras de amida I de la absorbancia de infrarrojos de los péptidos Ap, que se usan para la discriminación de pacientes de control no neurodegenerativo de pacientes con enfermedad de Alzheimer con la invención. Los péptidos Ap sintéticos aislados en conformación fibrilar monomérica “sana” (línea continua), oligomérica “patológica” (línea discontinua) y “patológica” (línea de puntos) (A) fueron capturados por el anticuerpo 1E8 en la superficie de ATR. La composición de la estructura secundaria difiere inequívocamente. La banda de amida I de la fracción de Ap oligomérica a partir de LCR humano capturada con el anticuerpo KW1 (B, línea discontinua) difiere de la fracción fibrilar nativa capturada con el anticuerpo B10 (C, línea de puntos). Ambas reflejan la variedad conformacional natural en comparación con las muestras sintéticas. Las fracciones de Ap a partir de LCR sin procesar de 14 controles (línea continua) y 9 pacientes con enfermedad de Alzheimer (línea de puntos), capturadas con el anticuerpo A8978 conformacionalmente independiente (D), difieren menos que los péptidos sintéticos en conformaciones definidas. No obstante, la separación es única: todos los máximos de amida I de control están por encima de 1643 cm-1, todos los pacientes con Alzheimer están por debajo (línea de separación). Incluso más pronunciado, el promedio aritmético de los espectros de clase indica las diferentes posiciones de la banda (E).
Figura 6: La posición de la banda de amida I permite una discriminación única del control de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (A). Un LDA de clasificación con función de separación cuadrática calculada con valores de extinción a 1647 y 1640 cm-1 confirmó estos hallazgos (B).
Figura 7: Los máximos de la banda de amida I de las fracciones del péptido Ap de plasma sanguíneo estabilizado con EDTA obtenidas de un paciente de control y un paciente con enfermedad de Alzheimer discriminan de manera idéntica a Ap de LCR (figura 5E). El anticuerpo A8978 se unió mediante el éster de NHS del ácido 12-mercaptododecanoico al Ge-I RE.
Figura 8: Relación señal/ruido (S/N) de amida I (cuadrados negros) y bandas de amida II (círculos grises) de péptidos Ap sintéticos.
Figura 9: Las bandas de amida I promedio de 37 pacientes con AD y 63 pacientes de control no neurodegenerativos detectadas en el LCR (A) indican un claro desplazamiento descendente de frecuencia en las muestras de pacientes con AD. Usando un umbral de frecuencia como discriminador, la curva ROC indicó un AUC de 0,93 (B).
Figura 10: Las bandas de amida I promedio de 35 pacientes con AD y 61 pacientes de control no neurodegenerativos detectadas a partir de plasma sanguíneo (A) indican un desplazamiento descendente de
frecuencia similar en las muestras de pacientes con AD detectado en el LCR. Usando un umbral de frecuencia como discriminador, la curva ROC indicó un AUC de 0,85 (B).
Figura 11: Distribución de las posiciones máximas de la banda amida I registradas de LCR (A) y muestras de plasma sanguíneo (B). Los rombos de color representan muestras de pacientes de control, los rombos en blanco, los casos de AD. Las distribuciones normales gaussianas se aproximaron bien a los datos del histograma mostrados. Se muestran cuantiles del 25/50/75% en diagramas de cajas. Estos indican además la posición promedio de la banda (cuadrado), desviación estándar (DE, bigotes) y valores mínimos/máximos observados (x). Una línea discontinua indica la posición de umbral discriminativo de 1643 cm-1.
Figura 12: La banda de amida I detectada a partir de LCR de dos pacientes con el sensor preparado con grupos de unión de tiol en lugar de grupos de unión de silano del AcM A8978 muestra características de banda idénticas para la separación de clases de enfermedad (línea mixta).
Figura 13: (A) Los sensores no bloqueados se unieron fácilmente la alfa-sinucleína o albúmina de muestras puras (elementos sensores independientes) y permanecieron receptivos para los péptidos Ap de una disolución pura en la aplicación en serie de estas proteínas (línea de puntos: señal combinada de albúmina y alfasinucleína). (B) Un sensor bloqueado no mostró unión detectable de alfa-sinucleína y albúmina. Sólo se detectaron péptidos Ap después de la aplicación en serie.
Figura 14: Bandas de amida I y II obtenidas con un elemento sensor bloqueado (línea discontinua, gris) y un elemento sensor no bloqueado (línea continua, negra) después de la incubación con LCR de un paciente con AD confirmada.
Figura 15: Bandas de amida I y II obtenidas con el sensor después de la incubación con medio de cultivo celular acondicionado y aclarados consecutivos. El bloqueo de la superficie con caseína dio como resultado el patrón de bandas y las intensidades esperados de los péptidos Ap (A) en su mayoría de hélice alfa (A). Usando albúmina en lugar de caseína, una mayor intensidad de señal y un patrón de bandas irregular indican contribuciones espectrales superpuestas de sustancias no deseadas (B).
Figura 16: Bandas de amida I obtenidas con diferentes anticuerpos en un sensor bloqueado de la fracción Ap en LCR de control (línea continua, negra) y pacientes con AD (línea discontinua, gris). 1E8 reconoció un epítopo N-terminal (A). KW1 capturó péptidos Ap oligoméricos (B). B10 seleccionó fibrillas (C).
Figura 17: La fracción de alfa-sinucleína transmitida por el suero sanguíneo capturada con el anticuerpo 4B12 mostró una transición conformacional similar en muestras de sangre de control (línea continua negra) y pacientes con PD (línea discontinua gris) divisible por un umbral (línea mixta).
Descripción detallada de la invención
La invención se basa en la inmovilización directa e íntima de receptores para la sustancia macromolecular que va a analizarse, es decir, anticuerpos sobre una superficie de germanio mediante química de silano o tiol con un protocolo optimizado y simplificado. Para analizar el líquido (por ejemplo, sangre o LCR), se alimenta al sensor en un sistema de flujo. La sustancia macromolecular se inmoviliza por el anticuerpo en la superficie funcionalizada del sensor.
El elemento sensor óptico de los aspectos (1) y (1') de la invención es particularmente adecuado para el análisis de infrarrojos y opcionalmente además para el análisis paralelo mediante otro método óptico que incluye la detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Además, el elemento sensor es adecuado para el análisis óptico de sustancias macromoleculares incluyendo péptidos y proteínas, pero también polímeros que contienen nucleótidos tales como ADN y ARN.
El elemento sensor de infrarrojos de la invención, el elemento de reflexión interna, es un cristal de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo. Se prefiere que el cristal de germanio sea un monocristal de germanio, mientras que se prefiere particularmente un monocristal de germanio de corte trapezoidal.
El cristal de germanio permite más de un paso de la luz infrarroja a través del elemento de reflexión, siendo particularmente preferidos más de cinco pasos. Para permitir el contacto con la proteína biomarcadora candidata en tales pasos múltiples, el receptor para la proteína biomarcadora se injerta en el número apropiado de superficies de dicho elemento de reflexión interna de germanio.
Los grupos de unión de silano y tiol que se utilizan para acoplar el receptor y por tanto, la macromolécula al elemento de reflexión interna de germanio, incluyen grupos de unión de silano y tiol homogéneos, mezclas de grupos de unión de silano y mezclas de grupos de unión de tiol. Para permitir una unión estrecha e íntima del receptor/macromolécula, se utilizan grupos de unión de cadena corta, preferiblemente grupos de unión que
tienen una longitud de cadena de no más de 20 átomos o no más de 15 átomos.
Tales grupos de unión de cadena corta incluyen grupos de unión de silano tienen una de las fórmulas siguientes:
X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z o
X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
y los grupos de unión de tiol tienen la fórmula siguiente:
HS-(CH2)n-Y-(CH2)n-Z,
en las que X en cada aparición se selecciona independientemente de halógeno y alcoxilo C1-6, n es un número entero de 1 a 10, n' es un número entero de 1 a 5; R1 en cada aparición se selecciona independientemente de alquilo C1-6, Y se selecciona de un enlace químico, -O-, -CO-, -SO2-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2SO2- y -SO2NR2-(en las que R2 es H o alquilo C1-6), y Z es un grupo reactivo con amina que incluye -CO2H, -SO3H y derivados de éster de los mismos.
El halógeno dentro de la presente invención incluye un átomo de flúor, cloro, bromo y yodo. Alquilo C1-6 y alcoxilo C1-6 incluyen grupos alquilo o alcoxilo lineales, ramificados o cíclicos que tienen de 1 a 6 átomos de carbono que pueden estar saturados o insaturados. En el caso de grupos alquilo y alcoxilo cíclicos, esto se refiere a aquellos que tienen de 3 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo C1-6 y alcoxilo C1-6 adecuados incluyen, entre otros, metilo y metoxilo, etilo y etoxilo, n-propilo y n-propoxilo, iso-propilo y iso-propoxilo, ciclopropilo y ciclopropoxilo, nbutilo y n-butoxilo, terc-butilo y terc-butoxilo, ciclobutilo y ciclobutoxilo, n-pentilo y n-pentoxilo, ciclopentilo y ciclopentoxilo, n-hexilo y n-hexoxilo, ciclohexilo y ciclohexoxilo, etc. El grupo reactivo con amina Z incluye todos los tipos de grupos funcionales que son reactivos con un grupo amino libre. Entre ellos, se prefieren particularmente -CO2H, -SO3H y derivados de éster de los mismos (incluyendo ésteres activos).
Los elementos estructurales -(CH2)n- y -(CH2)n- en las fórmulas anteriores también pueden contener uno o más dobles y/o triples enlaces y pueden sustituirse con uno o más átomos de halógeno tales como flúor.
En una divulgación de la solicitud, el elemento sensor óptico puede obtenerse mediante silanización y, en los grupos de unión, X se selecciona independientemente de grupos alcoxilo C1-6, preferiblemente de grupos metoxilo y etoxilo, Y es -NHCO-, Z es -CO2H o un derivado de éster del mismo, y n es un número entero de 1 a 5 y n' es un número entero de 1 a 3, preferiblemente n es 3 y n' es 2.
En otra divulgación, el elemento sensor óptico puede obtenerse mediante tiolación y, en los grupos de unión, Y es un enlace químico, Z es -CO2H o un derivado de éster del mismo, y n es un número entero de 1 a 8 y n' es un número entero de 1 a 5, preferiblemente n es 8 y n' es 4. Se prefiere particularmente un éster de NHS de ácido 12-mercaptododecanoico.
Se da a conocer además un elemento sensor óptico, siendo al menos un receptor para la sustancia macromolecular un anticuerpo específico. Además, se prefiere que la sustancia macromolecular sea una proteína que es característica para una enfermedad de plegamiento incorrecto de proteínas tal como, pero sin limitarse a, enfermedad de Alzheimer (péptidos Ap y proteína tau), enfermedad de Parkinson ((alfa)-sinucleína), enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (proteína priónica), o corea de Huntington (proteína huntingtina), preferiblemente la sustancia macromolecular es un péptido amiloidogenético o un (poli-)péptido de composición de estructura secundaria característica dependiente del estado de salud.
La sustancia bloqueante que no reacciona de manera cruzada con la proteína biomarcadora candidata incluye caseína, etanolamina, L-lisina, polietilenglicoles, albúminas, y derivados de los mismos, y preferiblemente es caseína.
La proteína biomarcadora candidata es el péptido beta-amiloide (Ap), y el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al epítopo central del péptido beta-amiloide, tal como el anticuerpo A8978 (Sigma Aldrich) y cuando la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína, el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al péptido alfa-sinucleína sin especificidad conformacional, tal como el anticuerpo 4B12 (Covance, BioLegend Inc.) o S5566 (Sigma Aldrich).
El dispositivo del aspecto (2) de la invención tiene el elemento sensor del aspecto (1) de la invención incorporado en una celda (cámara) de IR adecuada. Puede incluir además un elemento de emisión de luz (IR), un elemento de detección de luz (IR) y una unidad de procesamiento de datos. Para la detección paralela mediante un método óptico adicional, el dispositivo puede incluir además una fuente de luz y un elemento detector para tal método óptico adicional, tal como una fuente de luz y elementos detectores para fluorescencia UV/Vis, a
diferentes longitudes de onda.
En el método del aspecto (3) de la invención, la oxidación se realiza mediante tratamiento con H2O2/ácido oxálico. Además, en el método, la silanización con los grupos de unión de silano cortos se realiza preferiblemente con un derivado de silano que tiene las fórmulas siguientes:
X3Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y,
X2(R1)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y o
X(R1)(R2)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y,
en las que las variables son tal como se definió anteriormente. Se prefiere particularmente que se use un derivado de éster del resto CO2H o SO3H en la definición de Y, que puede ser un éster de alquilo C1-6 sencillo, pero también puede ser un éster activado tal como un éster de N-hidroxisuccinimida o cualquier otro derivado de éster activado. También se prefiere en el método que el receptor sea un anticuerpo. Se prefiere además que la sustancia bloqueante sea caseína.
En el método del aspecto (4) de la invención, la activación de superficie se realiza mediante tratamiento con HF (49%). Además, en el método, la tiolación con los grupos de unión de tiol cortos se realiza preferiblemente con grupos de unión de tiol que tienen la fórmula siguiente: HS-(CH2)n-Y-(CH2)n-Z,
en la que las variables son tal como se definió anteriormente. Se prefiere particularmente que se use un derivado de éster del resto CO2H o SO3H en la definición de Y, que puede ser un éster de alquilo C1-6 sencillo, pero también puede ser un éster activado tal como un éster de N-hidroxisuccinimida o cualquier otro derivado de éster activado. También se prefiere en el método que el receptor sea un anticuerpo. Se prefiere además que la sustancia bloqueante sea caseína.
En ambos aspectos (3) y (4), el método del elemento sensor de infrarrojos se construye a temperatura ambiente sin productos químicos agresivos. Cada etapa individual puede evaluarse basándose en los espectros de IR. Esta etapa de validación es esencial para la detección específica y la determinación precisa de la estructura secundaria del analito.
El método del aspecto (6) de la invención comprende las etapas de
(a) conducir, en una celda de IR que comprende el elemento sensor de infrarrojos tal como se ha definido anteriormente en el presente documento, un flujo de proteínas biomarcadoras candidatas potenciales para el receptor en la superficie de dicho sensor de infrarrojos;
(b) enviar un haz de IR a través de dicha celda y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo, en el que el espectro obtenido tiene una relación señal-ruido suficiente para resolver la banda de amida I; y
(c) analizar el desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora para determinar una composición de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata, en el que un desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la progresión de la enfermedad, en el que la proteína biomarcadora candidata es betaamiloide y el desplazamiento del máximo de la banda de amida I del péptido beta-amiloide a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm_1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Alzheimer, o en el que la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína y en el que un desplazamiento descendente del máximo de la banda de amida I del péptido alfa-sinucleína a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm_1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
Puede incluirse además la etapa (d): analizar el espectro de infrarrojos obtenido para clasificar la muestra con métodos estadísticos basados en la composición de estructura secundaria de la sustancia macromolecular. En una realización preferida, el método comprende además antes de etapa (a): la instalación de dicho elemento sensor óptico en la celda de IR. Adicional/alternativamente, el método puede comprender además la etapa (e): regenerar la superficie del elemento óptico mediante la aplicación de una disolución de ligando libre para el receptor.
En una realización adicional preferida, el espectro obtenido en la etapa (b) tiene una relación señal-ruido suficiente para resolver la banda de amida I. Esto permite que la etapa (c) comprenda preferiblemente el análisis del desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora para determinar la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata; y/o
En una realización adicional, la etapa (c) del método comprende además comparar el espectro de infrarrojos obtenido con un espectro del ligando macromolecular con estructura secundaria conocida y/o con concentración conocida.
En otra realización, el método comprende además, en paralelo al análisis de infrarrojos, la detección mediante otro método óptico, incluyendo fluorescencia UV/Vis, a diferentes longitudes de onda. En particular, se prefiere un método que combina espectroscopía vibracional inmuno-ATR-IR con espectroscopía de fluorescencia paralela.
Los métodos de los aspectos (6) y (7) permiten/son adecuados para determinar macromoléculas en fluidos corporales, en particular para determinar directamente proteínas biomarcadoras candidatas en fluidos corporales de origen mamífero (ser humano, animal), incluyendo líquido cefalorraquídeo, sangre o suero, sin tratamiento previo (es decir, sin una etapa anterior independiente de enriquecimiento o purificación). El método es adecuado para la determinación de la proteína biomarcadora candidata de una manera independiente (in vitro) o en línea (determinación directa del fluido corporal en el paciente). En ambos casos, el método puede comprender además la evaluación de la progresión de la enfermedad.
Los métodos de los aspectos (6) y (7) son particularmente adecuados para la determinación de la progresión de la enfermedad de Alzheimer con beta-amiloide como proteína biomarcadora candidata, en los que un desplazamiento del máximo de la banda de amida I del péptido beta-amiloide por debajo de un valor umbral de 1643 cm_1 /- 1 cm_1 es indicativo de enfermedad de Alzheimer. Estos métodos también son particularmente adecuados para la determinación de la progresión de la enfermedad de Parkinson con alfa-sinucleína como proteína biomarcadora candidata, en los que un desplazamiento descendente del máximo de la banda de amida I del péptido alfa-sinucleína por debajo de un valor umbral de 1643 cm_1 /- 1 cm_1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
La invención de la presente solicitud proporciona la inmovilización específica de receptores para sustratos macromoleculares tales como anticuerpos funcionales en la superficie de un elemento óptico de manera directa y estrecha. A diferencia de los documentos WO 02/056018 y EP-A-1806574 mencionados anteriormente, que dan a conocer la funcionalización química del elemento óptico con hidratos de carbono y silanos de cadena larga para analizar la inmovilización del receptor, o la interacción del receptor con ligandos, la estrecha inmovilización de los receptores para macromoléculas tales como un anticuerpo altamente específico permite el análisis conformacional de una macromolécula dada como componente de un fluido complejo.
Con el sensor de la invención, el límite de detección para el péptido Ap, un biomarcador candidato principal para la enfermedad de Alzheimer, era dos magnitudes más bajo en comparación con la concentración natural en LCR, y aproximadamente una magnitud más bajo en comparación con la concentración natural en sangre. En el transcurso de la enfermedad de Alzheimer, cambia la conformación del péptido Ap. Los ensayos convencionales sólo incluyen la concentración y la razón de péptidos Ap con diversas longitudes de cadena en el LCR. Con el sensor de la presente invención, pueden detectarse diferentes conformaciones de Ap en tiempo real, y la absorbancia medida presenta una señal promedio de las presentes estructuras secundarias. Para los pacientes con Alzheimer, pudieron identificarse cambios significativos y específicos en la región espectral sensible conformacional en comparación con los pacientes de control. De ese modo, se demostró la sensibilidad y viabilidad de la técnica.
La radiación electromagnética tiene que acoplarse al elemento sensor de la invención. La longitud de onda que puede usarse comprende ultravioleta a terahercios. Para el desarrollo de prototipos, se utilizó la región de infrarrojo medio (MIR). La sustancia unida al anticuerpo absorbe la radiación a longitudes de onda específicas, generando un espectro de absorbancia. La intensidad de las señales de absorbancia permite la interpretación cuantitativa de la concentración de la sustancia. La longitud de onda de absorbancia permite la interpretación directa y cualitativa de, por ejemplo, la estructura secundaria en el caso de proteínas. Además, el elemento sensor de la invención está diseñado para una detección paralela de al menos dos intervalos de longitud de onda con al menos dos métodos espectroscópicos distintos pero aplicados simultáneamente, por ejemplo, mediciones de absorbancia de infrarrojos y fluorescencia del analito.
El proceso general puede automatizarse en gran medida. Por tanto, el dispositivo y el método de la invención también pueden utilizarse por personal no científico. También se contempla el acoplamiento del método con estadísticas de clasificación para fines de diagnóstico. Con la técnica de sensores establecida, las sustancias definidas pueden analizarse de manera cualitativa y cuantitativa, directamente dentro de disoluciones complejas, si se dispone de anticuerpos para la sustancia deseada. Por tanto, se ha hecho accesible un análisis directo de la estructura secundaria de proteínas en fluidos corporales no tratados. La especificidad del sensor se basa en la especificidad del anticuerpo. Para la investigación básica, la invención en particular permite el análisis estructural de proteínas a partir de disoluciones de baja concentración.
Aplicando un clasificador bioinformático, pueden diferenciarse automáticamente varios estados de la sustancia unida. La sensibilidad y especificidad de la discriminación debe validarse para cada caso.
El sensor abre un nuevo campo para buscar nuevos biomarcadores con clasificación conformacional. El uso de la invención en aplicaciones clínicas es particularmente relevante, porque los fluidos corporales pueden analizarse directamente después de la extracción. Sólo se detecta el componente predefinido, y se analizan tanto la cantidad como su estructura para obtener información de diagnóstico.
Un ejemplo particular es una enfermedad neurodegenerativa como el Alzheimer, que muestra cantidades y estructuras alteradas de las moléculas candidatas de biomarcador Ap y tau identificadas hasta ahora en el LCR. Con la invención de la presente solicitud, ambos parámetros se detectan simultáneamente.
La invención proporciona el análisis de la estructura secundaria de una banda de amida I de proteína de una proteína específica dentro de un fluido complejo. La estructura secundaria se usa como biomarcador del estado de la enfermedad. La frecuencia estructural sensible de la amida I en presencia del biomarcador correspondiente por debajo de un umbral definido en el presente documento indica el estado de la enfermedad. El umbral se describe en las figuras 9, 10 y 11 para el péptido Ap y en la figura 16 para alfa-sinucleína. La siguiente descripción detallada se centra en el péptido Ap para el Alzheimer y en la alfa-sinucleína para el Parkinson. Este umbral es el hallazgo novedoso. Para determinar el umbral, se inventó una configuración experimental que proporciona una relación señal/ruido suficiente de la banda de amida I en presencia del fluido corporal. Es importante medir la estructura secundaria del biomarcador en presencia del fluido corporal, porque es muy sensible a las condiciones de medición. Por ejemplo, la estructura secundaria de Ap varía entre la hélice alfa y el enrollamiento al azar dependiendo de las condiciones de medición. Como ejemplo en la solicitud, se usa el péptido Ap. Se obtuvo una excelente relación S/N de la banda de amida I a concentraciones de analito por debajo del nivel fisiológico (figura 8). Los péptidos Ap se concentran a aproximadamente 10-15 ng/ml en líquido cefalorraquídeo (LCR) humano. El límite de detección demostrado reduce este valor al menos en un orden de magnitud.
La proteína deseada se detecta, tal como se muestra con el péptido Ap de ejemplo: la captura del péptido Ap sintético a partir de disoluciones tamponadas definidas y del medio de cultivo celular acondicionado complejo se confirmó mediante el análisis de fluorescencia de control opcional (figura 11).
Basándose en los resultados de los ejemplos 2 y 3, un clasificador de umbral con un valor de 1643 cm-1 /-1 cm-1 es una característica de la invención.
El material óptico preferido de la invención es el germanio. Se ha descubierto que una configuración denominada “BiaATR” con una única geometría de reflexión tiene una calidad de señal insuficiente para el análisis de la estructura secundaria de los péptidos Ap a concentraciones fisiológicas. Aunque los péptidos Ap se proporcionaran en un exceso > 5 veces en una disolución pura y deuterada, no pudo realizarse un análisis de la estructura secundaria en los espectros de S/N bajos logrados [Kleiren et al. Spectroscopy 2010]. Por tanto, este enfoque no puede determinar el umbral como marcador de la enfermedad. Una realización preferida de la invención presenta un IRE de cristal de reflexión múltiple de forma trapezoidal. Una forma de paralelogramo estaría estrechamente relacionada y sería igualmente posible. Parece crucial aprovechar al menos 5 reflexiones internas en la superficie funcionalizada para lograr una relación señal/ruido suficiente para determinar el umbral.
Una etapa de bloqueo de la superficie saturada de anticuerpo es crucial para el análisis de la banda de amida I previsto del analito. Se usa una disolución sin detergente de una proteína globular, que no reacciona con el analito, pero reacciona con el grupo de unión de silano o tiol, para la extinción/bloqueo químico de sitios de unión inespecíficos del elemento sensor (véanse los ejemplos 5 y 6).
El hallazgo de que se requiere una sustancia bloqueante que no reaccione de manera cruzada, tal como la caseína, para el análisis conformacional, en particular el análisis de la banda de amida I, es importante para la presente invención. Un patrón de bloqueo inmunológico, la albúmina, no es adecuado para la detección del péptido Ap específico (véase el ejemplo 7).
En los protocolos inmunológicos, a menudo se aplica leche en polvo en disoluciones tamponadas. Una disolución de leche en polvo tamponada no es aplicable para la detección de Ap porque contiene albúmina. No son necesarios detergentes para el sistema de sensores. Todos los ejemplos se han realizado con disoluciones sin detergente. No se esperan complicaciones con la invención con concentraciones bajas comunes de detergentes tal como se usa en protocolos inmunológicos.
Para el análisis de la estructura secundaria del péptido Ap en una muestra, el anticuerpo tiene que ser sensible (específico) para un epítopo central del péptido, pero insensible a la estructura del epítopo del péptido (véase el ejemplo 8).
Los métodos de los aspectos (6) y (7) de la invención son aplicables para una variedad de enfermedades conformacionales, también conocidas como enfermedades de plegamiento incorrecto de proteínas, o
proteopatías, que son causadas por el plegado incorrecto de los siguientes péptidos/proteínas: péptidos betaamiloides (Ap) y proteína tau (enfermedad de Alzheimer (AD)); alfa-sinucleína (enfermedad de Parkinson (PD)), proteína priónica (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), encefalopatía espongiforme bovina (BSE) comúnmente conocida como enfermedad de las vacas locas), proteína huntingtina (corea de Huntington).
Se muestra específicamente el uso para el análisis de Ap (ejemplos 1 a 8) y alfa-sinucleína (ejemplo 9).
La invención se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplos
Material y métodos
La invención puede usarse directamente con un espectrómetro IR equipado con el compartimento de muestras disponible comercialmente “GS11000 - 25 Reflection Variable Incidence Angle ATR” de Specac (Specac Ltd., Slough, Inglaterra) (figura 1 A, trayectoria óptica figura 1 B). El elemento óptico, un cristal de ATR de germanio (52 X 20 X 2 mm, Korth Kristalle GmbH, Altenholz (Kiel), Alemania), se incluyó en un soporte optimizado (figura 1 B, 2). Las modificaciones químicas especificadas posteriormente de la superficie del cristal generaron la propiedad específica del sensor (figura 3). Si no se menciona lo contrario, todos los productos químicos se adquirieron de Sigma-Aldrich (Múnich, Alemania). Los tampones y el agua se desgasificaron en el baño ultrasónico.
Conjunto de muestra: El estudio de viabilidad incluyó primero a 23 pacientes, 9 pacientes con un diagnóstico de Alzheimer confirmado lo mejor posible y 14 controles no neurodegenerativos. Con inclusión continua, se realizaron análisis con muestras de LCR de 37 pacientes con AD y 63 pacientes de control, y muestras de plasma sanguíneo de 35 pacientes con AD y 61 pacientes de control. El diagnóstico de los pacientes se basa en informes psicológicos, datos de obtención de imágenes de MRT, resultados de análisis de sangre y LCR, y diagnósticos de pruebas psicométricas. Según la disponibilidad, se consideraron los hallazgos de la PET (tomografía por emisión de positrones) o la SPECT (tomografía computerizada por emisión de fotón único). Los informes adicionales resultan de las observaciones de la evolución que involucran a parientes cercanos.
Toma de muestras y tratamiento previo: Se extrajo LCR mediante punción lumbar y se dividió en alícuotas en el hospital universitario de Essen, se ultracongelaron en nitrógeno líquido, se enviaron y se almacenaron a -80°C. Las muestras no se trataron previamente antes de la medición, solo se descongelaron a 37°C durante 30 segundos y se mantuvieron en hielo hasta su uso.
Solución salina tamponada con fosfato (tampón PBS): cloruro de sodio (NaCl) 137 mM, cloruro de potasio (KCl) 2,7 mM, fosfato total 12 mM (en forma de Na2HPO4 y NaH2PO4), pH 7,4.
Tampón de reacción-fosfato: Na2HPO450 mM/NaH2PO4, pH 8,0.
Disolución de bloqueo de caseína: Hidróxido de sodio 200 mM (NaOH), caseína al 1% (p/v) de leche bovina (en polvo), pH ajustado con H3PO4 a 7,4.
Disolución de silanización: El silano usado (éster de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo del ácido N-(4,4,4-trietoxisilanbutil)succinámico) se sintetizó y se caracterizó tal como se describe (J. Schartner et al., Journal of the American Chemical Society, 135 (10): 4079-4087 (2013)).
Anticuerpo: El método se sometió a prueba con dos anticuerpos como moléculas de captura, 1E8 (Nanotools Antikorpertechnik GmbH, Teningen, Alemania) y A8978 (n.° de lote: 061M4773 Sigma Aldrich). 1E8 se une a los aminoácidos N-terminales 1-11, A8978 se une a los aminoácidos 13-28 de los péptidos beta-amiloides. La detección de fluorescencia se produjo a través del anticuerpo 8G7 marcado con FITC (Nanotools), que reconoce el extremo C-terminal de los péptidos AP1-42. Además, se utilizaron anticuerpos sensibles a la conformación frente a estados oligoméricos (KW1) (Morgado et al., PNAS, 109 (31): 12503-12508 (2012)) y estados fibrilares de péptidos Ap (B10) (G Habicht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104 (49): 19232-19237 (2007)).
Preparación de la superficie del sensor con silanos: El Ge-IRE se pulió bilateralmente con una suspensión de molienda de diamante en grano de 0,1 |im durante 5 min (Struers A/S, Ballerup, Dinamarca). El cristal se incubó tres veces en una mezcla de peróxido de hidrógeno/ácido oxálico (9:1) durante 5 min, se aclaró con agua entre cada etapa de incubación y se secó con gas nitrógeno. Además, el cristal se instaló inmediatamente con ondulaciones de silicona optimizadas en la celda de flujo continuo. Se reguló la velocidad de flujo a 1 ml/min mediante una bomba peristáltica (IDEX Health & Science GmbH, Wertheim, Alemania). El volumen total del sistema ascendió a 650 |il.
La superficie del sensor se incubó con una disolución de silano 300 |iM (figura 3) en 2-propanol durante 60 min,
el silano unido de manera inespecífica se aclaró con 2-propanol durante 30 min. Después de cambiar los medios al tampón de reacción, se lavó la disolución de anticuerpo 25 |ig/ml sobre la superficie de silano activada hasta la saturación, monitorizado por la cinética de inmovilización de la banda de amida II del anticuerpo. El anticuerpo unido de manera inespecífica se aclaró con tampón PBS hasta que se alcanzó un equilibrio de la absorbancia de la amida II. Los sitios de reacción libres de la superficie del sensor se saturaron con disolución de bloqueo de caseína seguido de aclarado con tampón PBS.
Preparación de la superficie del sensor con tioles: El Ge-IRE se preparó de forma idéntica a la descrita para la silanización. El cristal se preparó tal como se describe por (S.M. Han et al., JACS, 123 (10): 2422-2425 (2001)). Después del tratamiento con HF, el cristal se sumergió inmediatamente en una disolución de isopropanol que contenía éster de NHS del ácido 12-mercaptododecanoico 1 mM. La monocapa se formó después de 24 h, el cristal se secó con gas N2 y se instaló inmediatamente en la configuración de ATR. Los tioles no unidos se retiraron lavando durante 30 min con isopropanol. La preparación adicional fue idéntica al protocolo de silanización.
Realización de la medición: Las mediciones de IR se realizaron en un espectrómetro Vertex 70V (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Alemania) con un detector de telururo de cadmio-mercurio (MCT) enfriado con nitrógeno líquido. Se registraron interferogramas de doble cara en el movimiento del interferómetro hacia adelante y hacia atrás a una velocidad de datos de 60 kHz con una resolución espectral de 2 cm-1, apodización de Blackman-Harris de 3 términos, corrección de fase de Mertz y llenado de cero 4 veces. Los espectros de referencia se registraron como un promedio de 1000, los espectros de muestra de 200 interferogramas. El registro de los espectros de un solo canal de referencia del sensor blanco, el sensor con 2-propanol, la superficie silanizada, los tampones, la superficie recubierta con caseína o anticuerpo en estados de equilibrio permitió una espectroscopía de diferencia de alta sensibilidad basada en la ley de Lambert-Beer (E = -log (I/I0). La absorbancia del cambio de estado es el logaritmo decádico negativo de la relación de intensidad antes y después del cambio. Se añadieron 50 |il de LCR al sistema tamponado con PBS en un flujo circulante para el análisis de la estructura secundaria de la fracción de péptido Ap. Una vez alcanzado el equilibrio de unión, el material no unido se aclaró con tampón PBS del sistema hasta que no se observaron cambios espectrales. Por tanto, el espectro de absorbancia de Ap se calculó a partir de la diferencia entre este estado y la superficie del sensor aclarada con PBS bloqueada con caseína.
Tratamiento previo de los espectros: Las trazas espectrales de vapor de agua atmosférico se retiraron mediante la sustracción a escala de un espectro de referencia. El ruido de alta frecuencia con un ancho completo a media altura (FWHH) de menos de cuatro números de onda se eliminó a través de un filtro de paso bajo de Fourier. Los espectros se corrigieron en el nivel inicial tal como se describe (J. Ollesch et al., The Analyst, 138 (14): 4092 (2013)), y se normalizaron a la misma intensidad de señal de amida I entre 1730 y 1620 cm_1 antes de la clasificación.
Clasificación: Con el fin de reducir la dimensionalidad de los datos espectrales, se eligió la posición de los máximos de amida I de los espectros promedio de ambos grupos de pacientes como puntos de datos relevantes para la clasificación. La clasificación de los datos resultó de un análisis discriminante lineal (LDA), mediante el entorno de programación Matlab, versión 2012a. Se utilizó la función interna del programa (“clasificar”). Todos los cálculos se realizaron en un PC de oficina con una CPU Intel Core2Quad Q9650@3.0 GHz, 8 GB de RAM (Dell Optiplex 780).
Ejemplo 1: Análisis de la banda de amida I en Ap con grupos de unión acoplados a silano
La sensibilidad específica de la configuración establecida del sensor (figuras 1, 2) está definida por el anticuerpo. Mediante el uso de microscopía de fluorescencia sólo fue posible determinar la fluorescencia si el anticuerpo 8G7 acoplado a FITC estaba unido a la superficie. El control no reveló ninguna fluorescencia (figura 4). El anticuerpo 8G7-FITC se unió covalentemente a la superficie del silano reactiva con amina (figura 3 A, B) y no pudo retirarse lavando con tampón (figura 4 C). Otro anticuerpo sometido a prueba, 1E8, no mostró ninguna fluorescencia (figura 4 E). Después del bloqueo de los sitios de unión no específicos, abiertos, con caseína, no se observó unión adicional de 8G7, lo que muestra que 8G7 no se une a caseína ni a 1E8. Si se observa 8G7-FITC como una proteína en general, este experimento muestra que la superficie del silano está protegida de la interacción inespecífica con las proteínas contenidas en la muestra.
Solo después de la incubación con el péptido AP1-42, se detectó una señal de fluorescencia desde la superficie posterior marcada con 8G7-FITC (figura 4 J), lo que demuestra la inmovilización satisfactoria de Ap. Además, se demostró que el sensor diseñado permite experimentos paralelos con diferentes técnicas ópticas.
La sensibilidad conformacional de la banda de amida I analizada se comprobó con el péptido AP1-42 monomérico, oligomérico y fibrilar (figura 5 A). Los estados fibrilar y oligomérico difieren fuertemente del péptido no agregado, lo que se puede observarse por la mayor cantidad de láminas p. Esto puede revelarse por un desplazamiento del máximo de amida I hacia 1624 cm-1 y 1630 cm-1. El componente de alta frecuencia a 1665 cm-1 es característico
de las fibrillas. El péptido Ap oligomerizado se describe como un producto intermedio tóxico en la formación de placas amiloides en pacientes con Alzheimer (I. Benilova et al., Nature Neuroscience, 15 (3): 349-357 (2012)). Los oligómeros tienen una estructura de láminas p diferente en comparación con los monómeros y las fibrillas. Una posible explicación es la mayor cantidad de láminas antiparalelas (Cerf et al., The Biochemical Journal, 421 (3): 415-423 (2009); Yu et al., Biochemistry, 48(9):1870-1877 (2009); Laganowsky et al., Science, 335(6073): 1228-1231 (2012)) (figura 5 A, hombro en la banda verde a unos 1682 cm-1). Esto implica una banda de amida I diferente para monómeros y fibrillas.
Con los anticuerpos conformacionalmente sensibles B10 (fibrillas) y KW1 (oligómeros), pudieron detectarse ambas fracciones del péptido Ap correspondientes dentro del mismo LCR humano natural de un paciente de control (figura 5 B, C). En comparación con una disolución sintética de péptidos Ap aislados, en la que sólo se revela la estructura secundaria del péptido aislado en una conformación definida, los datos de las figuras 5 B y C presentan las composiciones de estructura secundaria esperadas presentes en el fluido corporal natural.
Por tanto, los anticuerpos conformacionalmente sensibles no son adecuados para la detección de cambios estructurales relacionados con enfermedades. Estos anticuerpos detectan específicamente sólo la conformación deseada, pero la característica importante es la composición proporcionada de monómeros, oligómeros y fibrillas amiloides. Con el anticuerpo conformacionalmente independiente A8978, la banda de amida I detectada se asemejaba cuantitativamente a la composición estructural de la fracción del péptido Ap. Es probable que esto provoque la alta especificidad de la técnica de sensor para discriminar pacientes (figura 5 D, E).
La discriminación de los pacientes de control - con Alzheimer basándose en la posición máxima de la amida I es posible con una precisión del 100% (figura 6 A).
Un clasificador alternativo, un LDA basado en la intensidad de amida I a 1647 y 1640 cm-1, da como resultado una precisión promedio del 97 6% con una sensibilidad del 94 11% y una especificidad del 100 0%, basándose en la validación cruzada de Monte Carlo repetida 1000 veces que deja un tercio de los datos fuera para la validación del clasificador (figura 6 B).
Con el anticuerpo unido covalentemente por medio del éster de NHS del ácido 12-mercaptododecanoico como grupo de unión de tiol en el IRE de germanio (figura 3 C, D), se logró una discriminación idéntica de AD de los pacientes de control basándose en la estructura secundaria de la fracción del péptido Ap de plasma sanguíneo estabilizado con EDTA (figura 7).
Ejemplo 2: Análisis de la estructura del péptido Ap en LCR de pacientes con enfermedad de Alzheimer (AD) y un grupo de control, conjunto de datos ampliado de 37 pacientes con AD y 63 controles.
El análisis a modo de ejemplo original de 20 muestras se amplió a 100 pacientes. La conformación promedio de los péptidos Ap, tal como están presentes en el LCR, mostró una frecuencia de banda de amida I más alta en el control que en el grupo de AD (figura 9A). Esto indicó un plegamiento de hélice alfa predominante en el control, mientras que el grupo de AD ya muestra un componente de lámina beta enriquecido. Usando la frecuencia de la banda de amida I como indicador, 1643 cm-1 representa hasta ahora el umbral óptimo para la discriminación de las clases con una precisión del 92%, una sensibilidad del 95% y una especificidad del 90%. La curva de característica operativa del receptor (ROC) correspondiente representa un área bajo la curva (AUC) de 0,93 (figura 9B).
Ejemplo 3: Aplicación para el análisis de la estructura del péptido Ap en plasma sanguíneo estabilizado con EDTA de 35 pacientes con AD y 61 pacientes de control.
Al igual que con el LCR, la conformación promedio de los péptidos Ap detectados en plasma sanguíneo mostró una frecuencia de banda de amida I más alta en el control que en el grupo de AD (figura 10A). Esto indicó la misma influencia de enfermedad en la fracción de péptido Ap portada por la sangre. De nuevo, 1643 cm-1 representa el umbral de frecuencia óptimo para la discriminación de las clases con una precisión del 89%, una sensibilidad del 80% y una especificidad del 93%. La curva ROC correspondiente representa un AUC de 0,85 (figura 10B).
En los ejemplos 2 y 3 se analizaron muestras de LCR de 37 pacientes con AD y 63 pacientes de control, y muestras de plasma sanguíneo de 35 pacientes con AD y 61 pacientes control.
El histograma y los diagramas de cajas correspondientes confirmaron los hallazgos con máximos bien diferenciados de las distribuciones (figura 11). Todas las clases se aproximaron bien con una distribución normal gaussiana. Las posiciones de banda promedio de las clases de control y AD a partir de LCR no se superpusieron con 1 desviación estándar. Una prueba de la t bilateral indicó una diferencia de clase significativa con p <0,001 para ambos grupos de muestras, LCR y plasma.
Las posiciones máximas de la banda de amida I de las fracciones del péptido Ap pudieron separarse bien mediante un umbral de clasificación simple: los máximos de banda por debajo de 1643 cm-1 se asignaron a la clase de AD, igual o superior a 1643 cm-1 como pacientes de control. Este umbral representa el clasificador con una precisión óptima del 92% para el LCR y del 89% para las muestras de plasma sanguíneo.
Basándose en las estadísticas de la prueba de la t con un nivel de confianza del 99,9%, puede esperarse un umbral de clasificación generalizado en un intervalo de 1638-1648 cm-1.
Ejemplo 4: Péptido Ap capturado a partir de LCR de pacientes con AD y pacientes de control por medio de un grupo de unión de tiol.
El IRE de germanio de la configuración se pulió, se limpió con acetona, se incubó en HF (10 min al 40% a temperatura ambiente), se lavó con agua destilada, se secó en N2 , se modificó durante la noche con un grupo de unión de tiol (éster de NHS del ácido 12-mercaptoundecanoico, figuras 3C, 3D), se aclaró con tampón, se funcionalizó con anticuerpo A8978 y se desensibilizó con caseína. La fracción Ap de las muestras de LCR de un paciente con AD y un paciente de control mostró características discriminatorias idénticas a las detectadas con grupos de unión de silano, el umbral de clasificación de 1643 cm-1 demostró ser válido (figura 12).
Ejemplo 5: Un elemento sensor no bloqueado es receptivo para péptidos Ap y dos componentes seleccionados de sangre/LCR.
Se pulieron, silanizaron y saturaron tres elementos sensores con anticuerpo 1E8 frente a péptidos Ap. Se usaron dos después de eliminar por aclarado las moléculas de anticuerpo unidas de manera inespecífica, uno se bloqueó con una disolución de caseína y se aclaró. En un sensor no bloqueado, se incubó alfa-sinucleína a una concentración de 20 ng/ml, se aclaró y se incubó el péptido Ap1-40 a una concentración de 15 ng/ml y se aclaró. El otro sensor no bloqueado se incubó con albúmina a una concentración de 25 |ig/ml, se aclaró y se incubó el péptido Ap1-40 a una concentración de 15 ng/ml y se aclaró. Los elementos sensores fueron receptivos para alfasinucleína y albúmina en concentraciones que pueden esperarse en fluidos corporales (figura 13A). La unión fue inespecífica, porque los sitios de unión para los péptidos Ap estaban libres en cualquier caso; se registró una señal de péptido Ap regular.
El sensor bloqueado se incubó con disolución 20 ng/ml de alfa-sinucleína y se aclaró, sin unión observable a la superficie del sensor (figura 13B). Consecutivamente, el sensor se incubó con albúmina 25 |ig/ml y se aclaró, de nuevo sin señal de albúmina observable. Sólo la incubación con la disolución 15 ng/ml de péptido Ap1-40 dio como resultado una señal regular después del aclarado (figura 13B).
Ejemplo 6: El sensor sin etapa de bloqueo no es aplicable para el diagnóstico.
Se prepararon dos elementos sensores: uno con y uno sin etapa de bloqueo de caseína. Se incubaron alícuotas de LCR de un paciente con AD en los sensores para el análisis de la banda de amida I de Ap. Las intensidades de la banda de amida I registradas en la superficie no bloqueada mostraron una unión mucho más alta y, por tanto, más inespecífica (figura 14). Sin bloqueo, la posición de la banda ya no se correlacionaba con el estado patológico: la lectura del sensor no bloqueado indicó una conformación de hélice alfa predominante a 1649 cm-1, mientras que la lectura del sensor bloqueado indicó un enriquecimiento de lámina beta con la frecuencia máxima de amida I de Ap a 1639 cm-1. Por tanto, una frecuencia máxima más alta es atribuible a la detección inespecífica del transfondo proteico predominantemente helicoidal en el LCR.
Ejemplo 7: Con el elemento sensor preparado mediante silanización, funcionalización con anticuerpos, bloqueo con caseína, incubación con medio de cultivo celular acondicionado y aclarado de proteínas unidas inespecíficamente, se observó un patrón regular de la bandas de amida: la banda de amida II era menos intensa que la banda de amida I (figura 15A). El análisis de control de fluorescencia confirmó la unión del péptido Ap (figura 4). Por el contrario, el patrón de bandas de amida registrado con otra alícuota de la misma muestra mostró una mayor intensidad de amida II, cuando se usó albúmina en lugar de caseína para el bloqueo. La intensidad global de la amida I se aumentó en aproximadamente un 100%. Por tanto, la albúmina obviamente proporcionó sitios de unión inespecíficos adicionales para proteínas ya no definibles y otras sustancias que presentan una absorbancia de entre 1600-1500 cm-1 (figura 15B).
Ejemplo 8: 1E8 y anticuerpos específicos para oligómeros y fibrillas aplicados para análisis de LCR.
Los anticuerpos 1E8 y A8978 demostrados a modo de ejemplo detectan péptidos Ap tanto monomerizados como fibrilares (figura 6A). Para fines de diagnóstico, la especificidad potenciada del anticuerpo A8978 que detecta un epítopo central de Ap demostró ser ventajosa con respecto al anticuerpo 1E8, cuando se analizó un fluido corporal complejo. Se sabe que 1E8 reacciona de manera cruzada con sAPPalfa (fragmento N-terminal de la proteína precursora de amiloide (APP) después del procesamiento de alfa-secretasa) debido a su epítopo N-terminal de Ap. No se ha informado de una conformación de sAPPalfa relacionada con enfermedad, y la señal
superpuesta dificulta una lectura clara del sensor (figura 16A). Para una separación rigurosa de las conformaciones del péptido Ap de la AD de las del control, se requiere la especificidad potenciada de un anticuerpo como A8978 por el epítopo central (figuras 9, 10 y 11).
El uso de anticuerpos específicos de conformación frente a oligómeros (figura 16B) o fibrillas (figura 16C) no mostró características de muestra específicas de enfermedad. Ambas conformaciones estaban presentes en muestras de LCR de pacientes con AD y de control. Por tanto, el sistema de diagnóstico deseado debe prepararse con anticuerpos que sean inespecíficos para la conformación del epítopo.
Ejemplo 9: Aplicación del sensor para el análisis de alfa-sinucleína presente en suero sanguíneo con respecto a la enfermedad de Parkinson (PD).
El elemento sensor se preparó, pulió y silanizó normalmente. Para la funcionalización específica de alfasinucleína, se inmovilizó el anticuerpo monoclonal 4B12 (Covance, BioLegend Inc.) en el sensor, seguido de bloqueo con caseína. Los espectros registrados de alfa-sinucleína presentes en el suero sanguíneo mostraron una frecuencia máxima de banda de amida I con claro desplazamiento descendente a 1641 cm-1 en la muestra de PD en comparación con 1646 cm-1 registrado de la muestra de pacientes de control. De este modo, se muestra la aplicabilidad del sensor para diagnósticos de PD sin marcador en muestras de sangre (figura 17).
Claims (12)
1. Elemento sensor de infrarrojos para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad, en el que dicho elemento sensor de infrarrojos comprende un elemento de reflexión interna de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo, que proporciona más de un paso de la luz infrarroja a través del elemento de reflexión,
en el que el elemento de reflexión interna de germanio es transparente en el infrarrojo con una relación señalruido suficiente para detectar la banda de amida I de las diferentes conformaciones en un fluido complejo, y al menos un receptor para la proteína biomarcadora que es un anticuerpo que puede unirse específicamente a la proteína biomarcadora candidata independientemente de la conformación de la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata,
en el que el anticuerpo se injerta directamente a al menos una superficie de dicho elemento de reflexión interna de germanio mediante silanización con grupos de unión de silano o mediante tiolación con grupos de unión de tiol, haciendo reaccionar grupos amina accesibles libremente de dicho al menos un receptor con grupos reactivos con amina en los grupos de unión de silano/tiol, y bloqueando los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de silano/tiol con caseína, en el que dichos grupos de unión de silano o grupos de unión de tiol tienen una longitud de cadena de no más de 20 átomos,
en el que la proteína biomarcadora candidata es el péptido beta-amiloide y el anticuerpo puede unirse específicamente y de manera conformacionalmente independiente al epítopo central del péptido beta-amiloide, o la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína y el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al péptido alfa-sinucleína sin especificidad conformacional.
2. Elemento sensor de infrarrojos según la reivindicación 1, en el que
(i) el elemento sensor es además adecuado para el análisis paralelo mediante otro método óptico que incluye detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda; y/o
(ii) el elemento de reflexión interna es un monocristal de germanio, preferiblemente es un monocristal de germanio cortado de forma trapezoidal.
3. Elemento sensor de infrarrojos según la reivindicación 1 ó 2,
en el que los grupos de unión de silano y tiol incluyen grupos de unión de silano y tiol homogéneos, mezclas de grupos de unión de silano y mezclas de grupos de unión de tiol, y tienen una longitud de cadena de no más de 20 átomos o no más de 15 átomos, preferiblemente los grupos de unión de silano tienen una de las fórmulas siguientes:
X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z o
X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
y los grupos de unión de tiol tienen la fórmula siguiente:
HS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
en las que X en cada aparición se selecciona independientemente de halógeno y alcoxilo C1-6, n es un número entero de 1 a 10, n' es un número entero de 1 a 5; R1 en cada aparición se selecciona independientemente de alquilo C1-6, Y se selecciona de un enlace químico, -O-, -CO-, -SO2-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2SO2- y -SO2NR2-(en el que R2 es H o alquilo C1-6), y Z es un grupo reactivo con amina que incluye -CO2H, -SO3H y derivados de éster de los mismos.
4. Elemento sensor de infrarrojos según la reivindicación 3, que puede obtenerse mediante
(i) silanización y, en los grupos de unión, X se selecciona independientemente de grupos alcoxilo C1-6, preferiblemente de grupos metoxilo y etoxilo, Y es -NHCO-, Z es -CO2H o un derivado de éster del mismo, y n es un número entero de 1 a 5 y n' es un número entero de 1 a 3, preferiblemente n es 3 y n' es 2; o
(ii) tiolación y, en los grupos de unión, Y es un enlace químico, Z es -CO2H o un derivado de éster del mismo, y n es un número entero de 1 a 8 y n' es un número entero de 1 a 5, preferiblemente n es 8 y n' es 4.
5. Dispositivo para el análisis directo de la cantidad y la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad, comprendiendo dicho dispositivo el sensor de infrarrojos según las reivindicaciones 1 a 4.
6. Método para la preparación del elemento sensor de infrarrojos con un grupo de unión de silano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:
(a) activar en superficie al menos una superficie del elemento de reflexión interna de germanio en forma de trapezoide o paralelogramo mediante oxidación,
(b) injertar grupos de unión de silano a la superficie activada obtenida en la etapa (a),
(c) acoplar covalentemente el anticuerpo al elemento de reflexión interna de germanio por medio del grupo reactivo con amina de los grupos de unión de silano, y
(d) bloquear los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de silano con caseína.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
(i) la oxidación se realiza mediante H2O2/ácido oxálico; y/o
(ii) los grupos de unión de silano son según la reivindicación 3 ó 4 y portan un derivado de éster en sus grupos reactivos con amina, preferiblemente un derivado de éster activo tal como un éster de N-hidroxi-succinimidilo.
8. Método para la preparación del elemento sensor de infrarrojos con grupos de unión de tiol según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:
(a) activar en superficie al menos una superficie del elemento de reflexión interna de germanio en forma de trapezoide o paralelogramo mediante la reacción con HF,
(b) injertar grupos de unión de tiol a la superficie activada obtenida en la etapa (a), y
(c) acoplar covalentemente el anticuerpo al elemento de reflexión interna de germanio por medio del grupo reactivo con amina de los grupos de unión de tiol, y
(d) bloquear los grupos reactivos con amina restantes en los grupos de unión de tiol con caseína.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
(i) la activación de superficie se realiza mediante HF (49%); y/o
(ii) los grupos de unión de tiol son según la reivindicación 3 ó 4 y portan un derivado de éster en su grupo reactivo con amina, preferiblemente un éster activo tal como un éster de N-hidroxi-succinimidilo.
10. Uso del elemento sensor de infrarrojos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o del dispositivo según la reivindicación 5, para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad en un fluido complejo,
en el que un desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la progresión de la enfermedad,
en el que la proteína biomarcadora candidata es beta-amiloide y el desplazamiento del máximo de la banda de amida I del péptido beta-amiloide a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm_1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Alzheimer, o
en el que la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína y en el que un desplazamiento descendente del máximo de la banda de amida I del péptido alfa-sinucleína a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm_1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
11. Método para la detección de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de una proteína biomarcadora candidata que experimenta transiciones conformacionales asociadas con progresión de enfermedad en un fluido complejo, que comprende las etapas de
(a) conducir, en una celda de IR que comprende el elemento sensor de infrarrojos según las reivindicaciones 1 a 4, un flujo de proteínas biomarcadoras candidatas potenciales para el receptor en la superficie de dicho sensor de infrarrojos;
(b) enviar un haz de IR a través de dicha celda y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo en el que el espectro obtenido tiene una relación señal-ruido suficiente para resolver la banda de amida I; y
(c) analizar el desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora para determinar una composición de diferentes conformaciones de la estructura secundaria de la proteína biomarcadora candidata, en el que un desplazamiento del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la progresión de la enfermedad, en el que la proteína biomarcadora candidata es betaamiloide y el desplazamiento del máximo de la banda de amida I del péptido beta-amiloide a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm-1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Alzheimer, o en el que la proteína biomarcadora candidata es alfa-sinucleína y en el que un desplazamiento descendente del máximo de la banda de amida I del péptido alfa-sinucleína a una frecuencia por debajo de un valor umbral de 1643 1 cm-1 es indicativo de la progresión de la enfermedad de Parkinson.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
(i) el método comprende además la etapa (d): regenerar la superficie del elemento infrarrojo mediante la aplicación de una disolución de ligando libre para el receptor; y/o y/o
(ii) la etapa (c) comprende comparar el espectro de infrarrojos obtenido con un espectro de la proteína biomarcadora candidata con estructura secundaria conocida y/o con concentración conocida; y/o
(iii) el método comprende además, en paralelo al análisis de infrarrojos, la detección mediante otro método óptico, incluyendo fluorescencia UV/Vis, a diferentes longitudes de onda; y/o
(iv) el método combina espectroscopía vibracional inmuno-ATR-IR con espectroscopía de fluorescencia paralela; y/o
(v) en el que el fluido complejo incluye líquido cefalorraquídeo, sangre o suero, y no está pretratado; y/o (vi) el método es adecuado para la determinación independiente (in vitro) o en línea de la proteína biomarcadora candidata.
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Family Cites Families (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0934515B1 (en) | 1996-10-09 | 2006-03-08 | Symyx Technologies, Inc. | Infrared spectroscopy and imaging of libraries |
| US6110446A (en) * | 1998-10-05 | 2000-08-29 | Colgate Palmolive Company | Dual component antiplaque and tooth whitening composition |
| WO2000070345A1 (en) | 1999-05-14 | 2000-11-23 | Iris Bio Technologies | Reversible immobilization of ligands onto metal surfaces, their preparation and use in biochemical applications |
| DE10030920C2 (de) | 2000-06-24 | 2003-01-02 | Glukomeditech Ag | Messvorrichtung zur gleichzeitigen refraktrometrischen und ATR-spektrometrischen Messung der Konzentration flüssiger Medien und Verwendung dieser Vorrichtung s |
| JP2002040023A (ja) | 2000-07-28 | 2002-02-06 | Mitsubishi Chemicals Corp | アルツハイマー病の検出方法 |
| EP2202521A1 (en) | 2001-01-16 | 2010-06-30 | Université Catholique de Louvain | Surface chemical modification of optical elements for the spectroscopic detection of molecules and organic components |
| US7255835B2 (en) * | 2001-09-04 | 2007-08-14 | North Carolina State University | Single pass attenuated total reflection fourier transform infrared microscopy apparatus and method for identifying protein secondary structure, surface charge and binding affinity |
| US7132122B2 (en) * | 2002-10-30 | 2006-11-07 | The Regents Of The University Of California | Direct micro-patterning of lipid bilayers using UV light and selected uses thereof |
| US8481017B2 (en) * | 2004-02-23 | 2013-07-09 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Thin films for controlled protein interaction |
| US20070003921A1 (en) * | 2005-07-01 | 2007-01-04 | Andrus Paul G | Method of grading disease by Fourier Transform Infrared Spectroscopy |
| EP1806574A1 (en) | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Université Catholique de Louvain | Surface modification of optical elements for the spectroscopic detection of molecules and organic components |
| EP1857808A1 (de) | 2006-05-15 | 2007-11-21 | Sika Technology AG | Messanordnung |
| JP4147264B2 (ja) * | 2006-09-08 | 2008-09-10 | 株式会社ステリック再生医科学研究所 | 神経線維性変性抑制剤 |
| WO2008086228A2 (en) * | 2007-01-04 | 2008-07-17 | University Of Washington | Arrays and methods for guided cell patterning |
| JP2010515717A (ja) * | 2007-01-11 | 2010-05-13 | フィリップス−ウニベルジテート・マールブルク | アルツハイマーおよび他の神経性認知症疾患の診断ならびに処置 |
| US20120021486A1 (en) * | 2009-01-16 | 2012-01-26 | Cerasela Zoica Dinu | Enzyme-based nanoscale decontaminating composites |
| US8883985B2 (en) | 2010-02-16 | 2014-11-11 | National University Corporation Kyoto Institute Of Technology | Antibody-immobilized carrier, method of producing antibody-immobilized carrier, and use of said antibody-immobilized carrier |
| EP2558088A4 (en) * | 2010-04-14 | 2014-01-15 | Univ Akron | POLYMER COMPOSITION COMPRISING A PHYTOCHIMIC AGENT AND DIALYSIS MEMBRANE FORMED FROM THE POLYMER COMPOSITION |
| CA2823716C (en) * | 2011-01-04 | 2018-02-13 | Exxonmobil Upstream Research Company | Method and apparatus for a mid-infrared (mir) system for real time detection of petroleum in colloidal suspensions of sediments and drilling muds during drilling, logging, and production operations |
| EP2490029A1 (en) | 2011-02-16 | 2012-08-22 | Université Catholique De Louvain | Vancomycin analysis |
| WO2012170993A2 (en) | 2011-06-09 | 2012-12-13 | New York University | Assays and methods pertaining to pre-amyloid intermediates |
| CN103764166B (zh) * | 2011-06-22 | 2017-10-24 | 通用医疗公司 | 蛋白质病的治疗 |
| EP2700933A1 (en) * | 2012-08-20 | 2014-02-26 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) | Raman, infrared, or Raman-Infrared analysis of peripheral blood plasma protein structure and its relation to cognitive development in Alzheimer's disease |
| EP2738558A1 (en) | 2012-11-28 | 2014-06-04 | ETH Zurich | Method and tools for the determination of conformation and conformational changes of proteins and of derivatives thereof |
| JP2017501848A (ja) * | 2013-11-19 | 2017-01-19 | プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド | 便秘症状からのレビー小体病の免疫療法のモニター |
| EP3071597B1 (en) * | 2013-11-21 | 2020-07-29 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use |
| US11073470B2 (en) | 2014-02-14 | 2021-07-27 | Betasense Gmbh | Attenuated total reflectance-based biosensor for conformation and secondary structure analysis |
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