DE19930607C2 - Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Vielzahl von Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Abstract

Zur Gewinnung von Daten über die Reaktionskinematik wird der Ablauf von Reaktionen in einer oder mehreren Proben von Zusammensetzungen an einer Vielzahl diskreter Meßorte optisch überwacht. Erfindungsgemäß werden zur Registrierung der Lichtsignale aufeinanderfolgende Einzelbilder jeweils der Gesamtheit der Meßorte während der zu erwartenden Dauer der ablaufenden Reaktionen aufgenommen. Die Auswertung der Lichtsignale erfolgt durch Analyse der die Meßorte wiedergebenden Bildausschnitte der aufgenommenen Einzelbilder.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Vielzahl von Proben und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bzw. des Patentanspruchs 6. Ein Verfah­ ren bzw. eine Vorrichtung dieser Gattung ist aus DE 197 45 373 A1 bekannt.

Die Kinetik chemischer Reaktionen wird üblicherweise anhand meßbarer physikalischer Eigenschaften verfolgt, die sich abhän­ gig von der Konzentration bestimmter Reaktanten oder des End­ produktes der Reaktion in der jeweils beobachteten Zusammen­ setzung ändern. Gebräuchlich sind insbesondere photometrische Messungen im Bereich sichtbaren oder ultravioletten Lichtes zur Erfassung von Fluoreszenz, Lumineszenz und optischer Eigen­ schaften wie z. B. des Lichtabsorptionsvermögens in ausgewählten Spektralbereichen, häufig unter Verwendung von Indikatorfarb­ stoffen. Um das jeweils zu messende Licht hervorzurufen, kann die beobachtete Probe der Zusammensetzung mit anregender Strah­ lung (z. B. UV-Licht zur Anregung von Fluoreszenz oder Lumines­ zenz) oder mit dem erforderlichen Einfallslicht (zur Messung der Absorption) bestrahlt werden. Das zu messende Licht kann aber auch Licht sein, das in der Zusammensetzung originär er­ zeugt wird und dessen Intensität sich in charakteristischer Weise während des Reaktionsablaufs ändert, wie dies als Chemo­ lumineszenz bekannt ist.

Wird die Reaktion in einem einzigen Reaktionsgefäß untersucht, kann das der Reaktion entsprechende physikalische Signal in einfacher Weise unter ununterbrochener Beobachtung durch ein Photometer unmittelbar registriert werden. Soll die Reaktion im Sinne eines großen Durchsatzes, wie es im Rahmen von Suchtests (Screening) notwendig ist, mehrfach mit unterschiedlicher Zu­ sammensetzung untersucht werden, bedient man sich üblicherweise sequentieller Verfahren unter Verwendung mehrerer Reaktions­ gefäße mit entsprechend unterschiedlich zusammengesetzten Pro­ ben. Als Reaktionsgefäße werden üblicherweise handelsübliche Küvetten, Mikrotiterplatten aber auch verschiedene Trägermate­ rialien genutzt, die sowohl einer kinetischen Signalregistrie­ rung zugänglich als auch zur Durchführung der chemischen Reak­ tion geeignet sind.

Bei einer ersten Variante sequentieller Verfahren läßt man die chemische Reaktion nacheinander in den verschiedenen Reaktions­ gefäßen ablaufen, und das zur Lichtmessung verwendete Photome­ ter wird nacheinander an den einzelnen Gefäßen eingesetzt. Die zur Bewertung einer chemischen Reaktion der Probe in einem Reaktionsgefäß notwendige Registrierdauer wird also vollständig für die Registrierung nur dieser Reaktion aufgewendet. Nach Beendigung dieser Registrierung wird der Vorgang separat mit dem nächsten Reaktionsgefäß durchlaufen. Dies wird wiederholt, bis die Reaktion in allen Proben registriert wurde. Die Gesamt­ meßzeit dieser Verfahren setzt sich hier hauptsächlich zusammen aus der Summe aller einzelnen Registrierdauern. Die Anzahl der Meßpunkte je Zeiteinheit, die zur Auswertung der kinetischen Reaktion zur Verfügung stehen, wird ausschließlich durch das Meßgerät bestimmt und liegt bei gebräuchlichen Photometern im Bereich von 10 bis 100 Meßpunkten je Sekunde. Nachteil dieses Verfahrens ist die notwendige lange Meßzeit für eine große An­ zahl von Proben.

Bei anderen sequentiellen Verfahren wird, zur Verkürzung der Gesamtmeßzeit, die zu beobachtende Reaktion in allen Reaktions­ gefäßen so zeitversetzt gestartet, daß während Reaktionsablau­ fes in einem Reaktionsgefäß bereits die Reaktion im jeweils nächsten Reaktionsgefäß beginnt. Die Reaktionsabläufe werden hierbei beobachtet, indem die jeweiligen Meßorte, also die einzelnen Proben, nacheinander, entsprechend dem Maß der Start­ zeitversetzung, vom Photometer zur Meßwertnahme anvisiert wer­ den und diese Folge zyklisch wiederholt wird, bis zum Ende der zuletzt gestarteten Reaktion. Die Gesamtmeßzeit dieser Verfah­ ren setzt sich hauptsächlich zusammen aus der Zeitdifferenz zwischen dem Meßbeginn an der ersten Probe und dem Meßbeginn an der letzten Probe (Summe der Startzeitversetzungen) und der Meßdauer für eine einzelne Reaktion.

Bei allen sequentiellen Verfahren ist die zeitliche Auflösung der Messungen begrenzt durch die Geschwindigkeit, mit welcher von Probe zu Probe geschritten werden kann. Die Schrittfolge wird üblicherweise realisiert durch mechanische Relativbewegung zwischen der Probenanordnung und der Lichtmeßeinrichtung, wie es z. B. aus DE 38 36 716 A1 oder EP 0 841 557 A2 be­ kannt ist. Dies läßt keine sehr hohen Geschwindigkeiten zu und bedeutet zudem einen relativ großen apparativen Aufwand. Ge­ bräuchliche Systeme erreichen bei der Registrierung von Kinetiken in Titerplatten mit 96 Kavitäten Geschwindigkeiten von bis zu zwei Meßpunkten je Sekunde. Hinzu kommt, daß der zeitliche Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Meßwertnahmen an jeweils der selben Probe von der Anzahl der Proben abhängt. Die Anzahl der Meßwertnahmen je Zeiteinheit bestimmt aber bei vorgegebenem Meßsignal im wesentlichen die Qualität der Beurteilung der registrierten chemischen Reaktion.

Die vorstehend genannten Nachteile lassen sich reduzieren oder ausräumen, indem man zur Detektion der Lichtsignale Strahlung aus den verschiedenen, gleichzeitig bereitgestellten Proben mittels eines geeigneten optischen Systems an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche einer Bildaufnahmeeinrichtung über­ trägt, die während der zu erwartenden Dauer der Reaktionen zyklisch abgetastet wird, um für die verschiedenen Orte der Bildaufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Lichtmeßwerte zu erhalten, die ausgewertet werden. Die Abta­ stung einer Bildaufnahmefläche kann viel schneller erfolgen als eine Abtastung der Proben durch mechanische Relativbewegung zwischen der Gesamtanordnung der Proben und einem Lichtmeß­ system. Somit lassen sich die Lichtsignale aus den verschie­ denen Proben immer nahezu gleichzeitig (quasi-parallel) detek­ tieren.

Eine Technik zur derartigen quasi-parallelen Detektion ist in der eingangs erwähnten DE 197 45 373 A1 beschrieben. Dort wird als Bildaufnahmeeinrichtung eine mit Video-Norm betriebene Kamera verwendet, deren Bildaufnahmefläche ein CCD-Array ist. Die Übertragung der Lichtstrahlung aus den Proben erfolgt mit­ tels eines hochauflösenden Lichtleiterbündels, das trichter­ förmig als sogenannter "Taper" ausgebildet ist, dessen groß­ flächige Stirnfläche die Probenvielzahl abdeckt und dessen kleinflächige Stirnfläche der Bildaufnahmefläche entspricht. Dieses recht aufwendige optische System soll Parallaxen-Effekte vermeiden, die sich ergeben können, wenn man für das Abbilden ein konventionelles Linsensystem verwendet. Bei konventioneller Linsenabbildung, also beim Abbilden der Gesamtansicht der Pro­ benvielzahl mittels des üblichen Objektivs einer CCD-Kamera, werden nämlich verschiedene Proben wegen ihrer unterschiedlich weiten Versetzung gegenüber der optischen Achse naturgemäß aus unterschiedlichen Betrachtungswinkeln vom Objektiv "gesehen". Diese Parallaxe beeinflußt zwangsläufig die an der Bildaufnah­ mefläche empfangene Lichtmenge und bewirkt somit, daß die Absolutwerte der detektierten Lichtsignale aus Proben an den Rändern des Gesichtsfeldes einem anderen Maßstabsfaktor unter­ liegen als die Lichtsignale aus zentral gelegenen Proben. Die für die einzelnen Proben erhaltenen Meßwertreihen sind bei herkömmlicher Linsenabbildung demnach nicht nur abhängig vom Reaktionsverlauf in der Probe, sondern unterliegen wegen der Parallaxe auch einem ungleichmäßigen, vom Ort der Probe abhän­ gigen Maßstab. Die Verwendung des parallaxenfrei abbildenden Lichtleiterbündels anstelle eines Objektivs soll dies verhin­ dern.

Bei einer anderen, aus DE 197 48 211 A1 bekannten Technik paralleler Detektion wird jeder Probe ein eigenes Linsensystem zugeordnet, bestehend aus einer dicht an der betreffenden Probe angeordneten Minilinse, welche ein Bild eines Ausschnittes der Probe in einer Zwischenebene erzeugt, und jedes dieser Zwi­ schenbilder wird dann auf ein jeweils zugeordnetes CCD-Element abgebildet, mittels einer gemeinsamen Feldlinse. Durch ein solches "gesplittetes" Linsensystem erfolgt eine Projektion einzelner verschiedener, jeweils parallaxenfrei erzeugter Zwi­ schenbilder von diskreten Ausschnitten der Gegenstandsebene auf die CCD-Elemente. Insoweit ist die Wirkung eher vergleichbar derjenigen eines Lichtleiterbündels.

Beide vorstehend genannten Verfahren einer parallelen bzw. quasi-parallelen Detektion haben den Nachteil, daß relativ komplizierte Mittel erforderlich sind, um die verschiedenen Lichtsignale den einzelnen Proben eindeutig zuzuordnen. Ein gesplittetes Linsensystem oder ein hochauflösendes Lichtleiter­ bündel zur parallaxenfreien Abbildung ist aufwändig und teuer, und zwar umso mehr, je größer die Anzahl der Proben ist. Hinzu kommt, daß die gesplittete Optik oder das Lichtleiterbündel an die spezielle Ausbildung und Geometrie der Probenanordnung an­ gepaßt sein muß. Dies bedingt, daß für die räumliche Anordnung der Reaktionsgefäße bzw. Proben ein bestimmtes Format vorgege­ ben wird, was aber von Nachteil ist, wenn die Anordnung von Reaktionsgefäßen verändert werden soll oder wenn die Proben von Fall zu Fall in nicht vorhersehbarer Weise unterschiedliche Anordnung und/oder Geometrie haben. Dies kann z. B. bei Verwen­ dung von Trägermaterialien wie Zellulosematrizen, bei denen einzelne Spots als Reaktionsgefäße bzw. Proben benutzt werden, durch die Einwirkung wäßriger Medien auf diese Trägermateria­ lien in unerwünschter Weise vorkommen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Technik vorzuse­ hen, die es erlaubt, Daten über die Reaktionskinetik in einer Vielzahl von Proben mit hoher zeitlicher Auflösung unter Ver­ wendung optischer Abbildung zu gewinnen, wobei weder die Auflö­ sung noch die Gesamtmeßzeit noch der Aufwand für die Abbil­ dungsoptik nennenswert von der Anzahl der Proben abhängt. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Patentanspruch 1 beschriebene Verfahren und durch die im Patentanspruch 6 be­ schriebene Vorrichtung gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Ausgestaltungen der Erfindung sind in Unteransprüchen gekennzeichnet.

Das Prinzip der Erfindung besteht darin, die Verwendung einer zyklisch abtastenden Bildaufnahmeeinrichtung zu kombinieren mit (a) der Verwendung nur eines einzigen Objektivs zur Gesamt­ abbildung aller Proben, (b) der Überlagerung einer virtuellen Maske zur Abgrenzung der Proben in der Gesamtabbildung und (c) einer Bestimmung der kinetischen Konstante der Reaktion nach dem Zeitgesetz erster Ordnung in jeder Probe. Werden Reaktionen nach dem Zeitgesetz erster Ordnung beobachtet, dann folgen die diesbezüglichen Lichtmeßwerte zeitlich einer Exponentialfunk­ tion, deren Zeitkonstante die kinetische Konstante dieser Reaktion darstellt und unabhängig von irgendwelchen Maßstabs­ faktoren der Funktion ist. Somit bleibt die Bestimmung der kinetischen Konstante unberührt von den oben beschriebenen Parallaxen-Effekten. Dies wiederum erlaubt die Verwendung nur eines einzigen Objektivs, auch unter Inkaufnahme etwaiger Parallaxen-Effekte. Der bisher notwendige Aufwand zur paral­ laxenfreien Abbildung kann daher entfallen.

Ebenso entfallen auch die bisherigen Probleme hinsichtlich der Kompatibilität zwischen der räumlichen Anordnung des Abbil­ dungssystems und den jeweiligen Geometrien der Probenanordnung. Änderungen oder Unterschiede in der räumlichen Anordnung der Proben, z. B. unterschiedliche Formate der Anordnung der Reak­ tionsgefäße oder unterschiedliche Formen bzw. Größen in der Ausdehnung eines zu beobachteten Probenbereiches, können leicht verkraftet werden. Für die Registrierung der Signale, also die Bildaufnahme, muß lediglich sichergestellt sein, daß alle ge­ wünschten Meßorte gleichzeitig von der Bildaufnahmeeinrichtung "sichtbar" sind. Nur für die Auswertung der aufgenommenen Si­ gnale bedarf es einer besonderen Berücksichtigung des Formates, um die Bildbestandteile bzw. Pixel jeder einzelnen Probenabbil­ dung gegenüber den anderen Probenabbildungen und gegenüber den übrigen Bildbereichen abzugrenzen. Diese Abgrenzung erfolgt einfach mittels Überlagerung einer virtuellen Maske, deren Gestalt dem jeweiligen Format der Gefäßanordnung leicht ange­ paßt werden kann. Eine solche Maske kann aus einem Vorrat vor­ gespeicherter Masken abgerufen werden; sie kann aber auch von Fall zu Fall neu definiert werden, unter Beobachtung des auf­ genommenen Gesamtbildes der Gefäßeinrichtung. Bei Realzeit- Auswertung muß die Maske natürlich vor dem Start der Reaktionen definiert werden.

In vielen Fällen ist es jedoch vorteilhafter, die Maske erst nach erfolgter Aufzeichnung der Bildsignale zu definieren, unter Beobachtung eines Standbildes aus der Aufzeichnung, um die Maske optimal auf die Gegebenheiten des tatsächlich statt­ gefunden Reaktionsablaufes abzustimmen. Die Ableitung der Meß­ werte mittels der Maske und die Auswertung geschieht dann an­ schließend anhand der wiederabgespielten Aufzeichnung. Hierbei kann die Abspielung mit verlangsamter Geschwindigkeit erfolgen, zur Anpassung an die Leistungsfähigkeit der verwendeten Verar­ beitungsmittel.

Die nachträgliche Definition der virtuellen Maske ist auch dann von besonderem Vorteil, wenn die Proben jeweils Zellkulturen sind und sich etwa beim Ausplattieren einer Zellkultur auf ein festes Kulturmedium die Lage der anwachsenden Kulturen in zu­ fälliger, nicht vorhersagbarer Weise ausbildet.

Allgemein gilt, daß die Abgrenzung der auszuwertenden Bildberei­ che mittels einer virtuellen Maske zu einer wesentlichen Verminderung der zu verarbeitenden Datenmenge führt. Die Daten­ gewinnung kann jeweils auf das Wesentliche konzentriert werden, so daß trotz möglicher hoher räumlicher und zeitlicher Auflö­ sung die Datenflut in vertretbaren Grenzen gehalten werden kann.

Eine Verringerung der Datenmenge kann man ohne Nachteil in allen Fällen auch erreichen, indem man die zur Auswertung her­ angezogenen Meßwerte für jeden Meßort zeitlich nicht äquidi­ stant sondern derart ableitet, daß der Abstand aufeinan­ derfolgender Meßwerte in zeitlich hochaufzulösenden Abschnitten des Reaktionsverlaufes größer ist als in Abschnitten, wo eine geringere zeitliche Auflösung tolerierbar ist. So kann man den zeitlichen Abstand der zur Auswertung herangezogenen aufeinan­ derfolgenden Meßwerte in Abschnitten schnellerer Lichtsignal­ änderungen kleiner wählen als in Abschnitten langsamerer Licht­ signaländerungen. Diese Möglichkeit gab es bei den vorbekannten Verfahren nicht, bei denen sich die Bewertungsverfahren an ei­ nem konstanten Signal/Zeit-Quotienten orientierten, so daß die Auswertung stets anhand zeitlich äquidistanter Meßpunkte erfol­ gen mußte.

Durch die erfindungsgemäße Bildaufnahme können Lichtsignale von einer Vielzahl verschiedener Meßorte nahezu gleichzeitig und in schneller Folge registriert werden. Die Lichtsignale lassen sich als Bildsignale mittels üblicher Aufzeichnung auf üblichen Datenträgern sichern.

Als Bildaufnahmeeinrichtung kann im Grunde jede Einrichtung verwendet werden, die in der Lage ist, aufeinanderfolgende Ein­ zelbilder der Gefäßeinrichtung so aufzunehmen, daß sich hieraus verarbeitbare Bildsignale ableiten lassen. Vorzugsweise wird eine Videokamera verwendet, die während der zu erwartenden Re­ aktionsdauer in der üblichen Weise zur periodischen Abtastung ihres Bildrasters betrieben wird, um die auszuwertenden Bild­ signale direkt als Videosignale zu erzeugen. Brauchbar ist aber auch eine elektronische Kamera, die aufeinanderfolgende Einzel­ bilder jeweils als Standbild nach jeweiliger Einzel-Auslösung aufnimmt und entsprechende elektrische Bildsignale liefert. Die zur Auswertung heranzuziehenden Meßwerte können in diesen bei­ den Fällen in Realzeit "live" aus Bildsignalen schon während des Betriebs der Kamera abgeleitet werden; die Meßwerte können aber auch, was in vielen Fällen vorzuziehen ist, aus einer Auf­ zeichnung der elektrischen Bildsignale abgeleitet werden. Im Rahmen der Erfindung ist es auch möglich, die Einzelbilder mit­ tels einer Laufbild- oder Einzelbildkamera auf ein photoemp­ findliches Medium wie z. B. einen Film aufzuzeichnen, das dann (nach Entwicklung und Fixierung) zur Erzeugung verarbeitbarer elektrischer Signale mittels eines Scanners abgetastet wird.

Die Anzahl der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren beobacht­ baren Meßorte wird durch das Auflösungsvermögen der verwendeten Bildaufnahme- bzw. Abtasteinrichtung bestimmt. Bereits das Auf­ lösungsvermögen relativ billiger Videokameras von einigen hun­ derttausend Pixeln pro Vollbild kann gut ausreichen, die Reak­ tionen an mehr als hundert verschiedenen Proben gleichzeitig photometrisch zu registrieren. Die Vielzahl der Proben können sich in einer entsprechenden Vielzahl von Reaktionsgefäßen befinden, sie können aber auch verschiedene Orte in einem Reak­ tionsgefäß einnehmen.

Die Signale etwa einer Videoaufnahme, wie sie vorzugsweise genutzt wird, besitzen eine weitgehend lineare Abhängigkeit zwischen Konzentration eines Indikatorfarbstoffes in einer Probe und dem Farbwert des Videosignals der betreffenden Pro­ benabbildung. In den meisten Fällen können also Pixelwerte des Videosignals in linearem Maßstab die Farbstoffkonzentration anzeigen, was die Auswertung sehr vereinfacht. In davon abwei­ chenden Fällen kann man eine nichtlineare Abhängigkeit durch Mitführen geeigneter Konzentrationsreihen berücksichtigen:
Durch Anpassen nichtlinearer Kurven mittels geeigneter Verfah­ ren, wie z. B. mittels einer Spline-Funktion, kann diese Abhän­ gigkeit mathematisch definiert werden. Diese Funktion kann dann weiterhin genutzt werden um die unmittelbar durch das Bild­ signal registrierten Farbwerte in entsprechender Weise zu kor­ rigieren, d. h. auf die tatsächliche Konzentration zu kalibrieren.

Um die zu registrierenden Lichtsignale von störenden Signalen zu trennen, kann es von Vorteil sein, Filter einzusetzen. Im Falle einer Anregung der Lichtsignale durch UV-Bestrahlung kann z. B. ein Schwerpunktfilter mit einer Durchlässigkeit zwischen 280 und 360 nm verwendet werden, um das UV-Anregungssignal der Lichtquelle zu filtern, und des weiteren ein Schwerpunktfilter unmittelbar vor der Kameralinse, um das Signallicht zu filtern. Letzeres ist von Vorteil, wenn eine monochromatische Bildauf­ nahmeeinrichtung verwendet wird; im Falle einer farbtauglichen Bildaufnahmeeinrichtung können auszuwertende Farbanteile des Signallichtes gewünschtenfalls durch "elektronische Filterung" selektiert werden, d. h. durch Einstellung des Anteilsverhält­ nisses der Primärfarbkomponenten des Farbbildsignals.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der beigefügten Zeichnun­ gen und anhand einiger Ausführungsbeispiele erläutert.

Fig. 1 zeigt schematisch, teilweise in Blockform, ein Beispiel für den Aufbau einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens;

Fig. 2 zeigt schematisch die Draufsicht auf die Kavitäten einer Titerplatte als Beispiel für eine typische Anordnung einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen;

Fig. 3 zeigt die Gestalt einer virtuellen Maske für die Abbildung der Gefäßanordnung nach Fig. 2;

Fig. 4 zeigt ein Beispiel für eine nicht-äquidistante Meßwertnahme;

Fig. 5 und 6 zeigen ein Beispiel für die Ausbildung von Zellkulturen in einem Reaktionsgefäß und die Anordnung geeigneter Maskenöffnungen zu deren Beobachtung.

Die in der Fig. 1 gezeigte Vorrichtung enthält eine insgesamt mit 10 bezeichnete Gefäßeinrichtung, im dargestellten Fall mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 (in Schnittansicht ge­ zeigt). Die Reaktionsgefäße 11 enthalten Proben 12 von Zusam­ mensetzungen, in denen Reaktionen ablaufen, die photometrisch überwacht werden sollen, um Lichtsignale zu registrieren, die charakteristisch für die Reaktionsabläufe sind. Die Gefäßein­ richtung 10 kann, wie als Beispiel schematisch gezeigt, eine Titerplatte sein, deren Kavitäten die Reaktionsgefäße 11 bil­ den. Es kann auch eine beliebige Anordnung anderer Reaktions­ gefäße verwendet werden, z. B. eine Anordnung einzelner Küvet­ ten oder ein Trägermaterial wie etwa eine Zellulosematrix, in der einzelne Spots die Reaktionsgefäße bilden. Jedes der Ge­ fäße bzw. jeder Spot bildet einen gesonderten diskreten Meßort für eine durchzuführende photometrische Messung. Jedes Gefäß kann aber selbst wiederum einer Summe diskreter Meßorte beein­ halten, die sich selektiv mit einer virtuellen Maske in einem aufgenommenen Bild abgrenzen und bewerten lassen. Die Gefäß­ einrichtung 10 kann aber auch ein einziges Gefäß sein, in welchem an unterschiedlichen Stellen Reaktionen mit unterschiedlicher Kinetik ablaufen können. In diesem Fall bilden die jeweils zu überwachenden Stellen der Probe diskrete Meßorte.

Oberhalb der Gefäßeinrichtung 10 ist eine Bildaufnahmeeinrich­ tung 20, die mononochromatisch oder farbtauglich sein kann, so angeordnet, daß sie von oben alle Meßorte gleichzeitig über­ blickt. Das heißt, das Objektiv 21 der Bildaufnahmeeinrichtung 20 bildet die Draufsicht der Gefäßeinrichtung 10 auf einer lichtempfindlichen Bildaufnahmefläche (z. B einem CCD-Bildsen­ sor im Falle einer elektronischen Kamera) ab. Jeder Meßort ist also anhand der Bildkoordinaten seiner Abbildung eindeutig identifizierbar. Die Bildaufnahmeeinrichtung 20 sei im darge­ stellten Beispielsfall eine Videokamera und kann gewünschten­ falls so ausgelegt sein, daß die Bildwiederholfrequenz (Rasterabtastrate bzw. Vollbildfrequenz) veränderbar ist.

Die in der Zeichnung dargestellte Vorrichtung enthält ferner eine aus Lampen 31, 32 bestehende Beleuchtungseinrichtung, um die Meßorte in der Gefäßeinrichtung 10 derart zu bestrahlen, daß die Reaktions­ abläufe anhand von Lichtsignalen beobachtet werden können. Die Art der Beleuchtung wird abhängig davon gewählt, welche Art von Lichterscheinung oder optischer Eigenschaft als Indikation für das Fortschreiten der ablaufenden Reaktionen genutzt wer­ den soll. Beim dargestellten Beispiel sind seitlich der Bildaufnahmeeinrichtung 20 vier um 90° winkelversetzte Lampen 31 vorgesehen (von denen nur die beiden vorderen zu sehen sind), welche die Proben 12 von oben bestrahlen, und eine unter der (transparenten) Gefäß­ einrichtung 10 angeordnete Lampe 32, welche die Proben 12 von unten bestrahlt. Für die Anordnung der Lampen kann aber auch eine andere, für die Lichtmessung geeignete Geometrie gewählt werden.

Soll z. B. Fluoreszenz oder Lumineszenz als reaktionsindizie­ rende Größe beobachtet werden, wird für die Beleuchtung eine entsprechende anregende Strahlung verwendet, z. B. UV-Licht, vorzugsweise aus allen Lampen 31 und 32. Um Nutzlicht von Störlicht zu trennen, können Filter benutzt werden, vorzugs­ weise Schwerpunktfilter (z. B. Durchlässigkeitsbereich zwischen 280 und 360 nm) an den UV-Lampen (nicht dargestellt) und ein Schwerpunktfilter 22 (z. B. 430 ± 10 nm) zum Durchlassen des Luminenzlichtes vor dem Objektiv 21.

Werden Indikatorfarbstoffe in den Proben verwendet, können die Proben durch sichtbares Licht beleuchtet werden. Hierbei kann mit Auflicht unter Verwendung der Lampen 31 und/oder mit Durchlicht unter Verwendung der Lampe 32 gearbeitet werden. Zur Beobachtung von Lichtabsorption verwendet man vorzugsweise nur die Lampe 32 als Durchlicht-Beleuchtungsquelle. Um Nutz­ licht von Störlicht zu trennen oder bestimmte Farbeffekte in den Proben selektiv zu registrieren, können auch hier Filter, gegebenenfalls dem jeweiligen Farbstoff angepaßt, an den Lampen 31, 32 bzw. vor dem Objektiv 21 benutzt werden. Ist die Bildaufnahme­ einrichtung 20 eine Farbkamera, kann eine eventuell erwünschte Farbselektion auch elektronisch bei der Signalverarbeitung erfolgen, durch entsprechende relative Gewichtung der Primärfarbkomponenten des Farbbildsignals (z. B. der Rot-, Grün- und Blau-Komponente bei einem RGB-Videosignal).

Soll Chemolumineszenz als reaktionsindizierende Größe beobach­ tet werden, bleiben die Lampen 31, 32 vorzugs­ weise ausgeschaltet.

Die in der Zeichnung gezeigte Vorrichtung enthält ferner Verarbeitungsmittel 40 in Form eines Computers, einen Monitor 50 und eine Aufzeichnungs- und Abspieleinrichtung 60 für Videosignale. Der Videosignalausgang der Bild­ aufnahmeeinrichtung 20 führt zur Einrichtung 60 und von dort zu Videosignal­ eingängen des Monitors 50 und der Verarbeitungsmittel 40. Es sind (nicht dargestellte) Schaltmittel vorgesehen, um die Videosignale von der Bildaufnahmeeinrichtung 20 wahlweise mit oder ohne gleichzeitige Aufzeich­ nung in der Einrichtung 60 auf den Monitor 50 und/oder auf die Verarbeitungsmittel 40 koppeln zu können und um aufgezeichnete Videosignale aus der Einrichtung 60 zum Monitor 50 und/oder zu den Verarbeitungsmitteln 40 koppeln zu können.

Die Verarbeitungsmittel 40 enthalten Prozessoren 41 und Speichereinrichtun­ gen 42 zur programmgesteuerten Verarbeitung und Auswertung der Videosignale. Eine allgemein als Block 70 dargestellte Einga­ bevorrichtung enthält Mittel für Nutzereingaben (Tastatur, Maus) an den Verarbeitungsmitteln 40. Weitere Peripheriegeräte, stellvertre­ tend durch den Block 80 dargestellt, können Ausgabeeinrichtun­ gen wie z. B einen Drucker oder zusätzliche Datenträger enthal­ ten. Zwischen den Verarbeitungsmitteln 40 und dem Monitor 50 ist die übliche Datenkommunikationsverbindung vorgesehen, um von den Verarbeitungsmitteln verarbeitete Bildsignale, Graphiken als Ergebnisse der Auswer­ tung von Videosignalen und von den Verarbeitungsmitteln generierte Ikons, Befehls- und Anzeigefelder, Masken, Fenster, Mitteilungen, Menüs u. dergl. wiederzugeben.

Zur Durchführung des Verfahrens wird die Gefäßeinrichtung 10 mit der oder den zu beobachtenden Probe(n) gefüllt und in das Gesichtsfeld der Bildaufnahmeeinrichtung 20 gebracht, und gewünschtenfalls werden die Lampe 31 und/oder die Lampe 32 und die Bildaufnahmeeinrichtung 20 eingeschaltet. Das von der Bildaufnahmeeinrichtung 20 nach deren Einschaltung gesehene Bild wird auf dem Bildschirm des Monitors 50 wiedergegeben. Mit Hilfe der Verarbeitungsmittel 40 kann als Schablone oder Maske ein frei definiertes virtuelles Netz erzeugt und so auf dem Bildschirm positioniert werden, daß die Innenseiten der Netzöffnungen bzw. die "Maschen" des Netzes Bildausschnitte einrahmen, welche jeweils einen Meßort als Fläche auf dem Bildschirm definieren. Die Art der Geometrie dieser Flächen kann beliebig sein, z. B. kreisförmig oder rechteckig.

Die Fig. 2 zeigt als Beispiel eine Gefäßeinrichtung 10 mit einer Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 in einer Ansicht, wie sie von der Bildaufnahmeeinrichtung 20 gesehen wird und auf dem Bildschirm des Monitors 50 abgebildet werden kann. Diese Gefäßeinrichtung 10 kann eine Titerplatte sein, deren Kavitäten die Reaktionsgefäße 11 bilden. Der Einfachheit halber sind nur 24 Kavitäten dargestellt, angeord­ net in einer Matrix aus vier Reihen und sechs Spalten; in der Praxis kann die Titerplatte weit mehr Kavitäten aufweisen, in handelsüblichen Ausführungsformen z. B. 8 × 12 = 96 oder 16 × 24 = 384 Kavitäten. Die Reaktionsgefäße können auch einzelne Küvetten sein oder Spots einer Spotmatrix von Proben (z. B. 20 × 20 Spots) auf einem geeigneten Trägermaterial.

Die Fig. 3 zeigt als Beispiel ein virtuelles Netz 90 in Form einer Maske mit 24 quadratischen Teilflächen 91, welche ein­ zelne Maskenöffnungen darstellen. Dieses Netz 90 ist dazu konzipiert, der Abbildung der Gefäßeinrichtung 10 nach Fig. 2 überlagert zu werden. Jede Teilfläche 91 entspricht einem "Meßort", d. h. sie definiert einen Bildbereich, der einem auszuwertenden Bereich der in den Reaktionsgefäßen 11 enthaltenen Proben entspricht.

Nach Festlegen der Datensammelrate (d. h. Meßwertnahme je Zeit­ einheit) und nach dem Start der Reaktionen in den Reaktions­ gefäßen können die Werte jeweils mehrerer oder aller Pixel der einzelnen Teilflächen 91 jeweils mittels üblicher Algorithmen integriert werden. Da jede Teilfläche einem Meßort entspricht, repräsentieren die integrierten Daten aus jeder einzelnen Flä­ che pro Rasterabtastperiode (Videovollbild) einen Lichtmeßwert vom betreffenden Meßort. Es können auch Daten über jeweils mehrere Vollbildperioden integriert werden, um jeweils einen Lichtmeßwert zu bilden. Durch schrittweises Auswerten der Videobilder können also zeitlich geordnete Meßwertreihen erhalten werden, mit denen die Kinetik der chemischen Reaktion, die in allen Reaktionsgefäßen abläuft, beschrieben werden kann.

Diese Meßdaten können für weitere Bewertungen zugänglich abgespeichert oder graphisch dargestellt werden. Eine solche graphische Darstellung kann auch auf den Bildschirm des Monitors 50 wiedergegeben werden. Beispielsweise können die berechneten Meßwertkurven in jeweils einem eigenen kleinen Feld des Schirmbildes wiedergegeben werden, wobei diese Graphikbildchen vorzugsweise in gleicher räumlicher Anordnung zueinander angelegt werden, wie es der Anordnung der Meßorte entspricht. Die Menge der Graphikbild­ chen kann entweder bildschirmfüllend oder in einem gesonderten Abschnitt des Schirms neben der Meßortabbildung wiedergegeben werden.

Mittels bekannter Rechenverfahren werden aus den Meßdaten die kinetischen Konstanten der Reaktionen nach dem Zeitgesetz erster Ordnung berechnet. Die Gewinnung der einzelnen Meßwerte (Datenpunkte) kann gewünschten­ falls nicht äquidistant erfolgen, angepaßt an die Nichtlineari­ tät entsprechend dem Zeitgesetz erster Ordnung.

Ein Beispiel für eine nicht äquidistante Meßwertnahme ist qualitativ in der Fig. 4 veranschaulicht. Diese Figur zeigt den zeitlichen Verlauf der an einer Probe beobachtbaren Lichtintensität L im Falle einer Reaktion erster Ordnung. Die Meßgröße steigt nach dem Start der Reaktion steil an und wird dann zunehmend flacher. Zur genauen Auswertung genügt eine hohe zeitliche Auflösung der Meßwertnahme nur in den Bereichen steilen Anstiegs, während man sich in anderen Bereichen mit geringerer Auflösung begnügen kann, um die Datenmenge zu reduzieren. Diesem Prinzip folgt das in der Fig. 4 gezeigte Schema, indem die zeitlichen Abstände der Meßwertnahme zu Beginn der Reaktion sehr klein und dann zunehmend größer gewählt werden, wie es die diskreten Punkte in der Fig. 4 rein qualitativ veranschaulichen. Als praktisches Beispiel für eine Reaktion erster Ordnung mit einer Reaktionsdauer von 900 Sekunden kann zu Beginn ein Zeitabstand von 0,4 Sekunden gewählt werden, der bis zum Ende der Reaktion allmählich auf etwa 80 Sekunden vergrößert wird, um insgesamt nur etwa 500 Meßwerte zu erhalten (statt 2250 Meßwerte im Falle einer durchgehenden unveränderten Zeitauflösung von 0,4 Sekunden).

Im folgenden werden vier spezielle Beispiele für die Durchfüh­ rung des Verfahrens beschrieben.

Beispiel 1

Bei diesem Beispiel wird zur Bildung der Reaktionsgefäße ein 96 mal 140 mm großes Trägermaterial (Zellulose, Whatman 540) verwendet, auf welches eine Peptidbibliothek der Sequenz QUE- XaaXaaF-FLU-Z, in der QUE als Fluoreszenzquencher, Xaa als eine mögliche natürliche Aminosäure und FLU als ein Fluorogen dienen, in einer Spotmatrix von 400 (20 × 20 Spots) aufsyntheti­ siert wird. Unter dem Trägermaterial befindet sich eine Wanne, und darüber sind im Abstand von 30 cm eine handelsübliche Farb-Videokamera als Bildaufnahmeeinrichtung 20 und seitlich davon vier UV-Lampen 31 (wie in der Zeichnung gezeigt) angebracht. Unmittelbar vor dem Objektiv 21 ist ein Schwerpunktfilter 22 (430 ± 15 nm) angebracht. Die Wanne ist gefüllt mit 10 ml einer gepufferten Chymotrypsinlösung (0,1 mg/ml Chymotrypsin; 0,1 M Phosphatpuf­ fer pH 7.8).

Durch Eintauchen der Spotmatrix in die Chymotrypsinlösung wird die Reaktion gestartet. Die Zunahme der Fluoreszenz durch chymotryptische Hydrolyse wird mittels der als Bildaufnahmeeinrichtung 20 verwendeten Videokamera bei einer Bildwiederholfrequenz von 20 Vollbildern je Sekunde für eine Dauer von 15 min nach Start der Reaktion vom Gerät 60 aufgezeichnet.

Zur Auswertung wird, während des Abspielens der aufgezeichne­ ten Videosequenzen, auf dem Bildschirm des Monitors 50 ein virtuelles Netz von 20 mal 20 Einzelflächen so angeordnet, daß repräsentative kreisrunde Flächen der 400 Spots abgegrenzt werden. Durch Integration von 16 Pixeln je Einzelfläche über jeweils 10 Vollbilder, was einer Meßwertrate von jeweils einem Meßwert je 10 Vollbilder bzw. von 2 Meßwerten pro Sekunde für jeden Spot entspricht, werden alle 400 Spots kinetisch ausge­ wertet, und mittels linearer Regression werden die Anfangs­ anstiege berechnet. Der Vergleich der synthetisierten Peptid­ sequenzen mit den berechneten kinetischen Konstanten läßt Rückschlüsse über die Substratspezifität der verwendeten Protease zu.

Beispiel 2

Als Anordnung von Reaktionsgefäßen wird hier eine Titerplatte mit 96 Kavitäten verwendet. In die Kavitäten werden je 137 µl einer Lösung aus 7 µl Serum, 50 µl Substratlösung (123 mg/L Succinyl-Phe-Pro-Phe-4-nitroanilid in 35 mmol/L HEPES Puffer, pH 7,8) und 80 µl Chymotrypsin-Lösung (1 g/L Chymotrypsin in 35 mmol/L HEPES Puffer, pH 7,8) pipettiert.

Die Reaktion wird jeweils durch die Zugabe der 50-µl-Substrat­ lösung gleichzeitig zu allen Kavitäten mittels eines handels­ üblichen Pipettiersystems gestartet. Während der Reaktion wird die Titerplatte von unten mittels weißem Licht (z. B. durch die Lampe 32 bei der in der Zeichnung dargestellten Apparatur) gleichmäßig angestrahlt. Die Änderung der Lichtabsorption wird mittels der als Bildaufnahmeeinrichtung 20 verwendeten Videokamera bei einer Bildwiederholfrequenz von 20 Vollbildern je Sekunde für 20 min nach Start der Reaktion aufgezeichnet. Das geeignete Lichtsignal wird durch Vorschal­ ten eines Schwerpunktfilters 22 (390 ± 5 nm) vor das Objektiv 21 der Bildaufnahmeeinrichtung 20 erhalten.

Zur Auswertung wird, vor dem Abspielen der aufgezeichneten Videosequenzen, auf dem Bildschirm des Monitors 50 ein stehen­ des Bild der 96 Kavitäten erzeugt, und ein virtuelles Netz von 8 mal 12 Einzelflächen wird so auf dem Bildschirm angeordnet, daß repräsentative Flächen der 96 Spots einzeln abgegrenzt werden. Während des Vorlaufs der Videosequenzen mit einer Bildwiederholfrequenz von 10 Vollbildern je Sekunde wird durch Integration von 3 mal 3 Pixeln je Einzelfläche die Änderung der Lichtabsorption aller 96 Kavitäten erfaßt.

Die Reaktion wird gemäß einem Konzentrations-Zeitgesetz ers­ ter Ordnung ausgewertet. Die Reaktionsgeschwindig­ keits-Konstanten befinden sich im Bereich zwischen 4.10^-3 und 3.10^-2 je Sekunde. Zur Berechnung der Reaktionskonstanten werden Datensammelraten verwendet, die folgendem Zeitgesetz entsprechen:

Dsz = ln(1 - A)/k, mit A = [1 - exp(- k.gZ)]/Dp.

Es bedeuten:
Dsz = Zeit, zu der ein Meßpunkt zur Berechnung herangezogen wird;
k = kinetische Konstante einer Reaktion erster Ordnung
gZ = gesamte Reaktionszeit, über die die Reaktion beobach­ tet wird;
Dp = Anzahl aller Datenpunkte, mit der die Reaktion be­ schrieben wird.

Mittels dieser Datenpunkte können nun die genauen kinetischen Konstanten mittels üblicher Algorithmen berechnet werden. Der Vergleich dieser Konstanten einzelner Kavitäten erlaubt die Charakterisierung der Peptidyl-prolyl-cis/trans-Isomerase- Aktivitäten in humanem Serum.

Beispiel 3

In eine Titerplatte mit 16 mal 24 Kavitäten werden je 70 µl Substratlösung 10 µl Enzymlösung und 1 µl einer DMSO-Lösung pipettiert. Die DMSO-Lösung enthält jeweils unterschiedliche Naturstoffe einer Naturstoffbank, in einer Konzentration von 1 mg je ml DMSO. Einige der Lösungen enthalten als Kontrolle keine solche Zusätze. Das Substrat besitzt die Sequenz A1-A2- A3-P-A4-A5-A6. Dabei steht P für die Aminosäure Prolin. A1, A2, A3, A4, A5, A6 stehen für Peptide, vorzugsweise aber Aminosäuren, aber auch Verbindungen, die sich innerhalb von Peptidketten einbauen lassen und bei Anregung mit einer geeig­ neten Wellenlänge fluoreszieren, bzw. auch Verbindungen, die bei entsprechender Geometrie und geeignetem Abstand von der fluoreszierenden Verbindung diese Fluoreszenz löschen (quen­ chen) können. Die verwendeten Aminosäuren bzw. Peptide können mit dem Fachmann bekannten chemischen Modifizierungen weit­ gehend verändert sein.

Ein besonderes Kennzeichen dieser Substrate ist, daß es unter geeigneten Bedingungen zur Ausbildung einer zeitweilig bestän­ digen Verbindung zwischen chemischen Funktionalitäten kommen kann, die zu einem Ringschluß führen können, die die Amino­ säure Prolin einschließen. Dieser Ringschluß führt zu der besonderen Eigenschaft dieser Substrate, daß sich die Konzen­ tration der Konformation der Peptidyl-Prolyl-Bindung dieses Ringes von der Konzentration unterscheidet, die dieses Sub­ strat ohne einen solchen Ring in wäßrigen Lösungen, mit phy­ siologischen Eigenschaften, ausbilden. Eine weitere Beson­ derheit dieser Substrate ist die Eigenschaft, daß dieser molekulare Geometrieunterschied zwischen offenkettiger und ringförmiger Struktur zu einem Unterschied in der Fluoreszenz führt. Die Öffnung des Ringes kann durch physikalische Metho­ den erfolgen, so z. B. durch einen Lichtblitz, wenn der Ring­ schluß lichtempfindlich ist, sie kann aber auch durch chemi­ sche Reagenzien (Starter) ausgelöst werden, wenn der Ring­ schluß chemisch empfindliche Gruppierungen wie z. B. protease­ sensible Schnittstellen aufweist. Erfolgt die Ringöffnung durch geeignete Versuchsanordnung so schnell, daß die Einstel­ lung des Konformerengleichgewichtes geschwindigkeitsbestimmend wird, kann dessen Katalyse anhand der Fluoreszenzänderung beobachtet werden.

Beim hier beschriebenen Verfahrensbeispiel erfolgt die enzyma­ tische Katalyse durch Zugabe von 10 µl einer Lösung von Cyclophylin als Peptidylprolyl-cis/trans-Isomerase. Die Ringöffnung je Kavität gelingt nach Zugabe von 40 µl Starter innerhalb von 7 sec. Eine notwendige schnelle Mischung wird durch eine berührungsfreie Methode innerhalb dieser Zeit erreicht. Die Zugabe des Starters erfolgt hierbei mittels einer 16-fach- Dosiereinrichtung sequentiell in aufeinanderfolgende 16er- Reihen der Kavitäten, innerhalb einer Zeit von 4 Sekunden für alle 16 mal 24 Kavitäten. Dabei gelangt jeweils innerhalb von 3 Sekunden nach Start der Reaktion die jeweilige 16er-Reihe zur Auswertung. Danach werden alle Kavitäten über eine Zeit von 20 Minuten gemäß den spektroskopischen Gegebenheiten wie Beispiel 1 und mit einer Datensammelrate vermessen, die ähnlich variiert, wie es in Fig. 4 gezeigt ist, entsprechend einem Zeitgesetz erster Ordnung unter Zugrundelegung einer Geschwindigkweitskonstante von 4.10^-3 s^-1 und einer Gesamt­ anzahl von 999 Meßwerten je Kavität.

Die Draufsicht auf die Titerplatte wird von der Bildaufnahmeeinrichtung 20 aufgenommen und als Gesamtbild auf dem Monitor 50 wiedergege­ ben. Über dieses Bild wird ein virtuelles Netz von 16 mal 24 rechteckigen Einzelflächen so auf dem Bildschirm angeordnet, daß diese jeweils einen Ausschnitt der Probenabbildungen in den Kavitäten der Titerplatte abgrenzen. Nach dem Start der Reaktion und Vermischen der 40 µl Starterlösung in den jeweils 90 µl Vorlagelösung (10 µl Enzym- und 80 µl Substratlösung) werden, durch Integration von jeweils 4 Pixeln innerhalb jeder Einzelfläche bei oben beschriebener Registrierhäufigkeit von insgesamt 999 Meßpunkten je Kavität, alle 384 Flächen zeitbe­ zogen ausgewertet, und nach Anpassen einer Reaktion gemäß einem Geschwindigkeitsgesetz erster Ordnung werden die Geschwin­ digkeitskonstanten berechnet. Der Vergleich der Geschwindig­ keitskonstanten aller Kavitäten miteinander, beispielsweise als Balkendiagramm, läßt Wirkstoffe erkennen, die die Aktivi­ tät des zugesetzten Enzyms inhibieren.

Beispiel 4

Dieses Beispiel entspricht im wesentlichem dem Beispiel 3. Es demonstriert aber in besonderer Weise den Einsatz des Meßver­ fahrens innerhalb eines Massenscreenings ("Highthroughput").

Nach Zuführung einer vorbereiteten Titerplatte (16 mal 24 Kavitäten) auf einen Titerplatten-Trägerschlitten des Meßplat­ zes beginnt jeweils ein neuer Meßzyklus. Die Vorbereitung der Titerplatte beinhaltet das Zupipettieren aller notwendigen Reagenzien in den geeigneten Mengen, so daß durch Zugabe eines Startreagenz die zu beurteilende Reaktion gestartet werden kann. Folgende Schritte laufen dann ohne manuelles Eingreifen automatisch ab:

• 1. Die Titerplatte wird sequentiell mit Startreagenz verse­ hen.
• 2. Die einzelnen Kavitäten der Titerplatte werden berührungs­ frei durch Zugabe eines gepulsten Luftstromes homogen gemischt.
• 3. Die Titerplatte fährt unmittelbar weiter in die Zone der Beobachtung, d. h. in das Gesichtsfeld der Bildaufnahmeeinrichtung 20.
• 4. Beim automatischen Bewegen der Titerplatte erfolgt die Lesung der Titerplattenkennung mittels Balkencode- Lesegerät.
• 5. über 20 Minuten erfolgt die Registrierung der Meßsignale, wie dies in Beispiel 3 beschrieben wurde.
• 6. Die 383616 Originalmeßdaten (16 mal 24 mal 999) werden automatisch von den Verarbeitungsmitteln 40 als Datenfile, welches an der Titerplattenkodierung und dem Datum erkennbar ist, auf einem Datenträger (Server) abgelegt.
• 7. Alle Meßdaten werden kavitätsbezogen verrechnet, wie dies im Beispiel 3 beschrieben wurde.
• 8. Die kavitätsbezogenen Ergebnisse, wie Geschwindigkeitskon­ stante, Amplitude, extrapolierte Endfluoreszenz werden ebenfalls automatisch von den Verarbeitungsmitteln 40 als Datenfile, welches an der Titerplattenkodierung und dem Datum erkenn­ bar ist, auf einem Datenträger (Server) abgelegt.
• 9. Entsprechend einem vorher eingegebenen Bewertungsmaßstab werden nichtplausible Messungen (dies sind insbesondere solche mit unerwartet extremen Meßwerten) aber auch solche, bei denen ein Bewertungskriterium im Sinne eines sogenannten "Hits" erfüllt wurde, auf einem angeschlosse­ nen Drucker ausgegeben.
• 10. Die Titerplatte wird aus der Beobachtungszone herausgefah­ ren und mittels geeigneter Hilfsmittel vom Meßschlitten entfernt.
• 11. Durch Zuführen einer weiteren Titerplatte wird ein näch­ ster Zyklus gestartet.

Weitere Ausführungsformen

Wie bereits erwähnt, können die verschiedenen Proben auch verschiedene Bereiche in einem einzelnen Reaktionsgefäß sein, wobei die virtuelle Maske von Fall zu Fall so angepaßt werden kann, daß Meßwerte nur für diejenigen Bereiche abgeleitet werden, die eine auszuwertende Reaktion zeigen. Ein Beispiel hierfür ist in den Fig. 5 und 6 dargestellt. Die Fig. 5 zeigt das Bild eines Reaktionsgefäßes 11 nach Ablauf einer Reaktionszeit, in welcher sich eine Vielzahl diskreter, optisch als Flecken erkennbarer Zellkulturen entwickelt hat. Anhand dieses "letzten" Bildes einer zuvor aufgezeichneten Bilderfolge wird auf dem Bildschirm eine Maske definiert, deren Öffnungen als Teilflächen 91 die einzelnen Kulturen umgrenzen, wie in Fig. 6 gezeigt. Die Aufzeichnung der Bilder­ folge wird dann wieder abgespielt, und die entsprechend den Maskenöffnungen selektierten Bildsignale werden ausgewertet. Das Erkennen der Flecken und die Plazierung der Maskenöffnun­ gen kann auch durch geeignete Bildverarbeitungs-Software automatisch erfolgen. Für die Auswertung kann mit Globalmeß­ werten für jeden Meßort durch räumliche Integration der Meß­ ortpixel gearbeitet werden.

Wie weiter oben angesprochen, läßt sich das vorstehend beschriebene Verfahren auch mit Bildaufnahmeeinrichtungen realisieren, die Bild­ information nicht selbst in elektrische Signale umwandeln, sondern z. B. auf photographische Bildträger aufzeichnen. In diesem Fall werden die zu verarbeitenden Bildsignale durch Abtastung dieser Bildträger mittels eines geeigneten Scanners gewonnen (z. B. mittels eines Filmabtasters, wenn der Bildträ­ ger ein photographischer Kinofilm ist).

Claims (11)

1. Verfahren zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Viel­ zahl von Proben, durch optische Überwachung der Reaktions­ abläufe und Auswertung der dabei detektierten Lichtsignale,
wobei zur Detektion der Lichtsignale Strahlung aus den gleichzeitig bereitgestellten Proben an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche einer Bildaufnahmeeinrichtung übertragen wird, die während der zu erwartenden Dauer der Reaktionen zyklisch abgetastet wird, um für verschiedene Orte der Bild­ aufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Licht­ meßwerte zu erhalten, die ausgewertet werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Gesamtansicht aller Proben über ein einziges Objek­ tiv (21) der Bildaufnahmeeinrichtung (20) auf die Bildaufnahme­ fläche als Gesamtabbildung abgebildet wird,
daß bei der Abtastung dieser Gesamtabbildung eine virtuelle Maske mit einer Vielzahl von Öffnungen überlagert wird, deren jede eine Menge von Pixeln aus dem einer jeweils zugeordneten Probe entsprechenden Teil der Gesamtabbildung abgrenzt,
und daß die Lichtmeßwerte aus jeder dieser abgegrenzten Mengen von Pixeln abgeleitet und zur Bestimmung der kinetischen Konstante der Reaktion nach dem Zeitgesetz erster Ordnung in der betref­ fenden Probe ausgewertet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pixel in mindestens einer der abgegrenzten Pixelmengen wiederholt und über jeweils eine vorgewählte Anzahl n ≧ 1 von zyklischen Abtastungen integriert werden, um für die betref­ fende Probe eine Reihe aufeinanderfolgender Globalmeßwerte zu erhalten, anhand derer die Auswertung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net,
daß die bei den aufeinanderfolgenden zyklischen Abtastungen erhaltenen Lichtsignale aufgezeichnet werden
und daß die zur Auswertung der Lichtsignale herangezogenen Meßwerte aus der wiederabgespielten Aufzeichnung abgeleitet werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Auswertung der Lichtsignale herangezogenen Meßwerte für jede Probe als eine nicht äquidi­ stante Folge aus dem Bildsignal abgeleitet werden, derart, daß der Abstand aufeinanderfolgender Meßwerte in zeitlich hoch­ aufzulösenden Abschnitten des Reaktionsverlaufes größer ist als in Abschnitten, wo eine geringere zeitliche Auflösung tolerier­ bar ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand der zur Auswertung herangezogenen aufeinanderfol­ genden Meßwerte in Abschnitten schnellerer Lichtsignaländerun­ gen kleiner gewählt wird als in Abschnitten langsamerer Licht­ signaländerungen.

6. Vorrichtung zur Gewinnung von Daten, die Aufschluß geben über die Kinetik der Reaktionen von Reaktanten in einer Vielzahl von Proben, durch optische Überwachung der Reaktions­ abläufe und Auswertung der dabei detektierten Lichtsignale, zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
mit einer Gefäßeinrichtung (10) zur Aufnahme der Proben (12),
einer Bildaufnahmeeinrichtung (20) zum Übertragen von Strahlung aus den in der Gefäßeinrichtung (10) enthaltenen Proben an unterschiedliche Orte der Bildaufnahmefläche der Bildaufnahmeeinrichtung (20) und zum zyklischen Abtasten der Bildaufnahmefläche, um für verschiedene Orte der Bildaufnahmefläche jeweils eine Reihe aufeinanderfolgender Lichtmeßwerte zu erhalten, und mit
Verarbeitungsmitteln (40) zur getrennten Auswertung der für die verschiedenen Orte der Bildaufnahmefläche erhaltenen Licht­ meßwerte,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) ein einziges Objektiv enthält, das die Gesamtansicht des alle Proben enthaltenden Bereiches der Gefäßeinrichtung (10) auf die Bildaufnahmefläche abbildet,
die Verarbeitungsmittel (40) eine Einrichtung enthalten, um den bei der Abtastung erzeugten Bildsignalen eine virtuelle Maske mit einer Vielzahl von Öffnungen zu überlagern, deren jede eine Menge von Pixeln aus dem einer jeweils zugeordneten Probe entsprechenden Teil der Gesamtabbildung abgrenzt, und daß
die Verarbeitungsmittel ausgebildet sind, um aus jeder dieser ab­ gegrenzten Mengen von Pixeln die der betreffenden Probe zuge­ ordneten Lichtmeßwerte abzuleiten und daraus die kinetische Konstante der Reaktion erster Ordnung in der betreffenden Probe zu bestimmen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) zur Aufnahme von Farb­ bildern ausgelegt ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Bildaufnahmeeinrichtung (20) eine Videokamera ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildwiederholfrequenz der Videokamera veränderbar ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (Lampen 31, 32) zur Beleuchtung des Inhaltes der Gefäßeinrichtung (10) vorgesehen ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einrichtung (60) vorgesehen ist zum Aufzeichnen der von der Bildaufnahmeeinrichtung (20) aufgenom­ menen Einzelbilder und zum Abspielen von aus der Aufzeichnung gewonnenen Bildsignalen an die Verarbeitungsmittel (40).