WO2013071902A1 - Vorrichtung und verfahren zur nicht-invasiven erfassung von wachstumsprozessen und simultanen messung von chemisch-physikalischen parametern - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur nicht-invasiven erfassung von wachstumsprozessen und simultanen messung von chemisch-physikalischen parametern Download PDF

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Stephan Blossfeld
Johannes Pfeifer
Kerstin Nagel
Hanno Scharr
Achim Walter
Ulrich Schurr
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Forschungszentrum Jülich GmbH
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Definitions

  • the invention relates to an apparatus and a method for detecting growth processes and simultaneous measurement of chemical-physical parameters.
  • WinRHIZO Software “WinRHIZO” (Regent Instruments, Inc.). This typically examines washed-out roots after the invasive process of digging or sampling with the aid of a sample cylinder driven into the ground The obtained photographic images can then be analyzed with the aid of the software, whereby parameters of the root morphology, such as root length, root diameter and more can be measured (morphometric analysis) To non-invasively record morphometric data using the WinRHIZO software by measuring photographic images obtained, for example, from rhizotron experiments without the detour of scanning out washed roots.
  • WinRHIZO Registered Instruments, Inc.
  • Root parameters include weighing fresh and dry matter. Once the roots have been dug up, many parameters of the root architecture are irretrievably lost. These include, for example, parameters such as the exact root length density, the total width of the root system, branch angles, and the like. In addition, it is not possible to carry out further measurements on the same test object. This can only be done via comparison populations, which significantly increases the number of plants to be grown compared to non-invasive measurements.
  • invasive methods for determining the growth of aboveground plant organs are variously described in the literature. This includes, for example, the weighing of cut leaves or the scanning / photographing thereof, including morphometric, image-analytical methods.
  • auxanometers or resistance transducers have been used for decades to detect the growth of aerial shoots or leaves under various environmental conditions.
  • the spatial resolution is also limited and limited to the simple detection of the longitudinal growth.
  • dicotyledonous leaf waxes In addition, these study methods have the disadvantage that no difference can be made between the lengthening of the petiole and leaf sheath (or even individual segments of the leaf sheath) (growth of dicotyledonous plants).
  • transducers and auxanometers can not be used for technical reasons. Basic applications in hydroponics or aeroponics cultures appear to make little sense here.
  • root growth and shoot growth of the same plant can only be studied to a limited extent, depending on each other. This applies in particular to growth analyzes which are intended to capture growth in high spatial and temporal resolution.
  • This is one of the current limitations of the current state of the art, which can be solved for example by simultaneous, automated detection of root, shoot and / or leaf growth with high-resolution methods.
  • all investigations of growth involve the disadvantage that a simultaneous detection of environmental influences in high spatial and temporal resolution is typically not possible.
  • This disadvantage relates in particular to the simultaneous detection of chemical and / or physical properties of the rhizosphere in measurements of root growth in high spatial resolution.
  • the prior art has not made it possible to simultaneously detect changes in the chemical-physical properties of the growth medium and the dynamics of growth parameters in high spatial and temporal resolution. In order to investigate the interplay between growth and growth medium, this information had to be recorded in separate measurements and as a rule invasive and therefore could not be performed on the same object in parallel and continuously. According to the prior art, it is only possible to carry out quantitative measurements of chemical-physical parameters of a growth environment of living beings by using miniaturized measuring probes, such as microelectrodes or optical measuring systems (optics), which enable simultaneous detection of environmental influences in high spatial environments and temporal resolution typically did not allow (Strömberg 2008, Pijnenborg et al 1990, Blossfeld & Gansert 2007). With indicators for pH changes such. B.
  • Bromocresol purple which have already been used in agar systems for the study of rhizosphere effects, quantitative pH measurements are not possible for all growth media and only for limited ranges of the pH scale. Quantitative measurement can only be done within the envelope of the indicator (Jaillard et al 1996, Marschner et al., 1986). Outside the cargo handling area, only a qualitative measurement can be made. (Marschner 1986). Other indicators for detecting, for example, changes in the redox potential are known, for. B. methylene blue. Microelectrodes for the specific measurement of the concentration of ammonium, pH, calcium, chloride, sodium, oxygen, carbon dioxide and more are known (Microelectrodes Inc.).
  • the concentration of the measurement parameter is changed or consumed as a result of the measuring principle, which can lead to problems, in particular in the case of measurements over a longer period of time, in particular if reciprocal interactions are the subject of the investigation.
  • the spatial resolution is limited by using microelectrodes by their geometry.
  • the dimensions of the microelectrodes limit the spatial resolution to be achieved, the reaction time the achievable temporal resolution. If a flat measurement in high spatial and temporal resolution, several microelectrodes must be used, which is associated with relatively high cost and high costs. If simultaneously several chemical-physical parameters are to be measured continuously, this is also at the expense of the spatial resolution.
  • planar optodes also referred to below as optodes
  • Optodes are known, for example, for the specific measurement of the concentration of ammonium, oxygen, carbon dioxide, pH and various ions and organic compounds. The measurement is based on the use of specific, on the measured parameters tuned fluorescent dyes that are excited in the short term with light of one or more specific wavelengths. The dye fluoresces depending on the quantity of the parameter to be measured and the intensity of the exciting light for a few milliseconds, or nanoseconds.
  • fluorescence To be distinguished from the fluorescence is the phosphorescence, in which the light emission lasts much longer, u. U. up to several hours. Both terms (fluorescence and phosphorescence) are subordinated to the general concept of luminescence.
  • the dye is fixed in or on a polymer matrix and applied in or onto the growth medium to be examined.
  • the optical measurement takes place by means of a suitable optical structure (eg CCD camera) outside the growth medium.
  • a suitable optical structure eg CCD camera
  • the sensor eg the optode
  • the detector eg the CCD chip
  • Another possibility for optical detection of fluorescence is the application of a stepper motor-bound system (Blossfeld & Gansert 2007, Biossfeld et al., 2010). This is a camera-independent system in which both the excitation light and the fluorescence are conducted via a glass fiber from the light source to the sensor or from the sensor to the detector. The glass fiber is driven in a defined grid from the outside over the sensor.
  • the fluorescent dye is excited with light of a specific excitation wavelength, and after the excitation has ceased, the cooldown of the
  • Fluorescence measured Fluorescence lifetime
  • Fluorescence lifetime Fluorescence measured (fluorescence lifetime), which is dependent on the analyte concentration.
  • some fluorescent dyes have an extremely short fluorescence lifetime (a few nanoseconds), so that it may be necessary to integrate an analyte-sensitive reference dye into the optodes in addition to the analyte-sensitive fluorescent dye (Schröder 2006). Since this reference dye fluoresces independently of the analyte concentration in the millisecond range and is also excited by the excitation wavelength used, the two fluorescence signals (dual lifetime referencing) overlap. This mixed signal is therefore likewise dependent on the analyte concentration and thus allows the fluorescence lifetime measurement of fluorescence dyes with short-lived fluorescence lifetime.
  • rhizosphere parameters are, for example, oxygen or carbon dioxide concentration ([0 2 ], [C0 2 ]) and pH (pH), but fluorescent dyes are also available for measuring the concentration of a large number of other parameters (eg. Metal ions, ammonium nitrogen).
  • Table 1 Examples of fluorescent dyes and the corresponding possible parameters that can be analyzed
  • pH-sensitive fluorescent dye for the pH range 7.3 - 9.3
  • HPTS 8 - hydroxypyrene - 1, 3,6 - trisulfonic acid as trisodium
  • pH-sensitive fluorescent dye for the pH range 5.5 - 8.6 (Zhu et al., 2005) or C0 2- sensitive fluorescent dye 0 - 20%
  • PtOEP platinum (II) 2,3,7,8,12,13,17,18-octaethyl-21H, 23H-porphyrin
  • Pt-PFP platinum (II) mesotetra (pentafluorophenyl) porphyrin
  • Ruthenium (II) diimine complex ruthenium (II) tris-4,7-diphenyl-l, 10-phenanthroline, with trimethylsilylpropanesulfonate as counterion
  • the spatial resolution is generally dependent on the pixel resolution of the camera used and the camera distance (eg total area 101 cm 2 with a pixel size of 277 ⁇ m x 277 ⁇ m, Hakonen et al., 2010). In the case of the stepper motor-bound system, the spatial resolution depends on the step size of the motors and the diameter of the light cone (eg total area 80 cm 2 at a step size of 1.5 to 3.0 mm per step, Biossfeld & Gansert 2007).
  • the temporal resolution between two image acquisitions is the use of camera-based systems in the range of seconds or milliseconds and depends on the camera characteristics and the associated data processing routine (eg ring buffer, real-time processing, etc.). Long-term measurements of several days to weeks are possible, but may require a large data memory of several MB to GB with sufficiently fast access times, data transfer rates and temporary storage (Hakonen et al., 2010).
  • the temporal resolution between the individual steps is in the range of seconds (2-3 seconds), the temporal resolution between two complete raster cycles depends on the number of steps and is usually in the minutes range (Blossfeld & Gansert 2007). Long-term measurements of several days to weeks are also possible and require a comparatively small data memory of a few MB.
  • optodes When using optodes in the context of z. B. soil or convincedwurzeluntersu- ments they can be optically read through a transparent glass pane from the outside. An opening of the system is thus not necessary for the measurement, and said changes of the system, for. B. with regard to a disturbance of the gas or moisture balance are excluded.
  • the use of optodes for the general detection of chemical-physical parameters, such as the pH or the determination of salt concentrations is known.
  • a measurement of chemical-physical parameters simultaneously with the imaging acquisition of growth processes in high spatial or temporal resolution using optodes is not yet possible.
  • Imaging techniques such as DISP root, GROWMAP and GROWSCREEN root (Walter et al 2009, Nagel et al 2009) are not compatible with measurement via optodes for various reasons.
  • the hitherto known optodes have in their physical properties not the required optical characteristics, which are necessary for such a detection. It is essential, first of all, that planar optodes have a suitable trans- missivity, and the highest possible resolving power not impaired by (coherent and incoherent) scattering effects.
  • the growth object to be examined must be continuously identifiable for imaging growth analyzes as clearly as possible, rich in contrast and sharp through an optode.
  • abiotic growth processes for example, physical growth processes, such as the growth of soil physical parameters, e.g., soil cracks or soil pores, and their interaction with the other named parameters are of interest and can be analyzed using this apparatus and method of operation.
  • “biotic growth processes” also referred to as differentiation and development processes, also include those processes which take place in cultures / tissue cultures of animal, plant or fungal organisms / cells or populations of microorganisms Collected and analyzed together in one study or separately in different studies.
  • the invention also allows, among other things, observation of the growth and development of fungal hyphae or living organisms of the marine or terrestrial soil fauna, generally with simultaneous detection of the physicochemical properties and alteration of the surrounding medium in high spatial and temporal resolution.
  • growth processes is understood to mean both biotic and abiotic growth processes.
  • Non-invasive imaging of growth parameters such.
  • the detection of biotic differentiation, development and growth processes of organisms, organs, tissues or cells, which are of particular interest in the context of this invention include, for example, the spatial and temporal resolution of growth.
  • the term "spatial and temporal resolution of growth” is understood to mean, for example, tropisms, growth rates, relative growth rates, spatial distribution of growth rates and the temporal dynamics of changes in growth rates of plant roots and rhizomes, as well as their dynamic alteration of the root architecture it, imaging these growth parameters by means of an imaging method within the device according to the invention with an optical detection to automatically detect and analyze a camera system and to analyze it with image-analytical methods.
  • the term "detection” is understood to mean the collection and evaluation of the data which has been determined / provided by the optical detection unit / camera system. be used to evaluate the growth behavior as a function of the physicochemical parameters and to be able to make statements about the dependence of the growth of, for example, pH, ammonium concentration and light intensity.
  • the invention enables detection and analysis of the biotic / abiotic growth processes as well as analysis and detection of fluorescence-spectrometrically detectable, dynamically changing physicochemical parameters and processes within the growth medium or, with the aid of the planar, transparent optodes.
  • the continuous simultaneous detection of growth processes and chemical-physical environmental parameters according to the invention is automated and non-invasive, with both a qualitative, as well as a quantitative evaluation of growth processes and chemical-physical parameters or their dynamic change over time is possible.
  • automation with regard to the acquisition of growth parameters and chemical / physical parameters, both a mechano-automated positioning of the camera system in front of the examination object and vice versa a mechanically-automated positioning of the examination subject in front of the camera is possible.
  • the collection of the measured parameters should take place in sufficiently short time intervals, so that the relevant growth dynamics, ie the change over time, z. As growth rates, can be recorded and described so that a causal analytical interpretation is made possible.
  • a high temporal resolution in the measurement of chemical-physical quantities is achieved in that an elevation of the measured parameters takes place in sufficiently short time intervals, so that the relevant change in the parameters, eg. For example, concentrations of an analyte over time may be causally related to the measurement of biotic or abiotic growth processes.
  • the time resolution for measuring chemical-physical quantities should normally be 1 image / hour (1 image / h), as chemical processes in the rhizosphere may also change during the day.
  • a survey of the measured parameters should be carried out in sufficiently high spatial resolution, which in the sense of the invention is primarily two-dimensional, but under certain circumstances can also be understood three-dimensionally
  • the maximum resolution may allow detection of the structures to be measured, for example using the DISP method for spatial distributions of relative growth rates within 125 px (pixels) / mm resolution should be measured by growing root tips over time, but a resolution of approximately 5 - 10 px / mm is usually sufficient for taking root-growing roots in rhizotron systems.
  • the survey of the measured parameters should be carried out in sufficiently high spatial resolution, which is primarily two-dimensional in the context of the invention, but under certain circumstances may be understood in three dimensions, so that the change in question the parameter, eg Concentrations of an analyte over time can be brought into a causal analytical relationship with the measurement of biotic or abiotic growth processes.
  • the maximum resolution must enable detection of the structures to be measured.
  • the spatial resolution for measuring chemical-physical quantities should normally be at least 1 px (pixels) / mm. At any time of measurement, it may be a two-dimensional map of, for example, the concentration of the chemical analyte or the physical parameter
  • the reaction of the fluorophores on the surface of the optode will vary depending on the concentration of the analyte. This allows mapping of the respective parameters.
  • the invention relates to a device and a method by means of which measurements of a) optically detectable growth processes and b) fluorescence-spectrometrically detectable, dynamically changing chemical-physical parameters and processes within a growth medium or substrate, and their Interaction with the detected growth processes, imaging in high temporal and spatial resolution, can be simultaneously recorded and analyzed by image analysis. Furthermore, it is also possible to determine parallel or alternative chemical-physical parameters outside the growth medium / substrate, such as a gas analysis of the shoot in a gas-tight space in addition to the analysis of the growth processes of the roots and the chemical-physical parameters in the growth medium.
  • the measurement with optodes is based on the use of specific fluorescent dyes (fluorophores) which are tuned to the parameters to be measured and which are excited in the short term by light of one or more specific wavelengths.
  • the dye is in or on a polymer matrix, for. B. polymer film fixed and / in / on the medium to be examined / is in contact with the object or medium to be examined in chemical and / or physical contact.
  • the optical measurement is carried out by means of a suitable optical structure (eg CCD camera) outside the medium to be examined.
  • the simultaneously detectable and coregistratable chemical-physical parameters in the context of this invention can be of different nature. Can be measured For example, temperature, pH values, specific substance concentrations (for example of ammonium ions, oxygen, C0 2 ). Further parameters and their respective influence on determinable growth parameters are listed in Table 2.
  • the selection of the parameters to be observed is very versatile, since in principle a large number of fluorophores and coated optodes can be used or described. It is also possible to measure several of these parameters simultaneously.
  • the system can be flexibly adapted in its spatial and temporal "magnification" or resolution to the respective requirements of the experimental setup
  • magnification e.g. lens change, working distance, etc.
  • the structure can be used within an automated system. For example, this flexibility allows high throughput screening of plants with a high number of replicates that can be studied simultaneously.
  • Table 2 Examples of chemical-physical parameters and growth parameters that can be measured (independently of each other) in the context of this invention.
  • pH value of substrate structure e.g. Belly
  • growth media is to be understood in general as meaning the space which surrounds the object to be observed, such as, for example, an organism / a living being or the organism, and which permits its growth and thus represents the living environment.
  • the growth medium can be of a varied nature in the method of the method used, which can be both a natural substrate (for example soil, soil, sand) and "semi" synthetic substrates (for example agar, hydroponics, air cultures) from other growth media, such as fully synthetic, swellable substitution media is possible.
  • the growth medium is referred to as the rhizosphere.
  • the Rizosphere can be defined as the soil volume surrounding living plant roots, which is affected by root activity. Hinsinger et al. (2005) New Phytologist, 168: 293-303.
  • the term organism / living being may, for example, be a plant root system, which is imaged together with the surrounding growth medium.
  • the term organism may generally be understood as meaning plant or animal organisms or else bacteria, fungi.
  • the device according to the invention comprises a system which has one or more cameras, an optical configuration, a light source for illuminating the examination subject, e.g. As the rhizosphere, a special planar and thus sufficiently transparent optode, so that growth measurements are ensured (the optode has at least one immobilized fluorophore) and a digital computer unit (or an embedded computer system) uses. With the aid of this arrangement, it is possible to take non-invasive and non-destructive photographic recordings or time-lapse recordings of a growing organism, organ or tissue.
  • the biological object and the growth medium are within a transparent growth container, which is at least partially transparent.
  • a transparent growth container which is at least partially transparent.
  • a second group of created images and image series allows the simultaneous detection of one or more chemical and / or physical properties within the growth medium, wherein the recordings of all parameters can be made in high temporal and spatial resolution.
  • planar, transparent optode used according to the invention has advantageous optical properties in comparison to known, commercially available planar optodes.
  • the planar, transparent optode according to the invention makes it possible for the first time to simultaneously look through and photograph through an optode.
  • the optode according to the invention is thus transparent.
  • optical properties is understood to mean the parameters resolving power, contrast and transmissivity.
  • the advantageous optical properties in particular the transparency, simultaneous other measurements in the form of image analysis and imaging are also possible for the first time.
  • the advantageous optical properties of the optode which are desired in the context of the invention, and which can be used in photography or looking through the optode, the following properties are to be understood, which together ensure a high image quality and object-faithful image: a) achievable transmissivity (ie low absorption of light different
  • the achievable gray-scale contrast photometric contrast, differences in the brightness between light and dark areas in the recorded object are retained when the gray-scale contrast is maintained
  • the advantageous properties of the optode are particularly important because, according to the invention, photographic images of the objects or organisms to be examined are to be made through the optode, and the objects are behind the planar optode.
  • the aforementioned advantageous optical properties mean that only minimal changes are caused with regard to the imaging quality or the image quality of the object / organism photographed through the optode. The change is so small that objects / organisms located behind the optode can be recognized by the optode through object-true, and in photography through the optode through object-faithfully and significantly equal to the reference can be reproduced.
  • the aforementioned advantageous properties of the planar, transparent optode used according to the invention have certain correspondences with regard to the image quality, which are mentioned below: a) The desired high transmissivity of the optode is limited by a small amount
  • the light intensity here as a signal to be measured of importance
  • the light intensity is the signal
  • the point response (lintel, Green's function, transmission function) says like a sharp point of light
  • these optical properties are considered to be advantageous when it is intended to look through an object, such as in the case of viewing windows (window glass screens). ben).
  • the absorption must be as low as possible, the gray-scale contrast as high as possible, and the resolution as high as possible.
  • the device according to the invention for non-invasive detection of growth processes and simultaneous measurement of chemical and / or physical parameters consists of the following components:
  • the light source should emit light having a wavelength spectrum suitable for both illuminating / exciting the optodes used with the particular fluorophore (s) and emitting the wavelength spectrum (s) for the imaging photographic measurement Growth processes is needed. However, it is also possible for one light source to illuminate / excite the optode and another light source to emit the wavelength spectrum / wavelength needed to detect and analyze the growth processes.
  • the required wavelengths are to be selected in each case as a function of the fluorophore immobilized on the planar optode and its excitation maxima. In the case of HPTS, for example, these are the wavelengths 405 and 450 nm.
  • HPTS high-temperature temperature
  • the light source (s) should therefore emit light of a wavelength in the range of, for example, 200 to 2500 nm. The number of light sources needed depends on the particular wavelength spectrum that the light source can emit and the wavelengths it needs.
  • the chosen wavelength should be both the biological object, and the
  • roots show no influence from near-infrared (NIR) and short-wavelength infrared (SWIR) spectra. iii.
  • the wavelength must not overlap with the excitation and emission ranges of the flurophore used.
  • One possible light source may be a (monochromatic) infrared illumination which emits in the wavelength range between 700 nm and 2500 nm.
  • the wavelength range of the light source is limited to the range up to about 1100 nm, since the CCD camera sensors there reach their upper wavelength sensitivity limit.
  • the light source may preferably provide additional monochromatic wavelengths in the region of the excitation maximum or of the excitation maxima of the immobilized fluorophore (s) used on the optode. In this regard, the wavelength of the excitation maximum may vary depending on the fluorophore used.
  • the selection of the desired / required fluorescence measurement also determines the number of monochromatic wavelengths (eg dual excitation - single emission or dual lifetime referencing, see paragraph on ratiometric fluorescence measurement) in the case of HPTS and the dual excitation - single emission Fluorescence measurement methods are the required excitation wavelengths, for example, 405 nm and 450 nm, with 405 nm corresponding to the unprotonated form and 450 nm to the protonated form of HPTS.
  • the light sources can be one or more monochromatic LEDs or an LED cluster in which the emission of the LEDs for excitations of the individual excitation wavelengths of the fluorophores has a non-overlapping spectrum.
  • the "Fill Half Width" of the LEDs must ideally be as narrow as possible.
  • the light source may further consist of one or more layers of transparent, self-illuminating monochromatic OLEDs for each of the wavelengths required for the fluorophores.
  • the emission of the OLEDs for excitations of the individual excitation wavelengths of the fluorophores should also have a non-overlapping spectrum. Ideally, the "Fill Half Width" of the OLEDs must be chosen as narrow as possible.
  • a filter wheel or a filter changer can be arranged, which allows a change between at least two filters.
  • a filter for example, a "narrow band" filter having a small “small half width" of, for example, 15 nm for the excitation wavelength or wavelengths resulting from the selection of the immobilized fluorophores and the respective fluorescence measurement method can be used.
  • the dual excitation / single emission method for example, requires the use of two filters in the range of 405 nm and 450 nm, respectively.
  • an infrared transmission filter which transmits only infrared light above 700 nm but no light from the range of the visible and UV light ranges.
  • the optical detection unit serves, on the one hand, to acquire the image data / image signals which are emitted by the organism / growth system to be examined and which are required for detecting the growth process and, on the other hand, to detect the fluorescence light emitted by the fluorophores.
  • a CCD camera can be used as a camera.
  • the camera may be provided with a filter / notch filter which allows only the passage of light of a certain wavelength. This may, for example, be the light of the wavelength corresponding to the excitation wavelength of the fluorophore on the optode or, in the case of acquisition of image data of the growth process, the light of the wavelength required to acquire and analyze the growth of the organism to be examined. For the detection of growth processes, for example, light in the near infrared light spectrum is suitable.
  • the filter can be arranged in front of the lens of the camera. It can alternatively be arranged behind the lens with an optional tube extension in front of the sensor of the camera.
  • the optical detection unit can also have at least two cameras.
  • the first camera then serves to detect and record the chemical-physical parameters (eg pH value) in which the emission of the fluorescent light is measured.
  • This camera should have a narrow-band filter with a small fill half width (width of the total emitted wavelength spectrum at half height of the emission maximum).
  • the second camera is then used to capture the growth data.
  • an infrared pass-through filter can be arranged on the camera, which allows only infrared light to pass through the filter. It is thus from this camera detects only the infrared light that was used to capture the object to be examined for illuminating the same.
  • At least one growth container having at least partially a transparent wall surface may also have two or more transparent wall surfaces.
  • the transparent wall surface should be chosen so large that the optode sufficiently excited with light and the signal of the optode can be evaluated and the organism to be examined, also sufficiently exposed by the optical detection unit and the image data can be detected.
  • the transparent wall surface should be transmissive at least to light of the wavelength emitted by the illumination unit. This can be, for example, light in the infrared light spectrum and visible light spectrum.
  • the wall surface which is located behind the transparent wall surface, covered with a dark, non-reflective and highly absorbent material. This can be, for example, black velvet or a similar material.
  • the growth container should have a three-dimensional design and may for example have the shape of a cube, cuboid or a cylinder. Petri dishes are also suitable as growth containers.
  • the growth container is filled with growth medium.
  • growth medium is to be understood in general as the space surrounding the organism or organ to be observed, which allows its growth and thus represents the living environment.
  • the growth medium may be of a variety of nature, which may be both a natural substrate (e.g., soil, soil, sand) and "semi" synthetic substrates (eg, agar, hydroponics, air cultures), as well as the use of other growth media.
  • the growth medium is typically referred to as the rhizosphere, in which case the growth container is referred to as rhizotron, for example, the growth medium should be agar with the appropriate organism
  • a Hoagland solution in various modifications or any other nutrient solution suitable for plant cultivation can be used. which can then be automatically exchanged and measured, for example.
  • a Petri dish wheel can be measured in which the Petri dishes are always exchanged by a controlled motor and brought into the required direction / position for the lighting unit and optical detection unit (see also FIG. 1).
  • the illumination unit can be applied directly to the front of the transparent growth container.
  • the lighting unit can be mounted both on the camera side and on the opposite side.
  • the lighting unit is to be positioned in this embodiment such that the transparent side of the container is illuminated as homogeneously as possible.
  • positioning it is important to avoid total reflections and other lighting effects as possible.
  • This can be done, for example, by arranging the illumination unit at an angle of less than 90 ° (angle between camera and beam path of the illumination unit, either the camera or the illumination unit being oriented orthogonally to the surface of the transparent growth container and the surface of the transparent optode).
  • the light source can be mounted at a 30 ° angle. Deviating angles in a range of 0 to 90 ° degrees are also possible when measuring if required.
  • the growth container can also be arranged at an angle of less than 90 ° horizontally inclined to the illumination unit and the optical detection unit, so that on the one hand, total reflections are avoided and on the other hand, the growth in the direction of the optode takes place, so that the transparent planar optode contact the growth medium can. d) a planar, transparent optode
  • a planar, transparent optode suitable for the purposes of the invention for measuring the chemical and / or physical parameters, for example the pH value, which, when wetted with a film of liquid water, is distinguished by a transparency which, for example, all in Walter et al. (2009) for measuring growth processes of roots (such as DISP and GROWSCREEN root), and immobilizing the fluorescent dye, can be prepared as follows: A cellulose acetate film (eg from Clarifoil®) is coated with an ethylcellulose polymer into which the fluorescent dye HPTS (8-hydroxy-1,3,6-trisulfonic acid) is immobilized. To prepare the solution with which the film is coated, two solutions must first be provided.
  • Clarifoil® eg from Clarifoil®
  • HPTS 8-hydroxy-1,3,6-trisulfonic acid
  • solution 1 referred to as solution 1 and solution 2, which are then mixed.
  • solution 3 z. B. be applied by dip coating process on the carrier film.
  • the reagents for preparing solution 1 may be: a.) Tetraoctylammonium hydroxide solution (TOA +; 10% solution in methanol)
  • the reagents for preparing the solution 2 may be:
  • Ethyl cellulose (ethoxyl content 48%) is added to and dissolved in this total solution from d) and e), the proportion of ethyl cellulose then being 0.59% by weight of the total solution of d) and e).
  • solutions 1 and 2 are mixed in a ratio of 1 to 2.125.
  • the optode is dried, rinsed in Milli-Q water and can be kept dried.
  • all conditions known in the art may be selected.
  • a particularly suitable solution is immersion of the carrier material in the solution containing fluorescent dye 1 to 3 times for about 10 seconds, with the carrier material subsequently being withdrawn from the solution at a rate of about 1 cm / second.
  • the optodes used should have the visible range of the spectrum as well as the near-infrared range of the spectrum 1.) maximum transmittance, 2. maximum resolution and 3.) maximum gray-scale contrast in order to obtain the measurement as far as possible from growth parameters (see Walter et al., 2009).
  • polymer layer can be kept under running water without peeling
  • HPTS is particularly well-researched compared to other fluorophores (Zhu et al.
  • ionophores can also be incorporated or applied in or on the optode.
  • the optode is arranged so that the side coated with the fluorophore contacts the growth medium.
  • a control unit This can be used to control the device components such as the illumination unit and the optical detection unit.
  • An electronic data acquisition and evaluation unit (or embedded computer).
  • the determined data / image data can be stored and evaluated by means of special evaluation methods and evaluation programs.
  • the device in an advantageous embodiment, the device
  • the optical detection unit such as, for example, B of the camera, the optics, the growth container, the lighting unit such.
  • the optodes and filters from external influences such as external light, temperature fluctuations.
  • An optional access door can facilitate optional maintenance.
  • the invention further relates to a method for non-invasive detection of growth processes and simultaneous measurement of chemical and / or physical parameters, comprising the following method steps:
  • the invention offers novel solutions and applications for several economic and scientific purposes.
  • crop science should be mentioned, which open up the methods and methods of the invention, the possibility to perform screenings in the fields of plant science and crop science.
  • these screenings may be used to study the potential of various plant types (e.g., species, biotypes, ecotypes, mutants, species, transgenes, hybrids, and the like) to interact with their environment in the desired manner in a chemical-physical manner.
  • applications are found in the combined, simultaneous measurement of chemical-chemical interactions which emanate from living beings, tissues or cell colonies on the growth substrate or growth medium, or conversely from the growth substrate or growth medium to living beings, tissues or cell colonies, as well as the spatial and temporal effects and distributions of pollutants, xenobiotics, nutrients or other biological, chemical and physical stimuli and simultaneous imaging and image analysis of growth parameters, with the aim of: As a variety / ecotype screening, metabolic monitoring, tolerance and / or resistance screening and / or monitoring, in high spatial and temporal resolution.
  • An application may, for example, also consist in the investigation of the nutrient uptake capacity of a plant, or in the investigation of a herbicidal effect on metabolic processes of the rhizosphere, or tolerance of plants to environmental toxins. From an economic point of view, the latter plants are of particular interest, in particular crops and ruderal plants / weeds.
  • Another exemplary field of application thus also exists in environmental sciences and environmental toxicology.
  • a conceivable application could z. This includes, for example, identifying and quantifying the influence of environmental toxins (eg heavy metals) on root-soil interactions in the rhizosphere.
  • environmental toxins eg heavy metals
  • the deposition and concentration of heavy metals in ecosystems is currently increasing worldwide and has been a major focus of environmental toxicological research for years.
  • FIG. 1 Schematic overview of the device:
  • FIG. 2 Growth container in the form of a Petri dish:
  • FIG. 3 growth container in the form of a rhizotron
  • FIG. 4 Growth container in the form of a hydroponic culture:
  • Figure 5 Arrangement of the device with a schematic representation of
  • FIG. 6 Relative transmissivity (%) of an optode according to the prior art (a) in FIG.
  • FIG. 1 shows, by way of example, a schematic overall overview of the device with: a: root of a plant sprout,
  • growth containers eg rhizotron, petri dish
  • f light source, e.g. To excite the fluorophores,
  • n filter or filter wheel
  • FIG. 2 shows the side view of a cross section through a possible embodiment of the growth container as a petri dish system
  • FIG. 3 shows a side view of a cross section through a possible embodiment of the growth container as a rhizotron system a: soil / substrate surface,
  • FIG. 4 shows the side view of a cross section through a possible embodiment of the growth container as a hydroponic system
  • FIG. 5 schematically shows the connection of the individual device components with the aid of which growth processes and dynamically changing chemical-physical properties of the growth medium can be recorded simultaneously.
  • the following device components are shown:
  • Control unit which controls the alternating illumination of the examination subject by individual monochromatic light sources at intervals, as well as the triggering of the camera.
  • the interval between the respective single image recordings, or individual triggered light flashes, is determined by an existing predefined configuration file and by the runtime program of the control unit.
  • LED 2 Light source for recording growth processes (eg 880 or 920 nm).
  • LED 3 light source which corresponds to the second absorption maximum of the absorption spectrum of the fluorophore applied to the optode.
  • the light source may be, for example, an LED with a narrowband Trading maximum emission. (In the case of HPTS this is for example the wavelength 450 nm).
  • the light source which corresponds to the first absorption maximum of the absorption spectrum of the applied on the opto-fluorophore.
  • the light source may be, for example, an LED with a narrowband emission maximum (narrow band). (In the case of HPTS this is for example the wavelength 405 nm).
  • the control unit activates LED2 as a prerequisite for recordings corresponding to 25 (growth recordings in a spectral range which is not affected by the emission of the fluorophore).
  • Monochromatic light of the wavelength of LED4 which impinges on the optode which corresponds to the wavelength of the first absorption maximum of the absorption spectrum of the fluorophore deposited on the optode.
  • narrow-band stop filter which only reads through the light of a wavelength which corresponds to the emission maximum of the fluorophore used and applied on the optode (in HPTS for example 515 nm, when excited with light of a wavelength of the first absorption maximum).
  • Narrow-band stop filter which only reads through the light of a wavelength which corresponds to the emission maximum of the fluorophore used and applied to the optode (in the case of HPTS, for example, 515 nm, when excited with light of a wavelength of the second absorption maximum).
  • Broadband blocking filter for growth measurements, for example in the infrared spectrum.
  • the selected spectral range of the filter can be chosen as wide as desired, but ideally includes a range in which desired structure discriminations are ensured optimally and without influencing the structures to be investigated (eg root growth).
  • Sequential number n of the recording made in 25. within a sequence of images created as a file.
  • Multi-TIFF file for storing
  • Image evaluation software eg DISP
  • a control unit (1) controls the activities of various light sources (2, 3, 4) and an optical detection unit / camera (12, 17).
  • the light sources LED 3, 4 serve to excite a planar, transparent optode (6) and LED 2 serves to detect growth processes.
  • LED 4 is activated while LEDs 2 and 3 remain inactive (7d & 8g).
  • the monochromatic light from LED 4 (step 9) excites the planar optode (6) and the fluorescence light of the optode emitted thereby (step 14 m) passes through a narrowband notch filter (13j) and impinges on the optical detection unit / camera (12, 17).
  • a two-dimen- sional recording of the fluorescence corresponding to the first absorption maximum of the fluorophore used is made (18).
  • a total of 10 such recordings are created one after the other (step 38) and then provided with a sequential number (19) as an averaged image using conventional methods, and a time stamp (29) for each individual image is stored in a log file (30) ,
  • the subsequent fluorescence uptake is used in accordance with the second absorption maximum Fluorophore created.
  • LED 3 is activated (8h), while LEDs 4 and 2 remain inactive (7e & 5b).
  • the monochromatic light from LED 3 (10) excites the planar optode (6) and the fluorescent light emitted thereby (step 14n) passes through a narrow-band notch filter (13k) and strikes the optical detection unit / camera (12, 17).
  • a two-dimensional recording of the fluorescence corresponding to the second absorption maximum of the fluorophore used is produced (22).
  • For denoising (38) a total of 10 such recordings are created one after the other (38) and then provided with a sequential number (23) as an averaged image by conventional methods, and a time stamp (29) for each individual image is stored in a log file (30) ,
  • the subsequent recording of the growth processes and structures is created.
  • the LED 2 is activated (7f), while LEDs 3 & 4 remain inactive (8i & 5c).
  • the monochromatic light from LED 2 passes through the transparent planar optode (6) and strikes the sample behind it.
  • the light (14o) subsequently reflected by the sample passes through a broadband blocking filter (131) and strikes the optical detection unit / camera (12, 17).
  • a two-dimensional recording of the growth processes and structures is made (25).
  • For denoising (38) a total of ten such recordings are created one after the other (38) and then provided with a sequential number (26) as an averaged image by conventional methods, and a time stamp (29) for each individual image is stored in a log file (30).
  • the image processing of the fluorescence images (40) begins with the formation of a ratiometric image from 18. and 22. (41). This image is then offset with a dark image (39) to filter out the black noise.
  • the resulting corrected image (43) is then subjected to pixel-by-pixel correction according to relevant literature (44).
  • the resulting completely corrected image (45) is stored in a so-called multi-TIFF format (33q) and can be read from there and further processed.
  • the growth or structural images (25) are stored directly in a so-called multi-TIFF format (33p). This image is then further processed during the further image analysis (36) with relevant software (37).
  • FIG. 6 and some exemplary measured values in Table 3 show the relative transmissivity in% of an optode according to the prior art (a) in comparison with the new optode (b) according to the invention as a function of the wavelength.
  • a maximum possible light transmittance and thus transparency in the entire spectrum would be given at a 100% transmission of light (transmissivity) at all wavelengths.
  • the optode according to the invention has a transmission of more than 90% from a wavelength of about 280 nm, while the optode of the prior art at 280 nm only has a relative transmission of about 14.66% up to a maximum of 62% at 852 nm.
  • FIG. 7 shows relative absorption spectra in% and, for example, a relative emission spectrum in% of the optode according to the invention, which contains the fluorophore HPTS, at different pH values.
  • Ordinate X wavelength (nm); Abscissa Y: Relative absorption or emission in% based on the amount of light irradiated.
  • the optode has two absorption maxima in the range of 1.) 405 nm and a second absorption maximum at 450 nm. Furthermore, it has an emission maximum at 515 nm. This shows that the optode according to the invention is suitable for ratiometric fluorescence measurements, as already described above. Two excitation wavelengths of 405 nm and 450 nm can be used and an emission wavelength of 515 nm.
  • Table 4 Relative gray value contrast (% of gray values) in% relative to the reference (without optode) in black and white photographic photographs of Times New Roman point dots with a dot size of 128 exposed to 880 nm wavelength light ,
  • Table 4 shows the relative gray value contrast (gray value difference) with respect to the reference (without optode) in photographic black-and-white photographs of Times New Roman point dots with a dot size of 128 (See also Table 8) with one exposure Light of the wavelength of 880 nm. Location in the middle of the rightmost black dot (font size 128) in the respective photographic image using a narrow-band filter, which transmits only light with the wavelength 880 nm. A small value shows a small gray value contrast between white and black areas in the photograph. Desirable is a value as close as possible to the value without optode (100%).
  • the optode according to the invention clearly has the desired improved property compared with the optical device of the prior art.
  • Table 5 Relative gray level contrast (% of gray values) in% relative to the reference (without optode) in black and white photographic photographs of Times New Roman point dots with a 128 spot size exposed to visible light
  • Table 5 shows the relative gray value contrast (gray value difference) with respect to the reference (without optode) in photographic black-and-white photographs of points of the Times New Roman type with a dot size of 128. (See also Table 8) with exposure to visible light. Place of measurement: in the middle of the rightmost black dot (font size 128) as well as in the dot between the two dots with the font size 128 and 64 in the respective photographic shot without the use of a filter. A small value shows a small gray value contrast between white and black areas in the photograph. Desirable is a value as close as possible to the value without optode (100%).
  • the optode according to the invention clearly has the desired improved property compared to the optode of the prior art.
  • Table 6 shows the relative diameter in percent of the rightmost point in the photographic image (font size 128) when exposed to light of wavelength 880 nm as a measure of the resolution. A value close to 100% indicates a slight blurring and thus high selectivity. Desirable is a value as close as possible to the value without optode.
  • the optode according to the invention clearly has the desired improved property over the prior art optode.
  • Table 7 Relative diameter as a percentage of the rightmost point in the photographic image (font size 128) when exposed to visible light as a measure of resolving power
  • Table 7 shows the Relative Diameter as a percentage of the rightmost point in the photographic image (font size 128) when exposed to visible light as a measure of resolving power. A value close to 100% indicates a slight indistinctness and thus high selectivity. Desirable is a value as close as possible to the value without optode.
  • Plant seeds of the species to be tested are externally sterilized within a sterile bank by first placing the seeds in 70% ethanol, in aqueous solution, for three minutes and then in 0.5% sodium hypochlorite (including one drop of Tween to 10 ml ), in aqueous solution, for ten minutes and then rinsed thoroughly with autoclave water.
  • the medium is poured into Petri dishes. After curing of the agarose, the optodes are placed on the agarose gel so that the side coated with the fluorophore rests on the agarose as far as possible without air inclusions. Petri dishes are sealed with micropore tape and parafilm.
  • the sterilized seeds are sown within a sterile bench in perforations on the narrow side of the Petri dish and sealed the Petri dish with parafilm.
  • the plants are grown in suitable climatic conditions, the Petri dishes with the side which rests the optode to z. B. 45 ° is tilted inwards (see Fig. 2).
  • the optode used in this example is comparable in terms of transparency with glass or plastic vision, and allows an evaluation, for example with the software GROWSCREEN-Root or the software GROW Map-Root. Other evaluation methods are also possible.
  • the rhizotrons are z. B. filled with conventional Anzuchterde. Then the lens is removed and cleaned from adhering soil. On the bottom surface exposed in the rhizotron, the planar optode is placed on the bottom with the side coated with the fluorophore. Then the lens is placed on the optode and re-attached. Alternatively, the planar optode can also be attached to the appropriate location of the lens with, for example, silicone grease before the soil is poured into the rhizotron. Thus, it would be avoided that when opening an already filled rhizotrons the soil structure is changed.
  • the rhizotrons are at an angle of z. B. stored for 45 ° in the direction of the lens permanently.
  • the seeds of the plants to be examined are sown in the rhizotron and cultured under suitable, species-specific culturing conditions (see FIG.
  • An optical detection unit such as a CCD camera or the like is locked to the viewing window of the rhizotron at a defined distance and angle to create reproducible recordings.
  • the illumination unit usually monochromatic LEDs, are also locked analogously to the optical detection unit.
  • Illumination and detection units are controlled by a PC in order to record at defined intervals recordings of the root system and the rhizosphere pH dynamics.
  • the detection of the growth of the root system for example, using the software ROOTFIND and is usually based on images of the optical detection unit in bitmap format.
  • An upstream conversion of the images in black / white format etc. is possible, if the downstream evaluation software requires it.
  • the length and the number of visible roots are automatically recorded and stored in separate data files.
  • the calibration of the images is done by comparing the counted root pixels with the number of pixels of objects whose length and thickness are known, and which are also captured in the image (eg capillaries, etc.).
  • the recording of the rhizosphere pH dynamics is achieved by comparing the generated images (eg TIFF or RAW format) with previously created calibration data.
  • Conventional and commercially available evaluation software can be provided by the "Image processing toolbox" from Matlab or Photoshop The error correction of the generated images can be done analogously to the description by Strömberg & Hulth (2005):
  • the black noise is subtracted from the images of each wavelength.
  • the pH-Optode can e.g. calibrated as follows (modifications are also possible):
  • ⁇ 1 and ⁇ 2 describe the asymptotic Minimum and maximum of the sigmoid function
  • ⁇ 3 is the apparent pKa4 of HPTS (ie, the inflection point of the sigmoid function)
  • ⁇ 4 is a constant describing the slope of the function between ⁇ 1 and ⁇ 2.
  • “dual excitation” (ex) and “dual emis- sion” (em) properties of HPTS are used (eg, Fl, ex / em: 405 / 440nm and F2, ex / em: 465/510 um ).
  • the so-called “time correlated pixel-by-pixel” calibration can be applied (also described by Strömberg and Hulth 2005).
  • the optode to be calibrated is immersed in a vessel containing the respective buffer solution and the ratiometric response is detected through a viewing window or through the glass of the beaker, etc. with the detection unit.
  • the result of the calibration can be registered for each pixel individually or as a sum response and processed further later.
  • the root images and pH images generated during the experiment can then be overlaid with appropriate image manipulation programs (e.g., Corel Draw, Photoshop, ImageJ, etc.) to elucidate correlations between pH and root architecture.
  • image manipulation programs e.g., Corel Draw, Photoshop, ImageJ, etc.
  • Transmissivity of the optode input intensity of the light - absorption
  • the optodes were placed in a Petri dish (120 * 120 * 17 mm, Greiner Petri dishes with cams) filled with 20 ml deionized water (Milli-Q, Millipore Corporation). square, Greiner Bio-One item No .: 688102), and the bottom of the Petri dish turned upside down so that the optodes were planar fixed.
  • the lid of the Petri dish was then set to a standard consisting of a high resolution print on printer paper, in which different symbols (dots) of the font "Times New Roman" of the software Microsoft Word in the font sizes 1, 2, 4, 8, 16 , 32, 64 and 128.
  • a standard objective lens 25 mm, Cosmicar / Pentax, The Imaging Source, Bremen, Germany
  • a filter or an infrared pass-through filter 880 nm, Edmund Optics, Düsseldorf, Germany.
  • a constant illumination was carried out either by means of a halogen lamp (for measuring the optical properties of the optodes in visible light at about 400-800 nm) or by means of infrared LEDs (880 nm, Conrad Electronics, Hirschau, Germany).
  • Photographs were taken using the root leaf aquisition software (Schmundt et al., 1998) and stored in multi-TIFF format, after which the photographs were taken using the IrfanView software (http://www.irfanview.com /) and measured with the tools of the IrfanView software.
  • the measuring tool "Measure tool” of the IrfanView software was used to measure the resolving power.
  • the start and end points of the measurement of the diameters of the point of the font size 128 were determined by the respective change of the gray value of more than 3 gray scale levels compared to the background Diameter was measured.
  • the gray value was measured with the IrfanView software, whereby the measurement points were selected either in the middle of the dot of the font size 128 or in the middle between the dots of the font size of 128 and 64. Then the difference of the gray values was calculated.
  • one strip of the optode was planarly placed in a crystal glass cuvette and the cuvette filled with 1 ml of deionized water (Milli-Q, Millipore Corporation).
  • a glass cuvette filled with 1 ml of deionized water (Milli-Q, Millipore Corporation) was used.
  • the measurement was carried out using a two-beam spectrophotometer (UVIKON xl, Bio-Tek Instruments).
  • a photometric reference measurement can be set 100%.
  • the curve corresponding to this measurement would have a value of 100% over the entire range of the spectrum in the representation chosen in FIG. 6 a) / b) (relative transmission relative to the reference).
  • Table 8 shows the photographic images determined in the previously described measuring methods. The two optodes to be compared and the blank measurement with the same measurement setup can be compared to obtain a first impression.
  • Table 8 Photographic black-and-white photographs of Times New Roman dots at various dot sizes from dot size 1 to dot size 128 a) the blank reading (reference; without optode) with exposure to visible
  • the optode according to the invention achieves transmissivity values which lie above 90% in the spectrum (relevant for the purposes of the invention) between 300 and 900 nm. In the near-infrared region of the spectrum (700 to 900 nm), the new optode achieves a transmissivity of 100%. The area of near-infrared light is of particular importance for the purposes of the invention.
  • transmissivity for the purposes of the invention is not only relevant, but also the parameters resolving power and gray value contrast are important for achieving a maximum image quality, these parameters were determined for a commercially available pH optode and the new optode.
  • the obtained selectivity (resolving power) of the new optode was little and not significantly worse using both visible light and near-infrared light (880 nm) than the resolution achieved when no optode was placed in the beam path (Fig. Petri dish) (4% degradation on exposure to light in the visible region of the spectrum; 1% degradation on exposure to light of wavelength 880 nm).
  • the commercially available optode deteriorated resolving power as compared with the reference (measurement without optode in the visual axis) by using light of the visible spectrum by 27%, and by exposure to near-infrared light of wavelength 880 nm by 24%.
  • the deterioration of the gray scale contrast compared to the achieved gray value contrast without optode in the beam path is 26% when using visible light in the new opto and 6% when using near-infrared light (880 nm).
  • the gray level contrast degradation is 93% using visible light, and 89% using near infrared light (880 nm).
  • the new optode in the context of the invention has significantly and significantly better optical properties than the commercially available optode.
  • the new optode is proven to be suitable for use in imaging and image analysis techniques such as DISP, WinRHIZO and GROWSCREEN root.
  • Image analysis is the systematic analysis of the image content by means of visual image interpretation.
  • Imaging method An imaging method generates an image from measured variables of a real object, wherein the measured variable or information derived therefrom is visualized spatially resolved and coded via brightness values or colors. (Www.wikipedia.org).
  • Image processing refers to all processes by which images are processed and altered, i. the preparation and analysis of image or raster data. Designates a set of digital methods used to create, analyze, enhance, interpret, or display image data or raster data.
  • Grayscale is the number associated with a pixel, e.g. in raster data or in digital image processing. Depending on the number of bits which a gray value can take, a distinction is made between binary image (1 bit, states 0 and 1), gray value image (8 bits, states between 0 and 255) and color image (3 * 8 bits each with states between 0 and 255). These values are associated with entries of a color table (LUT) for display on a screen, i. the values are interpreted as indices of a color table. (Geoinformatik-Service of the University of Rostock, 2008, Chair of Geodesy and Geoinformatics (GG) AT Vietnamese Rostock, www.geoinformatik.uni-rostock.de).
  • the photometric contrast characterizes the brightness difference between two luminous surfaces: (Mütze et al., 1972).
  • Monomers are low molecular weight, reactive molecules that can combine to molecular chains or networks, to unbranched or branched polymers (wikipedia). l l. optode:
  • angular second Measurable in arc seconds (synonyms angular second, unit of measurement of the angle). 60 arc-seconds equals one minute of arc, 60 arc-minutes equals one degree. The resolution of 1 '(an angular minute) corresponds to a spatial resolution of about 1.5 mm at 5 m distance. The smaller the angular acuity, the better the visual acuity (Mütze et al., 1972).
  • Plant Soil 126 155-160

Landscapes

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemisch und/oder physikalischer Parameter, umfassend folgende Komponenten: • a) Beleuchtungseinheit (f, m), • b) optische Erfassungseinheit (i, h, n, g), • c) mindestens einen Wachstumscontainer (b, I), mit Wachstumsmedium (d), • d) mindestens eine transparente, planare Optode (c), • e) Steuerungseinheit (j), • f) elektronische Datenerfassungs- und Auswerteeinheit (k). Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemisch und/oder physikalischer Parameter, umfassend folgende Verfahrensschritte: • a) Erfassung der Wachstumsprozesse mittels bildgebender Methoden, • b) Erfassung der chemisch und/oder physikalischen Parameter durch Verwendung einer planaren, transparenten Optode (c), wobei die Daten aus a) und b) simultan und parallel zueinander gewonnen werden.

Description

B e s c h r e i b u n g
Vorrichtung und Verfahren zur Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung von chemisch-physikalischen Parametern
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung von chemisch-physikalischen Parametern.
Stand der Technik:
Technisch existiert eine Vielzahl verschiedener Methoden dynamische Wachstumsprozesse zu verfolgen und zu quantifizieren, wobei hierbei grundlegend zwischen invasiven und nichtinvasiven Methoden unterschieden werden kann. Ganz allgemein gilt, dass nicht-invasive Untersuchungen den Vorteil besitzen, dass Wachstumsprozesse (beispielsweise von Pflanzen) an denselben Messobjekten kontinuierlich im Zeitverlauf durchgeführt werden können und daher in vielen Fällen zu bevorzugen sind.
Invasive Wachstumsmessungen
Ein Beispiel invasiver Wachstumsmessungen an Wurzeln stellt die Verwendung der Software „WinRHIZO" (Regent Instruments, Inc.) dar. Hierbei werden üblicherweise ausgewaschene Wurzeln untersucht, die nach dem invasiven Prozess des Grabens oder Probennahme mit Hilfe eines Probenzylinders, welcher in den Boden getrieben wird, schwimmend in einem transparenten Kunststoffcontainer gescannt werden. Die gewonnenen photographischen Aufnahmen können dann mit Hilfe der Software bildgebend ausgewertet werden, wobei Parameter der Wurzelmorphologie, wie Wurzellänge, Wurzeldurchmesser und weiteres mehr ver- messen werden kann (morphometrische Auswertung). Es ist durchaus auch möglich, morphometrische Daten mittels der Software„WinRHIZO" nicht-invasiv zu erheben, indem photographische Aufnahmen, beispielweise gewonnen aus Rhizotronexperimenten ohne den Umweg des Scannens ausgewaschener Wurzeln, zu vermessen.
Weitere konventionelle invasive Wachstumsmessungen von Wurzelparametern bestehen unter anderem im Wiegen der Frisch- und Trockenmasse. Sind die Wurzeln einmal ausgegraben, gehen viele Parameter der Wurzelarchitektur unwiederbringlich verloren. Dazu gehören beispielsweise Parameter wie die exakte Wurzellängendichte, die Gesamtbreite des Wurzelsystems, Verzweigungswinkel u. a. Zudem ist es nicht möglich weitere Messungen am selben Versuchsobjekt durchzuführen. Dies kann nur über Vergleichspopulationen geschehen, wodurch sich die Anzahl der anzuziehenden Pflanzen im Vergleich zu nicht-invasiven Messungen deutlich erhöht.
Um beispielsweise Nährstoffgehalte, oder Gehalte anderer Analyte wie Kohlenhydrate, Prote- ine, Hormone etc. quantifizieren zu können, ist eine invasive Beprobung jedoch kaum zu umgehen und liefert in jedem Fall die genausten Ergebnisse.
Ganz analog werden invasive Methoden zur Bestimmung des Wachstums oberirdischer Pflanzenorgane vielfältig in der Literatur beschrieben. Darunter fällt beispielsweise das Wiegen von abgeschnittenen Blättern oder das Scannen/ Abfotographieren derselben unter Einbe- ziehung morphometrischer, bildanalytischer Verfahren.
In den letzten Jahren wurden viele bildgebende und bildanalytische Verfahren entwickelt, um das Abschneiden der zu untersuchenden Pflanzenorgane wie beispielsweise von Blättern zu vermeiden. Vielfach kann daher heute auf invasive Messungen verzichtet werden.
Nicht-invasive Wachstumsmessungen
Im Rahmen pflanzenphysiologischer Untersuchungen stellen Messungen mit Hilfe von Linealen und Schieblehren die aller einfachste aber dennoch praktische, da z. B. transportable, nicht-invasive Messmethode dar. Derartige klassische Messmethoden werden beispielsweise seit geraumer Zeit für das kontinuierliche Erfassen von Wachstumsprozessen in Blättern (Avery 1933) und Wurzeln benutzt (Erickson und Sax, 1956). Vielfach werden Sie daher noch heute für wissenschaftliche Arbeiten verwendet (Walter 1997). Der größte Nachteil derartiger Erfassungen von Wachstumsprozessen stellt jedoch die Tatsache dar, dass sich diese nur in geringer zeitlicher und räumlicher Auflösung durchführen lassen und zudem mit einem hohen manuellen Aufwand verbunden sind. Sollen Wachstumsprozesse in hoher zeitlicher Auflösung erfasst werden, so stehen hierfür verschiedene alternative Methoden zur Verfügung.
Verschiedene Formen und Varianten von Auxanometer oder Resistance-Transducer werden beispielsweise seit Jahrzehnten eingesetzt, um das Wachstum von oberirdischen Sprossen oder Blättern unter verschiedenen Umweltbedingungen zu erfassen. Die räumliche Auflösung ist dabei jedoch ebenfalls begrenzt und beschränkt sich auf die einfache Erfassung des Längenwachstums. Im Rahmen pflanzenphysiologischer Untersuchungen dikotylen Blattwachs- tums (Blattwachstum zweikeimblättriger Pflanzen) haben diese Untersuchungsmethoden darüber hinaus den Nachteil, dass nicht zwischen Längenwachstum der Petiole und Blattscheide (oder gar einzelnen Segmenten der Blattscheide) unterschieden werden kann. Im Rahmen von Untersuchungen des Wurzelwachstums können Transducer und Auxanometer technisch bedingt gar nicht eingesetzt werden. Grundsätzliche Anwendungen in Hydroponikoder Aeroponik-Kulturen erscheinen hier kaum sinnvoll.
Auf Grund der Beschränkungen dieser beiden Messarten bei Wachstumsmessungen wurden in den letzten Jahren zunehmend Methoden entwickelt, Wachstum nicht-invasiv mit Hilfe bildgebender Methoden zu erfassen. Im Rahmen pflanzenphysiologischer Untersuchungen wurden hierbei verschiedene bildanalytische Ansätze verfolgt und genutzt, abhängig davon, welche Pflanzenorgane untersucht werden sollten, bzw. welche räumliche und zeitliche Auflösung durch die Messdaten bereitzustellen sind.
Grundsätzlich gilt, dass Wurzelwachstum und Sprosswachstum derselben Pflanze in Abhän- gigkeit zu einander nur bedingt untersucht werden können. Dies gilt insbesondere für Wachstumsanalysen, welche das Wachstum in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung erfassen sollen. Hier liegt eine der gegenwärtigen Limitierungen des aktuellen Stands der Technik, welcher sich beispielsweise durch simultane, automatisierte Erfassungen von Wurzel-, Spross- und/oder Blattwachstum mit hochauflösenden Methoden lösen lassen. Weitergehend beinhalten bislang alle Untersuchungen des Wachstums den Nachteil, dass eine Simultanerfassung von Umwelteinflüssen in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung typischerweise nicht möglich ist. Dieser Nachteil betrifft hierbei insbesondere die simultane Erfassung chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften der Rhizosphäre bei Messungen des Wurzelwachstums in hoher räumlicher Auflösung. Nachteile des Stands der Technik:
Der bisherige Stand der Technik ermöglichte es nicht, Veränderungen der chemischphysikalischen Eigenschaften des Wachstumsmediums und die Dynamik von Wachstumsparametern in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung simultan zu erfassen. Um das Wechselspiel zwischen Wachstum und Wachstumsmedium zu untersuchen, mussten diese Informa- tionen bislang in separaten Messungen und in der Regel invasiv erfasst werden und konnten daher nicht am selben Objekt parallel und kontinuierlich durchgeführt werden. Nach dem bisherigen Stand der Technik ist es lediglich möglich, quantitative Messungen von chemisch-physikalischen Größen einer Wachstumsumwelt von Lebewesen durchzuführen, indem miniaturisierte Messsonden, wie Mikroelektroden oder optische Messsysteme (Opto- den), Verwendung finden, welche eine Simultanerfassung von Umwelteinflüssen in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung typischerweise bisher nicht zuließen (Strömberg 2008; Pijnenborg et al. 1990; Blossfeld & Gansert 2007). Mit Indikatoren für pH- Veränderungen wie z. B. Bromkresolpurpur, die bereits in Agarsystemen zur Untersuchung von Rhizosphä- ren-Effekten eingesetzt wurden, sind quantitative pH-Messungen nicht für alle Wachstumsmedien und nur für begrenzte Bereiche der pH- Skala möglich. Eine quantitative Messung kann lediglich im Umschlagsbereich des Indikators erfolgen (Jaillard et al. 1996; Marschner et al. 1986). Außerhalb des Umschlagbereiches kann nur eine qualitative Messung erfolgen. (Marschner 1986). Weitere Indikatoren zur Detektion von beispielsweise Änderungen des Redoxpotentials sind bekannt, z. B. Methylenblau. Mikroelektroden zur spezifischen Messung der Konzentration von Ammonium, pH, Calcium, Chlorid, Natrium, Sauerstoff, Kohlendioxid u. v. m. sind bekannt (Microelectrodes Inc.).
Bei der Verwendung von Mikroelektroden wird die Konzentration des Messparameters bedingt durch das Messprinzip verändert bzw. verbraucht, was insbesondere bei Messungen über einen längeren Zeitraum zu Problemen führen kann, insbesondere, wenn wechselseitige Interaktionen Gegenstand der Untersuchung sind.
Die räumliche Auflösung wird unter Verwendung von Mikroelektroden durch deren Geometrie beschränkt. Die Abmessungen der Mikroelektroden begrenzen die zu erzielende räumliche Auflösung, die Reaktionszeit die erzielbare zeitliche Auflösung. Soll eine flächige Messung in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung erfolgen, müssen mehrere Mikroelektroden eingesetzt werden, was mit vergleichsweise hohem Aufwand und hohen Kosten verbunden ist. Sollen simultan mehrere chemisch-physikalische Größen kontinuierlich gemessen werden, geht dies ebenfalls zu Lasten der räumlichen Auflösung.
Zur optischen Messung verschiedener chemischer und physikalischer Eigenschaften in den Fachgebieten der Medizin, Biotechnologie und der Biologie, hier insbesondere der Rhi- zosphärenanalytik, gilt die Verwendung von planaren Optoden (im Folgenden auch Optoden genannt) derzeit als Stand der Technik. Optoden sind beispielsweise zur spezifischen Messung der Konzentration von Ammonium, Sauerstoff, Kohlendioxid, pH und verschiedenen Ionen sowie organischen Verbindungen bekannt. Die Messung basiert dabei auf der Verwendung von spezifischen, auf den zu messenden Parametern abgestimmten Fluoreszenzfarbstoffen, die kurzfristig mit Licht einer oder mehrerer spezieller Wellenlängen angeregt werden. Der Farbstoff fluoresziert dabei in Abhängigkeit der Quantität des zu messenden Parameters und Intensität des anregenden Lichts für wenige Millisekunden, bzw. Nanosekunden.
Von der Fluoreszenz abzugrenzen ist die Phosphoreszenz, bei der die Lichtemission wesentlich länger andauert, u. U. bis zu mehreren Stunden. Beide Begriffe (Fluoreszenz und Phosphoreszenz) sind dem allgemeinen Begriff der Lumineszenz unterzuordnen.
In der Regel wird der Farbstoff in oder auf einer Polymermatrix fixiert und in, bzw. auf das zu untersuchende Wachstumsmedium ein-, bzw. aufgebracht. Die optische Messung erfolgt mittels eines geeigneten optischen Aufbaus (z. B. CCD-Kamera) außerhalb des Wachstumsmediums. Durch diese Entkopplung von Sensor (z. B. der Optode) und Detektor (z. B. der CCD-Chip) ist eine nicht-invasive Erfassung des zu analysierenden Parameters möglich. Eine weitere Möglichkeit der optischen Erfassung der Fluoreszenz stellt die Anwendung eines schrittmotorgebundenen Systems dar (Blossfeld & Gansert 2007, Biossfeld et al. 2010). Hierbei handelt es sich um ein kameraunabhängiges System, bei dem sowohl das Anregungslicht, als auch die Fluoreszenz über eine Glasfaser von der Lichtquelle zum Sensor, bzw. vom Sensor zum Detektor geleitet wird. Die Glasfaser wird dabei in einem definiertem Raster von außen über den Sensor gefahren.
Bislang haben sich zwei Fluoreszenzmessmethoden etabliert:
1. Fluoreszenzlebenszeitmessung eines Farbstoffes (z. B. Holst et al. 1998)
Bei dieser Methode wird der Fluoreszenzfarbstoff mit Licht einer spezifischen Anre- gungswellenlänge angeregt und nach Erlöschen der Anregung, die Abklingzeit der
Fluoreszenz gemessen (Fluoreszenzlebenszeit), welche abhängig von der Analytkon- zentration ist. Einige Fluoreszenzfarbstoffe besitzen jedoch eine extrem kurze Fluoreszenzlebenszeit (wenige Nanosekunden), sodass es erforderlich sein kann, neben dem analytsensitiven Fluoreszenzfarbstoff einen analytsensitiven Referenzfarbstoff in die Optoden zu integrieren (Schröder 2006). Da dieser Referenzfarbstoff unabhängig von der Analytkonzentration im Millisekundenbereich fluoresziert und ebenfalls von der verwendeten Anregungswellenlänge angeregt wird, überlagern sich die beiden Fluoreszenzsignale (dual lifetime referencing). Dieses Mischsignal ist damit ebenfalls ab- hängig von der Analytkonzentration und erlaubt so die Fluoreszenzlebenszeitmessung von Fluoreszenzfarbstoffen mit kurzlebiger Fluoreszenzlebenszeit.
2. Ratiometrische Fluoreszenzmessung eines Farbstoffes (z. B. Hakonen et
al. 2010). Bei dieser Methode wird im lokalen Maximum des Emissionsspektrums gemessen und Verhältnisse der Fluoreszenzintensität des Fluoreszenzfarbstoffes berechnet. Dabei können ggf. unterschiedliche Anregungswellenlängen und ggf. variierende Emissionswellenlängen verwendet werden, welche spezifisch von der jeweiligen Analytkonzentration abhängig sind. In der konkreten Ausführung gibt es beispielsweise mehrere Varianten (Schröder 2006):
Verwendung von zwei Anregungswellenlängen und einer Emissionswellenlänge =
(Dual Excitation/ single Emission).
Verwendung von zwei Anregungswellenlängen und zwei Emissionswellenlängen= (Dual Excitation/ dual Emission).
Verwendung von einer Anregungswellenlänge und zwei Emissionswellenlängen =
(Single Excitation/ DualEmission).
Bei beiden Messmethoden (Fluoreszenzlebenszeitmessung, ratiometrische Fluoreszenzmessung) ist es möglich, mittels eines geeigneten optischen Aufbaus (in der Regel eine CCD- Kamera) eine räumliche quantitative Erfassung (Kartografie) des zu messenden Parameters zu realisieren. Eine dreidimensionale, semiquantitative Erfassung wird beispielsweise in der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie verwendet. Eine Erfassung in zeitlich hoher Auflösung ist prinzipiell ebenfalls möglich, hängt im Einzelfall jedoch vom zu untersuchenden Messobjekt ab. Hierbei ist insbesondere der Einfluss des verwendeten Lichts auf das Messobjekt zu berücksichtigen. Die gebräuchlichsten gemessenen Rhizosphärenparameter sind beispielsweise Sauerstoff-, bzw. Kohlendioxidkonzentration ([02], [C02]) und pH- Wert (pH), jedoch sind auch Fluoreszenzfarbstoffe für die Messung der Konzentration einer Vielzahl anderer Parameter verfügbar (z. B. Metallionen, Ammonium-Stickstoff). Tabelle 1 : Beispiele von Fluoreszenzfarbstoffen und den entsprechend möglichen Parametern, die analysiert werden können
Figure imgf000009_0001
DHFAE: 2', 7'-dihexyl-5(6)-Noctadecyl-carboxamidofluorescein ethyl ester
und das phosphoreszente ruthenium(II)-Tris-4,7-diphenyl-l ,10-phenanthrolin eingebettet in Nanopartikel, als inerter Referenzstandard
pH sensitiver Fluoreszenzfarbstoff für den pH Bereich 7.3 - 9.3
HPTS: 8 - Hydroxypyrene - 1 ,3,6 - trisulfonische Säure als Trinatrium
salz
pH sensitiver Fluoreszenzfarbstoff für den pH Bereich 5.5 - 8.6 (Zhu et al. 2005) bzw. C02 sensitiver Fluoreszenzfarbstoff 0 - 20 %
PtOEP: Platin(II) 2,3 ,7,8, 12, 13, 17, 18-octaethyl-21 H,23H-porphyrin
pH sensitiver Fluoreszenzfarbstoff
Pt-PFP: Platin(II) mesotetra (pentafluorophenyl) porphyrin
02 sensitiver Fluoreszenzfarbstoff für den Bereich 0 % - >21 % 02
Ruthenium(II)diimin Komplex: Ruthenium(II)-tris-4,7-diphenyl-l ,10- phenanthrolin, mit trimethylsilylpropanesulfonat als Gegenion
02 sensitiver Fluoreszenzfarbstoff für den Bereich 0 % - >21 % 02
TOA+: Tetraoctylammonium Kation
Verbessert die Sensitivität von HPTS gegenüber C02 Die räumliche Auflösung ist in der Regel von der Pixelauflösung der verwendeten Kamera und dem Kameraabstand abhängig (z. B. Gesamtfläche 101 cm2 bei einer Pixelgröße von 277 μπι x 277 μπι, Hakonen et al. 2010). Im Falle des schrittmotorgebundenen Systems ist die räumliche Auflösung abhängig von der Schrittweite der Motoren und dem Durchmesser des Lichtkegels (z. B. Gesamtfläche 80 cm2 bei einer Schrittweite von 1.5 bis 3.0 mm je Schritt, Biossfeld & Gansert 2007).
Die zeitliche Auflösung zwischen zwei Bildaufhahmen liegt bei der Verwendung von kameragestützten Systemen im Sekundenbereich, bzw. Millisekundenbereich und ist von den Ka- meraeigenschaften, sowie der angegliederten Datenverarbeitungsroutine abhängig (z. B. Ringpuffer, Echtzeitverarbeitung, etc.). Langzeitmessungen von mehreren Tagen bis Wochen sind dabei möglich, benötigen jedoch ggf. einen großen Datenspeicher von mehreren MB bis GB mit ausreichend schnellen Zugriffszeiten, Datentransferraten und Zwischenspeichern (Hakonen et al. 2010). Bei der Verwendung von schrittmotorgebundenen Systemen liegt die zeitliche Auflösung zwischen den Einzelschritten im Sekundenbereich (2-3 Sekunden), die zeitliche Auflösung zwischen zwei vollständigen Rasterzyklen ist dabei abhängig von der Schrittzahl und liegt in der Regel im Minutenbereich (Blossfeld & Gansert 2007). Langzeitmessungen von mehreren Tagen bis Wochen sind dabei ebenfalls möglich und benötigen einen vergleichsweise kleinen Datenspeicher von wenigen MB.
Bisher sind semitransparente Optoden bekannt, die z. B. bei der Untersuchung von Boden das Vorhandensein von Tiergängen (z. B. Wurmgängen) visuell (durch die Optode hindurch) erkennen lassen (Holst und Grundwald 2001, Frederiksen & Glud 2006).
Bei der Anwendung von Optoden im Rahmen von z. B. Boden oder Pflanzenwurzeluntersu- chungen können diese durch eine transparente Glasscheibe von außen optisch ausgelesen werden. Eine Öffnung des Systems ist somit für die Messung nicht notwendig, und die genannten Veränderungen des Systems, z. B. hinsichtlich einer Störung des Gas- oder Feuchtehaushalts, werden ausgeschlossen. Wie zuvor beschrieben ist die Verwendung von Optoden zur allgemeinen Erfassung von chemisch-physikalischen Parametern, wie beispielsweise dem pH- Wert oder der Bestimmung von Salzkonzentrationen bekannt. Eine Messung von chemisch-physikalischen Parametern simultan zur bildgebenden Erfassung von Wachstumsprozessen in hoher räumlicher bzw. zeitlicher Auflösung unter Verwendung von Optoden ist bisher nicht möglich.
Bildgebende Verfahren wie DISP root, GROWMAP und GROWSCREEN root (Walter et al 2009, Nagel et al 2009) sind mit der Messung via Optoden aus verschiedenen Gründen bislang nicht kompatibel. Die bisher bekannten Optoden weisen in ihren physikalischen Eigenschaften nicht die benötigten optischen Charakteristiken auf, welche für eine solche Erfassung notwendig sind. Essentiell ist hierbei zunächst, dass planare Optoden eine geeignete Trans- missivität, und ein möglichst hohes, nicht durch (kohärente und inkohärente) Streuungseffekte beeinträchtigtes Auflösungsvermögen besitzen müssen. Das zu untersuchende Wachstumsobjekt muss für bildgebende Wachstumsanalysen möglichst klar, kontrastreich und scharf durch eine Optode hindurch kontinuierlich erkennbar sein.
Aus diesem Grund sind nicht alle beschriebenen oder im Handel erhältlichen Optoden für die automatisierte simultane Erfassung von Wachstumsparametern und chemisch-physikalischen Parametern des Wachstumsmediums geeignet. Die Mehrzahl der erhältlichen Optoden besitzt den Nachteil, dass diese fast vollständig opak, d. h. undurchsichtig sind. Die derzeit in der Literatur (US 2006/0105174 AI) als transparent beschriebenen Optoden sind für die gleichzeitige kontinuierliche Simultanerfassung von Wachstumsprozessen und chemischphysikalischen Parametern nicht für diesen Einsatzzweck getestet worden.
Im Rahmen von Wachstumsmessungen an Pflanzenorganen in einem Wachstumsmedium ist es beispielsweise essentiell, diese im Tagesverlauf zu beobachten, wenn die Erfassung in einer zeitlich hohen Auflösung erfolgen soll. Dies verlangt insbesondere einen Versuchsaufbau, bei dem das Licht so gewählt und appliziert wird, dass die Pflanze selbst möglichst wenig beeinträchtigt wird. Auf Wurzeloberflächen treffendes Licht kann von den Wurzeln wahrge- nommen werden und das Wachstum der Wurzeln beeinflussen.
Gemeinsamer Nachteil der unterschiedlichen Fluoreszenzmessmethoden ist, dass der ermittelte Parameter nur indirekte Rückschlüsse auf das Vorhandensein, bzw. die Aktivität der Pflanzenwurzeln erlaubt (z. B. Wachstumsprozesse). Aufgabe der Erfindung:
Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereit zu stellen, mit der/dem es möglich ist, die nicht-invasive Erfassung und Analyse von Wachstumsprozessen, insbesondere biotischen und abiotischen Wachstumsprozessen, bei zeitgleicher, simultaner Erfassung chemischer und/oder physikalischer Parameter in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu ermöglichen.
Unter der Bezeichnung„abiotische Wachstumsprozesse" sind beispielsweise physikalische Wachstumsprozesse, wie das Wachstum bodenphysikalischer Parameter, z.B. Bodenrisse oder Bodenporen, und deren Interaktion mit den anderen genannten Parametern Gegenstand des Interesses und mit dieser Apparatur und Verfahrensmethode analysierbar.
Unter„biotischen Wachstumsprozessen", auch als Differenzierungs- und Entwicklungsprozesse bezeichnet, sind im Sinne dieser Erfindung auch diejenigen Prozesse zu verstehen, die bei Kulturen/Gewebekulturen von tierischen, pflanzlichen oder pilzlichen Organismen/Zellen oder Populationen von Mikroorganismen stattfinden. Abiotische/biotische Wachstumsprozesse können gemeinsam in einer Untersuchung oder getrennt in verschiedenen Untersuchungen erfasst und analysiert werden.
Weitergehend sind jedoch auch Einsatzzwecke bei der Untersuchung anderer bioti- scher/abiotischer Wachstumsprozesse möglich. Beispielsweise erlaubt die Erfindung unter anderem auch die Beobachtung des Wachstums und der Entwicklung von Pilzhyphen oder Lebewesen der marinen bzw. terrestrischen Bodenfauna im Allgemeinen bei simultaner Erfassung der chemisch-physikalischen Eigenschaften und Veränderung des umgebenden Mediums in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Im Folgenden werden unter der Be- Zeichnung„Wachstumsprozesse" sowohl biotische als auch abiotische Wachstumsprozesse verstanden.
Eine nicht-invasive bildgebende Erfassung von Wachstumsparametern wie z. B. die Erfassung von biotischen Differenzierungs-, Entwicklungs- und Wachstumsprozessen von Organismen, Organen, Geweben oder Zellen, welche im Rahmen dieser Erfindung von besonde- rem Interesse sind, umfassen beispielsweise die räumliche und zeitliche Auflösung des Wachstums. Unter der Bezeichnung„räumliche und zeitliche Auflösung des Wachstums" sind beispielsweise Tropismen, Wachstumsgeschwindigkeiten, relative Wachstumsgeschwindigkeiten, räumliche Verteilung von Wachstumsgeschwindigkeiten und die zeitliche Dynamik der Veränderung von Wachstumsgeschwindigkeiten pflanzlicher Wurzeln und Rhizome, sowie deren dynamische Veränderung der Wurzelarchitektur zu verstehen. Aufgabe der Erfindung ist es dabei, diese Wachstumsparameter bildgebend mit Hilfe eines bildgebenden Verfahrens innerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer optischen Erfassungsein- heit/ einem Kamerasystem automatisiert zu erfassen und mit bildanalytischen Verfahren zu analysieren.
Unter der Bezeichnung„Erfassen" ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das Sammeln und Auswerten der Daten zu verstehen, die mit der optischen Erfassungseinheit/ dem Kame- rasystem ermittelt/bereitgestellt wurden. Diese Daten können mittels spezieller nach dem Stand der Technik bekannter Auswertprogramme, dazu verwendet werden, das Wachstumsverhalten in Abhängigkeit der chemikalisch-physikalischen Parameter auszuwerten und Aussagen über die Abhängigkeit des Wachstums von beispielsweise pH- Wert, Ammoniumkonzentration und Lichtintensität treffen zu können.
Die Erfindung ermöglicht sowohl eine Erfassung und Analyse der biotischen/abiotischen Wachstumsprozesse, als auch mit Hilfe der planaren, transparenten Optoden eine Analyse und Erfassung von fluoreszenz-spektrometrisch detektierbaren, sich dynamisch verändernden chemisch-physikalischen Parametern und Prozessen innerhalb des Wachstums-Mediums bzw. -Substrats, sowie deren Interaktion mit den erfassten Wachstumsprozessen, die in hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung bildgebend simultan erfasst und bildanalytisch ausgewertet werden können.
Die kontinuierliche Simultanerfassung von Wachstumsprozessen und chemisch- physikalischen Umweltparametern erfolgt erfindungsgemäß automatisiert und nicht invasiv, wobei sowohl eine qualitative, als auch eine quantitative Auswertung von Wachstumsprozessen und chemisch-physikalischen Parametern bzw. ihrer dynamischen Veränderung im Zeitverlauf möglich ist. Bei der Automatisierung in Hinsicht auf die Erfassung von Wachstumsparametern und chemisch-/physikalischen Parametern ist hierbei sowohl eine mechano- automatisierte Positionierung des Kamerasystems vor dem Untersuchungsobjekt, als auch vice versa eine mechanisch-automatisierte Positionierung des Untersuchungsobjekts vor der Kamera möglich.
Um eine hohe zeitliche Auflösung bei der Messung biotischer oder abiotischer Objekte zu erreichen, sollte die Erhebung der gemessenen Parameter in hinreichend kurzen Zeitabständen erfolgen, so dass die betreffende Wachstumsdynamik, d.h. die Veränderung im Laufe der Zeit, z. B. Wachstumsraten, dergestalt erfasst und beschrieben werden können, so dass eine kausalanalytische Interpretation ermöglicht wird. Eine hohe zeitliche Auflösung bei der Messung chemisch-physikalischer Größen wird dadurch erreicht, dass eine Erhebung der gemessenen Parameter in hinreichend kurzen Zeitabständen erfolgt, so dass die betreffende Veränderung der Parameter, z. B. Konzentrationen eines Analyten im Laufe der Zeit in einen kausalanalytischen Zusammenhang mit der Mes- sung der biotischen oder abiotischen Wachstumsprozesse gebracht werden kann. Handelt es sich beim Gegenstand der Untersuchung beispielsweise um eine Rhizosphäre, so sollte die zeitliche Auflösung zur Messung chemisch-physikalischer Größen normalerweise 1 Bild/Stunde (1 Image/h) betragen, da sich chemische Prozesse in der Rhizosphäre auch im Tagesverlauf ändern können. (Biossfeld et al. (2007))
Um eine hohe räumliche Auflösung bei der Messung biotischer oder abiotischer Objekte" zu erreichen, sollte eine Erhebung der gemessenen Parameter in hinreichend hoher räumlicher Auflösung erfolgen, welche im Sinne der Erfindung vornehmlich zweidimensional ist, aber unter bestimmten Umständen auch dreidimensional zu verstehen sein kann, so dass spezielle morphologische Parameter wie z. B. Wurzellängen und Wurzeldurchmesser exakt vermessen werden können. Je nach verwendeter Methode muss die maximale Auflösung die Erkennung der zu vermessenden Strukturen ermöglichen. Bei der Verwendung der DISP-Methode beispielweise, bei der räumliche Verteilungen der relativen Wachstumsraten innerhalb von wachsenden Wurzelspitzen im Zeitverlauf gemessen werden, sollte eine Auflösung von ca. 125 px ( Pixeln)/mm erzielt werden. Bei Aufnahmen von in Boden wachsenden Wurzeln in Rhizotronsystemen ist normalerweise eine Auflösung von ca. 5 - 10 px/mm ausreichend." Für eine hohe räumliche Auflösung bei der Messung chemisch-physikalischer Größen sollte die Erhebung der gemessenen Parameter in hinreichend hoher räumlicher Auflösung erfolgen, welche im Sinne der Erfindung vornehmlich zweidimensional ist, aber unter bestimmten Umständen auch dreidimensional zu verstehen sein kann, so dass die betreffende Veränderung der Parameter, z.B. Konzentrationen eines Analyten im Laufe der Zeit in einen kausalanalytischen Zusammenhang mit der Messung der biotischen oder abiotischen Wachstumsprozesse gebracht werden kann.
Je nach verwendeter Methode muss die maximale Auflösung die Erkennung der zu vermes- senden Strukturen ermöglichen. Handelt es sich beim Gegenstand der Untersuchung beispielsweise um eine Rhizosphäre, so sollte die räumliche Auflösung zur Messung chemischphysikalischer Größen normalerweise mindestens 1 px (Pixel)/mm betragen. Es kann zu jedem Messzeitpunkt eine zweidimensionale Karte beispielsweise der Konzentration des chemischen Analyten oder des physikalischen Parameters
(z. B. Temperatur) erstellt/ermittelt werden. Die Reaktion der Fluorophore auf der Fläche der Optode wird je nach Konzentration des Analyten unterschiedlich stark sein. Dadurch ist eine Kartierung der jeweiligen Parameter möglich.
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren, mit deren Hilfe Messungen von a) optisch detektierbaren Wachstumsprozessen und b) fluoreszenz-spektrometrisch detektierba- ren, sich dynamisch verändernden chemisch-physikalischen Parametern und Prozessen innerhalb eines Wachstums-Mediums bzw. -Substrats, sowie deren Interaktion mit den erfassten Wachstumsprozessen, in hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung bildgebend, simultan erfasst und bildanalytisch ausgewertet werden können. Es ist weiterhin auch möglich, parallel oder alternativ chemisch-physikalische Parameter außerhalb des Wachstumsmedi- ums/Substrats zu bestimmen, wie beispielsweise eine Gasanalyse des Sprosses in einem gasdicht abgeschlossenen Raum neben der Analyse der Wachstumsprozesse der Wurzeln und der chemisch-physikalischen Parameter im Wachstumsmedium.
Simultane bildgebende Erfassung von Wachstumsprozessen und chemisch-physikalischen Parametern
Zur optischen Messung und Erfassung verschiedener chemischer und physikalischer Eigenschaften des Wachstumsmediums können Optoden eingesetzt werden.
Die Messung mit Optoden basiert dabei beispielsweise auf der Verwendung von spezifischen, auf den zu messenden Parameter abgestimmten Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorophore), die kurzfristig mit Licht einer oder mehrerer spezieller Wellenlängen angeregt werden. Der Farb- stoff fluoresziert dabei in Abhängigkeit der Quantität des zu messenden Parameters. In der Regel wird der Farbstoff in oder auf einer Polymermatrix, z. B. Polymerfolie fixiert und in/auf das zu untersuchende Medium ein/aufgebracht bzw. steht mit dem zu untersuchenden Objekt oder Medium in chemisch und/oder physikalischem Kontakt. Die optische Messung erfolgt mittels eines geeigneten optischen Aufbaus (z. B. CCD-Kamera) außerhalb des zu untersu- chenden Mediums.
Die im Rahmen dieser Erfindung simultan detektierbaren und koregistrierbaren chemischphysikalischen Parameter können dabei unterschiedlicher Natur sein. Gemessen werden kön- nen beispielsweise Temperatur, pH- Werte, spezifische Stoffkonzentrationen (beispielsweise von Ammoniumionen, Sauerstoff, C02). Weitere Parameter und ihr jeweiliger Einfluss auf bestimmbare Wachstumsparameter sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Grundsätzlich ist die Auswahl der zu beobachtenden Parameter sehr vielseitig, da prinzipiell eine Vielzahl von Fluorophoren und beschichteten Optoden genutzt werden können, bzw. beschrieben sind. Auch die gleichzeitige Messung verschiedener dieser Parameter ist möglich.
In Tabelle 2 sind beispielhaft verschiedene mögliche Parameter ausgewählt, wobei das vorgestellte System simultane Messungen der dynamischen Veränderung von Parametern aus bei- den Spalten im Zeitverlauf ermöglicht. Die in Tabelle 2 aufgeführten Parameter sind nicht einschränkend zu sehen, sondern stellen nur eine mögliche Auswahl von Parametern dar. Es können daher auch andere Parameter durch den Einsatz von Optoden bestimmt werden. Durch Anpassung des Aufbaus ist es dabei auch möglich, mehrere Parameter aus einer oder beiden Spalte zu detektieren.
Durch konventionelle Anpassungen (z. B. Linsenwechsel, Arbeitsabstand etc.), bzw. Änderung des zeitlichen Intervalls zwischen den Einzelaufnahmen des optischen Aufbaus kann das System hierbei flexibel in seiner räumlichen und zeitlichen„Vergrößerung" bzw. Auflösung an die jeweiligen Anforderungen des Versuchsaufbaus angepasst werden. So lassen sich beispielsweise sowohl das Wachstum der Wurzelspitze einer Pflanze, als auch Veränderungen des gesamten Wurzelsystems im Zeitverlauf charakterisieren.
Zudem kann der Aufbau innerhalb einer automatisierten Anlage genutzt werden. Diese Flexibilität ermöglicht beispielsweise ein Screening von Pflanzen im Hochdurchsatz mit einer hohen Zahl von Replikaten, die gleichzeitig untersucht werden können.
Tabelle 2: Beispiele von chemisch-physikalischen Parametern und Wachstumsparametern, die (unabhängig voneinander) im Rahmen dieser Erfindung gemessen werden können.
Chemische & physikaliWachstumsparameter
sche Parameter des
Wachstumsmediums
C02 Konzentration Wachstumsgeschwindigkeit
02 Konzentration Wurzelarchitektur, Wurzelsystemarchitektur
Temperatur Wachstumsdynamik
pH-Wert Substratstruktur, z. B. auch
geschaffen durch die Bodenfauna
Ionen-Konzentrationen Tropismen
Zucker- und Kohlenhyd- Lokalisation von Wachstumsratanalyse zonen (z. B. Wurzel wachstums- zonen)
Stoffflussraten im WachsZell- und Organdifferenzierung
tumsmedium Altersbestimmungen
Bestimmungen von Entwicklungsstadien
Darüber hinaus ist der Einsatz der Erfindung mit einer Vielzahl von Wachstumsmedien bzw. Substraten möglich.
Unter Wachstumsmedien ist hierbei ganz allgemein der Raum zu verstehen, welcher das zu beobachtende Untersuchungsobjekt wie beispielsweise einen Organismus/ ein Lebewesen bzw. das Organ umgibt, und der dessen Wachstum zulässt und somit die Lebensumwelt darstellt. Das Wachstumsmedium kann bei der verwendeten Verfahrensmethode vielfältiger Natur sein, wobei es sich sowohl um ein natürliches Substrat (beispielsweise Boden, Erde, Sand) als auch um„halb"-synthetische Substrate (beispielsweise Agar, Hydrokulturen, Luftkulturen) handeln kann. Auch der Einsatz von anderen Wachstumsmedien, wie beispielsweise vollsynthetischen, quellfähigen Substitutionsmedien ist möglich. Bei der Betrachtung pflanz- licher Wurzelsysteme wird das Wachstumsmedium beispielsweise als die Rhizosphäre bezeichnet. Die Rizosphäre kann definiert werden, als das Bodenvolumen welches lebende Pflanzenwurzeln umgibt und welches durch die Wurzelaktivität beeinflusst wird. Hinsinger et.al. (2005) New Phythologist, 168:293-303.
Unter der Bezeichnung Organismus/Lebewesen kann es sich beispielsweise um ein pflanzliches Wurzelsystem handeln, welches zusammen mit dem dieses umgebenden Wachstumsmedium bildgebend aufgenommen wird. Unter der Bezeichnung Organismus können allgemein pflanzliche, tierische Organismen oder auch Bakterien, Pilze verstanden werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst ein System, welches eine oder mehrere Kameras, eine optische Konfiguration, eine Lichtquelle zur Ausleuchtung des Untersuchungsobjekts, z. B. der Rhizosphäre, eine spezielle planare und dergestalt hinreichend transparente Optode, so dass Wachstumsmessungen gewährleistet sind, (wobei die Optode mindestens ein immobilisiertes Fluorophor besitzt) sowie eine digitale Computereinheit (bzw. ein Embedded Compu- ter System) nutzt. Mit Hilfe dieser Anordnung ist es möglich, nicht-invasiv und nichtdestruktiv fotografische Aufnahmen bzw. Zeitrafferaufnahmen eines wachsenden Organismus, Organs oder Gewebes anzufertigen.
Damit die Anfertigung fotografischer Aufnahmen möglich ist, befinden sich das biologische Objekt und das Wachstumsmedium innerhalb eines transparenten Wachstumscontainers, der zumindest teilweise transparent ist. Basierend auf den erstellten Bildern und Bildserien ist es möglich, das Wachstum und spezielle Eigenschaften des Wachstums (z. B. Wurzelsystemarchitektur) aufzunehmen und zu analysieren. Gleichzeitig erlaubt eine zweite Gruppe von erstellten Bildern und Bildserien die Simultanerfassung einer oder mehrerer chemischer und/oder physikalischer Eigenschaften innerhalb des Wachstumsmediums, wobei die Aufnahmen aller Parameter in hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung erfolgen kann.
Die erfindungsgemäß eingesetzte planare, transparente Optode besitzt im Vergleich zu bekannten, im Handel erhältlichen planaren Optoden vorteilhafte optische Eigenschaften. Durch die erfindungsgemäße planare, transparente Optode ist erstmalig ein gleichzeitiges Hindurchschauen und Hindurchfotografieren durch eine Optode möglich. Die erfindungsgemäße Optode ist somit transparent. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter„optischen Eigenschaften" die Parameter Auflösungsvermögen, Kontrast und Transmissivität verstanden.
Durch die vorteilhaften optischen Eigenschaften, insbesondere die Transparenz, sind erstma- lig auch gleichzeitige andere Messungen in Form einer Bildanalyse und Bildgebung möglich. Unter den vorteilhaften optischen Eigenschaften der Optode, die im Sinne der Erfindung gewünscht sind, und die bei Fotografie oder Schauen durch die Optode hindurch genutzt werden können, sind die folgenden Eigenschaften zu verstehen, die zusammen eine hohe Bildgüte und objekttreue Abbildung gewährleisten: a) die erzielbare Transmissivität (also geringe Absorption von Licht verschiedener
Wellenlängen),
b) der erzielbare Grauwert-Kontrast (fotometrischer Kontrast; Unterschiede hinsichtlich der Helligkeit zwischen hellen und dunklen Bereichen beim aufge- nommenen Objekt bleiben bei hohem Erhalt des Grauwert- Kontrasts erhalten)
und
c) das erzielbare Auflösungsvermögens (bei hohem Auflösungsvermögen geringe
Verbreiterung der Punktantwort (in Pixel) in fotografischen Aufnahmen durch
die Optode hindurch; Erhalt einer hohen Trennschärfe).
Die vorteilhaften Eigenschaften der Optode sind insbesondere deshalb so bedeutsam, da erfindungsgemäß fotographische Aufnahmen von den zu untersuchenden Objekten bzw. Organismen durch die Optode hindurch gemacht werden sollen, und sich die Objekte hinter der planaren Optode befinden.
Die genannten vorteilhaften optischen Eigenschaften bedeuten im Falle der hier eingesetzten Optode, dass nur minimale Veränderungen hinsichtlich der Abbildungsqualität bzw. der Bildgüte des durch die Optode hindurch fotografierten Objekts/Organismus verursacht werden. Die Veränderung ist so gering, dass Objekte/Organismen, die sich hinter der Optode befinden, durch die Optode hindurch objekttreu erkannt werden können, und bei Fotografie durch die Optode hindurch objekttreu und signifikant gleich zur Referenz wiedergegeben werden können. Die genannten vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten planaren, transparenten Optode haben bestimmte Entsprechungen bezüglich der Bildqualität, die im Folgenden genannt werden: a) Die gewünschte hohe Transmissivität der Optode wird durch eine geringe
Absorption von Licht verschiedener Wellenlängen bedingt. Eine geringe Absorption bewirkt, dass eine nur geringe Abschwächung der Lichtintensität
resultiert. Die Lichtintensität, die hier als zu messendes Signal von Bedeutung
ist, ist diejenige, die von der Lichtquelle ausgesandt wird, beziehungsweise die
vom abzubildenden Objekt reflektiert wird. Die Lichtintensität ist das Signal,
das dann z. B. durch den Sensor einer digitalen Foto-Kamera gemessen, und
bildanalytisch ausgewertet werden kann. Ritzhaupt-Kleissl (2007) schreibt
„Für Anwendungen in mikrooptischen Bauteilen ist es essenziell, dass die zum
Einsatz kommenden Kompositmaterialien eine hohe optische Transparenz
besitzen, um eine möglichst verlustarme Lichtleitung und damit Signalübertragung zu ermöglichen." b) Der gewünschte hohe Grauwert-Kontrast wird durch eine geringe Lichtstreuung bewirkt. Streut die planare, transparente Optode das Licht wenig, bleibt ein
hoher Grauwert-Kontrast erhalten. Bei hohem Kontrast besitzen helle und
dunkle Bereiche in den fotografischen Aufnahmen nur wenig veränderte Grauwerte, wie sie erzielt würden, wenn sich kein Element im Strahlengang befindet, dass das Licht streut.
c) Die hohe Trennschärfe in der fotografischen Aufnahme bzw. das hohe Auflö- sungsvermögen in der fotografischen Aufnahme wird durch eine Punktantwort
mit kleinem Durchmesser bewirkt. Die Punktantwort (Streuscheibchen, Green- sche Funktion, Transmissionsfunktion) besagt, wie ein scharfer Lichtpunkt
nach Durchgang durch das optische System, hier die Optode, aussieht. Ist der
Lichtpunkt breit, wird das durch die Optode gesehene Bild unscharf. Die beob- achtete Verbreiterung kann durch Lichtstreuung bewirkt werden.
Grundsätzlich werden diese optischen Eigenschaften dann als vorteilhaft betrachtet, wenn durch ein Objekt hindurchgeschaut werden soll, wie z.B. bei Sichtscheiben (Fensterglasschei- ben). Die Absorption muss in diesem Fall möglichst gering, der Grauwert-Kontrast möglichst hoch, und das Auflösungsvermögen möglichst hoch sein.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemischer und/oder physikalischer Parameter setzt sich aus folgenden Komponenten zusammen:
a) Beleuchtungseinheit
Diese kann mindestens eine Lichtquelle umfassen sowie eine Steuereinheit, die diese Lichtquelle ein und ausschaltet. Die Lichtquelle sollte Licht mit einem Wellenlängespektrum emittieren, welches sowohl für die eine Beleuchtung/ Anregung der eingesetzten Optoden mit dem/den jeweiligen Fluorophor(en) geeignet ist als auch das Wellenlängenspektrum/die Wellenlängen emittieren, welche/s für die bildgebende, fotographische Messung der Wachstumsprozesse benötigt wird. Es ist jedoch ebenfalls möglich, dass eine Lichtquelle zur Beleuchtung /Anregung der Optode dient und eine weitere Lichtquelle zur Emission des Wel- lenlängenspektrums/der Wellenlänge dient, die für die Erfassung und Analyse der Wachstumsprozesse benötigt werden.
Die benötigten Wellenlängen sind hierbei jeweils in Abhängigkeit von dem auf der planaren Optode immobilisierten Fluorophor und dessen Anregungsmaxima auszuwählen. Im Falle von HPTS sind dies beispielsweise die Wellenlängen 405 und 450 nm. Für die Aufnahme von Bildern und Bildsequenzen zur Wachstumsanalyse wird ein dritter Wellenlängenbereich benötigt. Die Lichtquelle/n sollte/n daher Licht einer Wellenlänge im Bereich von beispielsweise 200 bis 2500 nm emittieren. Die Anzahl der benötigten Lichtquellen hängt von dem jeweiligen Wellenlängenspektrum ab, das die Lichtquelle emittieren kann und den jeweils benötigten Wellenlängen.
Diese Wellenlängen sind von drei Faktoren abhängig zu wählen:
i. Vom Absorptionsspektrum der verwendeten hinreichend transparenten planaren Optode, (die die simultanen Wachstumsmessungen, z. B. mit der Software GROWSCREEN-Root und/oder der GROWMap-Root gewährleistet).
ii. Die gewählte Wellenlänge sollte sowohl das biologische Objekt, als auch das
Wachstumsmedium wenig beeinflussen (-^Wurzeln zeigen beispielsweise keine Beeinflussung durch Beleuchtung im nahen Infrarot (NIR) und kurzwelligen Infra- rotlicht (SWIR= short wavelength infrared) Spektrum. iii. Die Wellenlänge darf nicht mit den Anregungs- und Emmisionsbereichen des jeweils verwendeten Flurophors überlappen.
Eine mögliche Lichtquelle kann neben anderen Wellenlängen eine (monochromatische) Infra- rotbeleuchtung sein, die im Wellenlängenbereich zwischen 700 nm und 2500 nm emittiert. Soweit eine herkömmliche CCD Kamera als optische Erfassungseinheit zum Einsatz kommt, ist der Wellenlängenbereich der Lichtquelle auf den Bereich bis etwa 1100 nm begrenzt, da die Sensoren der CCD Kameras dort ihre obere Wellenlängensensitivitätsgrenze erreichen. Die Lichtquelle kann vorzugsweise zusätzliche monochromatische Wellenlängen im Bereich des Anregungsmaximums bzw. der Anregungsmaxima des/ der verwendeten immobilisierten Fluorophoren auf der Optode bereitstellen. Diesbezüglich kann die Wellenlänge des Anregungsmaximums in Abhängigkeit vom verwendeten Fluorophor variieren. Die Auswahl der gewünschten/erforderlichen Fluoreszenzmessung bestimmt darüber hinaus ebenfalls die Anzahl der monochromatischen Wellenlängen (z. B. Dual excitation - Single emission, bzw. Dual lifetime referencing, siehe Absatz zur Ratiometrischen Fluoreszenzmessung) Im Falle von HPTS und dem Dual excitation - Single emission Fluoreszenzmessverfahren betragen die erforderlichen Anregungswellenlängen beispielsweise 405 nm und 450 nm, wobei 405 nm der unprotonierten Form und 450 nm der protonierten Form von HPTS entspricht.
Als Lichtquelle ist beispielsweise eine Kaltlichtquelle geeignet. Weiterhin kann die Lichtquel- len eine oder mehrere monochromatische LEDs oder ein LED Cluster sein bei denen die Emission der LEDs für Anregungen der einzelnen Anregungswellenlängen der Fluorophore ein nicht überlappendes Spektrum aufweisen. Die„Füll Half Width" (Halbwertsbreite) der LEDs muss idealerweise also möglichst schmal gewählt werden.
Die Lichtquelle kann weiterhin aus einer oder mehreren Schichten transparenter, selbstillu- minierender monochromatischer OLEDs für jede der für die Fluorophore benötigten Wellenlängen bestehen. Die Emission der OLEDs für Anregungen der einzelnen Anregungswellenlängen der Fluorophore sollte ebenfalls ein nicht überlappendes Spektrum aufweisen. Die „Füll Half Width"der OLEDs muss idealerweise also möglichst schmal gewählt werden.
Vor der Lichtquelle kann ein Filterrad oder ein Filterwechsler angeordnet sein, der einen Wechsel zwischen mindestens zwei Filtern ermöglicht. Als Filter kann beispielsweise ein „Narrowband"-Filter mit einer geringen„small half width" von beispielsweise 15 nm für die Anregungswellenlänge, bzw. -Wellenlängen, die aus der Auswahl der immobilisierten Fluorophoren und der jeweiligen Fluoreszenzmessmethode resultieren, eingesetzt werden. Für HPTS und das Dual-Excitation/Single-Emission-Verfahren ist beispielsweise der Einsatz von zwei Filtern im Bereich von 405 nm bzw. 450 nm erforderlich. In Abhängigkeit vom eingesetzten Fluorophor und dessen erforderlichen Anregungswellenlänge kann auch eine Infrarot- Durchlassfilter, der nur Infrarotes Licht oberhalb von 700 nm, aber kein Licht aus dem Be- reich des sichtbaren und UV-Lichtbereichs, durchlässt, eingesetzt werden. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, die Lichtquelle zusammen mit einem Diffusor zu versehen, mit dessen Hilfe eine homogene Beleuchtung erreicht wird.
b) Optische Erfassungseinheit
bestehend aus beispielsweise mindestens einer analogen oder digitalen Kamera. Die optische Erfassungseinheit dient zum einen der Erfassung der Bilddaten/Bildsignale, die von dem zu untersuchenden Organismus/Wachstumssystems abgegeben werden und die zur Erfassung des Wachstumsprozesse benötigt werden und zum anderen der Erfassung des von den Fluo- rophoren emittierte Fluoreszenzlichts.
Als Kamera kann beispielsweise ein CCD Kamera verwendet werden. Die Kamera kann mit einem Filter/Sperrfilter versehen sein, der nur den Durchtritt von Licht einer bestimmten Wellenlänge ermöglicht. Dies kann beispielsweise das Licht der Wellenlänge sein, das der Anregungswellenlänge des Fluorophors auf der Optode entspricht oder im Falle der Erfassung von Bilddaten des Wachstumsprozesses das Licht der Wellenlänge sein, welches für die Aufnahme und Analyse des Wachstums des zu untersuchenden Organismus erforderlich ist. Für die Erfassung von Wachstumsprozessen ist beispielsweise Licht im nahen Infrarotlichtspektrum geeignet. Der Filter kann vor der Linse der Kamera angeordnet sein. Er kann alternativ hinter der Linse angeordnet sein mit einer optionalen Tubusverlängerung vor dem Sensor der Kamera. Die optische Erfassungseinheit kann mindestens auch zwei Kameras aufweisen. Die erste Kamera dient dann der Detektion und Erfassung der chemischphysikalischen Parameter (z. B. pH- Wert) in dem die Emission des Fluoreszenzlichts gemessen wird. Diese Kamera sollte einen„Narrow-Band-Filter" (engbandigen Filter) mit einer geringen„Füll Half Width" (= Halb wertsbreite: Breite des insgesamt emittierten Wellenlängenspektrums bei halber Höhe des Emissionsmaximums) aufweisen. Die zweite Kamera wird dann für die Aufnahme der Wachstumsdaten verwendet. Für diese Anwendung kann beispielsweise ein Infrarot Passthrough Filter an der Kamera angeordnet sein, der nur Infrarotlicht durch den Filter passieren lässt. Es wird somit von dieser Kamera nur das infrarote Licht erfasst, dass zur Erfassung des Untersuchungsobjekts zur Beleuchtung desselben eingesetzt wurde.
c) Mindestens einen Wachstumscontainer, der mindestens teilweise eine transparente Wandfläche aufweist. Der Wachstumscontainer kann jedoch auch zwei oder mehr transparente Wandflächen aufweisen. Die transparente Wandfläche sollte so groß gewählt werden, dass die Optode mit Licht ausreichend angeregt und das Signal der Optode entsprechen ausgewertet werden kann und der Organismus der untersucht werden soll, ebenfalls ausreichend durch die optische Erfassungseinheit belichtet und die Bilddaten erfasst werden können. Die transparente Wandfläche sollte mindestens für Licht der Wellenlänge durchlässig sein, die von der Beleuchtungseinheit emittiert wird. Dies kann beispielsweise Licht im Infrarotlichtspektrum und sichtbaren Lichtspektrum sein. In einer vorteilhaften Ausführung des Wachstumscontainers ist die Wandfläche, die sich hinter der transparenten Wandfläche befindet, mit einem dunklen, nicht reflektierenden und stark absorbierenden Material abgedeckt. Dies kann beispielsweise schwarzer Samt oder ein ähnliches Material sein. Dieses Material dient zur Vermeidung von rückstreuendem Licht und anderen optischen Effekten. Der Wachstumscontainer sollte eine dreidimensionale Ausgestaltung aufweisen und kann beispielsweise die Form eines Würfels, Quaders oder eines Zylinders haben. Petrischalen sind ebenfalls als Wachstumscontainer geeignet. Der Wachstumscontainer ist mit Wachstumsmedium gefüllt. Unter Wachstumsmedium ist hierbei ganz allgemein der Raum zu verstehen, welcher den zu beobachtenden Organismus bzw. das Organ umgibt, dessen Wachstum zulässt und somit die Lebensumwelt darstellt. Das Wachstumsmedium kann vielfältiger Natur sein, wobei es sich sowohl um ein natürliches Substrat (beispielsweise Boden, Erde, Sand) als auch um „halb"-synthetische Substrate (beispielsweise Agar, Hydrokulturen, Luftkulturen) handeln kann. Auch der Einsatz von anderen Wachstumsmedien, wie beispielsweise vollsynthetischen, quellfähigen Substitutionsmedien ist möglich. Bei der Betrachtung pflanzlicher Wurzelsysteme wird das Wachstumsmedium typischerweise als die Rhizosphäre bezeichnet. Der Wachstumscontainer wird in diesem Fall dann als Rhizotron bezeichnet. Ist das Wachstumsmedium beispielsweise Agar so sollte dieses mit der entsprechend an den zu untersuchenden Organismus angepassten Nährlösung angereichert sein. Dazu kann beispielsweise eine Hoaglandlösung in verschiedenen Abwandlungen oder jede andere für Pflanzenanzuchten geeignete Nährlösung verwendet werden. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können auch mehrere Wachstumscontainer untersucht wer- den, die dann beispielsweise automatisiert jeweils ausgetauscht und gemessen werden können. So kann beispielsweise ein Petrischalenrad vermessen werden, bei dem die Petrischalen durch einen gesteuerten Motor jeweils immer ausgetauscht und in die erforderliche Richtung/Position für die Beleuchtungseinheit und optische Erfassungseinheit ge- bracht werden, (s. a. Figur 1)
Die Beleuchtungseinheit kann in einer vorteilhaften Ausführung der Vorrichtung direkt pla- nar auf der Frontseite des transparenten Wachstumscontainers aufgebracht sein. Die Beleuchtungseinheit kann hierbei sowohl kameraseitig als auch auf der entgegengesetzten Seite angebracht werden.
Die Beleuchtungseinheit ist bei dieser Ausgestaltung derart zu positionieren, dass die transparente Seite des Containers so homogen wie möglich ausgeleuchtet wird. Bei der Positionierung ist darauf zu achten, dass Totalreflektionen und andere Lichteffekte möglichst vermieden werden. Dies kann beispielsweise durch eine Anordnung der Beleuchtungseinheit in einem Winkel von unter 90° (Winkel zwischen Kamera und Strahlengang der Beleuchtungseinheit, wobei entweder die Kamera oder die Beleuchtungseinheit orthogonal auf die Fläche des transparenten Wachstumscontainers sowie die Fläche der transparenten Optode ausgerichtet ist) erfolgen. Beispielhaft kann die Lichtquelle in einem 30° Gradwinkel angebracht werden. Abweichende Winkel in einem Bereich von 0 bis 90° Grad sind bei der Messung bei Bedarf aber ebenfalls möglich. Der Wachstumscontainer kann ebenfalls in einem Winkel von unter 90° horizontal geneigt zur Beleuchtungseinheit und zur optischen Erfassungseinheit angeordnet sein, so dass zum einen Totalreflektionen vermieden werden und zum anderen das Wachstum in Richtung der Optode erfolgt, so dass die transparente planare Optode mit dem Wachstumsmedium kontaktieren kann. d) eine planare, transparente Optode
Eine im Rahmen der Erfindung geeignete planare, transparente Optode zur Messung der chemisch und/oder physikalischen Parameter, beispielsweise des pH- Wertes, die sich, wenn sie mit einem Film flüssigen Wassers benetzt ist, durch eine Transparenz auszeichnet, die beispielsweise alle in Walter et al. (2009) genannten Verfahren zur Messung von Wachstumsprozessen von Wurzeln ermöglicht (wie z. B. DISP und GROWSCREEN root), und den Fluoreszenzfarb stoff immobilisiert, kann kann wie folgt hergestellt werden: Eine Celluloseacetat-Folie (z. B. von Clarifoil®) wird mit einem Ethylcellulose-Polymer beschichtet, in welches der Fluoreszenzfarbstoff HPTS (8-Hydroxy-l,3,6-Trisulfonsäure) immobilisiert wird. Zur Herstellung der Lösung, mit welcher die Folie beschichtet wird, müssen zunächst zwei Lösungen bereitgestellt werden.
Hier als Lösung 1 und Lösung 2 bezeichnet, welche danach gemischt werden. Die resultierende Lösung, welche hier als Lösung 3 bezeichnet wird, kann z. B. per Tauchbeschichtungsver- fahren auf die Trägerfolie aufgebracht werden.
Die Reagenzien zur Herstellung der Lösung 1 können sein: a.) Tetraoctylammoniumhydroxid-Lösung (TOA+; 10%ige Lösung in Methanol)
wird gemischt mit
b.) Ethanol (99.5 %-ige Lösung), wobei die Terraoctylammoniumhydroxid-
Lösung an der entstandenen Gesamtlösung aus a) und b) einen Volumenanteil
von 20 % und die Ethanol-Lösung b) einen Volumentanteil von 80 % an der
Gesamtlösung aus a) und b) hat.
In diese Gesamtlösung aus a) und b) wird der Fluorophor, z. B. HPTS (8-Hydroxy-l, 3, 6- Trisulfonsäure) gegeben und gelöst, wobei der Fluorophor dann einen Anteil von 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent an der Gesamtlösung aus a) und b) hat.
Die Reagenzien zur Herstellung der Lösung 2 können sein:
d) Ethanol (99.5 %-ig)
wird gemischt mit
e) Toluol (99.5%ig) zu einer Gesamtlösung aus d) und e) wobei Ethanol an der
Gesamtlösung einen Volumenanteil von 40% und Toluol an der Gesamtlösung
einen Volumenanteil von 60 % hat.
In diese Gesamtlösung aus d) und e) wird Ethyl-Zellulose (Ethoxyl Gehalt 48 %) gegeben und gelöst, wobei der Anteil von Ethyl-Zellulose dann einen Anteil von 0,59 Gewichtsprozent an der Gesamtlösung von d) und e) hat. Zur Herstellung der Lösung 3 werden die Lösungen 1 und 2 im Verhältnis 1 zu 2,125 gemischt. Nach dem Tauchbeschichtungsverfahren (Dip-Coating) wird die Optode getrocknet, in Milli-Q-Wasser gespült und kann getrocknet aufbewahrt werden. Für das Tauchbeschichtungsverfahren können alle nach dem Stand der Technik bekannten Bedingungen gewählt werden. Als besonders geeignet hat sich ein 1- bis 3-faches ca. 10- sekündiges Eintauchen des Trägermaterials in die fluoreszenzfarbstoffhaltige Lösung erwiesen, wobei nachfolgend das Trägermaterial mit einer Geschwindigkeit von ca. 1 cm/Sekunde aus der Lösung herausgezogen wurde.
Als Fluorophore und Polymere sind grundsätzlich auch alle nach dem Stand der Technik bekannten Verbindungen geeignet, die in den jeweils bekannten Lösungsmitteln gelöst werden können.
Die verwendeten Optoden sollen im Sinne der Erfindung über den sichtbaren Bereich des Spektrums sowie über den Nahinfraroten Bereich des Spektrums 1.) eine maximale Transmis- sivität, 2.) ein maximales Auflösungsvermögen sowie 3.) einen maximalen Grauwert-Kontrast besitzen, um die Messung von Wachstumsparametern (vgl. Walter et al., 2009) möglichst nicht zu beeinträchtigen.
Je nachdem ob mehrere Fluorophore und/oder Ionophor- Schichten (ionenselektive Schichten, um gezielt nur einen Analyten an den Fluorophor gelangen zu lassen) in die Optode eingebracht werden ist ggf. sogar eine gleichzeitige Messung mehrerer chemischer Analyte und/oder physikalischer Parameter möglich.
Weitere Vorteile der Optode sind
a) die gleichzeitige hohe Abriebfestigkeit der Polymerschicht, die auf den Träger
aufgebracht ist und den Fluorophor enthält (Polymerschicht kann unter fließendes Wasser gehalten werden, ohne sich abzulösen),
b) die starke Immobilisierung des Fluorophors (beispielweise HPTS diffundiert
nicht aus der Polymerschicht), sowie
c) die hohe Sensitivität (Zhu et al. 2005) der Optode. Zhu et al. (2005) schreiben, dass HPTS als einer der besten Indikatoren zur fluores- zenzspktrometrischen pH-Messung gilt, da HPTS eine exzellente Fotostabilität, eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, und weitere vorteilhafte Eigenschaften aufweist.
Diese Eigenschaften sind insbesondere bei Immobilisierung des Fluorophors HPTS festzustel- len. HPTS ist im Vergleich zu anderen Fluorophoren besonders gut erforscht (Zhu et al.
2005), stabil gegenüber fotolytischem Abbau des Moleküls durch Lichteinstrahlung (Zhu et al. 2005). In vielen Fällen können beispielsweise auch Ionophore in oder auf die Optode ein- oder aufgebracht werden.
Die Optode ist so angeordnet, dass die Seite, die mit dem Fluorophor beschichtet ist, mit dem Wachstumsmedium kontaktiert.
Es beispielsweise auch möglich, dass zwei bis mehrere Optoden innerhalb des Wachstumscontainers gleichzeitig eingesetzt werden, mit denen dann beispielsweise die Parameter pH- Wert, Ammoniumkonzentration oder andere Salzkonzentrationen erfasst werden können. e) Ein Steuerungseinheit. Dies kann zur Steuerung der Vorrichtungskomponenten wie beispielsweise der Beleuchtungseinheit und der optischen Erfassungseinheit eingesetzt werden.
f) Eine elektronische Datenerfassungs- und Auswerteeinheit (oder Embedded Computer). Hier können die ermittelten Daten/Bilddaten gespeichert und mittels spezieller Auswerteverfahren und Auswerteprogramme ausgewertet werden.
In einer vorteilhaften Ausgestaltung weist die Vorrichtung
g) als elektronische Datenerfassungs-/ Auswerteeinheit einen Computer mit einem mathematischen Auswerteprogramm, wie beispielsweise MATLAB, The Math WORKS Inc. auf.
h) Eine Dunkelbox zur Abschirmung des zu untersuchenden Organismus/Wachstumscontainers vor störenden Außenlichteinflüssen und /oder insbesondere zur Abschirmung der optischen Erfassungseinheit , wie z. B der Kamera, der Optik, des Wachstumscontainers, der Beleuchtungseinheit wie z. B. der Lichtquelle, der Optoden und Filter vor Außeneinflüssen (wie beispielsweise externes Licht, Temperaturschwan- kungen). Eine optionale Zugangsklappe kann dabei optionale Wartungsarbeiten erleichtern.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemischer und/oder physikalischer Parameter, umfassend folgende Verfahrensschritte:
a) Erfassung der Wachstumsprozesse mittels bildgebender Methoden.
b) Erfassung der chemisch und/oder physikalischen Parameter durch Verwendung einer pla- naren, transparenten Optode, wobei die Daten aus a) und b) simultan und parallel zueinander gewonnen werden.
Eine vorteilhaften Ausführung des Verfahrens ist gekennzeichnet durch
a) Einbringen eines Wachstumsmediums in einen Wachstumscontainer.
b) Einbringen einer transparenten, planaren Optode in den Wachstumscontainer,
so dass die Seite der Optode, die mit dem Fluorophor beschichtet ist, mit dem
Wachstumsmedium kontaktiert.
c) Einbringen des Untersuchungsobjekts in das Wachstumsmedium des Wachstumscontainers und Kultivieren unter Kulturbedingungen.
d) Belichten des Wachstumscontainers durch eine Beleuchtungseinheit mit Licht
einer Wellenlänge, das im Anregungswellenlängenbereich des jeweiligen Flu- orophors der Optode liegt.
e) Belichten des Untersuchungsobjekts im Wachstumscontainer:
f) Aufnahme von Bilddaten aus e) und des emittierten Fluoreszenzlichts aus d)
mit einer optischen Erfassungseinheit:
g) Auswerten der Daten aus f).
Die Erfindung bietet neuartige Lösungen und Anwendungen für mehrere wirtschaftliche und wissenschaftliche Zwecke. Dabei ist beispielsweise vor allem die Nutzpflanzenwissenschaft zu nennen, der die erfindungsgemäßen Verfahren und Methoden die Möglichkeit eröffnen, auf den Gebieten der Pflanzenzuchtwissenschaft sowie der Pflanzenschutzwissenschaft Screenings durchzuführen. Diese Screenings können beispielsweise der Untersuchung des Potentials verschiedenen Pflanzentypen (beispielsweise Sorten, Biotypen, Ökotypen, Mutanten, Arten, Transgenen, Hybriden u. a.) dienen, mit ihrer Umwelt im gewünschten Sinne auf chemisch-physikalische Weise zu interagieren.
Anwendungen finden sich demnach in der kombinierten, simultanen Messung von chemisch- physikalischen Wechselwirkungen, welche von Lebewesen, Geweben oder Zellkolonien auf das Wachstumssubstrat oder Wachstumsmedium ausgehen, oder umgekehrt vom Wachstumssubstrat oder Wachstumsmedium auf Lebewesen, Geweben oder Zellkolonien ausgehen, sowie der räumlichen und zeitlichen Auswirkungen und Verteilungen von Schadstoffen, Xenobiotika, Nährstoffen oder anderen biologischen, chemischen und physikalischen Stimuli und gleichzeitiger bildgebender und bildanalytischer Erfassung von Wachstumsparametern, mit dem Ziel z. B. eines Sorten/Ökotypen-Screenings, Stoffwechsel-Monitorings, Toleranz- und/oder Resistenz-Screenings und/oder -Monitorings, in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Dabei kann eine Anwendung beispielsweise auch in der Untersuchung des Nähr- stoffaufnahmevermögens einer Pflanze bestehen, oder in der Untersuchung eines Herbizideffekts auf Stoffwechselprozesse der Rhizosphäre, oder Toleranzen von Pflanzen gegenüber Umweltgiften im Fokus stehen. Von besonderem Interesse sind in wirtschaftlicher Hinsicht unter letztgenannten Pflanzen insbesondere Nutzpflanzen sowie Ruderalpflanzen/Unkräuter zu verstehen.
Ein weiteres beispielhaftes Anwendungsfeld besteht somit auch in den Umweltwissenschaften und der Umwelttoxikologie. Eine denkbare Anwendung könnte z. B. darin bestehen, den Einfluss von Umweltgiften (z. B. Schwermetalle) auf die Wechselwirkungen zwischen Wurzel und Boden in der Rhizosphäre aufzuzeigen und zu quantifizieren. Die Deposition und Konzentration von Schwermetallen in Ökosystemen nimmt gegenwärtig weltweit zu und stellt seit Jahren einen Schwerpunkt der umwelttoxikologischen Forschung dar.
Im Weiteren wird die Erfindung an Hand von Ausführungsbeispielen und den beigefügten Figuren näher erläutert.
Es zeigen:
Figur 1 : Schematische Gesamtübersicht der Vorrichtung:
Figur 2: Wachstumscontainer in Form einer Petrischale:
Figur 3: Wachstumscontainer in Form eines Rhizotrons:
Figur 4: Wachstumscontainer in Form einer Hydrokultur:
Figur 5 : Anordnung der Vorrichtung mit schematischer Darstellung des
Verfahrensablaufs :
Figur 6: Relative Transmissivität (%) einer Optode nach Stand der Technik (a) im
Vergleich zur Transmissivität der erfindungsgemäßen, transparenten, planaren Optode (b) für Licht im Wellenlängenbereich zwischen 180 bis 900 nm; Abszisse X: Wellenlänge (nm); Ordinate Y: relative Transmissivität (%). Figur 7: Absorptionsspektren und beispielhaftes Emissionsspektrum (E) der transparenten, planaren Optode mit HPTS in Abhängigkeit verschiedener pH- Werte (pH 5,3; pH 9,7).
Es zeigt Figur 1 beispielhaft eine schematische Gesamtübersicht der Vorrichtung mit: a: Wurzel eines Pflanzensprosses,
b: Wachstumscontainer (z. B. Rhizotron, Petrischale),
c: planare, transparente Optode.
d: Wachstumsmedium bzw. Substrat,
e: Dunkelkammer,
f: Lichtquelle, z. B. zur Anregung der Fluorophore,
g: optionaler Vergrößerungstubus,
h: Kameraobjektiv,
i: Kamera,
j: Steuerungseinheit,
k: Computer als elektronische Auswerteeinheit,
1: weitere Wachstumscontainer in automatisierter Anlage (z. B. Petrischalenrad)
m: weitere Lichtquelle zur Beleuchtung des zu untersuchenden Organismus (z. B.
Nahinfrarot-LEDs zur Wurzelbeleuchtung.
n: Filter bzw. Filterrad,
o: Sproß der Pflanze,
p: Winkel der Lichtquellen/Beleuchtungseinheit, variabel einstellbar,
Es zeigt Figur 2 die Seitenansicht eines Querschnitts durch eine mögliche Ausgestaltung des Wachstumscontainers als Petrischalensystem mit
a: Agarosegel,
b: Spross der Pflanze,
c: Wurzel,
d: Petrischale aus transparentem Polystyrol,
e: Bohrung in Petrischale als Sprossdurchlass,
f: planare Optode.
Es zeigt Figur 3 die Seitenansicht eines Querschnitts durch eine mögliche Ausgestaltung des Wachstumscontainers als Rhizotronsystem mit a: Boden/Substratoberfläche,
b: Spross der Pflanze,
c: Wurzel,
d: Rahmen des Rhizotrons,
e: Sichtscheibe des Rhizotrons,
f: planare Optode,
g: Verschraubung der Sichtscheibe mit dem Rahmen des Rhizotrons.
Es zeigt Figur 4 die Seitenansicht eines Querschnitts durch eine mögliche Ausgestaltung des Wachstumscontainers als Hydrokultursystem mit
a: Nährlösungsoberfläche,
b: Spross der Pflanze,
c: Wurzel,
d: Rahmen des Containers (wasserdicht abgedichtet),
e: Sichtscheibe des Containers,
f: planare Optode,
g: Verschraubung der Sichtscheibe mit dem Rahmen des Containers,
h: Lufteinspeisung für Belüftung.
Es zeigt Figur 5 schematisch die Verknüpfung der einzelnen Vorrichtungskomponenten, mit deren Hilfe sich Wachstumsprozesse und sich dynamisch verändernde chemisch- physikalische Eigenschaften des Wachstumsmediums simultan erfassen lassen. Dargestellt werden folgende Vorrichtungskomponenten:
1. Steuerungseinheit, welche die abwechselnde Beleuchtung des Untersuchungsobjektes durch einzelne monochromatische Lichtquellen in Intervallen, sowie die Auslösung der Kamera steuert. Das Intervall zwischen den jeweiligen Einzelbildaufnahmen, bzw. einzelnen ausgelösten Lichtblitzen, wird durch eine vorhandene vordefinierte Konfigurationsdatei und durch das Laufzeitprogramm der Steuerungseinheit bestimmt.
2. LED 2: Lichtquelle für die Aufnahme von Wachstumspro- zessen (beispielsweise 880 oder 920 nm).
3. LED 3 Lichtquelle, welche mit dem zweiten Absorptions- maximum des Absorptionsspektrums des auf der Optode aufgetragenen Fluorophores korrespondiert. Bei der Lichtquelle kann es sich beispielsweise um eine LED mit einem schmalbandigen Emissionsmaximum handeln. (Im Falle von HPTS ist dies beispielsweise die Wellenlänge 450 nm).
Lichtquelle, welche mit dem ersten Absorptionsmaximum des Absorptionsspektrums des auf der Optode aufgetra- genen Fluorophores korrespondiert. Bei der Lichtquelle kann es sich beispielsweise um eine LED mit einem schmalbandigen Emissionsmaximum (Narrowband) handeln. (Im Falle von HPTS ist dies beispielsweise die Wellenlänge 405 nm).
t der Lichtquelle LED4:
a. Status aktiviert und integrierte Intensität der Lichtquelle, welche mit dem ersten Anregungsmaximums des Absorptionsspektrums des auf der Optode aufgetragenen Fluorophors korrespondiert, über die Zeit der Auslösung der Lichtquelle LED 4. Die Steuerungseinheit aktiviert LED 4 als Voraussetzung für Aufnahmen entsprechend 18 (Emission bei Anregung im ersten Absorptions- maximum des verwendeten Fluorophores).
b. Status inaktiviert,
c. Status inaktiviert.
arente, planare Optode.
ität der Lichtquelle LED2
d. Status inaktiviert,
e. Status inaktiviert,
f. Status aktiviert und integrierte Intensität der Lichtquelle LED2 über die Zeit der Auslösung der Lichtquelle LED 2 . Die Steuerungseinheit aktiviert LED2 als Voraussetzung für Aufnahmen entsprechend 25 (Wachstumsaufnahmen in einem Spektralbereich, welcher nicht durch die Emission des Fluorophores beeinträchtigt wird).
ität der Lichtquelle LED3
g. Status inaktiviert,
h. Status aktiviert und integrierte Intensität der Lichtquelle LED3, welche mit dem zweiten Anregungsmaximums des Absorptionsspektrums des auf der Optode aufgetragenen Fluorophors korrespondiert, über die Zeit der Auslösung der Lichtquelle LED 3. Die Steuerungseinheit aktiviert LED3 als Vorausset- zung für Aufnahmen entsprechend 22 (Emission bei Anregung im zweiten Absorptionsmaximum des verwendeten Fluorophores).
i. Status inaktiviert.
Auf die Optode treffendes monochromatisches Licht der Wellenlänge von LED4, welche mit der Wellenlänge des ersten Absorptionsmaximums des Absorptionsspektrums des auf der Optode aufgetragenen Fluorophors korrespondiert.
Auf die Optode treffendes monochromatisches Licht der Wellenlänge von LED3, welche mit der Wellenlänge des zweiten Absorptionsmaximums des Absorptionsspektrums des auf der Optode aufgetragenen Fluorophors korrespondiert.
Auf die Probe (durch die transparente Optode hindurch) treffendes Licht von LED2. Kameraverschluss (Shutter).
Sperrfilter
j. engbandiger Sperrfilter, welcher lediglich das Licht einer Wellenlänge durchläset, welches mit dem Emissionsmaximum des verwendeten und auf der Optode aufgetragenen Fluorophors korrespondiert (bei HPTS beispielsweise 515 nm, bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge des ersten Absorptionsmaximums).
k. Engbandiger Sperrfilter, welcher lediglich das Licht einer Wellenlänge durchläset, welches mit dem Emissionsmaximum des verwendeten und auf der Optode aufgetragenen Fluorophors korrespondiert (bei HPTS beispielsweise 515 nm, bei Anregung mit Licht einer Wellenlänge des zweiten Absorptionsmaximums).
1. Breitbandiger Sperrfilter (für Wachstumsmessungen) beispielweise im Bereich des infraroten Spektrums. Der gewählte Spektralbereich des Filters kann dabei beliebig breit gewählt werden, umfasst jedoch idealerweise einen Bereich, in welchem gewünschte Strukturdiskriminierungen optimal und ohne Beeinflussung der zu untersuchenden Strukturen (z. B. Wurzelwachstum) gewährleistet sind.
Von der Optode/Probe emittiertes/reflektiertes Licht
m. Emission nach Anregung im ersten Absorptionsmaximum des Fluorophores. n. Emission nach Anregung im zweiten Absorptionsmaximum des Fluorophores. o. Von der Probe reflextiertes Licht im Infrarotbereich.
Schließen des Kameraverschlusses 16. Bildaufnahme.
17. Kamera.
18. Photographische Aufnahme (Bild) der Emission des auf der Optode aufgetragenen Fluoreszenzfarbstoffes (2-D) bei Anregung entsprechend dem ersten Absorptionsmaximums des verwendeten Fluoreszenzfarbstoffes.
19. Sequenzielle Nummer n der in 18. erstellten Aufnahme innerhalb einer als Datei erstellten Bildsequenz.
20. Belichtungszeit der photographischen Aufnahme 18.
21. Intervall zwischen den Aufnahmen 18. und 22. (die Länge des Intervalls wird durch die programmierte Steuerungseinheit bestimmt).
22. Photographische Aufnahme (Bild) der Emission des auf der Optode aufgetragenen Fluoreszenzfarbstoffes (2-D) bei Anregung entsprechend dem zweiten Absorptionsmaximums des verwendeten Fluoreszenzfarbstoffes.
23. Sequentielle Nummer n der in 22. erstellten Aufnahme innerhalb einer als Datei erstell- ten Bildsequenz.
24. Belichtungszeit der photographischen Aufnahme 22.
25. Photographische Aufnahme (Bild) für die Erfassung von Wachstumsprozessen.
26. Sequenzielle Nummer n der in 25. erstellten Aufnahme innerhalb einer als Datei erstellten Bildsequenz.
27. Belichtungszeit der photographischen Aufnahme 25.
28. Intervall zwischen den Aufnahmen 25. und derjenigen Aufnahme, mit welcher der jeweilige Messaufnahmenzyklus entsprechend analog 18. wieder beginnt.
29. Ausgabe eines sekundengenauen bzw. millisekundengenauen Zeitstempels für jedes Einzelbild n der in 18., 22. und 25. erstellten sequentiellen Aufnahmen innerhalb der entsprechend 30. erstellten Protokolldatei oder in Form von Metadaten innerhalb der erstellten Bilddateien.
30. Protokolldatei oder Metadatei innerhalb der erstellten Bilddatei.
31. Hochzählen der Sequenznummer n mit n + 3 für die Gesamtanzahl der Zyklen entsprechend 18. bis 30.
33. Multi-TIFF Datei zur Speicherung von:
p. Bildaufnahme aus 25.
q. Bildaufnahme aus 45. 34. Intervall zwischen den Aufnahmen 22. und 25. (die Länge des Intervalls wird durch die programmierte Steuerungseinheit bestimmt).
35. Ablage der Bilder aus 25. In der Multi-TIFF Datei 33p.
36. Auswertung von 33p mit Hilfe der Bildauswertungssoftware 37.
37. Bildauswertungssoftware (z. B. DISP).
38. Entrauschen der Bildaufnahmen 18./22./25. durch 10-fache Wiederholung der jeweiligen Bildaufnahmen und anschließender Mittelung der Bildaufnahmen.
39. Erzeugung eines Dunkelbildes, ohne Einschalten einer Beleuchtung
40. Auswertung der Fluoreszenzbilder.
41. Bildung eines ratiometrischen Bildes aus 18. Und 22.
42. Verrechnung von 39. Und 41, zu Dunkelkorrektur.
43. Dunkel korrigiertes ratiometrisches Bild.
44. Pixel für Pixel Korrektur von 43.
45. Fertiges ratiometrisches Bild. Das erfindungsgemäße Verfahren zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemisch und/oder physikalischer Parameter ist wie folgt zu beschreiben:
Eine Steuerungseinheit (1) steuert die Aktivitäten verschiedener Lichtquellen (2, 3, 4) und einer Optischen Erfassungseinheit/Kamera (12, 17). Die Lichtquellen LED 3, 4 dienen dabei zur Anregung einer planaren, transparenten Optode (6) und LED 2 dient zur Erfassung von Wachstumsprozessen. Beginnend mit 5a wird die LED 4 aktiviert, während LED 2 und 3 inaktiv bleiben (7d & 8g). Das monochromatische Licht aus LED 4 (Schritt 9) regt die planare Optode (6) an und das dadurch emittierte Fluoreszenzlicht der Optode (Schritt 14 m) passiert einen engbandigen Sperrfilter (13j) und trifft auf die Optischen Erfassungseinheit/Kamera (12, 17). Während einer definierten Aufnahme-/Belichtungszeit (20) wird eine zwei dimensi- onale Aufnahme der Fluoreszenz entsprechend dem ersten Absorptionsmaximum des verwendeten Fluorophores erstellt (18). Zum Entrauschen (Schritt 38) werden insgesamt 10 solcher Aufnahmen nacheinander erstellt (Schritt 38) und anschließend nach gängigen Verfahren als gemitteltes Bild mit einer sequenziellen Nummer (19) versehen und ein Zeitstempel (29) für jedes Einzelbild wird in einer Protokolldatei (30) abgelegt.
Nach einem durch die Steuerungseinheit bestimmten Intervall (21) wird die nachfolgende Fluoreszenzaufnahme entsprechend dem zweiten Absorptionsmaximum des verwendeten Fluorophores erstellt. Dazu wird die LED 3 aktiviert (8h), während LED 4 und 2 inaktiv bleiben (7e & 5b). Das monochromatische Licht aus LED 3 (10) regt die planare Optode (6) an und das dadurch emittierte Fluoreszenzlicht (Schritt 14n) passiert einen engbandigen Sperrfilter (13k) und trifft auf die Optischen Erfassungseinheit/Kamera (12, 17). Während einer definierten Aufhahme-/Belichtungszeit (24) wird eine zweidimensionale Aufnahme der Fluoreszenz entsprechend dem zweiten Absorptionsmaximum des verwendeten Fluorophores erstellt (22). Zum Entrauschen (38) werden insgesamt 10 solcher Aufnahmen nacheinander erstellt (38) und anschließend nach gängigen Verfahren als gemitteltes Bild mit einer sequen- ziellen Nummer (23) versehen und ein Zeitstempel (29) für jedes Einzelbild wird in einer Protokolldatei (30) abgelegt.
Nach einem durch die Steuerungseinheit bestimmten Intervall (34) wird die nachfolgende Aufnahme der Wachstumsprozesse und Strukturen erstellt. Dazu wird die LED 2 aktiviert (7f), während LED 3 & 4 inaktiv bleiben (8i & 5c). Das monochromatische Licht aus LED 2 (Schritt 11) passiert die transparente planare Optode (6) und trifft auf die dahinter befindliche Probe. Das anschließend von der Probe reflektierte Licht (14o) passiert einen breitbandigen Sperrfilter (131) und trifft auf die Optischen Erfassungseinheit/Kamera (12, 17). Während einer definierten Aufnahme-/Belichtungszeit (27) wird eine zwei dimensionale Aufnahme der Wachstumsprozesse und Strukturen erstellt (25). Zum Entrauschen (38) werden insgesamt 10 solcher Aufnahmen nacheinander erstellt (38) und anschließend nach gängigen Verfahren als gemitteltes Bild mit einer sequenziellen Nummer (26) versehen und ein Zeitstempel (29) für jedes Einzelbild wird in einer Protokolldatei (30) abgelegt.
Nach einem durch die Steuerungseinheit bestimmten Intervall (28) beginnt die nächste Messreihe, wobei die sequenzielle Nummer der folgenden Aufnahme entsprechend der Gesamtzahl der abgeschlossenen Zyklen hoch gezählt wird (31). Die erstellten Aufnahmen (18./22./25.) werden anschließend wie folgt weiterverarbeitet: Die Bildverarbeitung der Fluoreszenzaufnahmen (40) beginnt mit der Bildung eines ratiometrischen Bildes aus 18. und 22. (41). Dieses Bild wird dann mit einem Dunkelbild (39) verrechnet um das Schwarzrauschen herauszu- filtern. Das so entstandene korrigierte Bild (43) wird anschließend einer Pixel-Für-Pixel Korrektur gemäß einschlägiger Literatur unterzogen (44). Das daraus entstandene vollständig korrigierte Bild (45) wird in einem sogenannten Multi-TIFF Format abgelegt (33q) und kann von dort beliebig ausgelesen und weiterverarbeitet werden. Die Wachstums- oder Strukturaufnahmen (25) werden direkt in einem sogenannten Multi-TIFF Format abgelegt (33p). Dieses Bild wird dann während der weiteren Bildanalyse (36) mit einschlägiger Software (37) weiterverarbeitet.
Es zeigt Figur 6 sowie einige exemplarische Messwerte in Tabelle 3 die relative Transmissivi- tät in % einer Optode nach dem Stand der Technik (a) im Vergleich mit der neuen erfin- dungsgemäßen Optode (b) in Abhängigkeit von der Wellenlänge. Eine höchstmögliche optimale Lichtdurchlässigkeit und damit Durchsichtigkeit im gesamten Spektrum wäre bei einer 100 %-igen Transmission des Lichts (Transmissivität) bei allen Wellenlängen gegeben. Wie der Vergleich der Optoden zeigt, weist die erfindungsgemäße Optode ab einer Wellenlänge von ca. 280 nm eine Transmission von mehr als 90 % auf, während die Optode des Stands der Technik bei 280 nm nur eine relative Transmission von ca. 14,66 % aufweist bis maximal 62 % bei 852 nm.
Es zeigt Figur 7 relative Absorptionsspektren in % und beispielhaft ein relatives Emissionsspektrum in % der erfindungsgemäßen Optode, die den Fluorophor HPTS enthält, bei unterschiedlichen pH-Werten. Ordinate X: Wellenlänge (nm); Abszisse Y: Relative Absorption bzw. Emission in % bezogen auf die eingestrahlte Lichtmenge. Die Optode weist zwei Ab- sorptionsmaxima im Bereich von 1.) 405 nm auf und ein zweites Absorptionsmaximum bei 450 nm. Weiterhin weist sie ein Emissionsmaximum bei 515 nm auf. Damit zeigt sich, dass die erfindungsgemäße Optode für ratiometrische Fluoreszenzmessungen, wie schon zuvor beschrieben, geeignet ist. Es können zwei Anregungswellenlängen von 405 nm und 450 nm verwendet werden und eine Emissionswellenlänge von 515 nm.
Tabelle 3: Relative Transmissivität der erfindungsgemäßen Optode und einer Optode nach dem Stand der Technik bei unterschiedlichen Wellenlängen
Wellenlänge (nm) Relative Transmissivität Relative Transmissivität
(%) (%)
Erfindungsgemäße Optode nach Stand der
Optode Technik
280 90,13 14,66
286 91,23 30,95
343 93,81 45,75
481 96,19 54,21
696 98,92 58,42
725 99,09 59,03
852 99,91 61,94
900 99,97 59,33
Tabelle 4: Relativer Grauwert-Kontrast (Differenz der Grauwerte) in % in Bezug auf die Referenz (Ohne Optode) bei fotographischen schwarz-weiß Aufnahmen von Punkten des Schrifttyps Times New Roman mit einer Punktgröße 128 mit einer Belichtung mit Licht der Wellenlänge von 880 nm.
Figure imgf000040_0001
Tabelle 4 zeigt den relativen Grauwert-Kontrast (Differenz der Grauwerte) in Bezug auf die Referenz (Ohne Optode) bei fotographischen schwarz-weiß Aufnahmen von Punkten des Schrifttyps Times New Roman mit einer Punktgröße 128. (Siehe auch Tabelle 8) mit einer Belichtung mit Licht der Wellenlänge von 880 nm. Messort je in der Mitte des ganz rechten schwarzen Punktes (Schriftgröße 128) in der jeweiligen fotografischen Aufnahme unter Verwendung eines engbandigen Filters, welcher ausschließlich Licht mit der Wellenlänge 880 nm transmittieren lässt. Ein kleiner Wert zeigt einen geringen Grauwert-Kontrast zwischen weißen und schwarzen Bereichen in der fotografischen Aufnahme. Erwünscht ist ein Wert möglichst nahe am Wert ohne Optode (100 %). Die erfindungs gemäße Optode weist die ge- wünschte verbesserte Eigenschaft gegenüber der Optode des Stands der Technik deutlich auf.
Tabelle 5: Relativer Grauwert-Kontrast (Differenz der Grauwerte) in % in Bezug auf die Referenz (Ohne Optode) bei fotographischen schwarz-weiß Aufnahmen von Punkten des Schrifttyps Times New Roman mit einer Punktgröße 128 mit Belichtung mit sichtbarem Licht
Ohne Optode Neue Optode Optode nach Stand
der Technik
Relativer Grauwert100 % 76 % 7 %
kontrast (Mittelwert) Es zeigt Tabelle 5 den Relativen Grauwert-Kontrast (Differenz der Grauwerte) in Bezug auf die Referenz (Ohne Optode) bei fotographischen schwarz-weiß Aufnahmen von Punkten des Schrifttyps Times New Roman mit einer Punktgröße 128. (Siehe auch Tabelle 8) mit Belichtung mit sichtbarem Licht. Messort: je in der Mitte des ganz rechten schwarzen Punktes (Schriftgröße 128) sowie im Punkt zwischen den beiden Punkten mit der Schriftgröße 128 und 64 in der jeweiligen fotografische Aufnahme ohne Verwendung eines Filters. Ein kleiner Wert zeigt einen geringen Grauwert-Kontrast zwischen weißen und schwarzen Bereichen in der fotografischen Aufnahme. Erwünscht ist ein Wert möglichst nahe am Wert ohne Optode (100 %). Die erfindungsgemäße Optode weist die gewünschte verbesserte Eigenschaft gegen- über der Optode des Stands der Technik deutlich auf.
Tabelle 6: Relativer Durchmesser in Prozent des ganz rechten Punktes in der fotografischen Aufnahme (Schriftgröße 128) bei einer Belichtung mit Licht der Wellenlänge 880 nm als Maß für das Auflösungsvermögen
Figure imgf000041_0001
Es zeigt Tabelle 6 den Relativen Durchmesser in Prozent des ganz rechten Punktes in der fotografischen Aufnahme (Schriftgröße 128) bei einer Belichtung mit Licht der Wellenlänge 880 nm als Maß für das Auflösungsvermögen. Ein Wert nahe an 100% zeigt eine geringe Unscharfe und damit hohe Trennschärfe an. Erwünscht ist ein Wert möglichst nahe am Wert ohne Optode. Die erfindungsgemäße Optode weist die gewünschte verbesserte Eigenschaft gegenüber der Optode des Stands der Technik deutlich auf. Tabelle 7: Relativer Durchmesser in Prozent des ganz rechten Punktes in der fotografischen Aufnahme (Schriftgröße 128) bei einer Belichtung mit sichtbarem Licht als Maß für das Auflösungsvermögen
Figure imgf000042_0001
Es zeigt Tabelle 7 den Relativen Durchmesser in Prozent des ganz rechten Punktes in der fotografischen Aufnahme (Schriftgröße 128) bei einer Belichtung mit sichtbarem Licht als Maß für das Auflösungsvermögen. Ein Wert nahe an 100% zeigt ein geringes Undeutlich werden und damit hohe Trennschärfe an. Erwünscht ist ein Wert möglichst nahe am Wert ohne Optode. Die erfindungsgemäße Optode weist die gewünschte verbesserte Eigenschaft gegenüber der Optode des Stands der Technik deutlich auf. (Normalisierte arithmetische Mittel der Pixel-Durchmesser, Messwiederholungen = 15, Versuchswiederholungen = 2).
1. Ausführungsbeispiel:
Kontinuierliche und simultane Erfassung des Wurzelwachstums sowie der Wurzelsystemar- chitektur sowie der Wachstumsdynamik zum einen, und simultaner kontinuierlicher Erfassung des Rhizosphären-pH- Wertes von dikotylen Pflanzen, wie zum Beispiel Nicotiana taba- cum oder Arabidopsis thaliana, die auf einem Agarosemedium als Kultursubstrat kultiviert werden, welches sich in Petrischalen als Kultivierungsgefäß befindet. Die wie zuvor beschrieben hergestellten Optoden und in den folgenden Ausführungsbeispielen verwendeten Optode sind hinsichtlich ihrer Transparenz mit Sichtscheiben aus Glas oder Kunststoff vergleichbar, und ermöglicht eine Auswertung beispielsweise mit der Software GROWSCREEN-Root oder der Software GROW Map-Root ohne Einschränkungen. Pflanzenanzucht:
Sterilisation des Saatguts: Pflanzensamen der zu untersuchenden Spezies werden innerhalb einer Sterilbank äußerlich sterilisiert, indem die Samen zunächst in 70 %-igem Ethanol, in wässriger Lösung, für drei Minuten und danach in 0,5 %-igem Natrium-Hypochlorit (inklusive einem Tropfen Tween auf 10 ml), in wässriger Lösung, für zehn Minuten inkubiert und danach gründlich mit au- toklaviertem Wasser gespült werden.
Bereitung des Kulturmediums:
In eine 33 %-ige Hoaglandlösung werden 10 g Agarose pro L gegeben und das Gemisch anschließend autoklaviert, gut homogenisiert und bis zur Weiterverarbeitung verschlossen gelagert.
Innerhalb einer Sterilbank wird das Medium in Petrischalen gegossen. Nach Aushärten der Agarose werden die Optoden auf das Agarosegel gelegt, so dass die mit dem Fluorophor beschichtete Seite möglichst ohne Lufteinschlüsse auf der Agarose aufliegt. Die Petrischalen werden mit Micropore-Band und Parafilm verschlossen.
Kultivierung der Pflanzen:
Die sterilisierten Samen werden innerhalb einer Sterilbank in Perforationen an der Schmalseite der Petrischale gesät und die Petrischale mit Parafilm verschlossen.
Die Pflanzen werden bei geeigneten Klimabedingungen angezogen, wobei die Petrischalen mit der Seite, der die Optode aufliegt, um z. B. 45° nach innen gekippt wird (siehe Fig. 2).
Erfassung der zu messenden Parameter, Kameraeigenschaften, siehe 2. Ausführungsbeispiel
2. Ausführungsbeispiel:
Kontinuierliche und simultane Erfassung des Wurzelwachstums sowie der Wurzelsystemarchitektur sowie der Wachstumsdynamik, und simultane kontinuierliche Erfassung des Rhi- zosphären-pH-Wertes von monokotylen oder dikotylen Pflanzen, wie zum Beispiel Nicotiana tabacum oder Arabidopsis thaliana, die auf Boden als Kultur Substrat kultiviert werden, welches sich in Rhizotronen als Kultivierungsgefäß mit mindestens einer transparenten Sicht- scheibe befindet.
Die in diesem Beispiel verwendete Optode ist hinsichtlich ihrer Transparenz mit Sichtscheiben aus Glas oder Kunststoff vergleichbar, und ermöglicht eine Auswertung beispielsweise mit der Software GROWSCREEN-Root oder der Software GROW Map-Root. Andere Auswerteverfahren sind jedoch ebenfalls möglich.
Pflanzenanzucht:
Bereitung des Kultursubstrats:
Die Rhizotrone werden z. B. mit konventioneller Anzuchterde gefüllt. Danach wird die Sichtscheibe entfernt und von anhaftendem Boden gesäubert. Auf die im Rhizotron freigelegte Bodenfläche wird die planare Optode mit der Seite, die mit dem Fluorophor beschichtet ist, auf den Boden gelegt. Danach wird die Sichtscheibe auf die Optode gelegt und wieder befes- tigt. Alternativ kann die planare Optode auch an die entsprechende Stelle der Sichtscheibe mit beispielsweise Silikonfett angeheftet werden bevor der Boden in das Rhizotron eingefüllt wird. Somit würde es vermieden werden, dass beim Öffnen eines bereits gefüllten Rhizotrons die Bodenstruktur verändert wird.
Die Rhizotrone werden in einem Winkel von z. B. 45° in Richtung der Sichtscheibe dauerhaft gelagert. Die Samen der zu untersuchenden Pflanzen werden in das Rhizotron gesät und bei geeigneten, artspezifischen Kultivierungsbedingungen kultiviert.(siehe Figur 3).
Erfassung der zu messenden Parameter, Kameraeigenschaften
Eine optischen Erfassungseinheit, beispielsweise eine CCD-Kamera oder ähnliches wird zur Sichtscheibe des Rhizotrons in einem definierten Abstand und Winkel arretiert, um reproduzierbare Aufnahmen zu erstellen. Die Beleuchtungseinheit, in der Regel monochromatische LEDs, werden analog zur optischen Erfassungseinheit ebenfalls arretiert. Beleuchtungs- und Erfassungseinheit werden über einen PC gesteuert ausgelöst, um in definierten Abständen Aufnahmen des Wurzelsystems und der Rhizosphären-pH-Dynamik zu erfassen.
Die Erfassung des Wachstums des Wurzelsystems erfolgt beispielsweise mit Hilfe der Software ROOTFIND und basiert in der Regel auf Bildern der optischen Erfassungseinheit im bitmap Format. Eine vorgelagerte Konvertierung der Bilder in schwarz/weiß Format etc. ist dabei möglich, sofern die nachgelagerte Auswertungssoftware dies erfordert. Dabei werden z.B. die Länge und die Anzahl der sichtbaren Wurzeln automatisch erfasst und in gesonderten Datenfiles abgelegt. Die Kalibrierung der Aufnahmen erfolgt über den Abgleich der gezählten Wurzelpixel mit der Anzahl der Pixel von Objekten deren Länge und Dicke bekannt ist, und die ebenfalls im Bild erfasst sind (z. B. Kapillaren, etc.). Die Erfassung der Rhizospähren pH-Dynamik wird über den Abgleich der erzeugten Bilder (z. B. TIFF oder RAW Format) mit zuvor erstellten Kalibrationsdaten realisiert. Als konventionelle und kommerziell erhältliche Auswertungssoftware kann hier die„Image processing toolbox" von Matlab oder auch Photoshop dienen. Die Fehlerkorrektur der erzeugten Bilder kann beispielsweise analog zur Beschreibung von Strömberg & Hulth (2005) erfolgen:
Hierbei werden zu Beginn der Aufnahmen ein oder mehrere Dunkelbilder erzeugt, um das „Schwarz-Rauschen" aus der späteren Bildantwort herauszurechnen. Dazu wird ein Bild erzeugt, bei dem die Objektivkappe auf dem verwendeten Objektiv verbleibt. Um das systematische Rauschen durch Mehrfachaufnahmen zu reduzieren, wird das Schwarzrauschen von den Bildern jeder Wellenlänge abgezogen.
Kalibrierung der Optode
Entsprechend den Ausführungen von Hakonen & Hulth (2007) kann die pH -Optode z.B. wie folgt kalibriert werden (Abwandlungen hiervon sind ebenfalls möglich):
Das HPTS Fluoreszenz Ratio folgt einem sigmoiden Verlauf in Abhängigkeit des pH Wertes. Daher kann eine vier Parameter sigmoide logistische Funktion (Gleichung 1) verwendet werden. Um eine Drift über die Zeit (t) zu korrigieren, werden die Kalibrierdaten vor der Versuchsreihe (Call) mit denen nach der Versuchsreihe (Cal2) verknüpft. (Gleichung 1). RF1>F2 (pH, t) = ocl(t) + (o2(t) - al(t))/(l + 10exp(pH-a3(t))a4(t) ) Gleichung 1
Wobei jeder der vier zeitabhängigen Parameter gemäß Gleichung 2 variiert: oci(t) = oci.Call + ((oci.Call - oci,Cal2)/ At(Call ,Cal2)) * t Gleichung 2 α 1 und α 2 beschreiben das asymptotische Minimum und Maximum der sigmoiden Funktion, α 3 ist der apparente pKa4 von HPTS (d. h. der Wendepunkt der sigmoidalen Funktion), und α 4 ist eine Konstante, die die Steigung der Funktion zwischen α 1 und α 2 beschreibt. Die ratiometrische pH Antwort (RFI,F2) des Sensors wird aus dem Verhältnis zwischen Fl und F2 gebildet (i.e., RF!,F2 = F1/F2). Hierzu werden z.B.„dual excitation "(ex) und„dual emissi- on " (em) Eigenschaften von HPTS zunutze gemacht (z. B. Fl , ex/em: 405/440nm und F2, ex/em: 465/510 um). Darüber hinaus kann die sogenannte„time correlated pixel-by-pixel" (zeitbezogene Pixel-für-Pixel) Kalibrierung angewendet werden (ebenfalls beschrieben von Strömberg und Hulth 2005). Zur Kalibration werden mehrere Lösungen unterschiedlichen pH- Wertes (in der Regel vier) mit Hilfe von Mischungen aus zwei Phosphatpuffern von pH 6.00 und 8.50 hergestellt (Ionenstärke; ITot = 3.0mM und [P04 3~]Tot = 1.95 mM). Die zu kalibrierende Optode wird in ein Gefäß mit der jeweiligen Pufferlösung eingetaucht und die ratiometrische Antwort durch ein Sichtfenster oder durch das Glas des Becherglases, etc. mit der Erfassungseinheit erfasst. Das Ergebnis der Kalibrierung kann für jeden Pixel einzeln, oder aber als Summenantwort registriert und im späteren Verlauf weiter verarbeitet werden.
Die Wurzelbilder und pH-Bilder, die während des Experimentes erzeugt werden, können dann mit geeigneten Bildbearbeitungsprogrammen (z.B. Corel Draw, Photoshop, ImageJ, etc.) überlagert werden und so Zusammenhänge zwischen pH- Wert und Wurzelarchitektur aufgeklärt werden.
3. Ausführungsbeispiel:
Ermittlung der optischen Eigenschaften Transmissivität, Auflösungsvermögen (optische
Trennschärfe) und Grauwert-Kontrast von zwei Optoden (zum Einen der erfindungsgemäßen transparenten Optode, im Vergleich mit einer handelsüblichen Optode), die quantifiziert und miteinander und mit einer Referenzmessung (ohne Optode) in relevanten Bereichen des Wellenlängenspektrums verglichen wurden.
Die Messprinzipien der hier erfolgten Quantifizierung der optischen Eigenschaften von Optoden bestehen
a) für die Quantifizierung der Transmissivität in der Messung der Absorption (Differenz aus einfallendem abzüglich ausfallendem Licht) und Berechnung der Transmissivität nach der Formel
Transmissivität der Optode = Eingangsintensität des Lichts - Absorption
des Lichts;
und
b) für die Quantifizierung des Auflösungsvermögens, in der Messung des Durchmessers eines fotografierten Punktes, da eine diffuse (schlecht aufgelöste) fotografische Aufnahme zu größeren Durchmessern in den Aufnahmen führt; und c) für die Quantifizierung des Grauwert-Kontrasts. im Vergleich von Grauwerten in schwarzen Bereichen des fotografierten Objektes (hier verwendeter Standard) mit weißen Bereichen des fotografierten Objekts (hier verwendeter Standard) durch Bildung der Differenz.
Bei der Untersuchung der gemäß Unterpunkt b) Quantifizierung des Aulösungsvermö- gens, wurde analog zur Methode der Punktantwort (engl.: point spread function) gearbeitet. Burger und Bürge (2008) schreiben„... diese Methode wird zur Messung des Verhaltens optischer Systeme (wie z. B. Linsen) genutzt, wobei eine Punktlichtquelle als Impuls dient, und die resultierende Verteilung der Lichtenergie Punktantwort genannt wird." Die im Folgenden beschriebenen Versuche erfolgten in zwei Versuchswiederholungen an verschiedenen Optoden und mit je 15 Messwiederholungen an der jeweiligen Optode bzw. fotografischen Aufnahme.
Zur Erzielung eines geeigneten quantitativen Maßes für das Auflösungsvermögen sowie für den Grauwert-Kontrast wurden die Optoden in einen mit 20 ml deionisiertem Wasser (Milli-Q, Millipore Corporation) gefüllten Deckel einer Petrischale (120 * 120 * 17 mm, Greiner Petrischalen mit Nocken, quadratisch, Greiner Bio-One Artikel-Nr.: 688102) gelegt, und der Boden der Petrischale umgedreht so in den Deckel gelegt, so dass die Optoden planar fixiert waren. Der Deckel der Petrischale wurde danach auf einen Standard gestellt, welcher aus einem hochauflösenden Ausdruck auf Druckerpapier bestand, bei dem verschiedene Symbole (Punkte) der Schriftart„Times New Roman" der Software Microsoft Word in den Schriftgrößen 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 und 128 gedruckt waren. Derselbe Aufbau wurde auch für den Fall verwendet, in dem keine Optode in der Petrischale lag. Dieser Fall diente als Referenz. Die Optoden wurden durch das Wasser sowie die den Boden der Petrischale hindurch mit einer CMOS-Kamera (Flea BW by Point Grey Research Inc., Vancouver, Canada) in Graustufen fotografiert. Die verwendeten Einstellungen für die fotografischen Aufnahmen erfolgten analog zu üblichen Aufnahmen unter Verwendung der Methode DISP oder GROWSCREEN root. Die Aufnahmen bei 880 nm erfolgten ohne elektronische Signalverstärkung, einer Blende (engl. Shutter current) von 500 (von möglichen 0 bis 1210), einer Belichtungszeit (engl. Exposure current) von 1 (von möglichen 0 bis 1023). Eine digitale Bildmittelung erfolgte über 10 Bilder. Die Aufnahmen bei sichtbarem Licht erfolgten in derselben Weise, mit Ausnahme der Verwendung einer Blende von 50. Es wurde eine Standard-Objektiv-Linse (25 mm; Cosmicar/Pentax; The Imaging Source, Bremen, Germany) ohne Filter beziehungsweise bei den Infrarot- Aufnahmen bei 880 nm ein Infrarot-Passtrough-Filter (880 nm; Edmund Optics, Karlsruhe, Germany) verwendet. Eine konstante Ausleuchtung erfolgte entweder mittels einer Halogenlampe (zur Messung der optischen Eigenschaften der Optoden im sichtbaren Licht bei ca. 400 - 800 nm) oder mittels Zuhilfenahme von Infrarot-LEDs (880 nm; Conrad Electronics, Hirschau, Germany). Die fotografischen Aufnahmen wurden mit der Software„Root leaf aquisition", (Schmundt et al. (1998) eingestellt und im Multi-TIFF- Format gespeichert. Danach wurden die fotografischen Aufnahmen mit der Software IrfanView (http://www.irfanview.com/) geöffnet und mit den Werkzeugen der Software IrfanView vermessen.
Zur Vermessung des Auflösungsvermögens wurde das Messwerkzeug„Measure tool" der Software IrfanView verwendet. Start- und Endpunkte der Messung der Durchmesser des Punktes der Schriftgröße 128 wurden dadurch festgelegt, dass ab einer Veränderung des Grauwertes von mehr als 3 Grauwertstufen im Vergleich zum Hintergrund der jeweilige Durchmesser gemessen wurde.
Zur Vermessung des Grauwert-Kontrasts wurde der Grauwert mit der Software IrfanView gemessen, wobei die Messpunkte entweder mittig im Punkt der Schriftgröße 128 oder mittig zwischen den Punkten der Schriftgröße 128 und 64 gewählt wurden. Danach wurde die Differenz der Grauwerte berechnet.
Zur Erzielung eines geeigneten quantitativen Maßes für die Transmissivität wurde jeweils ein Streifen der Optode in eine Kristallglasküvette planar eingebracht und die Küvette mit 1 ml deionisiertem Wasser (Milli-Q, Millipore Corporation) gefüllt. Als Referenz diente eine Kristallglasküvette, die mit 1 ml deionisiertem Wasser (Milli-Q, Millipore Corporation) gefüllt wurde. Die Messung erfolgte mit einem Zweistrahl-Spektralfotometer (UVIKON xl, Bio-Tek Instruments). Eine fotometrische Referenzmessung kann 100% gesetzt werden. Die Kurve, die dieser Messung entspricht, würde bei der in Figur 6 a)/b) gewählten Darstellungsweise (als relative Transmission bezogen auf die Referenz) über den gesamten Bereich des Spektrums einen Wert von 100% besitzen. Ergebnisse:
In der folgenden Tabelle 8 sind die in den vorangehend beschriebenen Messverfahren ermittelten fotographischen Aufnahmen abgebildet. Die beiden zu vergleichenden Optoden sowie die Leermessung mit demselben Messaufbau kann zur Gewinnung eines ersten Eindrucks verglichen werden.
Tabelle 8: Fotographische schwarz-weiß Aufnahmen von Punkten des Schrifttyps Times New Roman bei verschiedenen Punktgrößen von Punktgröße 1 bis Punktgröße 128 a) der Leermessung (Referenz; Ohne Optode) mit Belichtung mit sichtbarem
Licht, b) der neuen Optode (Gegenstand des Patentantrags) mit Belichtung mit sichtbarem Licht, sowie c) einer im Handel erhältlichen pH-Optode mit Belichtung mit sichtbarem Licht jeweils ohne Verwendung eines Filters. Darunter
fotographische schwarz-weiß Aufnahmen d) der Leermessung (Referenz; Ohne
Optode) mit Belichtung mit Licht der Wellenlänge 880 nm, e) der neuen Optode (Gegenstand des Patentantrags) mit Belichtung mit Licht der Wellenlänge
880 nm, sowie f) einer im Handel erhältlichen pH-Optode mit Belichtung mit
Licht der Wellenlänge 880 nm jeweils unter Verwendung eines Infrarot- Passtrough-Filters.
„Siehe Tabelle im Anhang"
Die erfindungsgemäße Optode erreicht Transmissivitätswerte, die im (im Sinne der Erfindung relevanten) Spektrum zwischen 300 und 900 nm oberhalb von 90 % liegen. Im nahinfraroten Bereich des Spektrums (700 bis 900 nm) erreicht die neue Optode eine Transmissivität von 100 %. Der Bereich nahinfraroten Lichts ist im Sinne der Erfindung von besonderer Bedeu-
tung, da nahinfrarotes Licht (> 800 nm) das Pflanzenwachstum nicht beeinflusst (Schmundt et al. 1998). Die im Handel erhältliche Optode erzielt im Spektrum von 300 bis 900 nm Werte von maximal 65 %.
Da die Transmissivität für die Anwendung im Sinne der Erfindung nicht allein relevant ist, sondern auch die Parameter Auflösungsvermögen sowie Grauwert-Kontrast zur Erzielung einer maximalen Bildgüte von Bedeutung sind, wurden diese Parameter für eine im Handel erhältliche pH-Optode sowie die neue Optode bestimmt.
Die erzielte Trennschärfe (Auflösungsvermögen) der neuen Optode war sowohl unter Verwendung sichtbaren Lichts, als auch unter Verwendung nahinfraroten Lichts (880 nm), nur wenig und nicht signifikant schlechter, als die erzielte Auflösungsvermögen, welche erzielt wurde, wenn keine Optode in den Strahlengang (Petrischale) gelegt wurde (4 % Verschlechterung bei Belichtung mit Licht im sichtbaren Bereich des Spektrums; 1 % Verschlechterung bei Belichtung mit Licht der Wellenlänge von 880 nm). Die im Handel erhältliche Optode verschlechterte die erzielten Auflösungsvermögen im Vergleich zur Referenz (Messung ohne Optode in der Sichtachse) unter Verwendung von Licht des sichtbaren Spektrums um 27 %, und bei Belichtung mit nahinfrarotem Licht der Wellenlänge 880 nm um 24 %.
Die Verschlechterung des Grauwert-Kontrasts im Vergleich zum erzielten Grauwert-Kontrast ohne Optode im Strahlengang beträgt bei Verwendung sichtbaren Lichts bei der neuen Opto- de 26 %, und 6 % bei Verwendung nahinfraroten Lichts (880 nm). Bei der im Handel erhältlichen Optode beträgt die Verschlechterung des Grauwert-Kontrasts 93 % bei Verwendung sichtbaren Lichts, und89 % bei Verwendung nahinfraroten Lichts (880 nm). Somit besitzt die neue Optode im Sinne der Erfindung deutlich und signifikant bessere, optische Eigenschaften als die im Handel erhältliche Optode. Im Gegensatz zur im Handel erhältlichen Optode ist die neue Optode nachweislich zur Anwendung in bildgebenden und bildanalytischen Verfahren wie beispielsweise DISP, WinRHIZO und GROWSCREEN root geeignet.
Die im Rahmen der Erfindung verwendeten Begriffe werden wie folgt definiert: 1. Auflösungsvermögen:
(Synonym: Bildschärfe, Trennschärfe). Fähigkeit eines optischen Gerätes, zwei eng benachbarte Objekteinzelheiten voneinander zu trennen, d.h. deutlich als zwei getrennte Gebilde wiederzugeben. Bei hoher Auflösung können feine Einzelheiten in den Objekten erkannt werden. Das Auflösungsvermögen ist objekt- und kontrastabhängig, daher sind Zahlenanga- ben über das Auflösungsvermögen nur als ungefähre Anhaltspunkte zu werten (Mütze et al. 1972).
2. Bildanalyse:
Als Bildanalyse wird die systematische Analyse des Bildinhaltes durch visuelle Bildinterpretation bezeichnet.
(Geoinformatik-Service der Universität Rostock, 2008, Professur für Geodäsie und Geoin- formatik (GG) Universität Rostock; www.geoinformatik.uni-rostock.de). 3. Bildgebung:
(Synonym: Bildgebendes Verfahren) Ein bildgebendes Verfahren erzeugt aus Messgrößen eines realen Objektes ein Abbild, wobei die Messgröße oder eine daraus abgeleitete Information ortsaufgelöst und über Helligkeitswerte oder Farben kodiert visualisiert wird. (www.wikipedia.org).
4. Bildgüte:
(Synonym: Bildqualität, Abbildungsqualität). Maß der objekttreuen Wiedergabe bei der optischen Abbildung. Meist subjektiv beurteilt, kann aber auch durch Abbildung einer geeigneten Vorlage (Test) beurteilt werden. Kriterien für die Bildgüte sind oftmals Auflösungsvermögen und Kontrastwiedergabe. (Mütze et al. 1972).
5. Bildverarbeitung:
Als Bildverarbeitung werden alle Verfahren bezeichnet, mit denen Bilder bearbeitet und verändert werden, d.h. die Aufbereitung und Analyse von Bild- bzw. Rasterdaten. Bezeichnet einen Satz digitaler Methoden, die verwendet werden zum Erstellen, Analysieren, Verbessern, Interpretieren oder Darstellen von Bilddaten oder Rasterdaten.
(Geoinformatik-Service der Universität Rostock, 2008, Professur für Geodäsie und Geoin- formatik (GG) AUF Universität Rostock; www.geoinformatik.uni-rostock.de).
6. Diffuses Licht:
Gestreutes Licht (Mütze et al. 1972). 7. Grauwert:
Helligkeits- oder Intensitätswert in der Bildverarbeitung.
Unter Grauwert versteht man die einem Bildpunkt (Pixel) zugeordnete Zahl, z.B. in Rasterdaten oder in der digitalen Bildverarbeitung. Je nach Anzahl der Bits, die ein Grauwert einneh- men kann, unterscheidet man Binärbild (1 Bit, Zustände 0 und 1), Grauwertbild (8 Bit, Zustände zwischen 0 und 255) und Farbbild (3*8 Bit mit jeweils Zuständen zwischen 0 und 255). Diesen Werten sind zur Darstellung auf einem Bildschirm Einträge einer Farbtabelle (LUT) zugeordnet, d.h. die Werte werden als Indizes einer Farbtabelle interpretiert. (Geoin- formatik-Service der Universität Rostock, 2008, Professur für Geodäsie und Geoinformatik (GG) AUF Universität Rostock; www.geoinformatik.uni-rostock.de).
8. Kontrast, fotometrischer:
Der fotometrische Kontrast kennzeichnet den Helligkeitsunterschied zwischen zwei leuchtenden Flächen: (Mütze et al. 1972).
9. Kontrast, optischer:
Sammelbezeichnung für den Helligkeitskontrast und den Farbkontrast. Siehe auch fotometrischer Kontrast (Mütze et al. 1972). 10. Monomer:
Einzelbaustein-Molekül eines Polymers. Monomere sind niedermolekulare, reaktionsfähige Moleküle, die sich zu molekularen Ketten oder Netzen, zu unverzweigten oder verzweigten Polymeren, zusammenschließen können (wikipedia). l l . Optode:
(Synonym: Optrode) Optochemi scher Sensor (Kessler 2006).
12. Planar:
Flach, eben (Duden 1974). 13. Polymer:
Chemische Verbindung aus Ketten- oder verzweigten Molekülen (Makromolekülen), die wiederum aus gleichen oder gleichartigen Einheiten (den sogenannten Monomeren) bestehen (wikipedia).
14. Strahlengang:
Verlauf der Lichtstrahlen in irgendeiner optischen Anordnung (Mütze et al. 1972).
15. Streuung:
Ablenkung von Licht bzw. Strahlung von seiner ursprünglichen Richtung durch kleine Teilchen (Mütze et al. 1972).
16. Transmission:
Durchgang von Strahlung durch ein Medium ohne Änderung der Frequenz in den monoch- ramtischen Strahlenanteilen. Bei allen glasklaren Stoffen ist gerichtete Transmission, d. h. ohne Streuung, gegeben. Im Gegensatz dazu gibt es auch gestreute Transmission, bei der der Körper die eintreffende Strahlung in verschiedenen Richtungen wieder austreten lässt (Streuung), und dabei die optischen Gesetze der Brechung jedoch nicht in Erscheinung treten (Mütze et al. 1972).
17. Transmissivität:
Eigenschaft der Durchlässigkeit von Medien. Eigenschaft in Bezug auf die physikalische Größe der Transmission (wikipedia). 18. Transparenz:
Durchlässigkeit für Licht (Duden 1974).
19. Trennschärfe:
(synonym: angulare Sehschärfe, Auflösungsvermögen) Das Vermögen Objekte so scharf zu sehen, dass Einzelheiten gut erkannt und aufgelöst werden können.
Messbar in Bogensekunden (synonym Winkelsekunde; Maßeinheit des Winkels). 60 Winkelsekunden entsprechen einer Winkelminute, 60 Winkelminuten entsprechen einem Grad. Die Auflösung von 1 ' (einer Winkelminute) entspricht einer Ortsauflösung von etwa 1 ,5 mm bei 5 m Abstand. Je kleiner die Winkel-Sehschärfe ist, desto besser ist die Sehschärfe (Mütze et al. 1972).
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Vorrichtung zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemischer und/oder physikalischer Parameter, umfassend folgende Komponenten:
a) Beleuchtungseinheit,
b) optische Erfassungseinheit,
c) mindestens einen Wachstumscontainer, mit Wachstumsmedium,
d) mindestens eine transparente, planare Optode,
e) Steuerungseinheit,
f) elektronische Datenerfassungs- und Auswerteeinheit.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit mindestens eine Lichtquelle umfasst, die Licht unterschiedlicher Wellenlängen emittiert.
3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit Licht mit einem Wellenlängenspektrum emittiert, welches sowohl für die eine Beleuchtung/ Anregung der eingesetzten Optoden mit dem/den jeweiligen Fluorophor(en) geeignet ist als auch das Wellenlängenspektrum/die Wellenlängen emittiert, welche/s für die Bild gebende, fotographische Messung der Wachstumsprozesse benötigt wird.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Lichtquelle Licht im Bereich von Wellenlängen von 200 nm bis 2500 nm emittiert.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Erfassungseinheit mindestens eine analoge oder digitale Kamera ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit über die Steuerungseinheit gesteuert ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Erfassungseinheit über die Steuerungseinheit gesteuert ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit als Lichtquelle LEDs und/oder OLEDs umfasst.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Wachstumscontainer wenigstens teilweise lichtdurch-lässig/transparent ist.
10. .Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Optode mindestens einen immobilisierten Fluorophor aufweist, der in Abhängigkeit der Quantität der zu messenden chemischen und/oder physikalischen Parameter fluoresziert.
1 1. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Optode auch nach Aufbringen des Fluorophors transparent ist.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Optode mit der Seite, die mit dem Fluorophor beschichtet ist, mit dem Wachstumsmedium kontaktiert.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Wachstumscontainer von Außenlicht abgeschirmt ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Dunkelbox den Wachstumscontainer und den Innenraum des Wachstumscontainers, die Beleuchtungseinheit und/oder die optische Erfassungseinheit vor Außenlicht abschirmt.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Wachstumscontainer, die Beleuchtungseinheit und die Kamera so zueinander positioniert sind, dass es zu keiner Reflektion an der Sichtscheibe des Wachstumscontainers kommt.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Wachstumscontainer in einem Winkel unter 90° geneigt zur Beleuchtungseinheit und zur optischen Erfassungseinheit ist.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 16,
dadurch gekennzeichnet,
dass die elektronische Datenerfassungs-/ Auswerte-Einheit ein Computer mit einem mathematischen Auswerteprogramm ist.
18. Verfahren zur nicht-invasiven Erfassung von Wachstumsprozessen und simultanen Messung chemischer und/oder physikalischer Parameter, umfassend folgende Verfahrensschritte:
i) Erfassung der Wachstumsprozesse mittels bildgebender Methoden.
ii) Erfassung der chemisch und/oder physikalischen Parameter durch
Verwendung einer planaren, transparenten Optode, wobei die Daten
aus i) und ii) simultan und parallel zueinander gewonnen werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18,
gekennzeichnet durch
a) Einbringen eines Wachstumsmediums in einen Wachstumscontainer
b) Einbringen einer transparenten, planaren Optode in den Wachstums
Container, so dass die Seite der Optode, die mit dem Fluorophor
beschichtet ist, mit dem Wachstumsmedium kontaktiert.
c) Einbringen des Untersuchungsobjekts in das Wachstumsmedium des
Wachstumscontainers und Kultivieren unter Kulturbedingungen.
d) Belichten des Wachstumscontainers durch eine Beleuchtungseinheit
mit Licht einer Wellenlänge, das im Anregungswellenlängenbereich
des jeweiligen Fluorophors der Optode liegt.
e) Belichten des Untersuchungsobjekts im Wachstumscontainer mit einer
Beleuchtungseinheit zur Erfassung der Wachstumsprozesse mittels
Bild gebender Methoden durch die Optode hindurch.
f) Aufnahme des emittierten Fluoreszenzlichts aus d) und Aufnahme von
Bilddaten aus e) und mit einer optischen Erfassungseinheit.
g) Auswerten der Daten aus f).
20. Verfahren nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Belichten des Untersuchungsobjekts gemäß e) mit Licht im nahinfraroten Bereich erfolgt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20,
dadurch gekennzeichnet,
dass die optische Erfassungseinheit und die Beleuchtungseinheit so zur Sichtscheibe des Wachstumscontainers ausgerichtet werden, dass es zu keiner Reflektion des Lichts in der Sichtscheibe des Wachstumscontainers kommt.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21 ,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Beleuchtungseinheit in einem definierten Winkel und Abstand zur Sichtscheibe des Wachstumscontainers ausgerichtet wird.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 22,
dadurch gekennzeichnet,
dass der Wachstumscontainer, die Beleuchtungseinheit und/oder die optische Erfassungseinheit durch eine Dunkelbox von Außenlicht abgeschirmt wird.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 23,
dadurch gekennzeichnet,
dass optische Erfassungseinheit und Beleuchtungseinheit über eine Steuerungseinheit gesteuert ausgelöst werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 24,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Daten der Erfassungseinheit elektronisch ausgewertet werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 25,
dadurch gekennzeichnet,
dass eine Auswertung gemäß g) mit einem mathematischen Verfahren erfolgt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 26,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Belichten der Optode und/oder die Aufnahme der Bilddaten des
Untersuchungsobjekts in Zeitintervallen zwischen μ-Sekunden bis Millisekunden erfolgt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 27,
dadurch gekennzeichnet,
dass das Belichten der Optode und/oder die Aufnahme der Bilddaten über einem Zeitraum von Minuten bis Wochen erfolgt.
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