DE3490229T1 - Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder methanerzeugender Aktivität von Methanogenen - Google Patents

Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder methanerzeugender Aktivität von Methanogenen

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DE3490229T1
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excited
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Inatomi Itami Hyogo Kenichi
Isoda Takarazuka Hyogo Satoru
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination

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Description

Dr.-lng. Roland Liesegang o/nnoon ---" Pöteritanwart* :
J 4 ο U Z Z ei European Patent Attorney
0 Sckellstrasse 1
%<* " D-8000 München 80
Telefon (089)44824
Telex 5214382 pali d
Telekopierer (089) 2720480, 2720481
Telegramme patemus münchen
Postscheck München 39418-802 Hypobank München 6400194333 — M ~ Reuschelbank München 2603007
Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder methanerzeugender Aktivität von Methanogenen
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder methanerzeugender Aktivität von Methanogenen in einem Prüfobjekt, das Methanogene enthält. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, welches zur Messung der Zellenzahl von Methanogenen oder der methanerzeugenden Aktivität von Mikroorganismen anwendbar ist, die in einer
_* Vielzahl von Mikro.organismen-Gr.uppen und Fremdstoffen
wie "verdautem"bzw. aufgeschlossenem Schlamm bzw. Rück-
**" 10 ständen und dgl. in einem Methan-Fermentationstank einer Kläranlage oder dgl. vorkommen.
Technologischer Hintergrund
Es ist ein Meßverfahren gemäß Fig. 1 bekannt. In
der Zeichnung bezeichnen Bezugszahl 1 ein Prüfobjekt; Bezugszahl 2 eine Lichtquelle; Bezugszahl 3 eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an die Lichtquelle 2; 4 eine photoelekfrische vervielfachende Röhre; 5 eine Energiequelle zum Anlegen eines elektrischen Potentials an die photoelektrische Röhre 4 und 6 einen Detektor zum Messen des Photostromes der photoelektrischen Röhre 4.
Im folgenden werden Erläuterungen bezüglich des aktuellen Meßverfahrens gegeben. Von der Lichtquelle 2 emittiertes
Licht passiert das Prüfobjekt 1, welches Mikroorganismen enthält. Das übertragene Licht wird von der photoelektrischen Röhre 4 empfangen, und seine Intensität wird vom Detektor 6 als Photostrom der photoelektrischen Röhre 4 gemessen. Da eine definierte Beziehung zwischen dem Absorptionsvermögen und der Konzentration der Mikroorganismen in dem Prüfobjekt 1 besteht, kann bei Verwendung sichtbaren Lichtes als Lichtquelle die Konzentration der Mikro-Organismen durch Messen des Absorptionsvermögens des Prüfobjektes ermittelt werden. Als Ergebnis oder in Verbindung damit kann die Zellenzahl bestimmt werden.
Ferner ist als ein anderes Verfahren zum Messen der Aktivität von Mikroorganismen bekannt, bei dem in einer optischen Messung die Menge einer biologischen Substanz bezüglich dem Energie-Stoffwechsel erfaßt wird, welche "ATP" (Adenosin-Triphosphat) oder "NAD(P)H" (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid(Phosphat)) genannt wird und in Mikroorganismen enthalten ist.
Wie vorher erwähnt besteht das konventionelle Verfahren darin, die Zellenzahl oder Aktivität der Mikroorganismen dadurch zu messen, daß das Absorptionsvermögen eines Prüfobjektes 1 bestimmt wird. Ein solches Verfahren ist dann erfolgreich, wenn das Prüfobjekt 1 aus einer einzigen Art von Mikroorganismen besteht und keine Fremdstoffe wie Rückstände, Schlamm oder dgl. im Prüfobjekt vorhanden sind. Wenn das Prüfobjekt 1 viele Arten von Mikroorganismen und darüberhinaus Fremdstoffe enthielt, war es unmöglich, einzeln die Zellenzahl oder Aktivität einer bestimmten Mikroorganismus-Art zu messen, was bei einem solchen Prüfobjekt wünschenswert ist. Da ferner ATP und NAD(P)H biologische Stoffe sind, die in allen Arten
von Mikroorganismen vorkommen, ist das Verfahren nicht zum Messen der Zellenzahlen oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen allein geeignet.
5
Abriß der Erfindung
Die Erfindung hat den Zweck, die Zellenzahl bzw. -zählung oder die methanerzeugende Aktivität der oben genannten Methanogene durch Strahlen angeregten Lichts eines bestimmten Wellenlängenbereiches auf ein Prüfobjekt enthaltend Methanogene und Messen der Intensität der Fluoreszenz eines bestimmten Wellenlängenbereiches zu messen, welche das oben genannte Prüfobjekt abstrahlt. Insbesondere zielt die Erfindung darauf ab, ein Verfahren anzugeben, das eine Messung der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität der oben genannten Methanogene selbst in einem gemischten System von Mikroorganismen ermöglicht, welches Fremdstoffe wie aufgeschlossenen Schlamm oder dgl. im Methan-Fermentationstank enthält.
Gemäß der Erfindung ist es möglich, mit hoher Genauigkeit die Zellenzahl oder die methanerzeugende Aktivität von Methanogenen durch Verwenden von Licht in einem Wellenlängenbereich von 220 nm bis 310 nm oder von 220 nm bis 255 nm oder von 260 nm bis 305 nm oder von 380 nm bis 440 nm als angeregtes Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches zu bestimmen, welches auf ein Methanogene enthaltendes Prüfobjekt gestrahlt wird.
oemäß der Erfindung ist es möglich, genau die Zellenzahlen oder die methanerzeugende Aktivität von Methanogenen durch Messen der Intensität der Fluoreszenz in Wellenlängenbereichen von 330 nm bis 370 nm oder 450 nm bis 490 nm zu messen, in
welchen das Prüfobjekt abstrahlt.
Gemäß der Erfindung ist es möglich, die Meßempfindlichkeit durch Alkalisieren des Prüfobjektes zu steigern oder die flüssige Komponente des Prüfobjektes durch eine Lösung zu substituieren, die nicht eine Fluoreszenz eines Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich aufweist, oder das Prüfobjekt zu verdünnen.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt ein Blockschaltbild zur Erläuterung des konventionellen Verfahrens zum Messen der Zellenzahlen von Mikroorganismen; Fig. 2 zeigt ein Blockschaltbild zur Erläuterung eines Verfahrens zum Messen der Zellenzahlen oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen gemäß einer Ausführung der Erfindung;
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, welche
die Fluoreszenzeigenschaften eines Komponentenmodells ohne Methanogene in aufgeschlossenem Schlamm verdeutlicht; Fig. 4 und Fig. 8 zeigen graphische Darstellungen
der Fluoreszenzeigenschaften von Methanogenen;
Fig. 5 und Fig. 9 sind graphische Darstellungen, welche die Fluorfeszenzeigenschaften von Methanogenen enthaltendem aufgeschlossenen
Schlamm darstellen;
Fig. 6 und Fig. ,7 ebenso wie Fig. 11 und Fig. 12 sind graphische Darstellungen, welche die Beziehung zwischen den Zellenzahlen von Methanogenen und der Intensität eines
angeregten Fluoreszenz-Spektrums ebenso darstellen wie die Beziehung zwischen der Methan-Erzeugungsmenge und der Intensität des angeregten Fluoreszenz-Spektrums;und Fig. 10 ist eine charakteristische Kurve, welche
Variationen der Fluoreszenzeigenschaften von Methanogenen und Escherichia coli aufgrund des pH-Wertes zeigen.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Im folgenden ist die Erfindung anhand einer Ausführung wie in der Zeichnung gezeigt beschrieben. In Fig. bezeichnen Bezugszahl 8 das Innere eines Methan-Fermentationstankes enthaltend ein Prüfobjekt; Bezugszahl 9 optische Faserbündel zum Einführen und Herausleiten von Licht in den und aus dem Fermentationstank 8; Bezugszahl 10 eine Lichtsammeivorrichtung zum Sammeln von Licht, das von einer Lichtquelle 13 in eines der optischen Faserbündel 9 emittiert wird, Bezugszahl 11 eine Auswahlvorrichtung zum Einstellen der Intensität des Lichtes in der Lichtquelle 13; Bezugszahl 12 ein optisches Filter zum Begrenzen der Wellenlänge des von der Lichtquelle 13 emittierten Lichtes; Bezugszahl 14 eine Energiequelle für die Lichtquelle; Bezugszahl 15 eine Lichtsammeivorrichtung zum Sammeln von Licht, welches von der optischen Faser 9 emittiert wird, Bezugszahl 16 ein optisches Filter zum Begrenzen einer Licht-Wellenlänge auf der Licht-Empfangsseite; Bezugszahl 17 eine photoelektrische vervielfachende Röhre; Bezugszahl 18 eine Energiequelle für die photoelektrische Röhre und Bezugszahl 19 einen Detektor zum Messen des Photostroms in der photoelektrischen Röhre 17.
Im folgenden sind Erläuterungen bezüglich des Prinzips und der Funktion der vorliegenden Erfindung gegeben. Es ist bekannt, daß Methanogene physiologische Eigenschaften haben, die sich von gewöhnlichen Mikroorganismen unterscheiden und spezifisch dafür sind, obgleich das Elektron-Transport-System, das im Energie-Stoffwechsel der Methanogene stattfindet, bisher nicht völlig geklärt werden konnte. Es ist nun bekannt, daß in diesem Elektron-Transport-System, welches im Energie-Stoffwechsel der Methanogene vorhanden ist, eine Substanz genannt "Faktor.20 ^420^" als Elektron-Träger dient, welche eine für Methanogene eigentümliche und in anderen biologischen Körpern nicht existente Substanz darstellt. Da also die Substanz, welche als Hauptkomponente F.2q enthält und Teil am Elektron-Transport-System der Methanogene hat, physiko-chemikalische Eigenschaften hat, die dafür spezifisch und meßbar sind und sich von denjenigen anderer Mikroorganismus-Gruppen als Methanogene und Fremdstoffen im Prüfobjekt wie aufgeschlossener Schlamm oder dgl. unterscheiden, und wenn solche Eigenschaften im Zustand von lebenden Zellen (d. h. lebenden Mikroorganismen) meßbar sind, kann eine derartige Substanz als Parameter in einer Messung der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität der Methanogene eingesetzt werden. Irisbesondere die Substanz F420, welche am Elektron-Transport-System der Methanogene als Hauptbestandteil mitwirkt, steht in ihrer physiologischen Funktion in einem direkten Verhältnis zum methanerzeugenden Mechanismus. Sie kann daher ein effektives Instrument bei der Messung der methanerzeugenden Aktivität bilden.
Als Ergebnis intensiver Studien und Untersuchungen, welche vom Erfinder ausgehend von den oben beschrie-
benen Überlegungen vorgenommen wurden, stellte sich heraus, daß die Fluoreszenzeigenschaft, die der Substanz F42Q zugeschrieben wird, in Methanogenen unterschiedliches Verhalten im Zellenstadium gegenüber den Fluoreszenzeigenschaften hat, welche anderen Mikroorganismen als Methanogenen und Fremdstoffen in aufgeschlossenem Schlamm zugeschrieben werden. Auf der Basis dieser Klarstellung wurde die Erfindung ; gemacht.
Fig. 3 zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum und das Fluoreszenz-Spektrum von Escherichia coli, die in einem Nährmedium (zusammengesetzt aus 10 g/l Trypton, 10 g/l Natriumchlorid und 5 g/l Hefeextrakt) suspendiert sind. In der graphischen Darstellung zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum die Intensität der Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 470 nm bezüglich Änderungen der erregten Wellenlänge, während das Fluoreszenz-Spektrum ein derartiges Spektrum bei einer erregten Wellenlänge von 380 nm hat. Als Substanzen, welche in verschiedenen biologischen Stoffen Fluoreszenzstrahlung aufweisen, sind Amino-Säuren wie Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin usw. repräsentativ. Jedoch stellen die Proben, die bei der Erfindung als Prüfobjekt verwendet sind, sämtlich Gemische solcher fluoreszierender Substanzen dar und können daher als Modell einer zu Methanogenen unterschiedlicher biologischer Stoffe zusammengestellten Probenreihe aufgefaßt werden.
Fig. 4 zeigt das Fluoreszenz-Erregerspektrum und das Fluoreszenz-Spektrum von Methanogenen (hier: Methanosarcina barkeri), die in einem Minimum-Medium (einer Kultur, welche keine andere biologische Kohlenstoff-Quelle enthält) suspendiert sind. In diesem Fall kann wegen der Verwendung des Minimum-Mediums keine Fluoreszenz des Kultur-Mediums be-
obachtet werden. Daher stammen die in Fig. 4 gezeigten Fluoreszenzeigenschaften allein von Methanogenen. Wie ein Vergleich zwischen den Fig. 3 und 4 zeigt, weisen die Fluoreszenzeigenschaften von Methanogenen ein unterschiedliches Verhalten gegenüber den Fluoreszenzeigenschaften der Probe gemäß Fig. 3 auf, d. h. der Modellprobe mit Mikroorganismen, welche sich von den Methanogenen und Fremdstoffen unterscheiden.
Fig. 5 zeigt ein Fluoreszenz-Erregungsspektrum und ein Fluoreszenz-Spektrum von aufgeschlossenem Schlamm, der als Probe aus dem Methan-Fermentationstank entnommen wurde. Beim Vergleich der Fig. 4 und der Fig. 5 wird deutlich, daß sich ein weitgehend übereinstimmendes Verhalten mit dem Erregerlicht einer Wellenlänge zwischen 220 nm und 310 nm offenbart (insbesondere mit entsprechenden Spitzen in den Wellenlängenbereichen zwischen 220 nm bis 255 nm und zwischen 260 nm und 305 nm), wobei die Fluoreszenz einen Wellenlängenbereich zwischen 330 nm bis 370 nm aufweist, so daß die Fluoreszenzeigenschaften des aufgeschlossenen bzw. gefaulten Schlammes im oben angegebenen Wellenlängenbereich der Methanogenen zuschreibbar ist. Es kann aus den Fluoreszenzeigenschaften nach Fig. 5 nicht geschlossen werden, ob das FluoreszenzpSpektrum des Wellenlängenbereiches zwischen 380 nm und 450 nm den Methanogenen zuschreibbar ist, weil es sich mit dem Verhalten des Modells der biologischen Probenreihe ohne Methanogene gemäß Fig. 3 überlappt. Das Fluoreszenz-Spektrum mit einer Spitze bei einer Wellenlänge von 500 nm gemäß Fig. 5 scheint Fluoreszenz von einer anderen Komponente als Methanogenen im aufgeschlossenem Schlamm zu sein, wie sich aus dem Vergleich zwischen Fig. 3 und Fig. 4 ergibt.
Fig. 8 zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum und das Fluoreszenz-Spektrum von Methanogenen (hier Methanosarcina barkeri), die in einem Minimum-Medium (keine organische Kohlenstoffquelle enthaltenden Kultur-Medium) suspendiert sind. Zum Vergleich sind auch das Fluoreszenz-Erregungsspektrum und das Fluoreszenz-Spektrum von Escherichia coli gezeigt, die ebenfalls in dem Minimum-Medium suspendiert sind. Es sei hier vermerkt, daß das Fluoreszenz-Erregungsspektrum der Methanogene eine Fluoreszenz-Intensität einer Wellenlänge von 470 nm bezüglich Änderungen der erregten Wellenlänge anzeigt, während das Fluoreszenz-Spektrum der erregten Wellenlänge bei 400 nm liegt. Ferner zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum von Escherichia coli eine Fluoreszenz-Intensität einer Wellenlänge von 470 nm bezüglich Änderungen der erregten Wellenlänge, während das Fluoreszenz-Spektrum bei der erregten Wellenlänge von 400 nm liegt. Da in diesem Fall das Minimum-Medium verwendet ist, sind die Fluoreszenzeigenschaften gemäß Fig. 8 von den Mikroorganismen allein abgeleitet, und es zeigt sich, daß die Fluoreszenzeigenschaften von Methanogenen ein bemerkenswert unterschiedliches Verhalten gegenüber den Fluoreszenzeigenschaften von Escherichia coli haben.
Fig. 9 zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum und das Fluoreszenz-Spektrum von aufgeschlossenem Schlamm, der als Probe aus dem Methan-Fermentationstank entnommen ist. In diesem Fall zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum eine Fluoreszenz-Intensität mit einer Wellenlänge von 470 nm bezüglich Änderungen der erregten Wellenlänge, während das Fluoreszenz-Spektrum ein solches Fluoreszenz-Spektrum bei der erregten Wellenlänge von 420 nm aufweist. Der Vergleich der Fig. 8 und 9 machen deutlich,
daß beim Fluoreszenz-Erregungsspektrum in einem Wellenlängenbereich von 380 nm bis 440·nm und beim Fluoreszenz-Spektrum in einem Wellenlängenbereich von 450 nm bis 490 nm ein gut übereinstimmendes Verhalten sich offenbart, woraus folgt, daß die Fluoreszenzeigenschaften des aufgeschlossenen Schlammes in den oben angegebenen Wellenlängenbereichen sich von Methanogenen herleiten.
Fig. 10 zeigt das Fluoreszenz-Erregungsspektrum von Methanogenen und Escherichia coli in dem Nähr-Medium bei entsprechenden pH-Werten. Das Fluoreszenz-Erregungsspektrum zeigt eine Fluoreszenz-Intensität mit einer Wellenlänge von 470 nm bezüglich Xnderungen der erregten Wellenlänge an. Aus der graphischen Darstellung ist ersichtlich, daß im wesentlichen keine Xnderungen im Fluoreszenz-Erregungsspektrum mit Escherichia coli bei pH-Werten im Bereich zwischen 7 und 11 auftreten, während die Spitzenwellenlänge der Fluoreszenz-Erregung und ihre Intensität abhängig von dem pH-Wert mit Methanogenen variiert, wobei die Spitzenwellenlänge um etwa 20 nm zu größeren Wellenlängen bei einem pH-Wert von 11 im Vergleich zu einem pH-Wert 7 verlagert ist und außerdem die Spitzenintensität um etwa das Dreifache zunimmt.
Auf diese Weise wird durch Hinzufügen einer Grundlösung oder eines Grundfeststoffes wie Natrium-Hydroxid, Kalium-Hydroxid, Ammonium-Hydroxid und dgl. ermöglicht, daß das Prüfobjekt alkalisch mit einem pH-Wertebereich zwischen 7 und 14 gemacht Wird, um die Signalintensität eines Fluoreszenzsignales zu erhöhen, welches von Methanogenen abgeleitet ist, um ferner den erregten Fluoreszenz-Wellenlängenbereich zu längeren Wellenlängen hin um 0 bis 30 nm zu verlagern, und um das S/N-Verhältnis bezüglich einer Hintergrund-Fluoreszenz zu verstärken,
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welche von anderen Komponenten als Methanogenen abgeleitet ist. Wie sich insbesondere aus Fig. 8 bis 10 ergibt, lassen sich bei Anwenden eines Lichtes im Wellenlängenbereich zwischen 410 nm und 430 nm als angeregtes Licht sowie Licht eines Wellenlängenbereiches zwischen 460 nm und 480 nm als Fluoreszenz-Licht die Spektren sowohl der Fluoreszenz-Erregung als auch der Fluoreszenz selbst in der Nachbarschaft ihrer Spitzenstellen messen.
Es ist ferner möglich, das S/N-Verhältnis des von den Methanogenen abgeleiteten Fluoreszenz-Signales sogar durch Trennen der flüssigen Komponente von dem Feststoff und durch Substituieren der flüssigen Komponente im Prüfobjekt durch eine Lösung wie Wasser, oder dgl., zu ersetzen, die nicht im Meß-Wellenlängenbereich des Erreger-Längenbereiches fluoresziert, und zwar durch Zentrifugieren, Filtrieren oder auf andere Weise; oder das Prüfobjekt kann mit einer Lösung wie Wasser verdünnt werden, die nicht im Meß-Wellenlängenbereich des Erreger-Wellenlängenbereiches fluoresziert. Ferner kann in diesem Fall bei Anwendung einer Grundlösung wie Natrium-Hydroxid, Kalium-Hydroxid und dgl. als im Meß-Wellenlängenbereich des Erreger-Wellenlängenbereiches nicht fluoreszierende Lösung die Wirkung der oben beschriebenen Alkalinität zusätzlich erzielt werden.
Aus dem erwähnten Ergebnis der Studien und Untersuchungen wurde gefunden,.daß folgende Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen, welche in einer Vielzahl von Mikroorganismus-Gruppen und Fremdstoffen wie aufgeschlossenem Schlamm oder dgl.existieren, in dem Methan- Fermentationstank angewendet werden können.
(1) Als Licht für die Fluoreszenz-Erregung kann ein Licht mit einem Wellenlängenbereich von 220 nm bis 310 nm verwendet werden, und die Zellenzahl und die methanerzeugende Aktivität der Methanogene
wird aus der Beziehung zwischen der Intensität des Erregungsspektrums und der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivitiät bestimmt. Da das Erregungsspektrum von Methanogenen seine Spitzenwerte in den oben erwähnten Wellenlängenbereichen hat, insbesondere in den Wellenlängenbereichen von 220 nm bis 255 nm und von 260 nm bis 305 nm, können die Zellenzahl oder die methanerzeugende Aktivität der Methanogene mit hoher Genauigkeit durch Messung der Intensität der Erregungsspektren in diesen beiden Wellenlängenbereichen ermittelt werden.
(2) Als Fluoreszenz wird ein Licht in einem Wellenlängenbereich zwischen 330 nm und 370 nm angewendet, und die Zellenzahl oder die methanerzeugende Aktivität der Methanogene wird auf der Grundlage der Beziehung zwischen der Intensität des Fluoreszenz- Spektrums und der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität der Methanogene ermittelt.
(3) Als Licht für die Fluoreszenz-Erregung wird Licht in einem Wellenlängenbereich zwischen 380 nm und 440 nm verwendet, und die Zellenzahl der methanerzeugenden Aktivität der Methanogene wird auf der Basis der Beziehung zwischen der Intensität des Erregungsspektrums und der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität der Methanogene ermittelt.
(4) Als Fluoreszenz wird ein Licht eines Wellen-
längenbereiches zwischen 450 nm und 490 nm verwendet,
und die Zellenzahl der methanerzeugenden Aktivität der Methanogene wird auf der Basis der Beziehung zwischen der Intensität des Fluoreszenz-Spektrums und der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität, der Methanogene ermittelt.
(5) Als Verfahren zum Erhöhen des S/N-Verhältnisses der von den Methanogenen abgeleiteten Fluoreszenz bezüglich der Hintergrund-Fluoreszenz, welche von anderen Komponenten als Methanogenen stammt, werden die folgenden drei Verfahren angewendet:
a) das Prüfobjekt wird alkalisch gemacht;
b) die flüssige Komponente des Prüfobjektes wird durch eine andere Lösung ersetzt;
c) das Prüfobjekt wird verdünnt.
Die Beziehung zwischen der Intensität des Fluoreszenz-Erregungsspektrums oder des Fluoreszenz-Spektrums und der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität kann von Methnomonas gefunden werden, welche aus aufgeschlossenem Schlamm isoliert sind, z. B.
Methnosarcina barkeri als Referenzprobe. Als Beispiel dafür zeigen die Fig. 6 und 7 ebenso wie die Fig. und 12 die Beziehung zwischen der Zellenzahl und der Intensität des Erregungsspektrums ebenso wie die Beziehung zwischen der methanerzeugenden Menge und der Intensität des Erregungsspektrums. übrigens zeigen die Fig. 6 und 7 die dargestellten Charakteristika, wenn Licht einer Wellenlänge von 280 nm als erregendes Licht und Licht einer Wellenlänge von 350 nm als Fluoreszenz-Licht angewendet werden, während die Fig. 11 und 12 die Charakteristiken dann zeigen, wenn Licht einer Wellenlänge von 420 nm
als Erregungslicht und Licht einer Wellenlänge von 470 nm als Fluoreszenz-Licht verwendet werden.
Gemäß einem solchen Meßverfahren wird die Zellenzahl oder die methanerzeugende Aktivität de:
Methanogene in Echtzeit im Betrieb des Methan-Fermentationstankes gemessen, so daß eine bemerkenswerte Wirkung durch Regeln des Methan-Fermentationstanks erwartet werden kann.
Ferner sind wesentliche Vorteile zu erwarten, wenn das Meßsystem gemäß Fig. 2 eingesetzt wird. Wenn demgemäß ein System-Regler vorgesehen und über Drähte mit dem Detektor 19, den optischen Filtern 12,16 usw. verbunden ist, dann können die Vorgänge wie Anlegen eines elektrischen Potentials an die photoelektrische Röhre selbsttätig von diesem System-Regler vorgenommen werden, oder die Intensität der Fluoreszenz-Erregung kann abhängig von der Intensität des in die photoelektrische Röhre 17 einzuleitenden Lichtes variiert werden, um die Größe des in die photoelektrische Röhre 17 fließenden Photo-Stromes in einem für die photoelektrische Röhre 17 geeigneten Bereich beizubehalten, und gleichzeitig kann der Photo-Strom bezüglich jeder Fluoreszenz-Erregungs-Intensität oder bezüglich jeder angelegten Spannung in einen Photo-Strom bezüglich einer definierten Fluoreszenz-Intensität oder einer definierten angelegten Spannung gewandelt werden.
Ferner wurden zu der oben beschriebenen Ausführung Erläuterungen bezüglich eines Meßverfahrens gegeben, bei welchem optischen Faserbündel 9 direkt in das Innere des Methan-Fermentationstankes 8 eingeführt sind, obgleich es ebenfalls möglich ist, daß das
objekt aus dem Methan-Fermentationstank als Probe entnommen und außerhalb dieses Tankes vermessen wird. Wenn das Prüfobjekt einer alkalischen Behandlung oder einer Verdünnung unterzogen oder in ihm die flüssige Komponente durch eine andere Lösung ersetzt wird, kann eine derartige Probennahme des Prüfobjektes die Behandlung erleichtern.
Wenn ferner Methanogene zu einem immobilisierenden Träger immobilisiert werden, ist es auch möglich, das Prüfobjekt an einer Stelle von immobilisierten Methanogenen unter Verwendung der optischen Faserbündel 9 zu vermessen.
In den vorstehenden Erläuterungen der Erfindung wurde das Messen der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen beschrieben, welche in einer Vielzahl von Mikroorganismus-Gruppen und Fremdstoffen wie aufgeschlossenem Schlamm oder dgl. in einem Methan-Fermentationstank vorkommen, wenngleich die Erfindung nicht auf ein derartiges Prüfobjekt beschränkt ist.
Wie vorstehend beschrieben ermöglicht die Erfindung das Messen der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen basierend auf der Messung der Fluoreszenz-Intensität in einem bestimmten Wellenlängenbereich, der von dem oben beschriebenen Prüfobjekt abgestrahlt wird, indem das Methanogene enthaltende Prüfobjekt durch Erregungslicht eines bestimmten Wellenlängenbereiches bestrahlt wird. Dies ermöglicht eine wirksame Messung der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen selbst in gemischten Systemen aus Mikroorganismen, welche Fremdstoffe enthalten.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung ist auf das Messen der Zellenzahl oder der methanerzeugenden Aktivität von Methanogenen anwendbar, die in einer Vielzahl von Mikroorganismus-Gruppen und Brennstoffen, wie aufgeschlossenem Schlamm oder dgl., in einem Methan-Fermentationstank oder dgl. für eine Abwasser-Kläranlage vorkommt.

Claims (15)

Dr.-lng. Roland Liesegang -" :**: · Patentanwalt; :~y 3A9022 9*""""""" Eü''öPean Patent Attorney Sckel Istrasse 1 D-8000 München 80 Telefon (089) 448 24 Telex 5214382 pali d Telekopierer (089) 27204B0, 2720481 Telegramme patemus münchen Postscheck München 39418-802 Hypobank München 6400194333 MITSUBISHI DENKI KABUSHIKI KAISHA Reusche.bank München 2603CK7 Tokyo, Japan P 147 93 Patentansprüche
1. Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder methanerzeugender Aktivität von Methanogenen, dadurch gekennzeichnet, daß angeregtes Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches auf ein Prüfobjekt enthaltend Methanogene gestrahlt wird und daß anschließend die Intensität der Fluoreszenz eines bestimmten Wellenlängenbereiches gemessen wird, welche das Prüfobjekt abstrahlt, wodurch die Zellenzahl oder die methanerzeugende Aktivität der Methanogene erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß angeregtes Licht eines Wellenlängenbereiches von 220 nm bis 310 nm angewendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß angeregtes Licht eines Wellenlängenbereiches von 220 nm bis 255 nm angewendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η -
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zeichnet, daß angeregtes Licht eines Wellenlängenbereiches von 260 nm bis 305 nm angewendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenz des bestimmten Wellenlängenbereiches ein Licht in einem Wellenlängenbereich von 330 nm bis 370 nm ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Prüfobjekt alkalisch gemacht ist.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß eine flüssige Komponente des Prüfobjektes durch eine Lösung ersetzt ist, welche nicht eine Fluoreszenz des Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich abstrahlt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß das Prüfobjekt in einer Lösung verdünnt ist, welche nicht eine Fluoreszenz des Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich abstrahlt.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß angeregtes Licht eines Wellenlängenbereiches von 380 nm bis 440 nm angewendet wird.
10.Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Prüfobjekt alkalisch gemacht ist.
35
11.Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine flüssige Komponente
des Prüfobjektes durch eine Lösung ersetzt ist, welche nicht eine Fluoreszenz des Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich abstrahlt.
-
12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Prüfobjekt in einer Lösung verdünnt ist, welche nicht eine Fluoreszenz des Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich abstrahlt.
13. Verfahren zum Messen der Zellenzahl oder methanerzeugender Aktivität von Methanogenen, dadurch gekennzeichnet, daß angeregtes Licht eines bestimmten Wellenlängenbereiches auf ein Prüfobjekt enthaltend Methanogene gestrahlt wird und daß anschließend die Intensität der Fluoreszenz eines Wellenlängenbereiches von 450 nm bis 490 nm gemessen wird, welche das Prüfobjekt abstrahlt, wodurch die Zellenzahl oder die methanerzeugende Aktivität der Methanogene erhalten wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Prüfobjekt alkalisch gemacht ist.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine flüssige Komponente des Prüfobjektes durch eine Lösung ersetzt ist, welche nicht eine Fluoreszenz des Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich abstrahlt.
16, Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Prüfobjekt in einer
Lösung verdünnt ist, welche nicht eine Fluoreszenz des Meß-Wellenlängenbereiches im angeregten Wellenlängenbereich abstrahlt.
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