DE102005027896A1

DE102005027896A1 - Verfahren und Vorrichtung zum optischen Messen einer Probe

Info

Publication number: DE102005027896A1
Application number: DE102005027896A
Authority: DE
Inventors: Stefan Prof. Dr. Hell; Christian Dr. Eggeling; Gerald Donnert
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2005-06-16
Publication date: 2006-12-28
Anticipated expiration: 2025-06-17
Also published as: US7719679B2; WO2006133944A1; JP2008544235A; DE102005027896B4; US20080088839A1; EP1891416A1

Abstract

Zum optischen Messen einer Probe wird ein elektromagnetisches Signal (2) wiederholt vorübergehend auf die Probe gerichtet, um eine Substanz in der Probe von einem ersten Zustand (1) in einen zweiten elektronischen Zustand (3) zu überführen, wobei zumindest ein Teil der Substanz aus dem ersten Zustand (1) oder dem zweiten Zustand (3) heraus Photonen aussendet, die zum optischen Messen der Probe verwendet werden. Das Signal (2) wird dabei mit einem zeitlichen Wiederholungsabstand auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet. Dieser Wiederholungsabstand und eine damit einhergehende Änderung bei einer Ausbeute von Photonen von der Substanz werden beobachtet, um den Wiederholungsabstand in Bezug auf die Ausbeute an Photonen zu optimieren.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum optischen Messen einer Probe, wobei das Verfahren die Merkmale des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 oder aufweist. Weiterhin betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zum optischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 20.
Bei dem elektromagnetischen Signal zum Überführen der Probe von einem ersten in einen zweiten Zustand kann es sich insbesondere um Licht handeln.

Aus der DE 101 54 699 A1 sind ein Verfahren zum optischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 11 bekannt, die auch als STED-Mikroskopie bezeichnet werden. Zur fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung einer Probe wird ein Farbstoff in der Probe zunächst mit Anregungslicht in einen angeregten energetischen Zustand gebracht. Bei dieser optischen Anregung gilt die übliche Grenze für die räumliche Auflösung bei optischen Verfahren von λ/2n, wobei λ die Wellenlänge des eingesetzten Lichts und n der Brechungsindex der Probe ist. Um diese Grenze zu unterschreiten, wird der optisch angeregte Zustand des Farbstoffs mit Abregungslicht bis auf einen gewünschten Messpunkt, in dem die Intensitätsverteilung des Abregungslichts eine Nullstelle aufweist, wieder abgeregt; d. h. mit dem Abregungslicht wird der Farbstoff überall außerhalb des Messpunkts zu stimulierter Emission gezwungen. Die Abmessungen des resultierenden fluoreszierenden Messpunkts, d. h. die räumliche Auflösung der verbleibenden Fluoreszenz, kann deutlich unter die übliche optische Auflösungsgrenze abgesenkt werden, indem das Abregungslicht außerhalb des gewünschten Messpunkts mit einer solch hohen Intensität auf die Probe aufgebracht wird, dass bei der Abregung durch stimulierte Emission eine Sättigung erreicht wird. So befindet sich der Farbstoff in der Probe nur noch in einem sehr eng begrenzten Bereich um die Nullstelle der Intensitätsverteilung des Abregungslichts in dem fluoreszierenden Zustand. Um auch mit einer niedrigen mittleren Intensität des Abregungslichts auszukommen, werden das Abregungslicht und damit auch das Anregungslicht gepulst. Ein weiterer Grund für die Verwendung von gepulstem Licht in der STED-Mikroskopie ist es, zu vermeiden, dass das intensive Abregungslicht die Probe auch dann belastet, wenn der Farbstoff nicht angeregt ist. Dieses Bestrahlen mit Licht wird mit geringem Wiederholungsabstand, der hinreichend oberhalb der Halbwertszeit des fluoreszierenden Zustands des Farbstoffs von typischerweise 1 ns liegt und eine Größenordnung von 10 ns aufweist, für dieselben Bereiche der Probe vielfach wiederholt, um auch bei nur wenigen Farbstoffmolekülen innerhalb eines Messpunkts ein sich noch hinreichend vom Hintergrundrauschen abhebendes Messsignal zu erhalten. Die in dieselben Bereiche der Probe einfallenden Pulse des Anregungs- und des Abregungslichts weisen dabei eine typische Wiederholungsrate von 80 MHz auf.

Bei der hohen Intensität des Abregungslichts, die für die Sättigung notwendig ist, besteht eine erhebliche Wahrscheinlichkeit, dass der Farbstoff in der Probe ausbleicht, d. h. so verändert wird, dass er kein Fluoreszenzlicht mehr aussendet. So wird die Lebensdauer des Farbstoffs, d. h. die Anzahl der Male, in denen Fluoreszenzlicht von ihm registriert werden kann, erheblich reduziert. Dies beschränkt die Ausbeute an Fluoreszenzlicht von einer konkreten Probe, in der naturgemäß nur eine begrenzte Anzahl von Farbstoffmolekülen zur Verfügung steht.

Ähnliche Problematiken in Bezug auf die Ausbeute an Photonen beim optischen Messen einer Probe treten auch bei anderen mit gepulstem Licht arbeitenden fluoreszenzmikroskopischen Verfahren auf, insbesondere wenn wie bei der Mehrphotonenanregung mit hohen Lichtintensitäten gearbeitet wird, und auch bei anderen Verfahren zum optischen Messen einer Probe wie beispielsweise der Lebensdauermessung an Fluorophoren (Life-Time-Imaging).

Um die Ausbeute an Photonen bei Verfahren zum optischen Messen einer Probe zu verbessern, sind Detektoren, mit denen die Photonen von der Probe registriert werden, mit erheblichem Aufwand bezüglich ihrer Ansprechwahrscheinlichkeit verbessert worden. So ist es gelungen, die Ansprechwahrscheinlichkeit von hochwertigen Detektoren binnen eines Zeitraums der vergangenen 10 bis 15 Jahre von etwa 20 % auf 40 bis 60 % zu steigern. Die damit verbundene maximal dreifache Erhöhung der Ausbeute an Photonen ist jedoch mit einer extremen Kostensteigerung bei den Detektoren einhergegangen.

Trotz des Forschritts bei den Detektoren ist es noch immer die endliche totale Ausbeute an Photonen, die den meisten fluoreszenzbasierten Messverfahren ihre Grenzen setzt. In der Fluoreszenzmikroskopie ist die endliche Zahl der von einem Fluoreszenzfarbstoff insgesamt, d. h. bis zum Bleichen ausgesandten Photonen so gut wie immer das Hauptproblem. Jede deutliche Steigerung des absoluten Signals durch Steigerung der Zahl der Fluoreszenzemissionen vor dem Bleichen ist für die Fluoreszenzmikroskopie von grundlegender Bedeutung.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum optischen Messen einer Probe mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 1 und eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Patentanspruchs 20 aufzuzeigen, mit denen eine erhebliche Steigerung der Ausbeute an Photonen erreicht wird, ohne dass dies zwangsläufig mit einer Kostensteigerung verbunden ist.

LÖSUNG

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1, des Patentanspruchs 7 oder des Patentanspruchs 10 und durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 20 gelöst. bevorzugte Ausführungsformen der neuen Verfahrens und der neuen Vorrichtung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Bei dem neuen Verfahren zum optischen Messen einer Probe und der neuen Vorrichtung wird der zeitliche Wiederholungsabstand des Signals variiert und eine damit einhergehende Änderung bei einer Ausbeute an Photonen von der Substanz beobachtet, um den Wiederholungsabstand in Bezug auf die Ausbeute an Photonen von der Substanz zu optimieren. Bei der Vorrichtung ist hierzu eine Optimierungseinrichtung vorgesehen.

Überraschenderweise stellt sich heraus, das die Ausbeute an Photonen von der Substanz ein Optimum bei einem optimierten Wiederholungsabstand des Signals erreicht, der deutlich größer als die Lebensdauer des Zustands der Substanz ist, aus dem heraus sie die Photonen aussendet. Es scheinen durch das Signal noch weitere Zustände der Substanz direkt oder indirekt angeregt zu werden, die eine längere Lebensdauer aufweisen und die sinnvoller Weise erst abklingen, bevor das Signal erneut auf die Substanz in demselben Bereich der Probe gerichtet wird. Es ist damit eine Abkehr von dem bisherigen Ansatz nötig, die Ausbeute an Photonen dadurch zu erhöhen, dass Totzeiten beim optischen Messen einer Probe durch einen möglicht kurzen, d. h. an die Lebensdauer des Photonen aussendenden Zustands der Substanz angenäherten Wiederholungsabstand vermieden werden. Vielmehr wird bei der vorliegenden Erfindung ein sinnvolles Maß an Totzeit zwischen zwei Wiederholungen des Signals hingenommen und gerade dadurch die Ausbeute an Photonen von der Substanz erhöht. Es versteht sich, dass es dabei nicht sinnvoll ist, den Wiederholungsabstand beliebig zu verlängern, weil dies zu Lasten der Gesamtdauer des optischen Messens geht. Der optimierte Wiederholungsabstand ist damit ein Kompromiss zwischen maximaler Ausbeute an Photonen von der Substanz und angemessener Gesamtdauer des optischen Messens.

Wenn der Wiederholungsabstand in einem Bereich von mindestens 0,1 μs bis 2 μs variiert wird, wird dabei der stärkste Anstieg der Ausbeute an Photonen von der Substanz durch Vergrößerung des Wiederholungsabstands erfasst.

Die Optimierung des Wiederholungsabstands kann aufgrund verschiedener Varianten der betrachteten Ausbeute an Photonen von der Substanz durchgeführt werden. Wenn die beobachtete Ausbeute an Photonen von der Substanz die mit einer bestimmten Anzahl von Wiederholungen des Signals erzielte Ausbeute an Photonen von der Substanz ist, wozu auch die Ausbeute an Photonen pro Wiederholung des Signals zählt, wird sich typischerweise eine Steigerung der Ausbeute mit jeder Vergrößerung des Wiederholungsabstands ergeben. Das Kriterium für den optimierten Wiederholungsabstand kann dann das Erreichen eines bestimmten Prozentsatzes von beispielsweise 90 % einer maximalen Ausbeute sein.

Wenn die beobachtete Ausbeute an Photonen von der Substanz die während einer bestimmten Dauer des optischen Messens der Probe erzielte Ausbeute an Photonen von der Substanz ist, ist der optimierte Wiederholungsabstand derjenige, bei dem die maximale Ausbeute in der vorgegebenen Zeit erzielt wird.

Die beobachtete Ausbeute an Photonen von der Substanz kann auch die von einer bestimmten Menge der Substanz insgesamt, d. h. bis zu ihrem Ausbleichen erzielte Ausbeute an Photonen sein. Bei dieser gesamten Ausbeute an Photonen von der Substanz ist mit jeder Vergrößerung des Wiederholungsabstands wieder eine Steigerung zu erwarten, und das Kriterium für den optimierten Wiederholungsabstand kann entsprechend das Erreichen eines bestimmten Prozentsatzes von beispielsweise 90 % der maximalen gesamten Ausbeute an Photonen von der Substanz sein.

Es versteht sich, dass der erfindungsgemäß ermittelte optimierte Wiederholungsabstand vorteilhafter Weise für das weitere optische Messen der Probe eingestellt wird. Bei der neuen Vorrichtung kann dies automatisch erfolgen, oder die Optimierungsvorrichtung kann einen optimierten Wiederholungsabstand oder eine Mehrzahl von nach unterschiedlichen Kriterien optimierten Wiederholungsabständen ausgeben, von denen einer von dem Benutzer der Vorrichtung ausgewählt und dann von der Optimierungseinrichtung oder dem Benutzer an einer Einstelleinrichtung für das willkürliche Einstellen des Wiederholungsabstands selbst für das weitere optische Messen der Probe eingestellt wird.

In einem weiteren Aspekt wird bei dem neuen Verfahren ein optimierter zeitlicher Wiederholungsabstand, mit dem das elektromagnetische Signal, z. B. ein optisches Lichtsignal, wiederholt vorübergehend auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet wird, um eine Substanz in der Probe von einem ersten in einen zweiten elektronischen Zustand zu überführen, größer als eine Lebensdauer eines dritten Zustands eingestellt, in den in parasitärer Weise ein erheblicher Teil der Substanz in der Probe aufgrund des elektromagnetischen Signals überführt wird. Insbesondere kann der zeitliche Wiederholungsabstand in Bezug auf die Lebensdauer eines solchen dritten Zustands festgelegt werden, aus dem die Substanz mit dem Signal in einen vierten Zustand überführbar ist, aus dem sie für einen Zeitraum, der länger als die Dauer des optischen Messens ist, nicht in den ersten oder den zweiten Zustand zurückkehrt. Der vorliegenden Erfindung liegt dabei die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass eine erhebliche Gefahr einer Inaktivierung der Substanz in der Probe davon ausgeht, dass die Substanz aus einem dritten Zustand, in den sie in parasitärer Weise gelangt, aus dem sie aber an sich relativ bald wieder in den ersten oder zweiten Zustand zurückkehrt, mit dem Signal in einen vierten Zustand überführbar ist, aus dem heraus sie für lange Zeit oder überhaupt nicht mehr in den ersten oder zweiten Zustand zurückkehrt. Bei solchen Vorgängen reichen sehr kleine Wahrscheinlichkeiten aus, um bei einem sehr häufig wiederholten Richten des elektromagnetischen Signals auf dieselben Bereiche der Probe einen großen Anteil der Substanz in der Probe in den vierten Zustand zu überführen und damit anhaltend zu inaktivieren. Wenn jedoch nach der Lehre der vorliegenden Erfindung der Wiederholungsabstand des Signals größer als die Lebensdauer des dritten Zustands gewählt wird, befindet sich beim jeweils nächst Richten des elektromagnetischen Signals auf die Probe kein nennenswerter Anteil der Substanz mehr in dem dritten Zustand. So können keine relevanten Teile der Substanz mehr aus dem dritten Zustand mit dem Signal in den vierten Zustand überführt und auf diese Weise inaktiviert werden.

Der erhebliche Anteil, zu dem die Substanz in den dritten Zustand gelangt, kann mit 1 × 10^–2 bis hinab zu 1 × 10^–4 der beim einmaligen Einfall des Signals in den dritten Zustand überführt wird, scheinbar sehr klein sein. Durch die typischerweise sehr große Anzahl von Wiederholungen des elektromagnetischen Signals während des Messens der Probe kann aber auch so ein kleiner Anteil der Substanz, der in den dritten Zustand überführt wird, die Gefahr des Bleichens der Substanz erheblicher erhöhen, wenn beispielsweise die Lebensdauer des dritten Zustands deutlich größer ist, als die effektive Lebensdauer des ersten oder des zweiten Zustands, so dass die Substanz in dem dritten Zustand akkumuliert. Das Bleichen wird natürlich ebenfalls verstärkt, wenn die Wahrscheinlichkeit, mit der das Signal die Substanz von dem dritten in den vierten Zustand überführt, relativ groß ist.

Besondere Relevanz für den hier erläuterten Aspekt der vorliegende Erfindung haben solche vierte Zustände, in die die Substanz mit dem elektromagnetischen Signal aus dem dritten Zustand gelangen kann und aus denen die Substanz für einen Zeitraum, der länger als 1 min, insbesondere länger als 10 min und ganz insbesondere länger als 1 h ist, nicht in den ersten oder zweiten Zustand zurückkehrt. Eine Rückkehr oder Nicht-Rückkehr der Substanz aus dem vierten Zustand in den ersten oder zweiten Zustand nach Ablauf dieses Zeitraums ist für das optische Messen der Probe gemäß der vorliegenden Erfindung in aller Regel nicht mehr relevant, da zumindest wesentliche Anteile der Substanz potentiell solange in dem vierten Zustand verbleiben, dass sie für das optische Messen der Probe während der Dauer des optischen Messens praktisch nicht mehr zur Verfügung stehen.

Soweit hier von der Lebensdauer des dritten Zustands oder dem Zeitraum, für den die Substanz aus dem vierten Zustand nicht in den ersten oder den zweiten Zustand zurückkehrt, die Rede ist, sind hiermit die jeweiligen Halbwertszeiten des dritten bzw. vierten Zustands gemeint. Für den Fachmann ist klar, dass auch bei einer sehr langen Halbwertszeit Anteile der Substanz erst viel später oder auch schon viel eher den jeweiligen Zustand verlassen, weil diesen Vorgängen Übergangswahrscheinlichkeiten zugrunde liegen, die in keine Übergänge zu festen Zeitpunkten resultieren.

Obwohl die erfindungsgemäße Maßnahme, den Wiederholungsabstand, mit dem das Signal auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet wird bis zum Erreichen eines Optimums zu erhöhen, einfach erscheint und tatsächlich keinen großen apparativen Aufwand bei der neuen Vorrichtung erfordert, sind die Effekte der Erfindung doch überraschend groß. So kann die Ausbeute an Photonen bei Verfahren zum optischen Messen einer Probe, bei denen ein Fluoreszenzfarbstoff in der Probe durch jedes der wiederholten Signale mit hohen Lichtintensitäten beaufschlagt wird, durchaus mehr als verzehnfacht werden. Ein konkretes Beispiele hierfür ist die in der DE 101 54 699 A1 beschriebene STED-Mikroskopie, bei der das Abregungslicht eine besonders hohe Intensität aufweist, und die Fluoreszenzmikroskopie mit Mehrphotonenanregung, bei der ebenfalls mit sehr hohen Lichtintensitäten gearbeitet werden muss. Grundsätzliche Vorteile ergeben sich aber auch bei anderen Verfahren zum optischen Messen einer Probe, wie beispielsweise dem Life-Time-Imaging mit gepulstem Licht.

Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass das elektromagnetische Signal, wie zum Beispiel das Lichtsignal, im Rahmen der Definition der vorliegenden Erfindung verschiedene Komponenten, also beispielsweise Anteile unterschiedlicher Wellenlängen oder auch zeitlich aufeinander abfolgende Teile aufweisen kann. Mit der Erfindung wird der Wiederholungsabstand für das elektromagnetische Signal festgelegt, das zum einmaligen optischen Messen mindestens eines Messpunkts auf die Probe gerichtet wird.

Ein als solcher bereits erfindungsgemäßer optimierter Wiederholungsabstand des elektromagnetischen Signals beträgt bei der vorliegenden Erfindung mindestens 0,1 μs. Dies entspricht einer maximalen Wiederholungsrate, mit der das Signal auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet wird, von 10 MHz. Bevorzugt ist es, wenn der Wiederholungsabstand des elektromagnetischen Signals mindestens 1 μs beträgt. Dies entspricht einer Wiederholungsrate von weniger als 1 MHz. Bei der Bestimmung der den Wiederholungsabständen entsprechenden Wiederholungsraten ist auch noch die Dauer des jeweiligen elektromagnetischen Signals zu berücksichtigen, so dass sich hier jeweils ein etwas niedrigerer Wert als der Kehrwert des Wiederholungsabstands ergibt.

Wie bereits angedeutet wurde, macht es bei der vorliegenden Erfindung keinen Sinn, eine Wiederholungsfrequenz, mit der das elektromagnetische auf irgendwelche Bereiche der Probe gerichtet wird, um diese optisch zu messen, beliebig zu verringern. Hierdurch würde sich die Dauer des optischen Messens, binnen derer eine bestimmte absolute Ausbeute an Photonen erzielt wird, erheblich erhöhen, so dass sich zum Beispiel das Signal-zu-Rausch-Verhältnis stark verschlechtern könnte oder Stabilitätsprobleme auftreten könnten. Es ist daher bevorzugt, wenn die Wiederholungsfrequenz des elektromagnetischen Signals mindestens 100 kHz beträgt. Eine deutlich darunter bleibende Wiederholungsfrequenz kann jedoch dann hingenommen werden, wenn die Probe in einer Anzahl n von Messpunkten gleichzeitig optisch gemessen wird, weil hierdurch die Ausbeute an Photonen pro Zeit um einen Faktor n erhöht wird. Entsprechend kann dann die Wiederholungsfrequenz des Signals bis auf 100 kHz/n herabgesetzt werden. Wenn die Probe beispielsweise ganzflächig mit dem elektromagnetischen Signal beaufschlagt und von einer Kamera beobachtet wird, kann z. B. die Anzahl der Bildpunkte der Kamera mit n gleichgesetzt werden, so dass n auch recht groß sein kann. Durch eine zu 1/n proportionale Reduzierung der Wiederholungsfrequenz werden aber zumindest bei größeren Werten von n keine nennenswerten Vorteile bezüglich der maximalen Ausbeute an Photonen von der Substanz in der Probe bis zu ihrem Ausbleichen mehr erzielt. Diese Vorteile stellen sich bereits bei einer Erhöhung des Wiederholungsabstands des elektromagnetischen Signals auf je nach Substanz etwa 0,1 μs bis 10 μs ein.

Zur konkreten Umsetzung der vorliegenden Erfindung kann eine Wiederholungsfrequenz des optischen Signals, das auf die Probe gerichtet wird, nach unten abgestimmt werden, um den Wiederholungsabstand zu erhöhen. Eine derartige Wiederholungsfrequenz liegt bei den meisten optischen Verfahren, bei denen ein optisches Signal wiederholt auf die Probe gerichtet wird, derzeit in der Größenordnung von 80 MHz. Zur Durchführung der Erfindung wird diese Wiederholungsfrequenz auf beispielsweise 500 kHz abgesenkt.

Wenn das elektromagnetische Signal jeweils nur auf mindestens einen räumlich begrenzten Bereich der Probe gerichtet wird, kann statt die Wiederholungsfrequenz des elektromagnetischen Signals zu reduzieren, auch eine Abtastgeschwindigkeit, mit der die Probe mit dem Signal räumlich abgetastet wird, erhöht werden, um den zeitlichen Wiederholungsabstand zu vergrößern. Es können auch beide Maßnahmen, d. h. die Reduzierung der Wiederholungsfrequenz und das Erhöhen der Abtastgeschwindigkeit zusammen genutzt werden, um den Wiederholungsabstand auf einen erfindungsgemäßen Wert hoch zu setzen. Wichtig ist, dass der Wiederholungsabstand, mit dem derselbe Bereich der Probe wiederholt mit dem elektromagnetischen Signal beaufschlagt wird, das erfindungsgemäße Mindestmaß einhält. Hierzu trägt ein so schnelles Abtasten der Probe mit dem elektromagnetischen Signal bei, dass das elektromagnetische Signal nicht zweimal hintereinander auf dieselben Bereiche der Probe einfällt, sondern sich die jeweils von dem optischen Signal beaufschlagten Bereiche nicht überlappen. In diesem Fall kann der Wiederholungsabstand, mit dem das elektromagnetische Signal auf denselben Bereich der Probe gerichtet wird, sehr groß werden, ohne dass hierdurch die Ausbeute an Photonen pro Zeiteinheit abfällt.

Wenn die Probe mit dem elektromagnetischen Signal abgetastet wird, werden die Photonen von der Probe vorzugsweise mit einem ein- oder zweidimensionalen Lichtsensorarray registriert, auf das zumindest ein Teil der Probe zeitlich invariant abgebildet wird. Jeder sich beim Abtasten der Probe gegenüber der Probe verschiebende räumlich begrenzte Bereich des elektromagnetischen Signals, wird so fortlaufend auf andere Lichtsensoren des Lichtsensorarrays abgebildet, wobei jedoch derselbe Lichtsensor immer Photonen aus demselben Bereich der Probe registriert. So ist mit dem erfindungsgemäßen schnellen Abtasten der Probe kein Problem bei der Trennung von Photonen aus verschiedenen Bereichen der Probe verbunden. Das Lichtsensorarray kann eine Kamera, insbesondere eine elektronische Kamera, wie beispielsweise eine CCD- oder CMOS-Kamera sein.

Bei einem hinreichend schnellen Abtasten der Probe mit dem elektromagnetischen Signal kann das Signal sogar einen kontinuierlichen Anteil aufweisen oder insgesamt ein kontinuierliches Signal sein, das dennoch aufgrund der hohen Abtastgeschwindigkeit, mit der die Probe abgetastet wird, nur vorübergehend auf die einzelnen Bereiche der Probe gerichtet wird. Das optische Signal kann also ganz oder teilweise von einem Dauerstrichlaser kommen.

Die Signalsteigerung durch sehr schnelles Abtasten mit sehr hohen Rastergeschwindigkeiten ist ebenfalls für den Fachmann überraschend, weil der Fachmann von einem schnellerem Abrastern der Probe an und für sich keinen Vorteil erwarten würde. Diese falsche Einsicht wird begünstigt durch die falsche Vorstellung dass man an einem Punkt solange messen müsse, bis man genügend Signal gesammelt hat. Das schnelle Abtasten erscheint daher dem Fachmann zunächst nur als unnötige Komplikation.

Die Umsetzung des neuen Verfahrens kann im Bereich der Fluoreszenzmikroskopie erfolgen. Konkret kann das Signal Anregungs- und Abregungslicht zur Anregung und räumlich begrenzten Wiederabregung der Substand bei einem STED-Verfahren umfassen. Das Signal kann ebenso Anregungslicht zur insbesondere Mehrphotonenanregung eines Fluoreszenzfarbstoffs oder allgemeiner eines Fluorophors als Substanz in der Probe umfassen.

Es kann sich bei dem zweiten Zustand, in den die Substanz mit dem elektromagnetischen Signal überführt wird und aus dem heraus sie Photonen aussendet auch um einen virtuellen Zustand (Nicht-Eigenzustand) eines Moleküls in der Probe handeln, der zwar äußerst kurzlebig (< 1 fs) aber doch an einem (nichtlinearen) Streuprozess des eingestrahlten elektromagnetischen Signals beteiligt ist, wobei das durch ihn durch (nichtlineare) Streuung generierte Streulicht als Messsignal verwendet wird. Solch nichtlineares Streulicht umfasst u.a. Höhere Harmonische (Second und Third Harmonics) und Coherent Antistokes Raman Scattering (CARS).

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Patentansprüchen und der gesamten Beschreibung. Weitere Merkmale sind den Zeichnungen – insbesondere den dargestellten Geometrien und den relativen Abmessungen mehrerer Bauteile zueinander sowie deren relativer Anordnung und Wirkverbindung – zu entnehmen. Die Kombination von Merkmalen unterschiedlicher Ausführungsformen der Erfindung oder von Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche abweichend von den gewählten Rückbeziehungen ist ebenfalls möglich und wird hiermit angeregt. Dies betrifft auch solche Merkmale, die in separaten Zeichnungsfiguren dargestellt sind oder bei deren Beschreibung genannt werden. Diese Merkmale können auch mit Merkmalen unterschiedlicher Patentansprüche kombiniert werden.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Im Folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Figuren anhand von bevorzugten Ausführungsbeispielen weiter erläutert und beschrieben.

1 zeigt verschiedene elektronische Energiezustände eines Fluoreszenzfarbstoffs.

2 zeigt das Abtasten einer Probe mit einem einzigen Messpunkt beim optischen Messen der Probe, und

3 zeigt das Abtasten einer Probe mit mehreren Messpunkten beim optischen Messen der Probe.

4 zeigt die Erhöhung der totalen Ausbeute an Photonen bei gepulster Anregung eines gängigen Fluorophors durch 1-Photonen-Absorption bei 470 nm und einer festen Pulsdauer von 100 Pikosekunden um das 7.7 fache durch Reduzierung der Wiederholungsfrequenz von 40 MHz auf 500 KHz.

5 zeigt die Erhöhung der totalen Ausbeute an Photonen bei gepulster Anregung des Grün-Fluoreszierenden-Proteins GFP durch 2-Photonen-Absorption bei 900 nm und einer Pulsdauer von ca. 200 Ferntosekunden um das 14.3 fache durch Reduzierung der Wiederholungsfrequenz von 40 MHz auf 500 KHz.

FIGURENBESCHREIBUNG
Die in 1 schematisch wiedergegebenen elektronischen Zustände eines Fluoreszenzfarbstoffs umfassen einen Grundzustand 1, der der niedrigsten Energie des Fluoreszenzfarbstoffs überhaupt und in seinem Singulettzustands S entspricht. Durch ein elektromagnetisches Signal 2 kann der Fluoreszenzfarbstoff in einen angeregten Zustand 3 überführt werden, der ebenfalls zu dem Singulettzustand des Fluoreszenzfarbstoffs gehört und bei dem es sich hier um den interessierenden fluoreszierenden Zustand des Fluoreszenzfarbstoffs handeln möge, aus dem er unter Aussenden von registrierbarem Fluoreszenzlicht 4 in den Grundzustand 1 zurückkehren kann. Daneben besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass der Fluoreszenzfarbstoff in einen dritten Zustand 5 gelangt, bei dem es sich hier um den Zustand mit niedrigster Energie innerhalb des Triplettzustands des Fluoreszenzfarbstoffs handelt. In 1 ist angedeutet, dass der Fluoreszenzfarbstoff den Zustand 5 aus dem Zustand 3 heraus erreicht. Es ist aber auch möglich, dass der Fluoreszenzfarbstoff direkt von dem Zustand 1 aufgrund des Signals 2 in den dritten Zustand 5 gelangt. Wenn eine Lebensdauer, die eine Rückkehr des Fluoreszenzfarbstoffs aus dem dritten Zustand 5 in den Grundzustand 1 oder auch in den angeregten Zustand 3 bestimmt, größer als ein Wiederholungsabstand des Signals 2 ist, wird durch eine schnelle Wiederholung des Signals 2 der Zustand 5 bis auf ein gewisses Maß aufgepumpt, das durch die genauen Verhältnisse der Übergangswahrscheinlichkeit in den Zustand 5, der Lebensdauer des Zustands 5 und des Wiederholungsabstands des Signals 2 bestimmt ist. D. h. ein gewisser Anteil der Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs von typischerweise ein paar Prozent befindet sich ständig in dem Zustand 5 und steht damit transient nicht für das Aussenden von Fluoreszenzlicht 4 zur Verfügung. Diese Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs in dem Zustand 5 sind jedoch grundsätzlich noch verfügbar und senden nach Rückkehr in den Zustand 1 oder 3 auch wieder Fluoreszenzlicht 4 aus. Der Fluoreszenzfarbstoff im Zustand 5 muss daher nicht als gebleicht, d. h. als für das optische Messen einer Probe nicht mehr zur Verfügung stehend betrachtet werden. Anders verhält es sich jedoch mit Anteilen des Fluoreszenzfarbstoffs, die aus dem dritten Zustand 5 unter Anregung durch das Signal 2 in einen vierten Zustand 6 gelangen können, aus dem heraus sie nicht mehr in den Grundzustand 1 oder den angeregten Zustand 3 zurückgelangen, weil entweder der vierte Zustand 6 eine sehr lange Lebensdauer aufweist, oder aus dem vierten Zustand 6 heraus eine chemische Veränderung, d. h. eine Zerstörung des Fluoreszenzfarbstoffs erfolgt.
Die typische Lebensdauer des fluoreszierenden Zustands 2 von Fluoreszenzfarbstoffen liegt in der Größenordnung von 1 ns. Die Lebensdauer des hier betrachteten Zustands 5 liegt typischerweise mindestens eine Größenordnung darüber. Die Halbwertszeit, mit der der Fluoreszenzfarbstoff aus dem Zustand 6 entweder über den Zustand 5 oder auf anderem Wege in einen der Zustände 1 und 3 zurückkehrt, ist, wenn er überhaupt zurückkehrt, um einige Zehnerpotenzen größer, so dass auch zahlenmäßig geringe Wahrscheinlichkeiten, dass der Fluoreszenzfarbstoff in den Zustand 5 und aus dem Zustand 5 in den Zustand 6 gelangt erhebliche Einfluss auf die Anzahl der Male haben, in denen der Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszenzlicht 4 aussenden kann, bevor er ausbleicht, d. h. auf irgendeine Weise inaktiv wird.
Das Ausfallen des Fluoreszenzfarbstoffs, weil er in den Zustand 6 gelangt, wird jedoch erfindungsgemäß dadurch unterdrückt, dass ein Wiederholungsabstand des Signals 2 über die Lebensdauer des dritten Zustands 5 hinaus erhöht wird. Zum Einen kommt es so zu überhaupt keiner nennenswerten Besetzung des Zustands 5 mehr, und zum Anderen ist damit auch die Gefahr, dass nennenswerte Anteile des Fluoreszenzfarbstoffs, die sich in dem Zustand 5 befinden, mit dem Signal 2 beaufschlagt werden und so in den Zustand 6 gelangen, beseitigt.
Da es für die Betrachtung des Wiederholungsabstands des Signals 2 nur auf dieselben Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs ankommt, also darauf, dass das Signal 2 nicht mit einer zu hohen Wiederholungsrate auf dieselben Bereiche einer Probe auftrifft, kann statt einer Erhöhung des Wiederholungsabstands des Signals 2, die einer Reduktion seiner Wiederholungsfrequenz entspricht, auch der Bereich der Probe, auf den das Signal 2 gerichtet wird, so schnell geändert werden, dass das Signal 2 nicht mit seiner eigenen Wiederholungsfrequenz auf dieselben Bereiche der Probe auftrifft. 2 skizziert das Abtasten einer Probe 7 mit einem Messpunkt 8, der dem Bereich entspricht, in dem die Probe 7 mit dem Signal 2 beaufschlagt wird. Wenn der Messpunkt 8 so schnell in der angedeuteten Richtung über die Probe 7 verfahren wird, dass das Signal 2 bei jeder seiner Wiederholungen nicht mehr auf denselben Bereich der Probe 7 wie zuvor auftrifft, wird derselbe Effekt erreicht, als wenn die Wiederholungsfrequenz des Signals 2 selbst reduziert würde. Bei ausreichend schneller Bewegung des Messpunkts 8 über die Probe 7 kann das Signal 2 sogar ein kontinuierliches Signal sein und trotzdem in den einzelnen Messpunkten 8 wie ein vorübergehendes Signal wirken.
3 deutet an, wie durch eine Erhöhung der Anzahl der Messpunkte 8, mit denen eine Probe 7 abgetastet wird, die Gesamtausbeute an Photonen pro Zeit auch dann erhöht werden kann, wenn die Wiederholungsfrequenz des Signals 2 für jeden der Messpunkte 8 reduziert wird. Im Falle der dargestellten 10 Messpunkte 8 kann die Wiederholungsfrequenz des Signals 2 in jedem Messpunkt 8 auf ein Zehntel reduziert werden, ohne dass dies gegenüber einem Messpunkt 8, in dem die Wiederholungsfrequenz nicht reduziert wird, einen Verlust an Anregung der Probe 7 durch das Signal 2 gemäß 1 bedeutet. Da gleichzeitig die Ausbeute an Photonen in jedem Messpunkt 8 durch die beschriebene Reduzierung der Wiederholungsfrequenz des Signals 2 nur unterproportional abfällt, da sich der relative Anteil des Fluoreszenzfarbstoffs reduziert, der in den Zustand 5 oder den Zustand 6 gemäß 1 gelangt, ist die Ausbeute an Photonen pro Zeit bei 10 Messpunkten statt einem Messpunkt mit 10-facher Frequenz des Signals 2 sogar von vornherein größer. Der Unterschied nimmt mit der Zeit immer mehr zu, weil fast keine Moleküle des Fluoreszenzfarbstoffs mehr in den Zustand 6 gelangen und damit dauerhaft für das optische Messen der Probe 7 ausfallen.
Zur Lehre dieser Erfindung gehört, dass eine für die Probe charakteristische Wiederholungsrate des beaufschlagenden elektromagnetischen Signals eine maximale totale Ausbeute an Photonen liefert. Dabei kann es sich auch um ein Wiederholungsratenbereich handeln, in dem die maximale totale Ausbeute an Photonen ganz oder zumindest im Wesentlichen erreicht wird. Innerhalb dieses Widerholungsratenbereichs ist es aber bevorzugt, die höchstmögliche Wiederholungsrate zu wählen, bei der nicht nur die totale Fluoreszenzausbeute hoch, sondern auch die totale Meßdauer möglichst kurz ist. Aus der in 4 gezeigten Messreihe für den Farbstoff Atto532 (Anregungswellenlänge 470 nm; 1-Photonen-Absorption) ergibt sich, dass eine Wiederholungsrate von 500 kHz–1 MHz eine gute Wahl ist. Bei dieser Wiederholungsrate ist im Vergleich zu einer für den Stand der Technik typischen Wiederholungsrate von 40 MHz die totale Ausbeute an Photonen von der Fluoreszenz des Farbstoffs um das 6.5–7,7 fache erhöht.
Die Messungen zur Ermittlung der maximalen Ausbeute an Photonen von der Fluoreszenz des Farbstoffs Atto532, deren Ergebnisse in 4 dargestellt sind, wurden an einer fixierten Atto532 Farbstoffschicht in einem Rasterblockmuster aus 32 unterschiedlichen Stellen (4 × 8) ausgeführt. In jedem Block wird die Leistung zeilenweise nach unten jeweils verdoppelt, so dass die dunkelsten Flecke der höchsten Laserleistung entsprechen. Die Erhöhung der Leistung und das Raster an sich sind hier aber nicht wesentlich. Wesentlich ist, dass die Aufnahme der Rasterblocks mit unterschiedlichen Laserpulsraten durchgeführt wurde: 40 MHz, 10 MHz, 1 MHz und 500 kHz. Dabei wurde die Aufnahmezeit an einer Stelle entsprechend der Wiederholrate so angepasst, dass jeder Punkt von der gleichen Gesamtzahl an Pulsen getroffen wurde. Insgesamt wird damit lediglich die Zeitspanne zwischen den Pulsen variiert aber nicht die integrale Strahlenbelastung. Die maximale Leistung betrug 40 μ W bei 40 MHz. Die Zeitverläufe zeigen die Fluoreszenzausbeute an einem festen Ort der Probe bei gleicher Peakpower und gleicher Gesamtzahl an Pulsen auf die Farbstoffmoleküle, gemessen bei den 4 Laserpuls-Wiederholraten. Das Integral über die Messzeit belegt eine Erhöhung der Fluoreszenzausbeute um den Faktor 7,7 zwischen der Messung bei 40 MHz und der Messung bei 500 kHz. Gleichzeitig ist die Reduzierung des Farbstoffbleichens mit der Reduzierung der Wiederholungsrate in den Bildern evident.
Aus 5 geht hervor, dass sich bei dem für die Fluoreszenzmikroskopie sehr wichtigen Grün-Fluoreszierenden-Protein (GFP) bei einer 2-Photonen-Anregung bei der Wellenlänge von 900 nm sogar eine Steigerung der gesamten Ausbeute an Photonen um einen Faktor von 10–14,3 ergibt, wenn man die Wiederholungsrate der Anregungslichtpulse statt bei üblichen 40 MHz in dem Intervall von 500 kHz bis 1 MHz platziert.
Die Messungen, deren Ergebnisse in 5 dargestellt sind, wurden an einer fixierten Schicht des Grün-Fluoreszierenden-Proteins (GFP) durchgeführt. Wie bei den voranstehenden Ergebnissen gemäß 4 wurde jeweils bei gleicher Peakpower und entsprechend der Wiederholungsrate angeglichener Aufnahmezeit gemessen (maximale Leistung 4 mW bei 40 MHz). Die Optimierung des Wiederholungsabstands der Pulse ergibt für GFP eine Erhöhung der Ausbeute an Photonen um den Faktor 14,3 im Vergleich zwischen den Messungen bei 40 MHz und bei 500 kHz. Die Reduzierung des Fluorophorbleichens ist auch in diesem Fall durch die Bleichbilder unmittelbar nachweisbar.

1: Grundzustand
2: Signal
3: Zustand
4: Fluoreszenzlicht
5: Zustand
6: Zustand
7: Probe
8: Messpunkt

Claims

Verfahren zum optischen Messen einer Probe, – wobei ein elektromagnetisches Signal wiederholt vorübergehend auf die Probe gerichtet wird, um eine Substanz in der Probe von einem ersten in einen zweiten elektronischen Zustand zu überführen, – wobei zumindest ein Teil der Substanz aus dem ersten oder dem zweiten Zustand heraus Photonen aussendet, die zum optischen Messen der Probe verwendet werden, – wobei das Signal mit einem zeitlichen Wiederholungsabstand auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet wird, dadurch gekennzeichnet, – dass der zeitliche Wiederholungsabstand des Signals variiert wird und eine damit einhergehende Änderung bei einer Ausbeute an Photonen von der Substanz beobachtet wird, – um den Wiederholungsabstand in Bezug auf die Ausbeute an Photonen von der Substanz zu optimieren.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Wiederholungsabstand in einem Bereich von mindestens 0.1 μs bis 2 μs variiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die beobachtete Ausbeute an Photonen von der Substanz die mit einer bestimmten Anzahl von Wiederholungen des Signals erzielte Ausbeute an Photonen von der Substanz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die beobachtete Ausbeute an Photonen von der Substanz die während einer bestimmten Dauer des optischen Messens der Probe erzielte Ausbeute an Photonen von der Substanz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die beobachtete Ausbeute an Photonen von der Substanz die von einer bestimmten Menge der Substanz insgesamt erzielte Ausbeute an Photonen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der optimierte Wiederholungsabstand für das weitere optische Messen der Probe eingestellt wird.
Verfahren zum optischen Messen einer Probe, – wobei ein elektromagnetisches Signal wiederholt vorübergehend auf die Probe gerichtet wird, um eine Substanz in der Probe von einem ersten in einen zweiten elektronischen Zustand zu überführen, – wobei zumindest ein Teil der Substanz aus dem ersten oder dem zweiten Zustand heraus Photonen aussendet, die zum optischen Messen der Probe verwendet werden, – wobei das Signal mit einem zeitlichen Wiederholungsabstand auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet wird, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, – dass ein optimierter zeitlicher Wiederholungsabstand des Signals eingestellt wird, der größer als eine Lebensdauer eines dritten Zustands (5) ist, in den in parasitärer Weise ein erheblicher Teil der Substanz in der Probe (7) aufgrund des Signals (2) überführt wird, – wobei die Substanz aus dem dritten Zustand (5) mit dem Signal (2) in einen vierten Zustand (6) überführbar ist, aus dem sie für einen Zeitraum, der länger als das Hundertfache der Lebensdauer des dritten Zustands (5) ist, nicht in den ersten Zustand (1) oder den zweiten Zustand (3) zurückkehrt.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der erhebliche Teil der Substanz bei einmaligem Einfall des Signals (2) mindestens 1 × 10^–4 und insbesondere mindestens 1 × 10^–2 der Substanz beträgt.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitraum für den die Substanz aus dem vierten Zustand (6) nicht in den ersten Zustand (1) oder den zweiten Zustand (3) zurückkehrt, mehr als 1 min, insbesondere mehr als 10 min und ganz insbesondere mehr als 1 h lang ist oder dass die Substanz aus dem vierten Zustand (6) nicht mehr in den ersten Zustand (1) oder den zweiten Zustand (3) zurückkehrt.
Verfahren zum optischen Messen einer Probe, – wobei ein elektromagnetisches Signal wiederholt vorübergehend auf die Probe gerichtet wird, um eine Substanz in der Probe von einem ersten in einen zweiten elektronischen Zustand zu überführen, – wobei zumindest ein Teil der Substanz aus dem ersten oder dem zweiten Zustand heraus Photonen aussendet, die zum optischen Messen der Probe verwendet werden, – wobei das Signal mit einem zeitlichen Wiederholungsabstand auf dieselben Bereiche der Probe gerichtet wird, insbesondere nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, – dass ein optimierter zeitlicher Wiederholungsabstand des Signals eingestellt wird, der mindestens 0,1 μs beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der optimierte Wiederholungsabstand mindestens 1 μs, beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wiederholungsfrequenz des optischen Signals, mit dem es beim weiteren optischen Messen der Probe auf irgendwelche Bereiche der Probe gerichtet wird, mindestens 100 kHz oder mindestens 100 kHz/n beträgt, wobei n eine Anzahl von Messpunkten (8) ist, in denen die Probe (7) gleichzeitig optisch gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal jeweils auf mindestens einen räumlich begrenzten Bereich der Probe gerichtet wird.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Wiederholungsabstand variiert wird, indem eine Abtastgeschwindigkeit, mit der die Probe (7) mit dem mindestens einen räumlich begrenzten Bereich räumlich abgetastet wird, nach oben abgestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Photonen von der Probe mit einem ein- oder zweidimensionalen Lichtsensorarray registriert werden, auf das zumindest ein Teil der Probe zeitlich invariant abgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal mindestens einen kontinuierlichen Anteil aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal (2) Anregungslicht und Abregungslicht zur Anregung und zur räumlich begrenzten Abregung der Substanz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal (2) Anregungslicht zur Mehrphotonenanregung der Substanz umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal (2) Licht zur nichtlinearen Mehrphotonenstreuung der Substanz umfasst.
Vorrichtung zum optischen Messen einer Probe – wobei die Vorrichtung ein optisches Signal wiederholt vorübergehend auf die Probe richtet, um eine Substanz in der Probe von einem ersten in einen zweiten elektronischen Zustand zu überführen, – wobei die Vorrichtung Photonen, die von zumindest einem Teil der Substanz aus dem ersten oder dem zweiten Zustand heraus ausgesendet werden, zum optischen Messen der Probe verwendet, – wobei die Vorrichtung das Signal mit einem zeitlichen Wiederholungsabstand auf dieselben Bereiche der Probe richtet, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einstelleinrichtung zum Einstellen eines optimierten zeitlichen Wiederholungsabstands des Signals vorgesehen ist, – mit der der zeitliche Wiederholungsabstand des Signals verstellbar und auf mindestens 0,1 μs einstellbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Wiederholungsabstand des Signals mit der Einstelleinrichtung auf mindestens 1 μs einstellbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass eine Optimierungseinrichtung zum Optimieren des zeitlichen Wiederholungsabstands des Signals vorgesehen ist, – die über die Einstelleinrichtung den Wiederholungsabstand des Signals variiert und eine damit einhergehende Änderung bei einer Ausbeute an Photonen von der Substanz registriert, und – die einen in Bezug auf die Ausbeute an Photonen von der Substanz optimierten Wiederholungsabstand ermittelt.
Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Optimierungseinrichtung den Wiederholungsabstand in einem Bereich von mindestens 0.1 μs bis 2 μs variiert.
Vorrichtung nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, dass die registrierte Ausbeute an Photonen von der Substanz die mit einer bestimmten Anzahl von Wiederholungen des Signals erzielte Ausbeute an Photonen von der Substanz umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die registrierte Ausbeute an Photonen von der Substanz die während einer bestimmten Dauer des optischen Messens der Probe erzielte Ausbeute an Photonen von der Substanz umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die registrierte Ausbeute an Photonen von der Substanz die von einer bestimmten Menge der Substanz insgesamt erzielte Ausbeute an Photonen umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Optimierungseinrichtung den ermittelten optimierten Wiederholungsabstand für das weitere optische Messen der Probe über die Stelleinrichtung automatisch einstellt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Optimierungseinrichtung den ermittelten optimierten Wiederholungsabstand ausgibt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Stelleinrichtung eine Wiederholungsfrequenz des optischen Signals (2) einstellt, um den Wiederholungsabstand einzustellen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Abtasteinrichtung zum räumlichen Abtasten der Probe (7) mit dem Signal (2) vorgesehen ist, wobei mit der Stelleinrichtung eine Abtastgeschwindigkeit der Abtasteinrichtung einstellbar ist, um den Wiederholungsabstand einzustellen.
Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Registriereinrichtung für die Photonen von der Probe ein- oder zweidimensionales Lichtsensorarray aufweist, auf das zumindest ein Teil der Probe zeitlich invariant abgebildet wird.
Vorrichtung nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass ein Dauerstrichlaser zur Bereitstellung des optischen Signals (2) vorgesehen ist.
Fluoreszenzlichtmikroskop nach einem der Ansprüche 20 bis 32.