DE19712214A1 - Meßverfahren für lumineszierende Proben - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung ist eine Weiterentwicklung der P 196 02 145.6 und betrifft ein optisches Meßverfahren zur Bestimmung der von einer bio- oder chemolumineszenten Probe ausgehenden Lichtemission.

Die Vermessung des Leuchtverhaltens von selbstleuchtenden Proben kommt in der Praxis in verschiedensten Bereichen vor. So gibt es chemolumineszente Proben, bei denen chemische Stoffe durch eine chemische Reaktion zur Lichtemission angeregt werden. Beispiele für chemolumineszente Stoffe sind Luminol und Lucigenin, die mit Chlor und Stickstoff unter Lichtemission reagieren.

Von besonderer Bedeutung sind jedoch auch biolumineszente Meßverfahren. Hierbei wird ausgenutzt, daß es Leuchtbakterien gibt, die bei ihrer Atmung bzw. allgemeinen Stoffwechselvorgängen Licht emittieren. Solche biologischen Organismen bilden häufig einen sehr empfindlichen Indikator für selbst geringe Mengen von toxischen Substanzen. So beschreibt beispielsweise die DE 28 41 896 den Einsatz des Photobacteriums wie beispielsweise P.Splendidum, P.Mandapamencis, P.Phosphorio. Weitere Leuchtbakterienstämme sind beispielsweise Bakterien der Gattung Vibrio, Lucibakterium, oder andere Mikroorganismen wie z. B. Meeres-Dinoflagellaten oder Pilze (Basidiomyceten). Toxizitätsmessungen mit derartigen Leuchtbakterien sind bereits als Routineverfahren normiert (vgl. DEV L34). Die natürliche Leuchtaktivität der Leuchtbakterien wird in diesen Toxizitätstests in der Regel durch die Zugabe der toxischen Substanz gehemmt. Die daraufhin einsetzende Abnahme der Lichtemission wird mit Hilfe eine Lichtdetektors gemessen und aufgezeichnet. Dabei ergibt sich in der Praxis das Problem, daß stark verfälschende Störeinflüsse durch das Suspensionsmedium der Bakterien auftreten. Dieses Medium kann nämlich je nach Herkunft eine eigene Färbung oder Trübung haben, welche das Meßergebnis erheblich beeinflußt. Aus diesem Grunde sind Verfahren entwickelt worden, wie durch Vergleichsmessung mit dem Suspensionsmedium ohne die Leuchtbakterien eine Korrektur der Störeinflüsse durchgeführt werden kann. So beschreibt z. B. der Artikel "Möglichkeiten und Grenzen der Farbkorrektur im Leuchtbakterientest mit Hilfe von Absorptions-Korrektur-Küvetten" (Berthold Klein, Z. Wasser-Forsch. 23, 70-74 (1990)) drei derartige Verfahren. Zwei von diesen Verfahren verwenden eine spezielle Absorptions-Korrektur-Küvette (ACC), die einen zweiteiligen Aufbau mit einer inneren und einer äußeren Kammer für die Probe hat. Während die die Leuchtbakterien enthaltende Flüssigkeit nur in die innere Kammer gefüllt wird, wird die äußere Kammer wechselweise mit einer klaren Vergleichsflüssigkeit oder dem reinen Suspensionsmedium (ohne Leuchtbakterien) gefüllt. Nach einem derartigen Befüllen ist über einen Zeitraum von ca. 20-30 Minuten das Leuchtverhalten zu beobachten, da sich aufgrund von Temperaturangleichungsprozessen das Leuchtverhalten der Bakterien zunächst stark ändert. Nach dem genannten Zeitraum nimmt es sodann eine konstante Drift an, so daß mit Hilfe von grafischen Verfahren anhand der ermittelten Meßkurven die Lichtintensität I₀ hinter optisch leerem Medium und die Lichtintensität I_f hinter gefärbtem Medium in der äußeren Kammer der ACC ermittelt werden kann. Der genannte Artikel beschreibt ferner ein Ver­ fahren, bei dem mit vier ACC-Küvetten, die unterschiedlich befüllt sind, gleichzeitig eine kompensierende Messung durchgeführt werden kann. Dieses Verfahren vermeidet, daß durch einen Austausch der Flüssigkeit in der äußeren Kammer der ACC zeitaufwendige Temperatureffekte auftreten. Dafür erfordert es jedoch den relativ aufwendigen Vorgang einer Messung mit vier Küvetten, der zudem mit weiteren Fehlerquellen behaftet ist (z. B. unterschiedliche Gefäßeigenschaften). Die geschilderten Methoden zur Korrektur von Farb- und Trübungseinflüssen bei Leuchtbakterientests sind alle sehr aufwendig. Ihre Durchführung erfordert geschultes Personal und ist auch dann noch aufgrund zahlreicher Fehlerquellen sehr fehlerbehaftet.

Die P 196 02 145.6 sich demgegenüber die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das einfach durchzuführen und daher auch von ungeschulten Personen anwendbar ist, und mit dem Störeinflüsse wie z. B. Färbungen oder Trübungen innerhalb einer lumineszierenden Probe erkannt und kompensiert werden können.

Diese Aufgabe wird von der P 196 02 145.6 durch ein optisches Meßverfahren gelöst, bei dem, wie bei den bekannten Verfahren, mit einem Lichtdetektor die Lichtemission einer lumineszierenden Probe gemessen wird; als kennzeichnendes Merkmal wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dann jedoch zusätzlich (mindestens) eine Vergleichsmessung durchgeführt, bei der mit Hilfe einer Lichtquelle die Probe ganz oder teilweise durchstrahlt und die resultierende Transmission des Lichtes gemessen wird. Durch das Durchstrahlen der Probe mit einer Lichtquelle bekannter Stärke und bekannter Anordnung ist es möglich, durch Messung der Transmission festzustellen, wieviel des Lichtes innerhalb der Probe absorbiert und damit durch die Störeinflüsse verändert wurde. Auf diese Weise erhält man Kenntnis über die Größe der Störeinflüsse und kann diese aus dem Meßsignal der Lumineszenz herauskompensieren.

Bei dem Verfahren nach der Stammanmeldung kann die Lichtquelle innerhalb der Probe oder außerhalb angeordnet sein. Wichtig ist nur, daß ihre geometrische Anordnung in bezug auf den Lichtdetektor bekannt und konstant ist.

Zur Ermittlung der Vergleichsmessung ist es möglich, die Lichtquelle mindestens einmal ein- bzw. auszuschalten und die Differenz in der gemessenen Lichtintensität festzustellen. Bei diesem Vorgehen wird in der Regel die Probe sowohl im ein- als auch im ausgeschalteten Zustand der Lichtquelle aktiv lumineszieren.

Bei einem anderen Meßvorgehen wird die Probe zunächst im nicht-lumineszenten Zu­ stand mit eingeschalteter Lichtquelle vermessen; anschließend wird im lumineszenten Zustand mit ausgeschalteter Lichtquelle gemessen, und die beiden somit ermittelten Meßwerte können miteinander korreliert werden.

Vorzugsweise wird bei dem Meßverfahren der Stammanmeldung das Spektrum der Lichtquelle auf das Spektrum der vorliegenden bzw. erwarteten Lumineszenz abgestimmt. Dies geschieht insbesondere so, daß die Spektren so weit wie technisch möglich einander angenähert werden. Da eine Lumineszenz in der Regel bei einer (oder einigen) diskreten Wellenlängen erfolgt, wird eine derartige Abstimmung der Spektren vorzugsweise so durchgeführt, daß für die Lichtquelle monochromatisches Licht verwendet wird, dessen Wellenlänge mit der Wellenlänge der Lumineszenz übereinstimmt.

Mit Hilfe der oben beschriebenen Vergleichsmessungen können die durch Färbungen oder Trübungen verursachten Störeinflüsse meßtechnisch kompensiert werden. In der Regel wird dazu in einer Serie von Kalibrierungsmessungen der Zusammenhang ermittelt, mit dem sich die Lumineszenz zum einen und das durchstrahlende Licht der Lichtquelle zum anderen bei Zugabe von definierten Trübungen ändern. Über eine derartige Kalibrierungsmessung kann sodann in einer späteren realen Messung aus dem Lichtintensitätswert der Lichtquelle der korrigierte Lichtintensitätswert der lumineszierenden Probe ermittelt werden.

Während das obige Verfahren der P 196 02 145.6 vorwiegend am Beispiel der Biolumineszenz mit Hilfe von Leuchtbakterien erläutert wurde, ist es jedoch keineswegs auf diese Lumineszenzerscheinung eingeschränkt. Es ist vielmehr mit allen bekannten chemo- und biolumineszenten (selbstleuchtenden) Vorgängen einsetzbar.

Die P 196 02 145.6 betrifft auch eine Vorrichtung zur optischen Messung von lumineszierenden Proben, welche in der bekannten Art einen transparenten Probenbehälter und einen Lichtdetektor enthält; als Kennzeichen enthält eine derartige Vorrichtung eine ein-/ausschaltbare Lichtquelle, welche innerhalb des Probenbehälters oder außerhalb des Probenbehälters angeordnet ist, und zwar in einer Weise, daß der von der Lichtquelle ausgehende Strahlengang nach Durchtritt durch den Probenbehälter den Lichtdetektor erreicht. Mit einer derartigen Vorrichtung ist es möglich, das oben geschilderte erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen. Durch Ein- bzw. Ausschalten der Lichtquelle kann dabei die Transmission des Lichtes durch die Probe gemessen werden, und dieser Wert kann zur Korrektur von Störeinflüssen herangezogen werden.

Bei der in der Vorrichtung nach der Stammanmeldung eingesetzten Lichtquelle handelt es sich vorzugsweise um Leuchtdioden (LED), Gasentladungslampen, Glühlampen, Laser, Halogen- oder Wolfram-Lampen. Bei dem Lichtdetektor handelt es sich vorzugsweise um eine Fotodiode, eine Fotozelle, einen Fotowiderstand oder eine Fotomultiplierröhre.

Um eine Anpassung des Spektrums der Lichtquelle in der beschriebenen Vorrichtung zu erzielen, können im Strahlengang geeignete Filter angeordnet sein. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um Bandpaßfilter oder Monochromatoren, insbesondere um Transmissionsfilter (die nur ein schmales Band des Spektrums durchlassen) oder optische Gitter. Diese Filter können sowohl vor der Lichtquelle angeordnet sein und damit das von ihr ausgehende Licht filtern, als auch vor dem Detektor und damit das Licht der erfindungsgemäßen Lichtquelle und der lumineszierenden Probe gleichermaßen filtern.

Ausgehend von diesem Stand der Technik gemäß der P 196 02 145.6 hat sich die vorliegende Erfindung die Aufgabe gestellt, für die Durchführung biotechnologischer Messungen, insbesondere den Leuchtbakterientest, geeignete Filter zur Verfügung zu stellen. Damit sollen gleichzeitig Meßfehler durch die Eigenfarbe von Lösungen vermeiden werden.

Diese Aufgabe wird durch Filter gelöst, die ihr Durchlässigkeitsmaximum bei 450 bis 550 nm, vorzugsweise 480 nm haben. Die Fensterbreite dieser Filter (= Bereich, in dem die Intensität über 50% des Maximums beträgt) beträgt vorzugsweise 5-30 nm, ganz besonders bevorzugt 15-25 nm.

Mit derartigen Filterkenndaten kann gerade bei dem Leuchtbakterientest eine wirkungsvolle Verbesserung der Messungen erzielt werden. Insbesondere werden damit typische Meßfehler vermieden. Wenn das zu vermessende Medium nämlich eine Eigenfarbe hat, kommt es in Abhängigkeit von der Intensität der Färbung zu einer Veränderung des Spektrums des durchgestrahlten Lichtes und des Lumineszenzlichtes. Insbesondere führt dies dazu, daß die Lage des Intensitätsmaximums von peak-förmigen Spektren verschoben wird, und zwar zur Wellenlänge der Eigenfarbe des Mediums hin. Übliche Meßmethoden ermitteln die Intensität des Maximums, da diese einfach und eindeutig bestimmbar ist. Aus der Intensitätsabnahme des Intensitätsmaximums wird dann nach dem Lam­ bert-Beerschen Gesetz die Konzentration des Farbstoffes errechnet. Durch die Lageverschiebung des Intensitätsmaximums bei einer Eigenfarbe des Mediums unterliegen derartige Methoden, die implizit von einer gleichbleibenden Lage ausgehen, somit einem Meßfehler.

Derartige Meßfehler werden bei der Erfindung vermieden, indem vor den Detektor ein Filter mit den erfindungsgemäßen Kenndaten gesetzt wird, um nur einen ganz bestimmten Ausschnitt des Spektrums auszuwerten. Eine Verschiebung des Intensitätsmaximums kann damit wirkungsvoll vermieden werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren haben gegenüber dem Stand der Technik den Vorteil, daß sie durch einen relativ einfachen apparativen Aufbau erzielbar sind, und daß bei ihrer Anwendung kaum Fehler durch eine falsche oder unsaubere Ausführung auftreten können. Das geschilderte Verfahren ist vielmehr routinemäßig durchführbar und führt zu robusten Ergebnissen.

In dem folgenden Beispiel werden Meßergebnisse wiedergegeben, die mit dem Verfahren zur Farbkompensation bei einem Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 L34, L341 gewonnen wurden. Tabelle 1 gibt die Ergebnisse dieses Tests wieder, bei dem ein nicht hemmender (d. h. nicht toxischer) Farbstoff dem Leuchtbakterientest in zunehmenden Konzentrationen zugesetzt wurde. Der Vergleich der nach dem er­ findungsgemäßen Verfahren farbkompensierten Meßwerte mit den wahren Werten zeigt, daß eine erhebliche Verbesserung der normalerweise gemessenen verfälschten Werte erzielt wird. Während durch den Farbstoff bei einem unkorrigierten Meßverfahren eine Hemmung der Aktivität der Leuchtbakterien von bis zu 37% vorgetäuscht wird, können derartige Fehler bei der Meßwertkompensation in der Regel beseitigt werden. Tabelle 2 zeigt die Durchführung desselben Tests, wobei jedoch ein (toxischer) Hemmstoff zugegeben wurde. Auch hier führt die erfindungsgemäß durchgeführte Meßwertkompensation zu erheblich verbesserten, d. h. dichter am wahren Wert liegenden Ergebnissen.

Einfluß eines nicht hemmenden Farbstoffes auf das Ergebnis im Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 L34, L341 ohne zusätzlichen Hemmstoff und dessen erfindungsgemäße Kompensation

Einfluß eines nicht hemmenden Farbstoffes auf das Ergebnis im Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 L34, L341 ohne zusätzlichen Hemmstoff und dessen erfindungsgemäße Kompensation

Einfluß eines nicht hemmenden Farbstoffes auf das Ergebnis im Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 L34, L341 mit zugesetztem Hemmstoff und dessen erfindungsgemäße Kompensation

Einfluß eines nicht hemmenden Farbstoffes auf das Ergebnis im Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 L34, L341 mit zugesetztem Hemmstoff und dessen erfindungsgemäße Kompensation

Die erfindungsgemäße Vorrichtung nach der P 196 02 145.6 ist in der beigefügten Fig. 1 dargestellt.

Die Fig. 2, 3 und 4 zeigen gemessene Spektren.

Die zu vermessende Probe 1 mit angedeuteten Leuchtbakterien 1a befindet sich in einem durchsichtigen Probenbehälter 5. Hierbei handelt es sich in der Regel um eine standardisierte Küvette. Der Probenbehälter 5 befindet sich vor dem Lichtdetektor 2. Bei dem Lichtdetektor 2 handelt es sich in der Regel um eine Fotozelle. Mit ihr wird die von den Leuchtbakterien 1a (bzw. von chemolumineszenten Stoffen innerhalb der Probe 1) ausgehende Lichtemission registriert und quantitativ erfaßt. Je nach Trübungsgrad der Probe 1 wird nun das von den Leuchtbakterien 1a ausgehende Licht innerhalb der Probe verschieden stark gestreut oder absorbiert. Ein und derselbe Leuchtwert eines Bakteriums 1a führt daher je nach Zusammensetzung des umgebenden Mediums zu einer unterschiedlich starken Lichtmenge, die den Detektor 2 erreicht. Als Kenngröße des Verfahrens interessiert jedoch die ursprüngliche, unverfälschte Leuchtstärke der Leuchtbakterien 1a. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird daher eine Zusatzeinrichtung eingeführt, welche im Prinzip eine Messung der reinen Störeinflüsse ermöglicht, so daß diese, nachdem sie derart ermittelt wurden, vom verfälschten Meßergebnis der Leuchtbakterien-Lumineszenz abgezogen werden können.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat zu diesem Zweck eine Lichtquelle 3 vor der Küvette 5 angeordnet. Das von der Lichtquelle 3 ausgesandte Licht tritt durch die transparente Küvette 5 und damit durch die Probe 1 hindurch und erreicht auf der anderen Seite der Probe den Detektor 2. Je nach Zusammensetzung der Probe, d. h. insbesondere nach Trübung oder Färbung, wird das Licht dabei unterschiedlich stark absorbiert bzw. gestreut. Das den Detektor 2 noch erreichende Licht ist dabei ein Maß für die Transmission des Behälters 5 und der Probe 1, aus der rückgeschlossen werden kann, wie stark das Medium um die Bakterien 1a Licht absorbiert. Als weitere optionale Ausstattung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist ein Monochromator 4 vorgesehen. Dieser befindet sich (in Richtung auf den Detektor 2) vor der Lichtquelle 3 und läßt nur einen bestimmten Spektralbereich der Lichtquelle 3, vorzugsweise ein schmales Wellenband, durchtreten. Dieses Wellenband ist in der Regel auf die Wellenlänge der Lumineszenz abgestimmt, damit auch wellenlängenabhängige Störeinflüsse, wie z. B. eine Absorption bei ganz bestimmten Wellenlängen, gezielt korrigiert werden können.

Ein weiteres Filter 6 kann erfindungsgemäß vor dem Detektor 2 angeordnet werden. Durch dieses Filter tritt sowohl das Licht der Lichtquelle 3 als auch der lumineszierenden Probe 1. Hierdurch findet eine weitere Anpassung der Spektren statt, wobei es insbesondere möglich ist, auch auf das Licht der Lumineszenzquelle einzuwirken und es z. B. praktisch zu monochromatisieren.

Die Auswirkung der Filterung auf die Spektren ist in den Fig. 2 bis 4 beispielhaft dargestellt.

Fig. 2 zeigt im Vergleich das Emissionsspektrum der Leuchtbakterien sowie des eingestrahlten (blauen) LED Lichtes. Beide Spektren sind nahezu deckungsgleich und weisen dasselbe Intensitätsmaximum auf.

Die Spektren werden jedoch durch eine Eigenfärbung des Mediums verändert. So zeigt Fig. 3 den Einfluß eines gelben Farbstoffes in zunehmenden Konzentrationen. Ein Ende des Spektrums wird überproportional geschwächt, so daß es zu einer Verschiebung der Lage des Intensitätsmaximums (zu größeren Wellenlängen hin) kommt. Übliche Meßverfahren, die sich auf die Bestimmung des Intensitätsmaximums stützen, liefern in dieser Situation fehlerhaft Ergebnisse.

Solche Meßfehler werden jedoch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vermieden, indem vor dem Detektor ein Filter 6 angeordnet wird. Wie Fig. 4 zeigt, führt dieses Filter dazu, daß nur das interessierende "wahre" Intensitätsmaximum (bei ca. 480 nm) beobachtet wird. Eine Lageverschiebung des Intensitätsmaximums findet nicht statt.

Claims (4)

1. Optisches Meßverfahren nach der P 196 02 145.6, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter (6) ein Durchlässigkeitsmaximum bei 450 bis 550 nm, vorzugsweise 480 nm haben.

2. Optisches Meßverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter (6) eine Fensterbreite von 5 bis 30 nm, ganz besonders bevorzugt 15 bis 25 nm haben.

3. Vorrichtung zur optischen Messung von lumineszierenden Proben nach der P 196 02 145.6, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter (6) ein Durchlässigkeitsmaximum bei 450 bis 550 nm, vorzugsweise 480 nm haben.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Filter (6) eine Fensterbreite von 5 bis 30 nm, ganz besonders bevorzugt 15 bis 25 nm haben.