DE19941415A1 - Messverfahren zur automatischen Ermittlung des Offsets bei fluorometrischen Chlorophyllgehaltsbestimmung und gleichzeitiger Bestimmung des Gelbstoffgehalts - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Meßverfahren zur Bestimmung der Gewässerqualität durch Messung der Algenbelastung dieses Gewässers. Die Messungen werden mittels Chlorophyll-Fluoreszenz-Messungen an einer Gewässerprobe realisiert. Eine neue Methode und ein neues Gerät erlaubt den durch Gelbstoff-fluoreszenz ausgelösten, sogenannten Offset bei solchen Chlorophyll-Fluoreszenz-Messungen zur Bestimmung des Chlorophyllgehaltes von Algensuspensionen permanent zu bestimmen. Dazu werden von den wichtigen Algenklassen optische Normspektren aufgenommen. diese mittels anderer Methoden (HPLC, naßchemisch) kalibriert und das optische, ebenfalls kalibrierte Normspektrum einer relevanten, den Offset bewirkenden, gelbstoffhaltigen Lösung (Subtraktiv) hinzugefügt. Dies geschieht mit einer Apparatur, die das benötigte Anregungsspektrum in eine Algensuspension strahlt und die Fluoreszenz dieser Suspension mittels eines optischen Detektors, vorzugsweise zwischen 680 nm und 730 nm detektiert.

Description

Chlorophyllgehaltsbestimmungen werden auf verschiedene Weise durchgeführt. Die naßchemische (nach DIN 38412), die Bestimmung mittels HPLC und die fluorometrische Methode sind die bekanntesten und gebräuchlichsten. Die fluorometrische Meßmethode regt bei einer oder bei mehreren Wellenlängen zwischen etwa 450 nm und 670 nm (also bei einer Bestrahlung einer Probe mit Licht im sichtbaren Bereich) eine Fluoreszenz des Chlorophylls mit einer Wellenlänge von etwa 700 nm an.

Die Intensität dieses Fluoreszenz-Signals wird meist direkt proportional zum Chlorophyllgehalt in der gemessenen Probe gesetzt. Verfeinerte Methoden verwenden statt der Auswertung der Fluoreszenz unter dem Einfluß einer einzelnen (Anregungs-)Wellenlänge mehrere (Anregungs-)Wellenlängen, oder sogar den Einsatz eines ganzen (Anregungs- )Spektralbereiches, um - mehrere - Algenklassen durch ihr spezifisches Verhalten gegenüber dem (Anregungs-) Spektrum identifizieren zu können.

Dazu werden zunächst die Reaktionsspektren der reinen Algenkulturen gegenüber den Anregungswellenlängen aufgenommen, dann mit Kenntnis dieser Spektren die Spektren von Gewässerproben verglichen. Das Probenspektrum wird dabei bei der rechnerischen Auswertung auf seine Zusammensetzbarkeit durch die (durch den vorherigen Schritt bekannten) spezifischen Algenklassenspektren untersucht (hier existieren spezifische Anpassungsmethoden ("Fitverfahren")).

Mit Hilfe von Fluoreszenzmessmethoden wird andererseits aber auch versucht (unter anderen Methoden), den Gelbstoffgehalt von Gewässerproben zu erfassen. Als Gelbstoffe bezeichnet man dabei eine Stoffgruppe, die im wesentlichen aus organischen Abbauprodukten besteht. Man versucht also mit eben dieser Fluoreszenzmessmethoden ein Maß für im Gewässer enthaltenen andere organische Substanzen zu finden. Dazu werden in der Regel allerdings kürzere Wellenlängen zur Anregung und für die Detektion der damit angeregten Fluoreszenz verwendet (z. B. 355 nm Anregung, 425 nm Fluoreszenz, U.-B. Goers, Inst. f. Physik Hamburg, GKSS-Fachbericht 91/E/39), da in diesen kürzeren Wellenlängenbereichen höhere Fluoreszenzausbeuten zu erzielen sind.

Damit ergibt sich aber das Problem, daß sich diese Fluoreszenz von Gelbstoffen oder gelbstoffähnlichen Substanzen in den Proben auch bei den zur Chlorophyllfluoreszenz- Messung verwendeten Anregungswellenlängen zwischen 450 nm und 670 nm mit einer Messung der angeregten Fluoreszenz der zwischen 680 nm und 730 nm bei Verwendung der technisch vorliegenden Detektoren überlagert.

Dieses Phänomen wird als Offset bezeichnet. Dieser Offset führt dazu, daß es bei der Bestimmung von Chlorophyll aus der Fluoreszenzintensität zu einer systematischen Fehlbestimmungen kommt. Diese Fehlbestimmungen werden normalerweise bei den Messungen hingenommen, da bisher eine Korrektur zu aufwendig oder als unnötig erschien. Tatsächlich aber können derartig auftretende systematische Fehler in einigen Fällen einen erheblichen Anteil am Meßergebnis erreichen.

Die in diesem Zusammenhang entwickelte, hier beschriebene, erfindungsgemäße Methode erlaubt jetzt aber, auf die verschiedenen Quellen der Fluoreszenz aus einer Probe zu schließen, diese in die beteiligten (Fluoreszenz-)Komponenten zu trennen und die einzelnen Beiträge an der Gesamtfluoreszenz zu ermitteln. Dadurch wird sowohl die Chlorophyllgehaltsbestimmung präzisiert, als auch - in einem Auswertungsgang - der Gelbstoffgehalt (also der Offset) bewertet.

Dazu war das bisher verwendete Verfahren zur Bestimmung der Anteile von Algenklassen (Blaualgen, Grünalgen, Kieselalgen und Cryptophyceen) in einer Wasserprobe zu erweitern:
Auszugehen ist von der Tatsache, daß Algen einer Klasse ähnliche Zusammensetzungen der photosynthetischen Pigmente aufweisen. So gibt es für jede Algenklasse ein typisches Fluoreszenz-Anregungsspektrum in einem Wellenlängenbereich von 680 nm-730 nm. Abb. 1 und Abb. 2 zeigen derartige Anregungsspektren. Zu jeder Anregungswellenlänge (auf der Abszisse (Abb. 1 (12)) abgetragen) reagieren die Algen mit einer typischen Intensität der Fluoreszenzantwort (diese Intensität auf die Ordinate abgetragen (Abb. 1 (13))).

Bei entsprechender Wahl der Anregungswellenlängen ist es jetzt möglich, eine in einer Probe vorkommende Algenart aufgrund ihres spezifischen Fluoreszenzspektrums einer bestimmten Algenklasse zuzuordnen, auch wenn die Messung nicht den ganzen Spektralbereich erfaßt. So können mit dem anregenden Licht von fünf unterschiedlichen Wellenlängen (hier bevorzugt die Wellenlängen bei 450 nm, 525 mn, 570 nm, 590 nm und 610 nm, im allgemeinen durch entsprechend ausgewählte Leuchtdioden erzeugt) markante Unterschiede zwischen den Spektren unterschiedlicher Algenklassen für eine Zuordnung verschiedener Algen in einem Gemisch genutzt werden. Abb. 1 zeigt mittlere Spektren von Chlorophyceen (Grünalgen (Abb. 1 (10))), Bacillariophyceen (Diatomeen, . . . ((Abb. 1 (9)), Cyanobacterien (Blaualgen ((Abb. 1 (7))) und Chryptomonaden ((Abb. 1 (8)). Jede Algenklasse weist zu jeder anderen Algenklasse markante Unterschiede bei zumindest einer Wellenlänge innerhalb des dargestellten Bereiches auf ((Abb. 1 (1-6).

Eine beliebige Summe von Vielfachen dieser Normkurven der verschiedenen Algenklassen kann durch ein adäquates Anpassverfahren an eine beliebige Menge von Fluoreszenz- Meßwerten so angepaßt werden, daß die Summe der mit einem bei der Anpassung zu bestimmenden Faktor gewichteten Normkurven optimal die jeweils vorliegenden Meßwerte beschreibt. Ist diese Anpassung erfolgt, dann sind die Wichtungsfaktoren ein Maß für die Anteile einer Algenklasse in der jeweiligen Probe.

Die Berechnung einer solchen Anpassung kann z. B. durch die Methode der kleinsten Fehlerquadrate oder Maximum-Likelyhood-Berechnungen geschehen. Bei der Methode der kleinsten Fehlerquadrate werden die Quadrate der Abweichungen der Meßwerte vom Modell (das Modell ist hierbei die Summe der gewichteten Normkurvenkoeffizienten) bei jeder Anregungswellenlänge eingehen.

Bei den so durchgeführten Messungen und den Darstellungen der Ergebnisse aus den Anpassungsrechnungen werden aber auch hier alle Ergebnisse von Gelbstofffluoreszenz im Sinne eines systematischen Fehlers überlagert. Da - solange nur im sichtbaren Bereich angeregt wird - das Gelbstoffspektrum stark dem Spektrum von Grünalgen ähnelt (Abb. 2), wird in erster Linie der Anteil der Fluoreszenz dieser Algenart überschätzt, weil die Fluoreszenz dieser Algenart durch den Gelbstoffanteil größer ist, in der Interpretation der Ergebnisse dieser Anteil aber im wesentlichen dem Grünalgenanteil zugeschlagen wird.

Abb. 2 zeigt die typischen Anregungsspektren von Gelbstoffen ((Abb. 2 (10)) bzw. huminstoffähnlichen Substanzen und das von Grünalgen ((Abb. 2 (11)). Deutlich sieht man, daß bei kürzeren Wellenlängen (unter 450 nm, bevorzugt betrachtet bei 370 nm) die relative Fluoreszenz der Gelbstoffe ansteigt, sich hier Grünalgen und Gelbstoffe klar unterscheiden.

Ermittelt man nun eine typische Gelbstoff-Normkurve (diese kann mittels Huminstoffnatriumsalz, Ligninsulfonsäure oder einfach verwässerter und abgefilterter Muttererde gewonnen werden) und fügt diese dem Satz (der für die Anpassungsrechnung benötigten) algenspezifischen Normkurven hinzu (, d. h. man verändert das bisher bei diesen Messungen verwendete Modell), so kann der Gelbstoffgehalt bzw. der Offset der Chlorophyllgehaltsbestimmung aus dem Gesamtanregungsspektrum bestimmt werden.

Das war bisher so nicht möglich und wurde auch bisher nicht beachtet. Es gibt zwar Instrumente, die Gelbstofffluoreszenz erfassen können, wie beschrieben bei kürzeren Anregungs- und Detektionswellenlängen; die hier entwickelte Methode ist aber das erste, das den Einfluß von Gelbstoffen auf Chlorophyllfluoreszenzmessungen erfassen kann.

Die mit der erfindungsgemäßen Entwicklung erzielten Vorteile bestehen darin, "realtime" und "online", d. h. auch bei Profilmessungen in Seen und Meeren jederzeit den genauen Offset des Meßsystems zur Chlorophyllbestimmung ermitteln zu können und dadurch die Präzision der Messung erheblich zu verbessern. Gleichzeitig kann mit der Bestimmung der Wichtungsfaktoren der Modellanpassung ein Maß für den Gelbstoffanteil im Gewässer angegeben werden.

Eine vorteilhafte Wahl der Anregungswellenlängen und Detektionswellenlängen ergibt sich, wenn Lichtquellen und Detektoren zur Anwendung kommen die nur an den Spektralstellen arbeiten, an denen photosynthetisch relevante Prozesse ablaufen. Das sind Wellenlängen, in denen auf die Chlorophyllmessungen einflußnehmende Prozesse stattfinden.

Messungen, bei denen die Anregungswellenlängen im Bereich etwa 250 nm bis 400 nm ((Abb. 2 (14)) liegen, und deren Detektoren für Gelbstofffluoreszenz zwischen 250 nm und 670 nm liegen, lassen die Aufnahme von Normkurven zu, mit denen ebenfalls der Offset einer Chlorophyllgehaltsmessung berechenbar ist.

Bei einem technisch realisierten Aufbau mit Anregungswellenlängen kürzer 500 nm und einem (neben dem 700-nm-Detektor) zweiten Detektor mit einer Detektionswellenlänge bei 500 nm z. B. läßt sich Huminstofffluoreszenz ohne Chlorophyllfluoreszenz detektieren.

Erstellt man nun für die Wellenlängen, die für Chlorophyllmessung genutzt werden, ebenfalls eine Normkurve (also mit und für Wellenlängen, die sonst für eine Huminstoffmessung kaum oder nicht verwendet werden würden), so läßt sich die Fluoreszenz bei Anregung durch längere Wellenlängen und einem Detektionsbereich von 680 nm-730 nm der bei der (Chlorophyllmessung genutzt wird) bestimmen bzw. interpolieren.

Bevorzugt wird hier eine Anregung bei 370 nm (1), 450 nm (2), 525 nm (3) und 570 nm (4) und eine Detektion bei etwa 650 nm verwendet, zusätzlich zu den Anregungen bei 370 nm (Abb. 1, (1)), 450 nm (Abb. 1, (2)), 525 nm (Abb. 1, (3)), 570 nm (Abb. 1, (4)) und 590 nm (Abb. 1, (5)), 610 nm (Abb. 1, (6)), dies bei einer Detektionswellenlänge um 700 nm.

Die bisherigen Anpassungsrechnungen zur Ermittlung der Anteile der in einer Probe enthaltenen Algenklassen unter Zugrundelegung der algenspezifischen Normkurven wird somit erfindungsgemäß zur Verbesserung der Meßgenauigkeit einer Chlorophyll-Messung erweitert um die auf das Anregungsspektrum der Algenfluoreszenzmessung transformierten bzw. interpolierten Normkurve der Gelbstoffnormkurve mit einer Detektionswellenlänge um 500 nm.

Die Gelbstoffkonzentration einer Probe löst z. B. (in einer ersten Messung) bei einem Detektor mit einer Detektionswellenlänge bei 700 nm und einer ersten Anregungswellenlänge von 250 nm "x" Fluoreszenzeinheiten aus, wobei ein Anteil (vgl. Abb. 2 (10)) x1 vom Gelbstoffanteil der Probe stammt, ein zweiter Anteil x2 von der in der Probe vorliegenden Algenart.

Eine andere Anregungswellenlänge von 450 nm (das ist eine Anregungswellenlänge, die auch zur Chlorophyllfluoreszenzbestimmung benutzt wird) erzeugt mit einem Detektions- Wellenlängenbereich zwischen 680 nm-730 nm "y" Fluoreszenzeinheiten, wobei ein Anteil (vgl. Abb. 2 (10)) y1 vom Gelbstoffanteil der Probe stammt, ein zweiter Anteil y2 von der in der Probe vorliegenden Algenart.

Mit zunächst unbekannter Wichtung w1, w2 (diese zu bestimmen und damit auf die Konzentration der beteiligten Komponenten zu schließen, ist das primäre Ziel der gestellten Aufgabe) weiß man, daß w1(y1-x1) den Anteil in der Differenz D = y-x der beiden Messungen darstellt, der vom Gelbstoffanteil stammt, w2(y2-x1) den Anteil an der Meßdifferenz, der von der Chlorophyllfluoreszenz stammt.

Gleiches geschieht noch mit anderen Anregungsfrequenzen:
Also gilt

y = w1y1 + w2y2

x = w1x1 +w2x2,

und

y-x = w1(y1-x1)-w2(y2-x2) = (w1y1-w2y2) + (w1x1-w2x2).

Setzt man z. B. x2 = K.x1, y2 = L.y1 (dies ist aus den Normkurven jederzeit bestimmbar: L = Verhältnis der Kurvenwerte bei Wellenlänge 2 (und entsprechend bei Wellenlänge 2), K = das bei Wellenlänge 1 (und entsprechend bei Messung 1)), so gehen diese Beziehungen über in

y = w1y1 + w2 L.y1 = (w1 + L.w2)y1

x = w1x1 + w2 K.x1 = (w1 + K.w2)x1,

und

y-x = (w1-L.w2)y1 + (w1-K.w2)x1.

Obwohl die Bestimmung von w1 und w2 mathematisch beim Vorliegen von vielen Messungen durch entsprechende Anpassungsberechnungen prinzipiell lösbar ist und hier keines Beweises bedarf, hier als vereinfachtes Beispiel:
Bei Anregung mit 450 nm ist die Fluoreszenz, gemessen mit dem Detektor für 700 nm, nur durch die Differenz der Wichtungen der Normkurven, also durch die Differenz der Konzentration der in den Proben enthaltenen Anteile bestimmt (vgl. Abb. 2 (11); y1 ist ungefähr gleich y2. Hier gilt bei einer Norm-Konzentration der beteiligten Komponenten, daß L ungefähr 1.0 ist (oder das wird hier so definiert)), also ist dann:

y = (w1 + w2)y1 = A.y1

x = (w1 + K.w2)x1 = B.x1

für die einzelnen Messungen und

y-x = (w1-w2)y1 + (w1-K.w2)x1 = C.y1 + D.x1,

für die Differenz der Messung bei Anregung mit 450 nm gegenüber der Messungen mit einer Anregung bei 250 nm. Aus zwei Messungen ergeben sich also 3 Gleichungen mit den Unbekannten A, B, C, D, x1, y1.

Nimmt man mit einer solchen Messapparatur also das Spektrum einer unbekannten Suspension auf, so ist im folgenden mittels eines Mikrocontrollers o. ä. ein Algorithmus zu starten, der solange die Normkurven, d. h. die Fluoreszenzmesswerte bei jeder Anregungswellenlänge mit sogenannten Vielfachen (Wichtungsfaktoren) multipliziert und die mit diesen Vielfachen multiplizierten Normkurven addiert, bis sich dieses Summenspektrum und das Probenspektrum weitestgehend gleichen, die Summe der Abstandsquadrate zwischen dem Fluoreszenzspektrum der Probe und dem aufaddierten Spektrum aus den Vielfachen der Normkurve bei jeder Wellenlänge minimal wird.

Hieraus lassen sich Chlorophyllgehalt und Gelbstoffgehalt gleichzeitig quantifizieren, da über die Vielfachen der kalibrierten Normkurven ein Maß für den Gehalt an den jeweiligen Algenklassen und Gelbstoffen vorliegt. Wichtig für eine gute Unterscheidung der beteiligten Komponenten ist die Nutzung von mindestens einer Wellenlänge, bei der sich die Spektren der Algenklasse und das Spektrum der Gelbstoffe unterscheiden. Es hat sich gezeigt, daß Normkurven von Gelbstoffen, die aus natürlichen Gewässern stammen, im allgemeinen recht ähnlich sind.

Die Normkurve kann entweder durch Abfiltern der Algen einer Probe direkt, durch Erstellen einer Gelbstoffteillösung wie Ligninsulfonsäure oder aus einer beliebigen, als durchschnittlich erkannten Normkurve aufgenommen werden. Die Gelbstoffnormkurve unterscheidet sich von den Normkurven von Grün- und Kieselalgen bei Detektionswellenlängen zwischen 680 nm und 730 nm besonders im Anregungswellenlängenbereich unter 450 nm. Daher ist die Nutzung einer Wellenlänge in diesem Bereich zur Erstellung einer Normkurve unabdingbar.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 Darstellung der wichtigsten Normkurven der spektralen Verteilung der angeregten Fluoreszenz der wichtigsten Algengruppen einschließlich einer Gelbstoff-/­ huminstoffähnlichen Normkurve, die bei einer Messung des Algengehalts eines Gewässers den Offset einer Messung verursacht (7) = Blaualgen, (10) = Grünalgen, (9) = Bacillariophyceae (Diatomeen), (11) = Gelbstoffe, (8) = Chryptophyceae

Abb. 2 Darstellung der Normkurven für Gelbstoffe und Grünalgen im Anregungsspektrum zwischen 450 nm und 610 nm. Die Ähnlichkeiten der beiden Spektren ist offensichtlich. Deutliche Unterschiede treten aber z. B. bei 370 nm auf. In diesem erfindungsgemäßen Verfahren zur Offset-Bestimmung der Chlorophyllbestimmung (bzw. zur Gelbstoffbestimmung) können derartige Stellen im Spektrum genutzt werden.

Claims (2)

1. Apparatur und Verfahren, das einmalig ein optisches Anregungsspektrum von Gelbstoffen bzw. gelbstoffähnlichen Stoffen zu den Wellenlängen, die in einem Fluoreszenz- Messverfahren verwendet werden, als Normkurve bestimmt und/oder speichert, dies mit Hilfe eines Detektors, der bevorzugt bei Wellenlängen zwischen 680 nm und 730 nm detektiert, und das berechnete Vielfache dieser Normkurve als Offset von in-situ-Messungen von Chlorophyll-Gelbstoff-Fluoreszenz-Messungen bei gleichen Anregungs- und Detektionswellenlängen angibt, dadurch gekennzeichnet, daß in der Apparatur das Anregungsspektrum kontinuierlich oder diskret auf eine wässerige Probe gesandt wird und mindestens eine Anregungswellenlänge zwischen 200 und 450 nm liegt und sowohl die Normkurven der beteiligten Substanzen bestimmt als die offsetfreie Messung erlaubt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß erweiternd Detektoren mit Detektionswellenlängen zwischen 250 nm und 750 nm benutzt werden, um ein Norm- Spektrum der fluoreszierenden organischen Stoffe in natürlichen Proben (Gelbstoffe) zu ermitteln und dieses von den Messungen von chlorophyll- und gelbstoffhaltigen Mischproben zu subtrahieren.